低分子抗体の高密度配向固定化技術の開発と免疫測定の高感度化

京都工芸繊維大学分子化学系

准教授 熊田 陽一

タンパク質を固定化した新しい材料設計 （インタラクティブバイオ界面）

材料基板

タンパク質（バイオ分子）

生体分子の機能 • 反応を触媒する力 • 分子を認識する力

様々な材料 • 有機材料 • 無機材料 • 複合材料

新しいバイオ材料 • 医療材料 • 医療診断材料 • バイオ電池 • 抗菌材料 • 固定化触媒 • アフィニティ分離材

＋

エンジニアリングとしての課題 （製造コスト、安定性、パフォーマンス・・・）

固定化

抗原抗体反応を利用した免疫診断（ELISA）

リガンド(抗体) の固定化

ブロッキング 検体の結合

Washing Washing

酵素標識抗体 の結合

シグナルの検出

Washing Washing

• 単位操作的特徴 固液間の吸脱着操作 物質移動律速 平衡・非平衡操作 • 試薬的特徴 抗体の特異性 抗体の親和定数(Ka) 抗体の速度定数(kon, koff) 抗体の固定化密度 抗体の安定性 抗体の生産コスト

固定化

PS plate

従来技術とその問題点 免疫検査には、抗体を固定化した担体 （プレートやラテックス粒子）が用いられているが、 ・ 抗体の密度が低く、配向が不均一・不適当 ・ 担体との接触によって活性が大きく低下する ・ 抗体の製造コストが極めて高い 等の問題があり、慢性的な感度不足と検査コストの高騰を引き起こしている。

抗体固定化材料のパフォーマンス

密度 X 配向性 X親和性X 残存活性

生産コスト パフォーマンス =

• 特異性・親和性の高い抗体か？ • 高密度に固定化できるか？ • 安定に固定化できるか？ • 配向はどの程度均一か？ • 製造コストは安価か？

これらの因子をいかに厳密に制御できるかが研究のカギ

これまで重要視されてきた因子

リガンド(抗体) の固定化

物理吸着

抗体固定化プレート （販売価格：5～10万円）

材料親和性ペプチドを導入した 単鎖抗体を設計

抗原認識部位

診断に必要な部分

診断に不必要な部分

低分子化 一本鎖化

単鎖抗体

タグ付き単鎖抗体

タグ導入

完全長抗体（従来の抗体）

タグ付き単鎖抗体の高密度配向固定

残存活性 高 ○ 固定化密度 低 × 生産コスト 高 ×

従来の抗体

残存活性 低 × 固定化密度 中 △ 生産コスト 低 ○

単鎖抗体（タグなし） 変性

残存活性 高 ○ 固定化密度 高 ○ 生産コスト 低 ○

タグ付き単鎖抗体

ペプチドタグ

プラスチック基板

材料親和性ペプチドを利用したタンパク質の固定化

材料親和性ペプチド： 固相表面の構造を認識し高親和的に付着するペプチド

特徴： • ペプチドの導入によってタンパク質を高密度に固定化できる。 • ペプチドの導入によってタンパク質の配向性を制御できる。 • ペプチドを介して固定化を行うことで高い生理活性を維持できる。

親和性ペプチド

プラスチック基板

目的タンパク質

PS-tag, PC-tag, PMMA-tag, SiN-tag

独自技術

ペプチドタグ融合グルタチオン S トランスフェラーゼ

GSTのアミノ酸配列 MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLIEGRGIPGNSS

PS-tag: RIIIRRIRR PC-tag: NSNFFGLVDGLNFAVQYLGK PMMA-tag: DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK SiN-tag: GGRHTPFFKGYRPQFYFRTTDVTGTIE

C-terminus

N-terminus

材料親和性ペプチド融合GSTの調製

親和性ペプチドのDNA

親和性ペプチド融合GST発現Vector

親和性ペプチドの遺伝子

精製 GSTrap HP column Elution ： 20mM GSH

100mM Tris

Vector構築 形質転換

本培養 37℃

2×YT 培地 （抗生物質：Amp）

pGEX-3X

GSTのDNA

IPTG 1mM

発現 30℃ 7h

2×YT 培地 （抗生物質：Amp）

親和性ペプチド融合GST

-1400

-1200

-1000

-800

-600

-400

-200

0

0 250 500 750 1000 1250 1500

Incubation time, sec

∆ F

requency, H

z wt-GST

GST-PS19-6

PS-tag融合GSTの高密度配向固定 Quartz Crystal Microbalance (QCM)

PS-tagを導入することで迅速かつ高密度な固定化が可能。

タンパク質が付着すると振動数が減少する。

PS-tag融合酵素 vs phi-PS表面

PC-tagおよびPMMA-tag融合GSTの高密度配向固定

-500

-400

-300

-200

-100

0

0 250 500 750 1000 1250 1500

Incubation time, sec

∆ F

requency, H

z

wt-GST

GST-PC-MLT8

GST-PC-OMP6-700

-600

-500

-400

-300

-200

-100

0

0 250 500 750 1000 1250 1500

Incubation time, sec

∆ F

requency, H

z

wt-GST

GST-PM-OMP25

PMMA-tag融合GST vs PMMA表面 PC-tag融合GST vs PC表面

Quartz Crystal Microbalance (QCM)

PC-tag、PMMA-tagを導入することで迅速かつ高密度な固定化が可能。

タンパク質が付着すると振動数が減少する。

光源 分光器 光源 分光器

相互作用による膜厚変化

センサーチップ

干渉 干渉

ボトム

波長(nm)

反射

率(%

)

膜厚変化により ボトムがシフト

⊿λ

波長(nm)

反射

率(%

)

反射干渉分光（RIfS）センサー

センサーチップ

ボトム波長のシフト量を吸着量とみなす

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 100 200 300 400 500 600

波長

シフト量

（nｍ

）

時間 （秒）

試料注入

20倍以上高密度な固定化に成功

RIfSセンサチップ上へのGSTの選択的固定化

GST-SiN-tag (ELN-V821)

wt-GST

センサの大幅な高感度化に期待

本研究で開発されたSiN-tagはSiN基板に対して広い汎用性を有している。

材料親和性ペプチドを導入した 単鎖抗体を設計

抗原認識部位

診断に必要な部分

診断に不必要な部分

低分子化 一本鎖化

単鎖抗体

タグ付き単鎖抗体

タグ導入

完全長抗体（従来の抗体）

マウス抗体 （150 kDa）

低分子化

ラクダ抗体 （75kDa）

低分子化 VHH (13kDa)

・世界最小 ・熱安定性大

Fab （50kDa）

scFv （30 kDa）

・ 汎用性大 ・ 結合活性大

材料親和性ペプチドを導入した様々な低分子化抗体を調製可能

・ 発現が容易 ・ リフォールディングが簡便

これまでに開発したタグ付き低分子抗体 抗体 由来 対象 Anti-RNase A scFv, Fab, VHH (3) マウス、ラクダ モデルタンパク質 Anti-CRP scFv, Fab (4) マウス 炎症マーカー Anti-AAT scFv マウス 肝がんマーカー Anti-CEA scFv, Fab マウス 大腸がんマーカー Anti-CA19-9 scFv マウス 膵がんマーカー Anti-hIgG scFv マウス モデルタンパク質 Anti-hIgA scFv マウス 腎臓病マーカー Anti-TSH scFv, Fab マウス バセドウ病マーカー Anti-TF scFv, Fab (2) マウス 様々なガンのマーカー Anti-AFP scFv, Fab (2) マウス 肝がんマーカー Anti-NP sｃFv, Fab マウス インフルエンザマーカー Anti-hCG VHH リャマ 妊娠検査マーカー Anti-Lysozyme VHH (2) ラクダ モデルタンパク質 Anti-Ovalubmin VHH (2) ラクダ モデルタンパク質 Anti-α-amylase VHH (2) ラクダ モデルタンパク質

タグ付き低分子抗体の広い汎用性を検証中、今後も検査項目を追加していく予定

低分子抗体の大量生産技術

200k116k

66k

45k

31k

21k

14k

培養上清

精製後scFvMW

SDS-PAGEの結果

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 20 40 60 80 100 120

DO値

(-)

gluc

ose(

g)Ye

ast e

xtra

ct(g

)

培養時間(H)

glucose Yeast extract 溶存酸素濃度(DO値)

低分子抗体の生産濃度

VHH：1g～10g/L scFv: 1g～4g/L

（工業生産に十分通用するレベル）

PS-tag融合単鎖抗体を用いる低コストかつ高感度な医療診断 （CEA (大腸がんマーカー)の検出）

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0 20 40 60 80 100

Abs

orb

ance a

t 450 (re

f. 6

50 n

m),

-

CEA concentration, ng/ml

scFv-PS / phi-PS plate

Whole Ab/Maxisorp

scFv-PSをリガンドに用いることで10倍の高感度化に成功！

サンドイッチELISAによるCRPの検出 (3種類のPS-tag融合scFvの感度比較)

0.0

1.0

2.0

3.0

1 10 100 1000

CRP concentration (ng/ml)

Abs

orb

ance a

t 405 n

m, -

● scFv

● scFv-PS

● scFv-PSII

● scFv-(PS)

＊ Whole Ab

PS-tag融合scFvを用いることで高感度な抗原検出が可能

PS-tag融合単鎖抗体を用いる低コストかつ高感度な医療診断 （TSH (甲状腺刺激ホルモン)の検出）

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

0.01 0.1 1 10 100 1000

Abso

rban

ce a

t 450

nm

(ref

. 650

nm

), -

TSH concentration, ng/ml

scFv-PS (840)

Whole Ab (840)

scFv-PS (phi-PS plate), whole Ab (Maxisorp)

0

scFv-PM固定化PMMA plateによる抗原検出

0.0

1.0

2.0

3.0

0.01 0.1 1 10 100 1000

ABS

at 4

50 n

m (R

ef. 6

50nm

), -

biotin-RNase, ng/ml

scFv-D15scFv-PM

特注PMMA製プレート

PMMA-tagの導入によって単鎖抗体をPMMAプレート上に高密度・高活性に固定化できた。

（タグなし）

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

0.1 1 10 100

Abs

orba

nce,

-

biotin-RNase (ng/ml)

Fab H-PM-HisFab L-PM-HisFab-PM-His (H+L)scFv-PM-His

Fab H-PM-HisおよびFab L-PM-Hisを単独で固定化した場合には抗原検出はできず、Fab-PM-His (H+L)ならびにscFv-PM-Hisを固定化した際に高いシグナルが得られた。

Anti-RNase Fab-PM-His (H+L)は「PMMAプレートへの付着力」と「抗原に対する結合活性」の両方を保持している。

Anti-RNase Fab-PM-His（H+L）固定化PMMA plateの評価 特注PMMA製プレート

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

0.01 0.1 1 10 100 1000

Abso

rban

ce a

t 450

- 65

0 nm

, -

biotin-hCG concn, ng/ml

VHH (45ug/ml)

VHH-PMMA-tag (45 ug/ml)

PMMA-tagの導入によってラクダ抗体（VHH）をPMMA基板表面に高密度かつ高活性に固定化可能であり、高感度に抗原検出可能である。

ラクダ由来VHH固定化PMMAプレートによるヒトhCGの検出

特注PMMA製プレート

材料親和性ペプチドのまとめ PS-tag PMMA-tag PC-tag SiN-tag

認識可能な表面 phi-PS (＋Tween20)

PMMA その他 PC SiN

タグ付きGST ○ ○ ○ ○

タグ付きscFv ○ ○ N.D. ○

タグ付きFab ○ ○ N.D. N.D. （検討予定）

タグ付きVHH ○ ○ N.D. N.D. （検討予定）

固相Refolding ○ N.D. （検討予定） N.D. N.D.

液相Refolding ○ （+ polyD-tag） ○ N.D. ○

（+ polyD-tag）

新技術の特徴・従来技術との比較

• 材料親和性ペプチドを融合した低分子抗体によって免疫診断の高感度化が可能。

• 従来はポリスチレンのみの使用に限られていたが、材料親和性ペプチドの種類を変えることで様々な表面に抗体を固定化可能となった。

• 本技術の適用により、10倍以上の高感度検出ならびに、抗体の製造コストを従来の1/10以下に削減できる。

実用化に向けた課題

• 現在、当研究室が保有している１５種類の低分子抗体について本技術の有用性を実証している。一方で、本技術を臨床検査に利用するためには、実用化に見合った優良な低分子抗体を新たに取得する必要がある。

• 長期間の保存安定性について、今後評価・検討していく必要がある。

各種リアルタイムバイオセンサへの応用

センサー基板 低分子抗体 の配向固定

コーティング

厚み：20 ~ 50nm

抗原の検出

シグナル

センサー上に固定化したscFvに抗原が結合するとリアルタイムにシグナルが検出される。

表面プラズモン共鳴(SPR)センサーへの応用

Biacore X-100 SPRセンサーの原理

センサーチップ(Au薄膜) lazer

Prism

Gold phi-PS film

高感度SPFSセンサの開発

SPR-SPFS複合機による超高感度バイオセンサの開発

京都大学再生研（岩田博夫先生、有馬祐介先生）との共同研究 （H21-23）

SPFSセンサを用いる超高感度医療診断

1 10 1000

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0 10 20 30 40 50 60

100

200

300

400

Antibody conc. (µg/mL)

Ads

orbe

d an

tibod

ies

(ng/

cm2 )

CRP conc. (pM)

Fluo

resc

ence

inte

nsity

scFvwhole antibody

scFvwhole antibody

(a) (b)

1 10 1000

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0 10 20 30 40 50 60

100

200

300

400

Antibody conc. (µg/mL)

Ads

orbe

d an

tibod

ies

(ng/

cm2 )

CRP conc. (pM)

Fluo

resc

ence

inte

nsity

scFvwhole antibody

scFvwhole antibody

1 10 1000

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0 10 20 30 40 50 60

100

200

300

400

Antibody conc. (µg/mL)

Ads

orbe

d an

tibod

ies

(ng/

cm2 )

CRP conc. (pM)

Fluo

resc

ence

inte

nsity

scFvwhole antibody

scFvwhole antibody

(a) (b)

抗体の固定化密度 SPFSセンサの感度

リアルタイムバイオセンサ上へのscFvの固定化

Quartz Crystal Microbalance (QCM)

Gold phi-PS film

Affinix QN (INITIUM)

scFv固定化QCMセンサによる抗原検出

-400

-300

-200

-100

0

0 2 4 6 8 10

Incubation time (min)

∆F (H

z)

10 µg/ml BSA

0.1 µg/ml Antigen

1 µg/ml Antigen

10 µg/ml Antigen

検出時間3分において0.1 – 10 µg/mlの抗原溶液の検出が可能であった。

RIfSセンサーの原理 研 究 の 背 景

RIfSセンサー開発機(wacaris)

センサ基板表面

SiN

Si

反射干渉分光（RIfS）センサ

センサチップの材料は窒化ケイ素（SiN）

anti-RNase scFv-SiN-D15 vs RNase

RNase antigen anti-RNase scFv-SiN-D15

anti-RNase scFv-D15 RNase antigen

SiN-tag融合scFvの方が10倍程度高感度な検出が可能であった。

SiN-tag融合scFvのSiN基板上への固定化とRIfSセンサによる抗原検出

anti-RNase scFv-D15 vs RNase

企業への期待

• あらゆるタンパク質の材料表面における高密度化・配向制御・活性維持に本技術は有効。

• 診断分野に関わらず、独自の材料、バイオ分子を有する企業との共同研究を希望。

• また、検査薬のみならず、バイオセンシングや固定化酵素触媒を開発中の企業、アフィニティ分離分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

本技術に関する知的財産権（１） 発 明 名：抗体のリフォールディング方法、リフォールディングされた抗体の製造方法、リフォールディングされた抗体、及びこれらの利用 出願人：京都工芸繊維大学 出願番号： PCT/JP2014/052475 発 明 名：窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）親和性ペプチド、及びその利用 出願人：京都工芸繊維大学 出願番号：PCT/JP2013/053290 発 明 名：抗体固定化担体、抗体固定化担体の製造方法および当該抗体固定化担体の利用 出願人：京都工芸繊維大学、デンカ生研 出願番号：PCT/JP2011/053157

発 明 名: ポリカーボネートおよび／またはポリメタクリル酸メチル親和性ペプチド、およびその利用 出願人：京都工芸繊維大学 出願番号：特許 第5655254号 発 明 名： 復元されたペプチドの生産方法およびペプチドが固定化された固相の生産方法 出願人：京都工芸繊維大学、エンプラス 出願番号：特許 第5582482号、米国、中国でも権利化済 発 明 名：一本鎖抗体、固相、遺伝子、ベクター及び宿主 出願人：京都工芸繊維大学、エンプラス 出願番号：特許 第5582483号

本技術に関する知的財産権（2）

他、数件

ご清聴ありがとうございました。

京都工芸繊維大学 分子化学系 化学工学研究室

お問い合わせ先

京都工芸繊維大学

産学連携マネージャー 片山 茂

ＴＥＬ ０７５－７２４ － ７９１１

ＦＡＸ ０７５－７２４ － ７０３０

e-mail s-kataya＠kit.ａｃ.ｊｐ