efecto inhibitorio

1

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA DE ESTOMATOLOGÍA

“EFECTO INHIBITORIO in vitro DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE

Caesalpinia Spinosa TAYA SOBRE CEPAS DE Enterococcus Faecalis

ATCC 29212”.

TESIS

PARA OPTAR EL GRADO DE

BACHILLER EN ESTOMATOLOGÍA

AUTOR

CINTYA LISET FLORES ARMAS

ASESOR

MG. GUSTAVO GUARDIA MÉNDEZ.

CO-ASESOR

DRA. ELVA MEJIA DELGADO.

TRUJILLO – PERÚ

Biblioteca Digital. Oficina de Sistemas e Informatica - UNT

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comecial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/pe/

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RESUMEN

El objetivo del presente estudio de tipo experimental fue determinar el efecto

inhibidor in vitro del extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Taya)

frente a cepas de Enterococcus faecalis. Se realizó la prueba de susceptibilidad,

utilizando el método de difusión en discos. Las cepas de E. faecalis fueron sembradas

en placas que contenían medio de cultivo Mueller Hinton, se colocaron discos con las

diferentes concentraciones del extracto etanólico de Taya. Las placas se incubaron a

37 0C midiéndose los halos con una regla vernier después de 24 horas; todos los

discos presentaron halo de inhibición, y los tamaños de estos aumentaron en relación

directamente proporcional a las concentraciones utilizadas. Se empleó también el

Método de dilución en tubos, ensayando concentraciones de 60%, 40%, 20% y 10%

del extracto etanólico de vainas de C. spinosa; a los cuales se le agregó el inóculo de

E. faecalis. Se llevo a estufa a 37ºC por 24 horas, luego se sembró en placas con

Agar Mueller Hinton para determinar las Unidades Formadoras de Colonias (UFC).

Después de 48 horas se realizó el conteo de UFC. Todas las concentraciones

presentaron efecto inhibitorio del crecimiento de E. faecalis. La concentración

mínima inhibitoria hallada fue la del 40 %.

Se concluye que el extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa “taya” posee

actividad inhibitoria in vitro sobre el crecimiento de cepas de Enterococcus faecalis.

Palabras clave: Caesalpinia spinosa, Enterococcus faecalis, Concentración Mínima

Inhibitoria, Unidades Formadoras de Colonia



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ABSTRACT

The aim of this experimental study was to determine the inhibitory effect in

vitro of the etanolic extract pods Caesalpinia spinosa (Taya) against strains of

Enterococcus faecalis. The susceptibility test was made, using the method of

dissemination in discs. The strains of E. faecalis were sown in plates

containing culture medium Mueller Hinton, and placed discs with different

concentrations of the ethanolic extract of Taya. These were incubated at 370C

measured halos with a vernier rule after 24 hours; all discs presented halo of

inhibition, and sizes of these increased in relation directly proportional to the

concentrations used. Employment is also the method of dilution in tubes,

tested concentrations of 60 %, 40 %, 20% and 10% of the ethanolic extract of

pods of C. spinosa; which was added the inoculum of E. faecalis.

The minimum inhibitory concentration found was 40 %.

The conclusion of this study is that the ethanolic extract from pods of

Caesalpinia spinosa "taya" has in vitro inhibitory activity on the growth of

strains of Enterococcus faecalis.

Key Words: Caesalpinia spinosa, Enterococcus faecalis, Minimum

Inhibitory Concentration, Colony Forming Units



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I. INTRODUCCIÓN

Durante el tratamiento de conductos radiculares el objetivo de la preparación

biomecánica es limpiar y modelar adecuadamente el conducto radicular antes de la

obturación. Sin embargo, en muchos casos donde se realiza una necropulpectomía

los conductos radiculares muestran bacterias aún después de una meticulosa

preparación quirúrgica de conductos radiculares.1

Estos microorganismos conducen al fracaso del tratamiento endodóntico, así,

muestras de dientes obturados con frecuencia presentan bacterias facultativas Gram-

positivas que incluyen Enterococos, Estreptococos y Lactobacilos, presentándose una

periodontitis apical persistente. 2

Baumgartner y cols.19923, quienes estudiaron las bacterias que se aislaban en los

5mm apicales de dientes con lesión periapical. Encontraron más de 50 especies de

bacterias de las cuales 34, el 68%, eran anaerobias estrictas. Las especies aisladas

más frecuentemente fueron: Actinomyces spp., Lactobacillus spp., Bacteriodes no

pigmentados, Veillonella spp., Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum y

Streptococcus mutans.

Diversos estudios han revelado que la microbiota de los dientes con fallas en el

tratamiento endodóntico difieren de la microbiota encontrada normalmente en los

conductos de dientes no tratados. 4-7 La microbiota que se encuentra en los dientes con



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fracaso en el tratamiento endodóntico es predominantemente anaerobia facultativa y

Gram positiva, siendo el Enterococcus faecalis la especie que se aísla con mayor

frecuencia.8

El Enterococcus faecalis es una bacteria en forma de coco dispuesta en cadenas o

pares, Gram positiva, anaerobia facultativa, no esporulada e inmóvil y que ha sido

identificada como una causa frecuente de infección del sistema de conductos

radiculares en dientes con fracaso en el tratamiento endodóntico. La temperatura

óptima de crecimiento in vitro de este microorganismo es de 35ºC, no obstante, se ha

observado crecimiento entre 10ºC y 45ºC.9

Una característica notable de esta especie es su capacidad para sobrevivir y crecer en

microambientes que pudieran ser tóxicos para otras bacterias, entre estos en presencia

de Hidróxido de Calcio.10 Su erradicación del conducto radicular es difícil utilizando

preparaciones químicomecánicas e irrigantes como desinfectantes, así como pastas y

sustancias antibacterianas.11

E. faecalis posee una pared celular con antígenos del grupo D, el cual es un ácido

lipoteicoico que se encuentra asociado con la membrana citoplasmática de la bacteria

y que contiene residuos de glicerol. Además, posee gran cantidad de mureina y ácido

teicoico.12



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También se han realizado otras investigaciones dirigidas a aclarar el papel que juegan

los factores de virulencia de E. faecalis, en la colonización por parte de esta bacteria

en un medio tan pobre en nutrientes, como el conducto radicular medicado. La

adhesión a la superficie de la dentina constituye un paso esencial que determina el

potencial patógeno de este microorganismo, en el conducto radicular medicado.13, 14

Puesto que la dentina contiene colágeno y otras proteínas, se sugiere que las proteasas

sintetizadas por E. faecalis, así como la proteína de unión al colágeno (Ace) pudieran

participar o por lo menos influir en la adhesión bacteriana, y por lo tanto permitir que

la bacteria colonice el conducto radicular.15

En los dientes con pulpa mortificada o necrótica, el contenido microbiano tóxico de

la cavidad pulpar determina la opción por sustancias antisépticas. La medicación

intraconducto será entonces un auxiliar valioso en la desinfección del sistema de

conductos radiculares, sobre todo en lugares inaccesibles a la instrumentación, como

las ramificaciones del conducto principal y túbulos dentinarios. 16

La elección de una medicación intraconducto entre sesiones requiere de las mismas

consideraciones que la aplicación de cualquier fármaco en otra región del organismo

humano. Por lo tanto es necesario considerar. Cantidad, localización y tiempo de

aplicación.16

Una variedad de agentes antimicrobianos han sido evaluados por su habilidad para

eliminar el E. faecalis del sistema del conducto radicular. Esto incluye preparaciones



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entre citas, tales como Hidróxido de calcio, Paramonoclorofenol,

Paramonoclorofenol Alcanforado y combinaciones de antibiótico-esteroideas, así

como irrigantes tales como hipoclorito de sodio, digluconato de clorhexidina, Acetato

de clorhexidina y componentes iodino.17

En un estudio in vivo e in vitro realizado por Spangberg et al se evaluó el efecto

sobre la irritación tisular (permeabilidad capilar) y la citotoxicidad de varios

medicamentos: PCMF alcanforado, fenol alcanforado, cresatina, formocresol e

yoduro de potasio yodado; y concluyeron que el PMCF alcanforado es el antiséptico

más tóxico e irritante, seguido de la cresatina; y el menos tóxico fue el yoduro de

potasio yodado.18

Soekanto et al. , evaluaron la toxicidad de varios medicamentos (fenol, PMCF, fenol

alcanforado, PMCF alcanforado, alcanfor) sobre células pulpares de ratas a distintas

concentraciones, y concluyeron que todos los medicamentos mostraron citotoxicidad,

incluyendo al alcanfor solo, el cual se pensaba que era un vehículo que reducía la

toxicidad del fenol y PMCF, sin embargo, según este estudio el alcanfor por sí mismo

mostró citotoxicidad y su adición al fenol y al PMCF incrementó la toxicidad de

éstos.19

Llamas et al, evaluaron en ratas el efecto in vitro del PMCF y el PMCF alcanforado

sobre los macrófagos y demostraron que estos compuestos disminuyeron

significativamente la capacidad de adhesión de macrófagos al sustrato. Tomando en



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cuenta que la adhesión es el primer paso de la fagocitosis por parte de macrófagos

además de la presentación del antígeno, tanto el PMCF como el PMCF alcanforado

pueden inhibir la función del macrófago y modular las respuestas inflamatorias e

inmune en los tejidos periapicales. Por lo tanto, cuando son usados intraconducto,

pueden retardar los procesos reparativos. Quizá estos medicamentos sólo deban ser

usados en tratamientos de conductos de dientes con pulpas necróticas.20

Todo esto indica la necesidad de un retorno a lo natural, con el objeto de encontrar

nuevos principios biológicamente activos, para disminuir los efectos tóxicos del uso

de estas sustancias.21

Paralelo al desarrollo tecnológico de la industria farmacéutica se ha desplegado un

importante interés por parte de los investigadores en estudiar sustancias naturales que

posean algunas propiedades farmacológicas con efecto antimicrobiano.22

Las plantas medicinales han sido utilizadas desde épocas primitivas en el tratamiento

de enfermedades. Durante mucho tiempo los fármacos naturales y sobre todo las

plantas medicinales, fueron el principal e incluso el único recurso del que disponían

los médicos. Esto hizo que se profundizara en el conocimiento de especies vegetales

con propiedades medicinales y que se ampliara la investigación a cerca de los

productos que de ellas se extraen.23



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Nuestro país está considerado entre los 12 países de mayor diversidad biológica de la

tierra, conocidos como países megadiversos tanto por el número de especies y de

recursos genéticos como por la variedad de ecosistemas.24

El uso de plantas es de gran importancia en la medicina tradicional. El conocimiento

científico de ciertas especies es desconocido y es necesario que aprendamos a

investigar los recursos naturales. Este conocimiento permitirá determinar los

principios activos de las plantas medicinales y estudiar su actividad en el organismo

para después aislarlos, obtenerlos y avalar los usos que la medicina popular le

atribuye a diversas especies vegetales.24

En nuestro medio algunas plantas medicinales en el área de salud dental están siendo

utilizadas en diversas formulaciones farmacéuticas, así tenemos: enjuagues bucales,

colutorios, soluciones tópicas y pasta dental .24

La Caesalpinia spinosa (Taya) es una planta producida en varias zonas del país. En

el Perú, se encuentra en los valles interandinos secos entre 1000 y 3100 msnm, los

departamentos de mayor producción son Cajamarca (41%), Ayacucho (16%), La

Libertad (13%), Huánuco (13%), también se reporta su presencia en Huancavelica,

Apurímac. 25



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En Perú, numerosos estudios han reportado la presencia de taninos, flavonoides,

gomas, alcaloides y proteínas en la Taya, que se pueden hallar tanto en la vaina como

en la semilla.26

Esta planta muy utilizada en la actualidad en la industria por sus altas

concentraciones de tanino y ácido gálico, es conocida además por su alto poder

astringente por coagular las albúminas de las mucosas y de los tejidos, creando una

capa aislante y protectora que reduce la irritación y el dolor; por tal motivo son

usados externamente para detener pequeñas hemorragias locales; en inflamaciones de

la cavidad bucal, catarros, bronquitis, quemaduras, hemorroides, e internamente

contra la diarrea, enfriamiento intestinal, afecciones vesiculares, y como

contraveneno en caso de intoxicación por alcaloides vegetales.27

Los taninos tienen la propiedad de formar complejos con macromoléculas,

particularmente con las proteínas; así forman enlaces puentes de hidrógeno, y una

unión covalente, colocándose entre las fibras de colágeno de la piel, empleándolos en

medicina en tratamientos de excoriaciones y quemaduras de la piel donde las

proteínas forman una capa protectora antiséptica bajo la cual se regeneran los

tejidos.28

En caso de la Caesalpinia spinosa "taya"; solo el extracto obtenido de la cáscara de

la Caesalpinia spinosa, tenía efecto inhibitorio mas no la pepa, que mostró un efecto



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inhibitorio nulo. Siendo este un aporte significativo para aquellas fórmulas

tradicionales que utilizan el fruto completo de la taya.29

La utilización de solventes orgánicos (como alcohol y acetona) tienen la ventaja de

preservar mejor los extractos e inhibir el crecimiento de bacterias, hongos y otros,

además de desnaturalizar las enzimas que pueden degradar los compuestos

biológicamente activos. En el caso de los extractos usando como solvente agua, estos

dan muestras viscosas y gelatinosas las cuales se hicieron difíciles de procesar (dados

estos factores, no podrían difundirse adecuadamente en el agar, y los resultados

obtenidos serían inconcluyentes).29

El uso de cepas bacterianas tanto Gram positivas como Gram negativas permitió una

idea representativa del efecto inhibitorio sobre dichos microorganismos.

Demostrándose un efecto preferencial por las Gram positivas, debiéndose aún probar

su efecto en un mayor número de cepas bacterianas.29

En la evaluación del extracto de taya usando el fruto (vaina) completo, se observó

actividad inhibitoria sobre cepas Gram positivas. Los componentes del fruto

relacionados con dicha actividad corresponden exclusivamente a la cáscara de la

vaina, donde la pepa no muestra actividad inhibitoria.29

Así mismo, en varios trabajos de investigación se concluye que la cáscara (vaina) de

Caesalpinia spinosa demuestra una buena acción inhibitoria sobre Staphylococcus



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aureus y Bacillus subtilis. 30,31 Mediante técnica de difusión en disco. Los extractos

fueron preparados usando como solvente alcohol-acetona (1:1). Se observó actividad

inhibitoria sobre cepas Gram positivas para el extracto de la vaina de tara más no

para el de la semilla. No se determinó la concentración mínima inhibitoria.29

De igual manera en un estudio publicado en Journal of Ethnopharmacology,

manifiesta que la taya también presenta actividad antibacteriana contra Bacillus

cereus, Staphylococcus epidermidis, Bacteroides fragilis.32

En otro estudio se hizo el ensayo antimicrobiano sobre extractos etanólicos al 80% de

nueve plantas obtenidos por maceración durante 5 días, una de las muestras

ensayadas fue la C. spinosa (vainas); se utilizaron cinco cepas Gram positivas y tres

Gram negativas usando el método de microdilución del caldo de cultivo (broth

microdilution). Los resultados son poco relevantes para la muestra mencionada a

excepción del ensayo contra E. faecalis donde el CMI fue de 0.5 mg / ml 33, sin

embargo no se menciona las diferentes concentraciones a las que fue comparada la

acción del extracto etanólico de C. spinosa.

Teniendo en cuenta las propiedades curativas, y el amplio y variado efecto

antibacteriano que presenta la Caesalpinia spinosa, nace el interés de determinar su

efecto antimicrobiano frente a uno de los agentes etiológicos con mayor capacidad

de supervivencia durante los procedimientos endodónticos, el Enterococcus faecalis.



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Es así que con el presente estudio se propone determinar el efecto in vitro y la

concentración mínima inhibitoria que presenta el extracto etanólico de vainas de

Caesalpinia spinosa “taya” sobre el crecimiento de E. faecalis, ya que es muy poca la

información a la acción in vitro de este agente y en nuestro medio no existen trabajos

similares en donde se demuestre el efecto antibacteriano de esta sustancia.

De obtener el efecto inhibitorio del extracto etanólico de vainas de C. spinosa (taya)

sobre el crecimiento de cepas de Enterococcus faecalis se abrirá una puerta de

posibilidades en la terapéutica de piezas dentarias con necrosis pulpar, que reducirá

los fracasos endodónticos ocasionados por infecciones persistentes y que evitará la

exposición local y sistémica a sustancias tóxicas, ya que esta solución podría

constituirse en una alternativa de origen natural para la medicación intraconducto.

1.1. Enunciado del problema:

¿Existe efecto inhibitorio in vitro del extracto etanólico de vainas de Caesalpinia

spinosa (Taya) sobre el Enterococcus faecalis ATCC 29212?

1.2. Hipótesis:

El extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa presenta efecto

inhibitorio in vitro sobre cepas de Enterococcus faecalis ATCC 29212.



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1.3. Objetivos:

1.3.1. Objetivos Generales:

Conocer el efecto inhibitorio in vitro del extracto etanólico de vainas de

Caesalpinia spinosa (Taya) sobre cepas de Enterococcus faecalis ATCC

29212.

1.3.2. Objetivos Específicos:

Determinar cualitativamente el efecto inhibitorio in vitro del extracto

etanólico de vainas Caesalpinia spinosa al 10%, 20%, 40% y 60%

sobre el crecimiento del Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Determinar cuantitativamente el efecto inhibitorio in vitro del extracto

etanólico de vainas Caesalpinia spinosa al 10%, 20%, 40% y 60%

sobre el crecimiento del Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Determinar la concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico de

vainas de Caesalpinia spinosa (Taya) sobre el crecimiento de cepas de

Enterococcus faecalis.



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II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1 MATERIAL DE ESTUDIO:

2.1.1 Material biológico:

Cepa de Enterococcus faecalis ATCC 29212, procedente de

Microbiologics Laboratory, obtenida en el Instituto Nacional

de Salud, Lima- Perú.

2.1.2. Material botánico:

Las vainas de Caesalpinia spinosa “taya” o “tara”, vainas

secas, recolectadas en la distrito de Otuzco. En el laboratorio

se seleccionó las vainas que no tenían daño alguno en su

cubierta; quedando aptas para su procesamiento.

2.2 MÉTODOS Y TÉCNICAS:

2.2.1 Tipo de Investigación: El presente trabajo presenta un diseño

experimental, “in vitro”, prospectivo y transversal.

2.2.2 Muestra: La muestra estará constituida por cepas de

Enterococcus faecalis ATCC 29212. Proveniente del

Microbiologics Laboratorio, adquiridos en el Instituto

Nacional de Salud, Lima- Perú. La cepa se enfrentó a cuatro

concentraciones (10%, 20%, 40% y 60%) del extracto

etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa “Taya”.



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2.3 VARIABLES Y ESCALAS DE MEDICIÓN:

Variable Indicador Tipo Escala

Extracto etanólico de

Caesalpinia spinosa

Variable independiente

Concentración de

Caesalpinia spinosa al

10%, 20%, 40% y

60%.

Cuantitativa Ordinal

Efecto inhibitorio In Vitro

sobre cepas

Enterococcus faecalis.

Variable dependiente

Escala de Duraffourd

Cualitativa Razón

Diámetro de halo

inhibitorio

Unidades Formadoras

de Colonias.

Cuantitativa Ordinal

2.4 Definición de términos operacionales:

Extracto etanólico de vainas Caesalpinia spinosa (Taya): Extracto

cuyo solvente es etanol y que contiene los principios activos de la

planta Caesalpinia spinosa preparado a las concentraciones del 10%,

20%, 40%, 60%.



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Efecto inhibitorio in vitro: Capacidad para detener la reproducción o

muerte de una bacteria. Se determinara cualitativamente según la

escala de Duraffourd y cuantitativamente según CIM.

Escala de Duraffourd: Escala utilizada para determinar

cualitativamente el efecto inhibitorio in vitro, según diámetro de halos

de inhibición

Nula (-), para un diámetro inferior a 8 mm.

Sensibilidad límite (sensible = +) para un diámetro

comprendido entre 8 a 14mm

Medio (muy sensible =++) para un diámetro entre 14 y 20mm

Finalmente para un diámetro superior a 20 mm el

microorganismo es sumamente sensible (+++)

Concentración inhibitoria mínima: Concentración mínima de una

sustancia que impide el crecimiento bacteriano in vitro.Se considera

CIM aquella en la que se presenta un crecimiento < de 30 UFC



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2.5 Diseño Procedimental:

2.5.1. Preparación del inóculo:

Cada cepa se diluyó en Tioglicolato estéril hasta que se obtuvo una

turbidez semejante al tubo 1 del Nefelómetro de Mc Farland, el cual contenía

1 x 108 UFC

2.5.2. Obtención del extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa34:

Se preparó extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Taya),

para lo cual se seguirá el siguiente procedimiento:

Se obtuvieron un kilogramo de vainas secas de “Taya” teniendo en

cuenta su tamaño, color y estado.

A continuación, se pusieron a secar al horno a una temperatura de 40ºC

por un periodo de 36 h. con la finalidad de eliminar de forma eficiente la

humedad.

Luego, se procedió a moler las muestras secas utilizando un mortero,

hasta obtener un pulverizado homogéneo, de esta muestra solo se tomó

50 gr de la muestra molida y se colocaron en un frasco oscuro de vidrio

con 500 mL de etanol comercial de 70º (C2 H5 OH), y fue llevado a

maceración por 10 días.

Después se filtró el macerado utilizando papel Whatman Nº 4 en un

matraz estéril, la solución obtenida fue de 330 ml esta se distribuyó en 3



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vasos de precipitación de 10 ml y en un vaso de 300 ml y se llevó una

estufa a 40º C hasta la evaporación total del alcohol, obteniendo 0.85

gramos de polvo seco de extracto de taya por cada 10 ml de la muestra

después de 12 días de evaporación. El extracto se recibió en viales

estériles.

2.5.4. Estandarización de la solución Stock 35:

Se pesó 0.9693 g de extracto seco en un vial estéril y luego se agregó

0.65 ml. de etanol, para obtener la Solución Stock cuya concentración

final fue del 60 %.

Luego de obtenida la Solución Stock se procedió a preparar las

concentraciones al 10%, 20%, 40% y 60%.

2.5.5. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) in

vitro de Caesalpinia spinosa.

Se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) mediante la

técnica de dilución en tubos, se colocó 0.5 ml de extracto etanólico de

Caesalpinia spinosa al 10%, 20%, 40% y 60% en tubos diferentes, a este

se agregó 0.2 ml de la cepa preparada en Tioglicolato. Se realizó 10

repeticiones por cada concentración y 10 más para el tubo control.

Luego, los 50 tubos de ensayo fueron colocados en la Jarra Has Pack,

incubados en la estufa a 37º C por 24 horas.



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Posteriormente se tomó 0.1 ml. de la dilución de cada uno de los tubos

placas, y se sembró en placas petri que contenían medio de cultivo Mueller

Hinton, se usó el asa de Driglasky para dispersar la muestra, todo el

procedimiento se llevó a cabo dentro del diámetro de 10 cm. de la llama de un

mechero.Dichas placas fueron colocadas dentro de la Jarra Has Pack, llevadas

a la estufa a 37°C por 48 horas.

Finalmente se observó el crecimiento bacteriano y se realizó el conteo de las

Unidades Formadoras de Colonias (UFC).

2.5.6. Determinación del efecto antibacteriano (prueba de

susceptibilidad):

Para la prueba de susceptibilidad, se prepararon 4 diluciones a las

concentraciones del 10%, 20%, 40%, 60% de extracto etanólico de

Caesalpinia spinosa. Dichas diluciones se conservarán a 4 ºC para el estudio

microbiológico en frascos ámbar.

Para esta prueba se utilizó el método de Difusión en Discos. Se prepararon

discos de papel filtro estériles, los cuales fueron cargados con 50 µl de cada

concentración del extracto etanólico.



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Luego con una aguja estéril estos fueron colocados sobre placas petri que

contenían cultivos de Enterococcus faecalis ATCC 29212 en medio Mueller

Hinton. Se hicieron 16 repeticiones por cada concentración

Todo el procedimiento se llevó a cabo dentro del diámetro de 10 cm. de la

llama de un mechero. Posteriormente las placas se incubaron a 37°C en

microanaerobiosis haciendo uso de la Jarra de Has Pack.

La lectura se llevó a cabo a las 24 horas. Se midieron los halos de inhibición

de cada una de las concentraciones, incluyendo el área del disco de papel de

filtro, con un calibrador vernier o pié de rey.

Al hacer la lectura, se clasificó los diámetros de los halos de inhibición

teniendo en cuenta a escala de Duraffourd.36



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3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO E INTERPRETACIÓN DE LA

INFORMACIÓN

Para analizar la información se construyeron cuadros de distribución de

frecuencias de una entrada con sus valores absolutos.

Para establecer si la distribución de los promedios de halos de inhibición

difieren entre si según la concentración del extracto etanólico de taya en la

efectividad antibacteriana tipo cuantitativa, se utilizó la prueba de Análisis de

varianza .En los casos que hubo distribución significativa se aplicó la prueba

de comparaciones múltiples o Prueba de Duncan.

Para establecer si la distribución de los halos de inhibición difieren entre si

según la concentración del extracto etanólico de Taya en la efectividad

antibacteriana tipo cualitativa, se utilizó la prueba Chi cuadrado.

Ambas con una significancia al 5 %.

Con la información recolectada se construyó una base de datos que serán

procesados de manera automatizada con el soporte del paquete estadístico

SPSS - 15.0.



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III. RESULTADOS

En el presente estudio de tipo experimental “in vitro”, cuyo propósito fue de

determinar el efecto inhibitorio del extracto etanólico de vainas de Caesalpinia

spinosa Taya sobre Enterococcus faecalis ATCC29212, y para la cual se utilizaron

4 concentraciones 10%, 20%, 40% y 60%, y un grupo control, se hallaron los

siguientes resultados:

Después de realizada la prueba de susceptibilidad y de haber medido los halos de

inhibición, se clasificó los diámetrosde acuerdo a la escala de Duraffourd38

obteniendo que:

De las 16 repeticiones al 10%, 15 presentaron eficacia límite y 1 efecto

medio. De las 16 repeticiones al 20%, 14 presentaron efecto límite y dos

efecto medio, de las 16 repeticiones al 40% todas presentaron efecto medio ,

y de las 16 repeticiones al 60% 15 presentaron efecto medio y 1 efecto alto en

la inhibición de Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Los promedios de los diámetros de halo de inhibición de crecimiento del

Enterococcus faecalis al 10% fue de 12.9mm, al 20% de 13.5mm, al 40% de

16.16 y al 60% de 17.31

El promedio de unidades formadoras de colonias obtenida a las 4 diferentes

diluciones fueron: al 10% -35 UFC, al 20% -30 UFC promedio, al 40%- 3

UFC promedio, y al 60% -0UFC.



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Tabla No1: Efecto inhibitorio in vitro cualitativo del extracto etanólico de

vainas Caesalpinia spinosa al 10%, 20%, 40% y 60% sobre el crecimiento

del E. faecalis ATCC 29212, según escala de Duraffourd.

CONCENTRACIÓN ESCALAS DE DURAFFOURD

TOTAL

Sensible Muy sensible

10% 15 1 16

20% 14 2 16

40% 0 16 16

60% 0 16 16

TOTAL 29 35 64

Fuente: Datos obtenidos por el grupo investigador, año2011

Sensible = + de 8 - 14mm

Muy sensible = ++ para un diámetro entre 14 y 20mm

En la tabla No 1, se observa el efecto inhibitorio in vitro cualitativamente del

extracto etanólico de vainas Caesalpinia spinosa al 10%, 20%, 40% y 60% sobre el

crecimiento del Enterococcus faecalis ATCC 29212, según las pautas de Duraffourd,



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Tabla No2: Efecto inhibitorio in vitro cuantitativo del extracto etanólico de

vainas Caesalpinia spinosa al 10%, 20%, 40% y 60% sobre el crecimiento del

E. faecalis ATCC 29212, según diámetro de halo inhibitorio y mediante el

Análisis de Varianza


En la tabla Nº 2, se muestra el análisis de varianza, y se obtuvo como resultado

que existe una diferencia estadística altamente significativa del diámetro del

halo de inhibición del crecimiento del Enterococcus faecalis de acuerdo a la

concentración del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa aplicada.

Fuente de variación Suma de cuadrados Gl Cuadrados medios F P

Tratamiento 208.074 3 69.358 26.732 0.000

Error 155.672 60 2.595

Total 363.743 63



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vainas Caesalpinia spinosa al 10%, 20%, 40% y 60% sobre el crecimiento

del E. faecalis ATCC 29212, según diámetro de halo inhibitorio y mediante

la Prueba de Duncan

Concentraciones ni Grupos alfa=0.05

1 2 3

10% 16 12.94

20% 16 13.56

40% 16 16.16

60% 16 17.31


En la tabla Nº 3, se muestran los promedios del diámetro de halo de inhibición

de crecimiento del Enterococcus faecalis después de aplicar la técnica de

difusión en discos. Se realizó la Prueba de Duncan, que comparó cada uno de los

promedios de los halos, demostrando que no existe diferencia significativa entre

los diámetros promedios de los halos inhibitorios del extracto etanólico al 10 % y

al 20%; pero existe diferencia significativa entre el este grupo homogéneo y el de

40% y 60%. También existe diferencia significativa entre el tamaño de halo

inhibitorio formado al 40% de concentración de extracto etanólico de C.

spinosa y el grupo del 60 % (p=0.05).



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Gráfico Nº 1: Efecto inhibitorio in vitro cuantitativo del extracto etanólico de

vainas de Caesalpinia spinosa a diferentes concentraciones sobre E. faecalis

ATCC29212


En el Gráfico Nº 1, se aprecia que conforme aumenta la concentración del

extracto etanólico de Caesalpinia spinosa aumenta el diámetro de halo de

inhibición, es decir aumenta el efecto inhibitorio



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vainas Caesalpinia spinosa al 10%, 20%, 40% y 60% sobre el crecimiento del

E. faecalis ATCC 29212, según UFC y mediante el Análisis de Varianza.

Fuente: Datos obtenidos por el grupo investigador, año 2011

En la tabla Nº 4, se muestra el análisis de varianza, el cual determina que existe una

diferencia estadística altamente significativa en el crecimiento de UFC de

Enterococcus faecalis de acuerdo a la concentración del extracto etanólico de

Caesalpinia spinosa aplicada. (p = 0.000).

Fuente de variación Suma de cuadrados Gl Cuadrados medios F P

Tratamiento 9,778.100 3 3,259.367 1,783.240 0.000

Error 65.800 36 1.828

Total 9,843.900 39



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vainas Caesalpinia spinosa al 10%, 20%, 40% y 60% sobre el crecimiento de

E. faecalis ATCC 29212, según UFC y mediante la Prueba de Duncan

Fuente: Datos obtenidos por el grupo investigador, año 2011

En la tabla Nº 5, se muestran los promedios de UFC de Enterococcus faecalis

después de la aplicación del extracto etanólico de C. spinosa a diferentes

concentraciones, se realizó la Prueba de significancia de Duncan.



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Gráfico Nº 2: Efecto inhibitorio in vitro cuantitativo de UFC de

Enterococcus faecalis ATCC29212 en función a cada una de las cuatro

concentraciones del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa.

Fuente: Datos obtenidos por el grupo investigador

En el gráfico Nº 2, se muestra que conforme se aumenta la concentración del

extracto etanólico de Caesalpinia spinosa el número de unidades formadoras de

colonias promedio de Enterococcus faecalis disminuye, es decir el efecto

inhibitorio aumenta.



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Tabla No 6: Determinación de la concentración mínima inhibitoria del

extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa sobre cepas de

Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Fuente: Datos obtenidos por el grupo investigador, año 2011.

En la tabla Nº 6 se muestra las UFC registradas en las 10 repeticiones por cada

concentración de extracto etanólico de Caesalpinia spinosa y el promedio de estas

por concentración. La dilución al 40% presentó menos de 30 UFC constituyendo la

CMI mientras que en la del 60% no se encontró UFC.

CONCENTRACION

DE EXTRACTO

ETANÓLICO DE

Caesalpinia spinosa

UNIDADES FORMADORES DE COLONIAS DE

Enterococcus faecalis

NÚMERO DE REPETICIONES

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

PROMEDIO

CONTROL

109

109

109

109

109

109

109

109

109

109

109 UFC

10%

34

35

34

35

35

35

36

36

35

35

35 UFC

20%

30

29

30

29

32

28

30

32

30

31

30 UFC

40%

4

3

0

0

6

5

5

4

0

3

3 UFC

60%

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0 UFC



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IV. DISCUSIÓN

El presente estudio de tipo experimental, demostró el efecto inhibitorio in

vitro del extracto etanólico de Caesalpinia spinosa a cuatro diferentes

concentraciones 10%, 20%, 40% y 60% frente a cepas de Enterococcus faecalis; si

bien existe un trabajo que demuestra la actividad de Caesalpinia spinosa frente a

Enterococcus faecalis, donde se menciona que la CMI fue de 0.5 mg / ml 33, no se

detalla cómo fue determinado este, ni el parámetro de concentraciones a partir de las

cuales se determinó este valor.

Es así que para determinar las concentraciones finales a aplicar, se realizó una

prueba piloto en donde se incluye la CMI mencionada anteriormente como

referencia, elaborando así concentraciones al 0.25mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.75 mg/ml y 1

mg/ml y comparando su efecto con la del extracto etanólico al 40% de concentración,

mediante la prueba de susceptibilidad se determinó después de 24 horas que la única

concentración que presentó efecto inhibitorio fue la concentración de extracto

etanólico al 40%.

En función a este resultado se utilizaron concentraciones de extracto

etanólico de Caesalpinia spinosa proporcionales cercanas mayores y menores, tales

como 10 %, 20%, 40% y 60%. Determinando a partir de estas concentraciones

finales la CMI.

La concentración mínima inhibitoria obtenida fue la de 40 %, ya que el

número de UFC a partir de esta concentración fue menor a 30.38 Sin embargo todas



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las concentraciones tuvieron efecto inhibitorio comparado con el control en donde se

observó un crecimiento de UFC de aproximadamente 109 UFC/ml. (Tabla 5)

Los promedios de diámetros de halos de inhibición obtenidos después de

aplicada la prueba de susceptibilidad de difusión en discos, demostró que existe

diferencia altamente significativa del efecto inhibitorio entre los grupos formados.

(Tabla 2), así mismo al comparar el efecto inhibitorio de las 4 concentraciones a

través de la prueba de Duncan obtenemos que no existe diferencia significativa entre

el efecto inhibitorio producido al 10% y 20 % de concentración del extracto etanólico

de Caesalpinia spinosa. (Tabla 3)

Sin embargo al aplicar la prueba de Duncan para comparar el crecimiento de

UFC a las diluciones de 10%,20%,30% y 40% se determinó que cada una de estas

presenta un efecto inhibitorio diferente altamente significativo en el crecimiento de

UFC de Enterococcus faecalis (p=0.05). (Tabla 4).

Malpartida, realizó un estudio experimental donde compara el efecto del

aceite esencial de Minthostachis mollis (muña), Paramonoclorofenol alcanforado y

Gluconato de clorhexidina al 2 % frente a cepas de E. faecalis, en dónde los

diámetros de halo de inhibición oscilaron entre 13.8 y 15.02mm, 17.6 y 19.42mm y

23.41 y 23.64 respectivamente.38

En el presente estudio al aplicar el extracto etanólico de Caesalpinia spinosa

se obtuvo de halos de inhibición promedios entre 12.9 y 17.3mm (Tabla 3), lo que



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nos estaría indicando que este extracto etanólico presenta un efecto inhibitorio mayor

al del aceite esencial de Minthostathis mollis y un efecto similar al del

Paramonoclorofenol alcanforado, 19

Azaña , en el 2010, realizó otro estudio en donde determina efectividad antibacteriana

in vitro del aceite esencial de Minthostachys mollis griseb (muña) sobre bacterias

prevalentes en patologías periapicales crónicas de origen endodóntico, entre ellas el

E. faecalis; en el que se aplicó la prueba de sensibilidad o susceptibilidad bacteriana

y en donde el aceite esencial de muña al 100 % presentó un promedio de diámetro

del halo inhibitorio de 9 mm , al 50% presentó halo promedio de 7.0 mm y al 25% un

halo inhibitorio promedio de 5 mm , el paramonoclorofenol que fue un Control + un

promedio de halo inhibitorio de 12mm.

Sin embargo los promedios de halos inhibitorios obtenidos al aplicar el extracto

etanólico de Taya sobre E. faecalis fueron de 12.9 mm al 10%, 13.6mm al 20%,

16.1mm al 40% y de 17.3mm al 60% (tabla3); promedios mayores a los formados por

el aceite esencial de muña y al formado por el paramonoclorofenol.

Así mismo al comparar cualitativamente los resultados, según la escala de

DURAFFOURD el esencial de muña al 100% causó sensibilidad límite sobre E.

faecalis; el extracto etanólico de Caesalpinia spinosa causó sensibilidad límite al

10% y 20%, pero al aumentar la concentración causó sensibilidad media y alta

sobre las cepas de E. faecalis. (TABLA 1)

Estos resultados podrían deberse a que son especies vegetales diferentes y

tienen un perfil fitoquímico distinto; así también, a que la obtención de principios



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activos se llevó a cabo bajo procesos distintos. El mayor efecto inhibitorio de la

Caesalpinia spinosa podría deberse a que al utilizar un solvente orgánico (etanol) se

preserva mejor los compuestos biológicamente activos.25

Así también, estudios hasta ahora realizados demuestran que la “taya” contiene

taninos, flavonoides, y gomas, de allí su efecto antimicrobicida27. La vaina posee la

mayor concentración de taninos que oscila entre 40% y 60%. Las vainas de

Caesalpinia spinosa contienen hasta 25 % de ácido gálico, que es uno de los mayores

constituyentes de los taninos.26

Probablemente los taninos serían los fitoconstituyentes con mayor propiedad

antibacteriana, al precipitar las proteínas (enzimas), implicadas en las diversas rutas

microbianas26.

Lock de Ugaz37, en su investigación demuestra que los fenoles y flavonoides,

constituyentes también de Caesalpinia spinosa, tienen propiedades antiinflamatorias,

antibacterianas, y antifúngicas, cuya acción provoca lesiones en la membrana

citoplasmática, ocasionando una disfunción en la composición interna de las células

bacterianas.



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V. CONCLUSIONES

1. El extracto etanólico de Caesalpinia spinosa (Taya) presenta efecto

inhibitorio in vitro sobre cepas de Enterococcus faecalis ATCC 29212 a las

24 horas de su aplicación.

2. El extracto etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa (Taya) presenta

efecto inhibitorio in vitro cualitativo límite para las concentraciones del 10%

y 20% y efecto inhibitorio medio para las concentraciones del 40% y 60% ,

sobre cepas de Enterococcus faecalis ATCC 29212 ,según la escala de

Duraffourd.

3. El efecto inhibitorio in vitro cuantitativo del extracto etanólico de vainas de

Caesalpinia spinosa sobre el E. faecalis ATCC29212 a las concentraciones

de 10%, 20%, 30% Y 60% fue directamente proporcional al diámetro de los

halos de inhibición, y a la formación de UFC.

4. La concentración inhibitoria mínima in vitro fue de 40 % para el extracto

etanólico de vainas de Caesalpinia spinosa frente a las cepas de

Enterococcus faecalis ATCC 29212.



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VI. RECOMENDACIONES

1. Realizar estudios comparativos in vitro del efecto del extracto etanólico de

Caesalpinia spinosa con medicamentos intraconducto .

2. Ejecutar estudios experimentales in vitro con Caesalpinia spinosa frente a

patógenos de la cavidad bucal, para ampliar el espectro de actividad

antimicrobiana de esta.

3. Obtener otros tipos de extractos de Caesalpinia spinosa para comparar con el

extracto etanólico, y determinar la eficacia antibacteriana.

4. Realizar pruebas in vivo para valorar la efectividad y la toxicidad que pueden

proporcionar los componentes activos de Caesalpinia spinosa, así como la

dosis terapéutica y la concentración óptima para ser utilizado como

medicamento intraconducto en tratamientos endodónticos.



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39. Malpartida F. Efecto inhibidor del aceite esencial de Minthostachysmollis

en comparación al paramonoclorofenol alcanforado y gluconato de

clorhexidina al 2 % frente a cepas de Enterococcus faecalis. Rev. del COP

de Región Lima. Setiembre 2010; 15 (32): 9-12.

40. Azaña I. Efectividad antibacteriana in vitro del aceite esencial de

Minthostachys mollis griseb (muña) sobre bacterias prevalentes en

patologías periapicales crónicas de origen endodóntico [Tesis para optar el

título de cirujano dentista].2010. Facultad de odontología. Universidad

Nacional Mayor de San Marcos



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ANEXOS



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Tabla Nº 1: Efecto inhibitorio in vitro del extracto etanólico de vainas de

Caesalpinia spinosa (Taya) sobre cepas de Enterococcus faecalis ATCC 29212,

según el método de difusión en discos.

DIÁMETRO DEL HALO DE INHIBICIÓN (mm)

N/C

CONCENTRACIONES DE EXTRACTO

ETANÓLICO DE Caesalpinia spinosa

10% 20% 40% 60%

T5

Control

F3 1 16 15 15 18 0

2 14 14 15 19 0

3 13.5 13.5 15 19 0

4 13 13.5 16 19 0

5 13 13 15.5 20 0

6 13 13 15 20 0

7 13 13 15.5 20 0

8 11.5 12.5 16 21.5 0

9 14 14.5 16 13 0

10 13.5 14 15 14 0

11 13 14 19 14 0

12 13 14 17 16 0

13 12 13.5 17.5 16 0

14 12 13.5 17 16 0

15 11.5 13 18 14 0

16 11 13 16 17.5 0

Prom

(mm.) 12.9 13.6 16.1 17.3 0




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SELECCIÓN Y PROCESAMIENTO DE Caesalpinia spinosa TAYA

REALIZADO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE LA

FACULTAD DE MEDICINA UNT



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Secado y selección de Caesalpinia spinosa

Vainas de Caesalpinia spinosa Taya seleccionada- Material estéril necesario para

procesamiento



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Trituración de vainas de Caesalpinia spinosa

Producto obtenido de la trituración Pesado de polvo 50 gr como

de vainas de Caesalpinia spinosa indica el proyecto



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Aplicación de 500 ml de alcohol de 70º a los 50gr de polvo de Taya contenido en

botella ámbar; la solución obtenida estéril se dejó macerar por 10 días en un lugar

oscuro y a temperatura ambiente.

Filtrado después de 10 días de maceración



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Obtención de 330 ml de macerado de Caesalpinia spinosa, este se colocó en la estufa

a 37 º c para la evaporación de alcohol .

Después de 12 días de evaporación, se obtuvo el extracto

etanólico de Caesalpinia spinosa. Obteniendo 62 ml al 40 % de

concentración y 2.5 gr de extracto al 100 % de concentración

REALIZACIÓN DE PRUEBA PILOTO



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Se tomaron microlitros del extracto obtenido y se disolvieron en agua destilada hasta

llegar a las 4 concentraciones requeridas.

Se obtuvieron las 4

concentraciones de extracto

etanólico de vainas

Caesalpinia spinosa 0.25mg/ml,

0.5 mg/ml, 0.75mg/ml, 1 mg/ml

Se aplicaron las 4 concentraciones más un control que fue el solvente (agua destilada)

y en el centro un papel filtro con extracto etanólico al 40 % se hicieron dos

repeticiones



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Después de 24 horas se haya suceptibilidad del Enteroccocus faecalis al extracto

etanólico de taya al 40 % de concentración. Obteniendo halo de inhibición promedio

de 13.5.

A partir de estos resultados se decide obtener nuevas concentraciones 40%, 20 %, 10

%,y del extracto al 100% en polvo seco se obtuvo la concentración al 60%



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Obtención de 4 concentraciones concentraciones finales

REALIZACIÓN DE PRUEBA DE SUCEPTIBILIDAD



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Tubos conteniendo Agar TSA jóvenes de Enterococos faecalis

Preparación de inóculo standarizado,comparando con tubo de mackfarland

Sembrado de cepas de Enterococcus

faecalis en Placas petri conteniendo Agar

sangre Muller Hinton

Discos de papel filtro embebidos en las 4 concentraciones de extracto etanólico de

Caesalpinia spinosa



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Se

utilizaron 10 placas petri ,16 repeticiones por

concentración, Colocación de 8 papeles filtro por placa petri. Incubación por 24 horas

en jarra Has Pack a 37ºC

Lectura de halo inhibitorio después de 24horas de incubación.

SUSCEPTIBILIDAD AL 10 %



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SUSCEPTIBILIDAD EN CONTROL



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DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA

TÉCNICA DE DILUCIÓN DE TUBOS

Tubos conteniendo extracto extanólico de Caesalpinia spinosa (las concentración del

extracto disminuyen de izq. a der.), y tubo control todos presentan inóculo de

Enterococcus faecalis. Se incubó por 24 horas a 37 0 C



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Sembrado de cada uno de los inóculos Dispersión con Asa de

Driglasky

RESULTADOS DE CMI

Todas las concentraciones inhibieron el crecimiento de colonias, pero la inhibición

total de UFC se dio apartir del 40% determinándose esta como la CMI, después de 48

horas a 370c

UFC AL 10% DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE Caesalpinia spinosa



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UFC EN PLACA CONTROL



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ANEXO 02

EVALUACIÓN DE LA TESIS

El Jurado deberá:

a. Consignar las observaciones u objeciones pertinentes

relacionadas a los siguientes ítems.

b. Anotar el calificativo final.

c. Firmar los tres miembros del jurado.

TESIS:………………………………………………............................………

……………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………

………

1. DE LAS GENERALIDADES

El Título: ……………………………………………………………………….

………………………………………………………………………………….

Tipo de Investigación: ………………………………………………………. .…………………………………………………………………………………. 2. DEL PLAN DE INVESTIGACIÓN

Antecedentes: ……………………………………………………………….. Justificación: …………………………………………………………………. Problema:…………………………………………………………………….. …………………………………………………………………………………. Objetivos: ……………………………………………………………………. Hipótesis: ……………………………………………………………………. Diseño de Contrastación:…………………………………………………… Tamaño Muestral:……………………………………………………………



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Análisis Estadístico: …………………………………………………………

3. RESULTADOS:……………………………………………………………

….

4. DISCUSIÓN:

………………………………………………………………….

5. CONSLUSIONES:

……………………………………………………………

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

……………………………………….

………………………………………………………………………………….

7. RESUMEN:

……………………………………………………………………

………………………………………………………………………………….

8. RELEVANCIA DE LA INVESTIGACIÓN:

………………………………….

………………………………………………………………………………….

9. ORIGINALIDAD:

……………………………………………………………...

10. SUSTENTACIÓN:

10.1Formalidad:

………………………………………………………...

10.2Exposición:………………………………………………………

….



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10.3Conocimiento del Tema:

………………………………………….

CALIFICACIÓN

(Promedio de las 03 notas del jurado)

JURADO Nombre Código Firma

Presidente: Dr. ………………………….. …………………

……………….

Grado Académico: ………………………………………………

Secretario: Dr. ………………………….. …………………

……………….


Miembro: Dr. …………………………… …………………

……………….


ANEXO 03

RESPUESTAS DEL TESISTA A OBSERVACIONES DEL JURADO

El Tesista deberá responder en forma concreta a las observaciones del

jurado a manuscrito en el espacio correspondiente:

a. Fundamentando su discrepancia.

b. Si está de acuerdo con la observación registrada.

c. Firmar.

TESIS: …………………………………………………………........................... ………………………………………………………………………………………



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……………………………………………………………………………………… 1. DE LAS GENERALIDADES

El Título: ……………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… Tipo de Investigación: ……………………………………………………… …………………………………………………………………………………. 2. DEL PLAN DE INVESTIGACIÓN

Antecedentes: ……………………………………………………………….. Justificación: …………………………………………………………………. Problema:…………………………………………………………………….. …………………………………………………………………………………. Objetivos: …………………………………………………………………….. Hipótesis: …………………………………………………………………….. Diseño de Contrastación:…………………………………………………… Tamaño Muestral:…………………………………………………………… Análisis Estadístico: …………………………………………………………

3. RESULTADOS:……………………………………………………………

….

4. DISCUSIÓN:

………………………………………………………………….

5. CONSLUSIONES:

……………………………………………………………



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6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

……………………………………….

………………………………………………………………………………….

7. RESUMEN:

……………………………………………………………………

………………………………………………………………………………….

8. RELEVANCIA DE LA INVESTIGACIÓN:

………………………………….

………………………………………………………………………………….

9. ORIGINALIDAD:

……………………………………………………………...

10. SUSTENTACIÓN:

10.1Formalidad:……………………………………………………………

…

10.2Exposición:

………………………………………………………………

10.3Conocimiento del Tema:

……………………………………………….



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………………………………………

Nombre

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efecto inhibitorio

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