8/2/2019 Effect of Yeast Hulls on Stuck and Sluggish Wine Ferment at Ions

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A P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , J u n e 1 9 8 9 , p . 1 5 6 0 - 1 5 6 4 V o l . 5 5 , N o . 60 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 9 / 0 6 1 5 6 0 - 0 5 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t D 1 9 8 9 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

E f f e c t o f Y e a s t H u l l s o n S t u c k a n d S l u g g i s h W i n e F e r m e n t a t i o n s :I m p o r t a n c e o f t h e L i p i d ComponentEEVA MUNOZ A N D W. M. INGLEDEW*

D e p a r t m e n t o f A p p l i e d M i cr o b i o l o g y a n d Food S c i e n c e , U n i v e r s i t y o f S a s k a t c h e w a n , S a s k a t o o n ,S a s k a t c h e w a n S7N O W O , CanadaR e c e i v e d 2 8 D e c e m b e r 1 9 8 8 / A c c e p t e d 2 M a r c h 1 9 8 9

T h e e f f e c t o f y e a s t h u l l s ( y e a s t g h o s t s ) o n s l u g g i s h o r s t u c k w h i t e w i n e f e r m e n t a t i o n s w a s s t u d i e d . T h ee n h a n c i n g e f f e c t o n y e a s t g r o w t h a n d f e r m e n t a t i o n r a t e d i s p l a y e d b y t h e h u l l s w a s s h o w n t o b e s i m i l a r t o t h ee f f e c t p r o v i d e d b y l i p i d e x t r a c t f r o m t h e s a m e h u l l s . U n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s a n d s t e r o l s w e r e i n c o r p o r a t e d i n t ot h e y e a s t f r o m l i p i d e x t r a c t s d u r i n g f e r m e n t a t i o n c a r r i e d o u t u n d e r o x y g e n - l i m i t e d c o n d i t i o n s . A d s o r p t i o n o ft o x i c m e d i u m - c h a i n f a t t y a c i d ( d e c a n o i c a c i d ) o n t o t h e y e a s t h u l l s t o o k p l a c e t h r o u g h a d i a l y s i s m e m b r a n e .H o w e v e r , w h e n t h e h u l l s w e r e p l a c e d i n s i d e a d i a l y s i s b a g , t h e i n c r e a s e i n y e a s t g r o w t h a n d f e r m e n t a t i o n r a t es e e n w h e n f r e e l y s u s p e n d e d h u l l s w e r e u s e d d i d n o t o c c u r . A c c o r d i n g l y , t h e e f f e c t o f y e a s t h u l l s i n p r e v e n t i n gs t u c k f e r m e n t a t i o n s c a n n o t b e a t t r i b u t e d o n l y t o t h e a d s o r p t i o n a n d c o n s e q u e n t r e m o v a l o f m e d i u m - c h a i n f a t t ya c i d s f r o m t h e j u i c e .W i n e f e r m e n t a t i o n s a r e n o r m a l l y c o m p l e t e d b y t h e m e t a -b o l i c a c t i v i t y o f r e s t i n g ( n o n g r o w i n g ) y e a s t c e l l s ( 1 9 ) . J u i c e so f t e n f e r m e n t f o r l o n g e r t h a n 3 0 d a y s , a n d o c c a s i o n a l l y t h ef e r m e n t a t i o n s b e c o m e s t u c k . S t u c k f e r m e n t a t i o n s a r e t h em o s t s e r i o u s , y e t o n e o f t h e m o s t c ommon, p r o b l e m s o f t h ew i n e i n d u s t r y ( 2 1 ) . I n a s t uc k f e r r n e n t a t i o n , t h e a v a i l a b l es u g a r i n j u i c e i s n o t t o t a l l y f e r m e n t e d a n d r e s i d u a l s u g a rr e m a i n s i n t h e f i n i s h e d p r o d u c t . A l t h o u g h h i g h o s m o t i cp r e s s u r e a n d t h e p r e s e n c e o f i n h i b i t o r y s u b s t a n c e s i n c l u d i n gp e s t i c i d e s f r o m g r a p e s h a v e b e e n i m p l i c a t e d , t h e m a i nr e a s o n f o r s t u c k f e r m e n t a t i o n i s p r e m a t u r e d e a t h o f r e s t i n gc e l l s a s a r e s u l t o f i n t o l e r a n c e t o e t h a n o l ( 8 ) ; t h i s p h e n o m e -n o n c a n b e p r e v e nt e d b y t h e a d d i t i o n o f n u t r i t i o n a l s u p p l e -m e n t s t o t h e j u i c e ( 1 4 , 1 9 ) .To a l l e v i a t e s t u c k o r s l u g g i s h ( e x c e s s i v e l y s l o w ) f e r m e n -

t a t i o n s , o x y g e n o r s t e r o l a n d u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ( 1 , 2 ) ,c a l l e d s u r v i v a l f a c t o r s ( 1 4 , 1 9 , 2 7 ) , o r a s s i m i l a b l e n i t r o g e n i nt h e f o r m o f am m o niu m s a l t s o r a m i n o a c i d s ( 2 4 ) , o r b o t hs u r v i v a l f a c t o r s a n d a s s i m i l a b l e n i t r o g e n ( 8 , 9 , 1 4 ) , h a v e b e e np r o v i d e d e a r l y i n f e r m e n t a t i o n t o a l l o w t h e p r o d u c t i o n o f as u f f i c i e n t n u m b e r o f ne w c e l l s a n d t o p r e v e n t e x i s t i n g c e l l sf r o m d y i n g . S u c h w o r k h a s l e d e n o l o g i s t s t o e x a m i n e t h ea n a e r o b i c c o n d i t i o n s o f w i n e m a k i n g , t h e p r a c t i c e o f m u i s tc l a r i f i c a t i o n p r i o r t o f e r m e n t a t i o n , t h e u s e o f h i g h e r i n o c u i -l u m l e v e l s , a n d t h e u s e o f a c t i v e d r y y e a s t ( h i g h e r s t e r o ll e v e l s ) ( 1 4 , 1 6 ) . L i m i t a t i o n o f f r e e a m i n o n i t r o g e n w a s s h o w nt o b e s e r i o u s i n w o r t s ( 9 ) a n d i n j u i c e s ( 1 4 ) i n w h i c h t h ef e r m e n t a t i o n s t i c k s o r b e c o m e s s l u g g i s h .Y e a s t g h o s t s o r y e a s t h u l l s , t h e c e l l w a l l m a t e r i d i l r e m a t i n -i n g a f t e r y e a s t e x t r a c t p r e p a r a t i o n , h a v e b e e n s u g g e s t e d a ss u p p l e m e n t s t o j u i c e t o p r e v e n t s t u c k f e r m e n t a t i o n s ( 2 7 ) .T h e a c t i o n o f t h e h u l l s w a s p o s t u l a t e d t o b e d u e t o p h y s i c a la d s o r p t i o n a n d r e m o v a l o f t o x i c f e r m e n t a t i o n s i d e p r o d u c t s ,t h e m e d i u m - c h a i n f a t t y a ci ds h e xa n o i c , o c t a n o i c , a n d d e -c a n o i c a c i d s ( 1 7 ) . T h e s e f a t t y a c i d s a r e f o r m e d v i a a s y n -t h e t i c r o u t e i n S a c c h a r o m y c e s y e a s t s ( 2 8 ) . I n t h e p r e s e n c e o fe t h a n o l t h ey c o m p l et e l y i n h i b i t y e a s t g r o w t h a t c o n c e n t r a -t i o n s f o u n d i n w i n e s ( 1 8 ) . More r e c e n t l y , L ar u e a n d L a f o n -L a f o u r c a d e ( 2 1 ) o b s e r v e d t h e e f f e c t o f a e r a t i o n i n r e d u c i n gt h e c o n c e n t r a t i o n o f m e d i u m - c h a i n f a t t y a c i d s i n w i n e , a s

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

h a d b e e n p r e v i o u s l y o b s e r v e d i n b e e r f e r m en t a t i o ns ( 6 , 2 8 ) .T h e e f f e c t o f o x y g e n w a s s e e n i n t h e c h a i n e l o n g a t i o n a n d i nt h e i n c r e a s e i n t h e d e g r e e o f u n s at u r at i o n i n membrane l i p i df a t t y a c i d s ( 6 ) . C o r r e l a t i o n h a s a l s o b e e n s h o w n b e t w e e nf a t t y a c i d c o n c e n t r a t i o n s i n b e e r a n d i n c e l l membranes ( 2 8 ) .I n a r e c e n t p a p e r , Munoz a n d I n g l e d e w ( 2 5 ) p r e s e n t e dr e s u l t s i n d i c a t i n g t h a t a d s o r p t i o n o f t o x i c b y - p r o d u c t s wasn o t t h e o n l y e n h a n c i n g e f f e c t d i s p l a y e d b y y e a s t h u l l s i n as l u g g i s h w i n e f e r m e n t a t i o n . U n d e r o x y g e n - l i m i t e d c o n d i -t i o n s ( s i m u l a t i n g a c t u a l c o n d i t i o n s i n w i n e m a k i n g ) , t h ee f f e c t o f y e a s t g h o s t s was t h e s a m e a s t h e e f f e c t o f e r g o s t e r o la n d Tween 8 0 ( s o u r c e o f o l e i c a c i d ) s u p p l e m e n t s . B o t h a c t e da s o x y g e n s u b s t i t u t e s , a l l o w i n g s t e r o l a n d u n s a t u r a t e d f a t t ya c i d p r o d u c t i o n f o r y e a s t c e l l m e m b r a n e s y n t h e s i s . I n t h ep r e s e n t w o r k , f e r m e n t a t i o n e x p e r i m e n t s a n d y e a s t l i p i da n a l y s i s b y g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a n d c h e m i c a l m e t h -o ds w e r e c o n d u c t e d t o v e r i f y t h e i m p o r t a n c e o f y e a s t h u l ll i p i d s i n t h e s t i m u l a t i o n o f f e r m e n t a t i o n a n d p r e v e n t i o n o fs t u c k a n d s l u g g i s t f e r m e n t a t i o n s . A d d i t i o n o f d e c a n o i c a c i dt o u n i n o c u l a t e d m e d i a w a s d o n e t o r e a s s e s s f a t t y a c i da 1 d s o r p t i o n a s t h e m e c h a i n i s m o f y e a s t h u l l a c t i o n .

MATI A I I , S AND M E TH ODSF e r m en t a t i o ns . l : e r me n ta t i o ns w e r e c a r r i e d o u t w i t h r e -c o n s t i t u t e d j u i c e . l o 2 . 8 l i t e r s o f j u i c e c o n c e n t r a t e ( S u n C a lP i n o t C h a r d o n n . a y . N i a g a r a V i n e P r o d u c t s l A t d . . S t . C a t h e -r i n e s , O n t a k r i o . C a n a d a ) 1 5 . 5 l i t e r s o f s t e r i l i z e d w a i t e r , 1 . 7 4 k go f s u c r o s e . 4 2 g o f a c i d b l e n d ( m i x t u r e o f t a r t a r i c . m a l i c , a n dc i t r i c a c i d s : H a r v e s t B r e w i n g C o , S a s k a l t o o n . S a s k a t c h -e w a n , C a n a i d a . a t n d 3 g o f g r a p e t a n n i n w e r e a i d d e d . Th e

r e s u l t i n g j u i c e W a l s s t e r i l i z e d w i t h 0 . 1 m l o t d i e t h y l p y r o c a r -b o n a t e ( S i g m a i C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s . M o . ) p e r l i t e r .A c t i v e d r y R e d S t a r M o n t r a c h e t y e a s t was r e h y d r a t e d i ns t e r i l e 0 . 1 % , p e p t o n e - w a t e r a t 3 9 C f o r 2 0 m i n , a n d t h e j u i c ew a s t h e n i n o c u l a t e d a t d i f f e r e n t l e v e l s d e p e n di n g o n t h ee x p e r i m e n t . A l l f e r m e n t a t i o n s w e r e c o n d u c t e d a t 1 4 C i n1 - l i t e r o r 5 0 0 - m l f e r m e n t o r s ( C e l s t i r ; W h e a t o n I n d u s t r i e s ,M i l l v i l l e , N . J . ) w i t h c o n s t a n t s t i r r i n g a t 9 0 rpm t o e n s u r e t h a th o m o g e n e o u s y e a s t a n d j u i c e s a m p l e s c o u l d b e o b t a i n e d .T h e 1 - l i t e r f e r m e n t o r s c o nt a i n ed 1 l i t e r o f j u i c e , a n d t h eh e a d s p a c e v o l u m e s w e r e 7 0 0 m l ; t h e 5 0 0 - m l f e r m e n t o r sc o n t a i n e d 5 0 0 m l o f j u i c e , a n d t h e h e a d s p a c e v o l u m e s w e r e1 5 6 0

8/2/2019 Effect of Yeast Hulls on Stuck and Sluggish Wine Ferment at Ions

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YEAST HULLS AND WINE FERMENTATION 1 5 6 12 4 0 m l . Th e j u i c e s w e r e s a t u r a t e d w i t h a i r p r i o r t o i n o c u l a -t i o n . A f t e r i n o c u l a t i o n , a constant f l o w o f n i t r o g e n gas a t 1 0m l / m i n w a s i n t r o d u c e d t h r o u g h t h e h e a d s p a c e . A yeast h u l lp r e p a r a t i o n o b t a i n e d f r o m Fould S p r i n g e r , Maisons A l f o r t ,F r a n c e , was u s e d i n t h e e x p e r i m e n t s . E i t h e r y e as t h u l l s wered i r e c t l y added i n t h e f e r m e n t o r a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 g / l i t e ro r 1 g o f h u l l s , wa s s u s p e n d e d i n 2 0 m l o f t h e j u i c e and p uti n s i d e a d i a l y s i s b a g t o p h y s i c a l l y s e p a r a t e t h e h u l l s from t h ef e r m e n t i n g y e a s t . S p e c t r a p o r ( S p e c t r u m Medical I n d u s t r i e s ,I n c . , L o s A n g e l e s C a l i f . ) d i a l y s i s m e m b r a n es w i t h a m o l e c -u l a r w e i g h t c u to f f o f 6 , 0 0 0 t o 8 , 0 0 0 ( 4 0 0 mml o n g , 2 3 mmw i d e ) o r 5 0 , 0 0 0 ( 8 0 0 mm l o n g , 1 2 mm w i d e ) were used f o rt h i s p u r p o s e .L i p i d e x t r a c t f r o m y e a s t h u l l s was p r e p a r e d by e x t r a c t i n g1 g o f y e a s t h u l l s w i t h 3 0 m l o f c h l o r o f o r m - m e t h a n o l - 5 Mh y d r o c h l o r i c a c i d ( 5 : 6 : 1 , v o l / v o l ) f o r 2 0 m in a t room t e m p e r -a t u r e ( 1 5 ) . A f t e r a d d i t i o n o f 6 ml o f w a t e r an d s h a k i n g , t h eo r g a n i c l a y e r wa s c o l l e c t e d a n d d r i e d u n d e r n i t r o g e n gas.T h e e x t r a c t s were r e d i s s o l v e d i n 5 m l o f warm 95% e t h a n o la n d i m m e d i a t e l y a d d e d t o t h e f e r m e n t o r . A 5 - m l p o r t i o n o fe t h a n o l was a d d e d t o t h e c o nt r o l f e r m e n t o r s . E x t r a c t i o n wasp e r f o r m e d i m m e d i a t e l y b e f o r e t h e s t a r t o f t h e f e r m e n t a t i o n .A d s o r p t i o n e x p e r i m e n t . D e c a n o i c a c i d a d s o r p t i o n o n t oy e a s t h u l l s wa s s t u d i e d b y u s i n g a s t e r i l e j u i c e - e t h a n o lm i x t u r e ( 1 2 B r i x , 5% e t h a n o l ) . Y e a s t h u l l s ( 1 g ) were sus-p e n d e d i n 2 0 m l o f t h e j u i c e a n d put i n s i d e a d i a l y s i s b a g( S p e c t r a p o r membrane; m o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f , 5 0 , 0 0 0 ; 8 0 0mm l o n g , 1 2 mm i n d i a m e t e r ) . The sa c was p l a c e d i n a 2 5 0 - m lE r l e n m e y e r f l a s k c o n t a i n i n g 5 0 m l o f t h e j u i c e w i t h 1 1 8 mg o fd e c a n o i c a c i d ( S i g m a ) pe r l i t e r . Th e Erlenmeyer f l a s k s werec o v e r e d w i t h a d o u b l e l a y e r o f P a r a f i l m a n d s h a k e n i n aw a t e r b a t h s h a k e r (Aquatherm; New Brunswick S c i e n t i f i cC o . , I n c . , E d i s o n , N . J . ) a t 2 0 0 rpm a n d 1 4 C f o r 2 4 h . A f t e rt h e e x p e r i m e n t , t h e volumes o f t h e j u i ce s i n s id e a n d o u t s i d et h e d i a l y s i s b a g were m e a s u r e d , a n d t h e n t h e j u i c e s werea n a l y z e d f o r t h e i r d e c a n o i c a c i d c o n t e n t s . The yeast h u l l sw e r e s e p a r a t e d f r o m t h e j u i c e i ns i d e t h e b a g b y c e n t r i f u g a -t i o n ( 1 0 m i n a t 3 , 0 0 0 x g a n d 4 C ) , e x t r a c t e d w i t h c h l o r o -f o r m - m e t h a n o l - 5 M H C l ( 1 5 ) , a n d t h e n a n a l y z e d f o r t h e i rd e c a n o i c a c i d c o n c e n t r a t i o n . E x p e r i m e n t s were r u n i n d u -p l i c a t e .M e t h o d s o f a n a l y s i s . D u r i n g a l l f e r m e n t a t i o n s , t h e s p e c i f i cg r a v i t i e s o f t h e j u i c e s w e r e a n a l y z e d w i t h a d e n s i t y m e t e r(DMA 4 5 ; Anton P a a r , G r a z , A u s t r i a ) . The r e s u l t s werep r e s e n t e d a s s p e c i f i c g r a v i t y o r c o n v e r t e d t o B r i x b y u s i n gp r e p a r e d c o n v e r s i o n t a b l e s ( 1 ) . V i a b l e yeast c e l l s werec o u n t e d i n t r i p l i c a t e b y t h e membrane f i l t r a t i o n t e c h n i q u ea n d e x p r e s s e d a s m i l l i o n s o f CFU p e r m i l l i l i t e r ( 1 4 ) . Y e a s tc e l l m a s s was e s t i m a t e d g r a v i m e t r i c a l l y a f t e r a b u f f e r w a s h( 1 4 ) .T h e s t e r o l c o n t e n t s o f t h e yeast ( c o l l e c t e d , a f t e r f e r m e n -t a t i o n , b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 0 m i n a t 3 , 0 0 0 x g a n d 4C a n dw a s h e d t h r e e t i m e s w i t h 1 / 1 5 M p o t a s s i u m d i h y d r o g e np h o s p h a t e b u f f e r [pH 4 . 5 ] ) w e r e a n a l y z e d b y t h e L i e b e r m a n -B u c h a r d r e a c t i o n ( 1 0 ) . E r g o s t e r o l was u s e d a s a s t a n d a r d .T o t a l f a t t y a c i d s w e r e e x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m - m e t h a -n o l - 5 M H C I from 1 0 0 m l o f f i n a l c u l t u r e c o n t a i n i n g t h e yeastb y t h e method o f Kemp and White ( 1 5 ) . Th e a c i d s werem e t h y l a t e d a t 1 0 0 t o 1 1 0 C f o r 3 0 m i n w i t h 2 m l o f s u l f u r i ca c i d - m e t h a n o l - t o l u e n e ( 1 : 2 0 : 1 0 , v o l / v o l / v o l ) reagent ( 1 3 ) .A f t e r m e t h y l a t i o n , t h e e s t e r s w e r e s e p a r a t e d i n a ga s c h r o -m a t o g r a p h ( m o d e l 5 7 5 0 ; Hewlett-Packard C o . , P a l o A l t o ,C a l i f . ) w i t h a s t a i n l e s s s t e e l colu mn ( 6 f t by 1 / 8 i n . [ 1 . 8 m b y0 . 3 c m ] ) p a c k e d w i t h GP 10% S P - 2 3 3 0 on 1 0 0 / 1 2 0 C h r o -m o s o r b W/AW ( S u p e l c o , I n c . , B e l l e f o n t e , P a . ) . The t e m p e r-a t u r e p r o g r a m u s e d w a s a s f o l l o w s : 1 m i n a t 1 3 0 C , r i s i n g a t

8 C / m i n t o 2 4 2 C , f o l l o w e d b y a 6 - m i n h o l d a t 2 4 2 C . T h ec a r r i e r g a s ( h e l i u m ) f l o w r a t e w a s 3 0 m l / m i n ; t h e a i r f l o w r a t ew a s 4 0 0 m l l m i n , a n d t h e h y d r o g e n f l o w r a t e w a s 4 0 m l / m i n .M e d i u m - c h a i n f a t t y a c i d s w e r e e x t r a c t e d f r o m 7 5 t o 1 0 0 m lo f c e n t r i f u g e d ( 1 0 m i n a t 3 , 0 0 0 x g a n d 4 C ) w i n e w h i c h h a db e e n p a s se d t h r o u g h a 0 . 4 5 - , u m - p o r e - s i z e membrane f i l t e r .T h e s a m p l e s w e r e s a t u r a t e d w i t h N a C l a n d a c i d i f i e d t o p H 1w i t h c o n c e n t r a t e d H C I . N o n a n o i c a c i d ( 0 . 1 m g / m l ) w a s u s e da s t h e i n t e r n a l s t a n d a r d . T h e j u i c e s w e r e s h a k e n f o r 1 5 m i nw i t h a n e q u a l v o l u m e o f c h l o r o f o r m - m e t h a n o l ( 3 : 1 ) . T h es a m p l e s w e r e t h e n c e n t r i f u g e d t o s e p a r a t e t h e p h a s e s , a n dt h e o r g a n i c p h a s e w a s e v a p o r a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e i n ar o t a r y e v a p o r a t o r . A f t e r d r y i n g , t h e a c i d s w e r e r e f l u x e d f o r1 h w i t h 5 0 m l o f 6% ( w t / v o l ) p o t a s s i u m h y d r o x i d e i n 95%e t h a n o l . A f t e r t h e a d d i t i o n o f 5 0 m l o f w a t e r , t h e u n s a p o n i -f i e d m a t e r i a l w a s r e m o v e d b y e x t r a c t i o n t h r e e t i m e s w i th 4 0m l o f p e t r o l e u m e t h e r ( b p 3 0 t o 6 0 C ; BDH, T o r o n t o ,C a n a d a ) . T h e a q u e o u s p h a s e w a s a c i d i f i e d t o p H 1 w i t hc o n c e n t r a t e d H C I i n a n i c e b a t h , a n d t h e f a t t y a c i d s w e r ee x t r a c t e d w i t h p e t r o l e u m e t h e r ( t h r e e t i m e s w i t h 4 0 m l ) .A f t e r e v a p o r a t i o n , m e t h y l a t i o n w a s c a r r i e d o u t a s a b o v e( 1 3 ) . F a t t y a c i d m e t h y l e s t e r s w e r e s e p a r a t e d i n a g a sc h r o m a t o g r a p h ( m o d e l 5 7 5 0 ; H e w l e t t - P a c k a r d ) o n t h e c o l -um n d e s c r i b e d a b o v e, w i th a t e m p e r a t u r e p r o g r a m o f 6 m i na t 7 5 C , a r i s e o f 4 C / m i n t o 2 2 5 C , a n d a 1 0 - m i n h o l d a t2 2 5 0 C .

RESULTSW i n e f e r m e n t a t i o n w h e n y e a s t h u l l s a r e s e p a r a t e d f r o m t h ej u i c e b y a d i a l y s i s m e m b r a n e . T h e 2 1 . 7 B r i x C h a r d o n n a yj u i c e s w e r e a i r s at u ra te d b e f o r e b e i n g i n o c u l a t e d w i t h 2 x1 0 6 C F U o f y ea st p e r m l . F o u l d - S p r i n g e r y e a s t h u l l s w e r eu s e d i n t h i s f e r m e n t a t i o n . T h e y w e r e e i t h e r f r e e l y s u s p e n d e di n t h e j u i c e o r p h y s i c a l l y s e p a r a t e d f r o m t h e f e r m e n t i n g y e a s tb y b e i n g p l a c e d i n s i d e a d i a l y s i s s a c . I n b o t h c a s e s , y e a s th u l l s w e r e u s e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 g / l i t e r . F i g u r e 1p r e s e n t s t h e t i m e c o u r s e o f a f e r m e n t a t i o n i n w h i c h a d i a l y s i smembrane w i t h a 5 0 , 0 0 0 - m o l e c u l a r - w e i g h t c u t o f f w a s u s e d .

T h e e n h a n c i n g e f f e c t o f y e a s t h u l l s o n f e r m e n t a t i o n r a t e a n dy e a s t g r o w t h , a s r e p o r t e d e a r l i e r ( 2 5 , 2 7 ) , c o u l d b e s e e n o n l ywhen t h e h u l l s w e r e i n d i r e c t c o n t a c t w i t h t h e f e r m e n t i n gy e a s t . When t h e h u l l s w e r e c o n t a i n e d i n s i d e a d i a l y s i s b a g ,f e r m e n t a t i o n p r o c e e d e d a s i n t h e c o n t r o l w i t h o u t y e a s t h u l l s .S i m i l a r r e s u l t s w e r e a l s o o b t a i n e d when a d i a l y s i s b a g w i t h am o l e c u l a r w e i g h t c u t o f f o f 6 , 0 0 0 t o 8 , 0 0 0 w a s u s e d ( d a t a n o ts h o w n ) .D e c a n o i c a c i d a d s o r b t i o n b y t h e y e a s t h u l l s . I f t h e i n c r e a s e dg r o w t h a n d i n c r e a s e d f e r m e n t a t i o n r a t e c a u s e d b y y e a s th u l l s i n a s l u g g i s h f e r m e n t a t i o n w e r e d u e t o t h e a d s o r p t i o n o fm e d i u m - c h a i n f a t t y a c i d s , t h e d i a l y s i s membrane i n t h ee x p e r i m e n t p r e s e n t e d i n F i g . 1 a c t e d a s a b a r r i e r , p r e v e n t i n gt h e s e i n h i b i t o r y s u b s t a n c e s f r o m b e i n g a d s o r b e d f r o m t h ej u i c e o n t o t h e h u l l s . T h i s w a s c o n s i d e r e d u n l i k e l y , b e c a u s eo f t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e f a t t y a c i d s . T o v e r i f y t h a tm e d i u m - c h a i n f a t t y a c i d s c a n b e a d s o r b e d f r o m t h e s u r -r o u n d i n g j u i c e t h r o u g h t h e d i a l y s i s membrane o n t o y e a s th u l l s , we c o n d u c t e d a n e x p e r i m e n t b y u s i n g a s t e r i l e j u i c e -e t h a n o l m i x t u r e c o n t a i n i n g 1 1 8 mg o f d e c a n o i c a c i d p e r l i t e ra n d 1 g o f t h e h u l l s l o c a t e d i n s i d e a 5 0 , 0 0 0 - m o l e c u l a r -w e i g h t - c u t o f f d i a l y s i s s a c a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n dM e t h o d s . A f t e r 2 4 h a t 1 4 C , t h e c on t e nt s o f t h e s a c a n d t h ej u i c e o u t s i d e t h e s a c w e r e r e a n a l y z e d f o r d e c a n o i c a c i d( T a b l e 1 ) .D u r i n g t h e e x p e r i m e n t , d e c a n o i c a c i d p a s s e d t h r o u g h t h em e m b r a n e , a n d 2 . 3 5 mg w a s a d s o r b e d o n t o t h e h u l l s . T h e

VOL. 5 5 , 1 9 8 9

8/2/2019 Effect of Yeast Hulls on Stuck and Sluggish Wine Ferment at Ions

3/5

1 5 6 2 MUNOZ AND INGLEDEWa

2 5 -

2 0

. x 1 510

5

0

s u s p e n d e d

0 5 1 0 15 20 25 30T i m e ( d a y s )

50 bE

U- 40 c o n t r o l-'----*u s p e n d e dC30-0 sacE 2 0

0 5 10 1 5 20T i m e ( d a y s )

F I G . 1 . C a r b o h y d r a t e u t i l i z a t i o n ( a ) a n d c e l l v i a b i l i t y ( b ) i n2 1 . 7 B r i x f e r m en t a t i o n s i n o cu l a t e d a t 2 x 1 0 6 C F U / m l . Y e a s t h u l l s( 1 g / l i t e r ) w e r e e i t h e r f r e e l y s u s p e n d e d ( 0 ) o r p u t i n s i d e a 5 0 , 0 0 0 -m o l e c u l a r - w e i g h t - c u t o f f d i a l y s i s b a g ( U ) . The c o n t r o l e x p e r i m e n th a d n o y e a s t h u l l s ( [ ] ) .

c o n c e n t r a t i o n o u t s i d e t h e sa c d r o p p e d f r o m 1 1 8 t o 5 5 . 6m g / l i t e r ( v a l u e s a r e means o f d u p l ic at e d e t er m i na t i o ns ) .Mass b a l a n c e s h o w s t h a t o n l y 13% o f t h e o r i g i n a l a c i d i n t h ej u i c e o u t s i d e t h e membrane was n o t d e t e c t e d i n t h e s e t w of r a c t i o n s . Some a c i d may h a v e b e e n l o s t b y e v a p o r a t i o n o rb y a d s o r p t i o n t o g l a s s s u r f a c e s o r t o t h e d i a l y s i s m e m b r a n e .E f f e c t o f y e a s t h u l l l i p i d e x t r a c t on t h e f e r m e n t a t i o n andy e a s t membrane c o m p o s i t i o n . L i p i d e x t r a c t f r o m F o u l dTABLE 1 . D e c a n o i c a c i d a d s o r p t i o n b y y e a s t h u l l s t h r o u g h

a d i a l y s i s memb r a neD e c a n o i c a c i d R e c o v e ry o f decanoic a c i d

location m g / l i t e r m g / s a m p l eB e f o r e e x p tJ u i c e 1 1 8 . 0 5 . 9 0Y e a s t h u l l s 0 . 0A f t e r e x p t

J u i c e 5 5 . 6 2 . 7 8A d s o r b e d on h u l l s 2 . 3 5J u i c e i n s i d e b a g ND' ND" ND, N o t d e t e c t e d .

T A B L E 2 . E f f e c t o f l i p i d e x t r a c t s o r c o m p l e t e y e a s t h u l l s onf e r m e n t a t i o n r a t e a n d y e a s t g r o w t h i n a 2 0 . 2 B r i xC h a r d o n n a y j u i c e f e r m e n t a t i o nMaximum y e a s t g r o w t h F e r m e n t a t i o n r a t e aS u p p l e m e n t V i a b l e c o u n t C e l l m a s s ( g / l i t e r p e r d a y )( 1 0 6 C F U / m l ) ( m g / m l )

L i p i d e x t r a c t1 g / l i t e r 8 0 4 . 8 1 4 . 62 g / l i t e r 9 1 5 . 5 1 5 . 2Y e a s t h u l l s 7 2 4 . 7 1 3 . 9( 1 g / l i t e r )N one 4 6 3 . 1 1 0 . 3" C o n s u m p t i o n o f d i s s o l v e d s o l i d s ( i n g r a m s p e r l i t e r p e r d a y ) m e a s u r e dd u r i n g d a y s 2 t o 1 1 o f t h e f e r m e n t a t i o n .

S p r i n g e r y e a s t h u l l s was u s e d a s a s u p p l e m e n t i n a s e r i e s o fC h a r d o n n a y j u i c e f e r m e n t a t i o n s . A f t e r a i r s a t u r a t i o n , j u i c e sa t 2 0 . 2 B r i x w e r e i n o cu l a t e d w i t h 4 x 1 0 6 t o 5 x 1 0 6 C F U o ft h e a c t i v e d r y y e a s t p e r m l . A f t e r i n o c u l a t i o n , n i t r o ge n g a s a t1 0 m l / m i n w a s u s e d f o r h e a d s p a c e f l u s h i n g t o p r e v e n t o x y g e nf r o m e n t e r i n g i n t o t h e f e r m e n t o r h e a d s p a c e . L i p i d e x t r a c t s ,c o r r e s p o n d i n g t o 1 o r 2 g o f y e a s t h u l l s u p p l e m e n t a t i o n p e rl i t e r , w e r e p r e p a r e d i m m e d i a t e l y b e f o r e i n o c u l a t i o n a s d e -s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . The p r e p a r e d e x t r a c t se n h a n c e d b o t h f e r m e n t a t i o n r a t e a n d y e a s t g r o w t h a s mucha s o r m o r e t h a n t h e i n t a c t y e a s t h u l l s d i d when c o m p a r e dw i t h t h e u n s u p p l e m e n t e d c o n t r o l . D a t a o b t a i n e d f r o m f e r -m e n t a t i o n s c a r r i e d o u t w i t h y e a s t h u l l a n d l i p i d e x t r a c ts u p p l e m e n t a t i o n s , a s w e l l a s w i t h o u t s u p p l e m e n t a t i o n , a r er e p o r t e d i n T a b l e 2 .More s u g a r was c o n s u m e d d u r i n g t h e f i r s t 2 d a y s o f t h ef e r m e n t a t i o n i n t h e j u i c e i n w h i c h y e a s t h u l l s w e r e u s e d a s as u p p l e m e n t i n s t e a d o f t h e e x t r a c t s ( 1 2 a n d 9 g / l i t e r , r e s p e c -t i v e l y ) . A f t e r d a y 2 o f f e r m e n t a t i o n , when t h e f e r m e n t a t i o nr a t e s b e c a m e l i n e a r , l i p i d e x t r a c t s i n c r e a s e d g r o w t h a n ds u g a r c o n s u m p t i o n m o r e t h a n t h e h u l l s d i d . T h e l a r g e ra m o u n t o f l i p i d e x t r a c t was t h e m o s t e f f e c t i v e e n h a n c e r .

A t t h e e n d o f t h e f e r m e n t a t i o n , t h e y e a s t s w e r e h a r v e s t e da n d t h e i r c o m p o s i t i o n w a s a n a l y z e d i n t e r m s o f t h e i r f a t t ya c i d c o m p o s i t i o n a n d s t e r o l c o n t e n t s . A l l t h e y e a s t s c o n -t a i n e d b e t w e e n 0 . 2 1 a n d 0 . 2 3 % ( w t / w t ) s t e r o l ( m e a s u r e d a se r g o s t e r o l ) . W h e n t h e s t e r o l c o n t e n t s w e r e c a l c u l a t e d p e rl i t e r o f c u l t u r e , t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e c o n t r o l f e r m e n -t a t i o n a n d t h e l i p i d e x t r ac t - s up p l e m e n t ed f e r me n ta t i on sw e r e c o n s i d e r a b l e ( T a b l e 3 ) . T a b l e 3 a l s o c o n t a i n s t h e d a t af o r y e a s t f a t t y a c i d a n a l y s i s e x p r e s s e d a s a r a t i o o f t h ea m o u n t s o f u n s a t u r a t e d a n d s a t u r a t e d C 1 6 a n d C 1 8 a c i d s( p a l m i t o l e i c a n d o l e i c a c i d s t o p a l m i t i c a n d s t e a r i c a c i d s ) .T h e y e a s t i n o c u l u m c o n t a i n e d 1% s t e r o l o r 2 m g o f c u l t u r ep e r l i t e r , a n d t h e f a t t y a c i d u n s a t u r a t i o n r a t i o w a s 1 . 1 .T h e d e g r e e o f f a t t y a c i d u n s a t u r a t i o n was l o w i n t h eu n s u p p l e m e n t e d c o n t r o l f e r m e n t a t i o n , i n d i c a t i n g t h a t t h e r ew a s a l i m i t e d o x y g e n s u p p l y f o r t h e y e a s t . I nc o r p o r at i o n o fT A B L E 3 . E f f e c t o f y e a s t h u l l l i p i d e x t r a c t o n t h e a m o u n t o fs t e r o l a n d d e g r e e o f u n s a t u r a t i o n i n y e a s t membrane f a t t y a c i d s

S u p p l e m e n t Am t o f s t e r o l D e g r e e o f( m g / l i t e r o f c u l t u r e ) u n s a t u r a t i o n "L i p i d e x t r a c t1 g / l i t e r 8 . 6 7 1 . 4 32 g / l i t e r 1 1 . 4 4 2 . 3 3None 7 . 6 6 0 . 2 9

" R a t i o b e t w e e n u n s a t u r a t e d a n d s a t u r a t e d C l f a n d C l 8 a c i d s .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

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4/5

YEAST HULLS AND W I N E F E R M E N T A T I O N 1 5 6 3T A B L E 4 . E f f e c t o f d i f f e r e n t i n o c u l u m l e v e l s o n t h e e n h a n c i n ge f f e c t o f y e a s t h u l l s i n a 2 0 . 7 B r i x j u i c e f e r m e n t a t i o n

Maximum g r o w t hI n o c u l u m l e v e l F e r m e n t a t i o n r a t e "a n d s u p p l e m e n t ( g / l i t e r p e r d ay ) C e l l c o u n t C e l l m a s s( 1 0 6 / m l ) ( m g / m l )9 x 1 0 6 c e l l s

C o n t r o l 1 2 8 3 3 . 4Y e a s t h u l l s 1 2 9 6 3 . 84 x 1 0 6 c e l l sC o n t r o l 1 0 4 6 3 . 1Y e a s t h u l l s 1 4 7 3 4 . 7" C o n s u m p t i o n o f d i s so l v ed s o l i d s ( i n g r a m s p e r l i t e r p e r d ay ) d ur i n g d a y s2 t o 1 1 o f t h e f e r m e n t a t i o n .

t h e l i p i d e x t r a c t f r o m 2 g o f y e a s t h u l l s i n t o t h e j u i c ei n c r e a s e d t h e r a t i o a l m o s t 1 0 - f o l d . A s h i f t t o l o n g e r - c h a i nf a t t y a c i d s w a s a l s o s e e n w i t h t h e l i p i d e x t r a c t ( d a t a n o ts h o w n ) . L i p i d e x t r a c t f r o m F o u l d S p r i n g e r y e a s t h u l l s w a sa n a l y z e d p r e v i o u s l y ( 2 5 ) a n d f o un d t o c o n t a i n 1% s t e r o l . I tw a s h i g h i n p a l m i t o l e i c a n d o l e i c a c i d c o n t e n t . T h e r e s u l t s i nT a b l e 3 s h o w t h e i n c o r p o r a t i o n o f s t e r o l s a n d e s p e c i a l l yu n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s f r o m t h e l i p i d e x t r a c t s i n t o t h e y e a s tm e m b r a n e s . I n c o r p o r a t i o n o f u ns at u r a t ed a c i d s i n t o y e a s tm e m b r a n e s i s known t o a f f e c t t h e c h a i n l e n g t h o f t h e a c i d s ,s h i f t i n g t h e b a l a n c e t o w a r d l o n g e r c h ai n s ( 2 8 ) .E f f e c t o f i n o c u l u m s i z e o n y e a s t h u l l - s u p p l e m e n t e d f e r m e n -t a t i o n . T h e a m o u n t o f o x y g e n o r i t s s u b s t i t u t e s ( s t e r o l a n du n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ) n e e d e d i n a p a r t i c u l a r f e r m e n t a t i o nd e p e n d s o n t h e s i z e o f t h e i n o c ul u m a n d t h e l e v e l o f t h e s ec o m p o u n d s i n t h e i n o c u l u m . A c t i v e d r y y e a s t c e l l s , a s u s e di n t h e s e e x p e r i m e n t s , a r e a e r o b i c a l l y p r o p a g a t e d a n d h a v ec l o s e t o maximum s t e r o l c o n t e n t ( 1 % o f d r y w e i g h t ) . T h e ya r e a l s o h i g h i n u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s . A n e x p e r i m e n t wasc a r r i e d o u t i n w h i c h a i r - s a t u r a t e d , y e a s t h u l l - s u p p l e m e n t e dj u i c e ( c o n c e n t r a t i o n , 1 g / l i t e r ) was f e r m e n t e d w i t h t w od i f f e r e n t y e a s t i n o c u l a . T h e e f f e c t o f i n o c u l u m s i z e s o f 4 x1 0 6 t o 5 x 1 0 6 a n d 9 x 1 0 6 CFU/ml o n t h e e n h a n c i n g e f f e c to f t h e h u l l s was s t u d i e d . T h e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e4 . W h e n 9 x 1 0 6 c e l l s p e r m l w e r e u s e d a s t h e i n o c u l u m , t h ey e a s t h u l l p r e p a r a t i o n d i d n o t s h o w a s t i m u l a t o r y e f f e c t o nt h e f e r m e n t a t i o n r a t e . A s l i g h t i n c r e a s e i n g r o w t h c o m p a r e dw i t h t h a t o f t h e u n s u p p l e m e n t e d c o n t r o l was n o t i c e d . T h eh i g h s t e r o l c o n t e n t a n d amount o f u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d sp r e s e n t i n t h e i n o c u l u m y e a s t , i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e i n i t i a lo x y g e n c o n ce nt r a t i o n o f a p p r o x i m a t e l y 5 m g / l i t e r ( j u i c e a i rs a t u r a t i o n ) , w e r e s u f f i c i e n t t o p e r m i t y e a s t g r o w t h t o a h i g h e rl e v e l t h a n when t h e l o w e r i n o c u l a t i o n r a t e was u s e d . U n d e rt h e s e c o n d i t i o n s , e xt er na l s o u r ce s o f u n s a t u r a t e d a c i d s o rs t e r o l a s p r o v i d e d b y t h e y e a s t h u l l s w e r e n o t n e e d e d t op r o m o t e h i g h e r y e a s t g r o w t h o r f e r m e n t a t i o n r a t e .

DISCUSSIONT h e t h e o r y c o n c e r n i n g f e r m e n t a t i o n e n h a n c e m e n t a n d t h ep r e v e n t i o n o f s t u c k f e r m e n t a t i o n s b y y e a s t h u l l s i s b a s e d ont w o o b s e r v a t i o n s . The f i r s t i s t h e r e m o v a l o f t o x i c d e c a n o i c ,o c t a n o i c , a n d h e x a n o i c a c i d s a n d t h e i r e s t e r s b y a d s o r p t i o no n t o y e a s t h u l l s i n a s t e r i l e ( u n i n o c u l a t e d ) medium ( 1 7 ) . T h es e c o n d i s t h e a c t u a l d e c r e a s e i n t h e c o n ce n t r at i o n o f t h e s ea c i d s i n a w i n e f e r m e n t e d i n t h e p r e s e n c e o f h u l l s a sc o m p a r e d w i t h a c o n t r o l f e r m e n t a t i o n ( 2 0 ) . The r e s u l t s o f t h ep r e s e n t e x p e r i m e n t s s u p p o r t t h e c l a i m t h a t y e a s t h u l l s a d -s o r b d e c a n o i c a c i d a s p r e v i o u s l y s h o w n ( 1 7 , 1 8 , 2 7 ) . T h e

e n h a n c i n g e f f e c t o f y e a s t h u l l s s e e n i n a s l u g g i s h o r a s t u c kf e r m e n t a t i o n , h o w e v e r , c a n n o t b e a t t r i b u t e d o n l y t o t h ea ds o r p t i o n o f m e d i u m - c h a i n f a t t y a c i d s f r o m t h e j u i c e o n t ot h e h u l l s . T h e h u l l s p r o m o t e d v i n i f i c a t i o n o n l y when i n c l o s ec o n t a c t w i t h t h e f e r m e n t i n g y e a s t . W h e n a d i a l y s i s m e m -b r a n e f o r m e d a b a r r i e r b e t w e e n t h e y e a s t a n d t h e h u l l s ,f e r m e n t a t i o n e n h a n c e m e n t w a s n o t s e e n . D e c a n o i c a c i d w a ss h o w n a b o v e , h o w e v e r , t o f l o w f r e e l y t h r o u g h t h e d i a l y s i sm e m b r a n e .T h e d e c r e a s e i n t h e c o n c e n t r at i o n s o f m e d i u m - c h a i n f a t t ya c i d s s e e n i n j u i c e s s u p p l e m e n t e d w i t h F o u l d - S p r i n g e r y e a s th u l l s ( 2 0 ) c a n b e e x p l a i n e d b y t h e i r c o n te nt o f u n s a t u r a t e df a t t y a c i d s . W h e n u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s a r e p r o v i d e d t o t h ej u i c e , i n c r e a s e d a m o u n t s o f b o t h u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s a n dl o n g e r - c h a i n f a t t y a c i d s a r e f o u n d i n y e a s t m e m b r a n e s . Ad e c r e a s e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f c e l l - s y n t h e s i z e d m e d i u m -c h a i n a c i d s f o l l o w s ( 6 ) . I n c o r p o r a t i o n o f u n s a t u r a t e d f a t t ya c i d s f r o m t h e l i p i d e x t r a c t s o f F o u l d - S p r i n g e r y e a s t h u l l si n t o t h e y e a s t d u r i n g t h e f e r m e n t a t i o n was s e e n i n t h ep r e s e n t w o r k . T h e f a t t y a c i d a d s o r p t i o n t h e o r y p r e s e n t e d f o rt h e a c t i o n o f y e a s t h u l l s i s t h e r e f o r e i n q u e s t i o n . E n h a n c i n ge f f e c t s s h o w n b y y e a s t h u l l s i n s l u g g i s h w i n e f e r m e n t a t i o n sa r e c a u s e d b y t h e i r r o l e a s o x y g e n s u b s t i t u t e s , u n d e r c o n d i -t i o n s w h e r e i n s u f f i c i e n t o x y g e n i s p r e s e n t t o a l l o w s t e r o l a n du n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s y n t h e s i s t o o c c u r .T h e i n c r e a s e i n t h e a m o u n t s o f u n sa t u r at e d f a t t y a c i d s a n ds t e r o l i n t h e y e a s t when f e r m e n t e d w i t h l i p i d e x t r a c t s i s o -l a t e d f r o m y e a s t h u l l s ( T a b l e 3 ) s h o w s t h a t u n s a t u r a t e d f a t t ya c i d s a n d s t e r o l h a v e b e e n i n c o r p o r a t e d i n t o t h e y e a s tm e m b r a n e s . T h e c o n t r o l y e a s t h a r v e s t e d f r o m t h e u n s u p p l e -m e n t e d f e r m e n t a t i o n c o n t a i n e d l o w e r l e v e l s o f u n sa t ur a t e df a t t y a c i d s , a n d t h e t o t a l amount o f s t e r o l p r e s e n t wass m a l l e r . I n c r e a s i n g t h e s u p p l y o f s t e r o l a n d u n s a t u r a t e d f a t t ya c i d s i n t h e f e r m e n t a t i o n medium b y s u p p l e m e n t a t i o n w i t hy e a s t h u l l s e n a b l e d more y e a s t c e l l s t o b e f o r m e d a n de n h a n c e d t h e f e r m e n t a t i o n r a t e . S t e r o l l e v e l s r e g u l a t e t h eg r o w t h o f t h e y e a s t . W h e n s t e r o l l e v e l s h a v e f a l l e n t o ac e r t a i n c o n c e n t r a t i o n , g r o w t h w i l l c e a s e u n l e s s o x y g e n o re x t e r n a l s t e r o l i s p r e s e n t ( 4 ) . T h i s l e v e l was d e t e r m i n e d t o b e0 . 1 % o f t h e y e a s t d r y w e i g h t f o r b r e w e r s ' y e a s t ( 4 ) a n d 0 . 3 % co f t h e d r y w e i g h t f o r w i n e y e a s t ( 2 2 ) . I n t h e p r e s e n t w o r k ,t h e f i n a l s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s i n t h e y e a s t w e r e f r o m 0 . 2 1 t o0 . 2 3 % , w h i c h c a n b e c o n s i d er e d t h e l o w e s t l e v e l f o r g r o w t hf o r t h e w i n e y e a s t u s e d . I n a e r o b i c a l l y g r o w n b r e w e r s ' y e a s t ,f r e e s t e r o l n o r m a l l y c o r r e s p o n d s t o o n l y 0 . 3 % o f t h e d r yw e i g h t ; m o s t o f t h e s t e r o l i s p r e s e n t a s s t e r o l e s t e r s ( 5 ) . T h ea m o u n t o f f r e e s t e r o l p r e s e n t i n y e a s t h u l l s i s l a r g e e n o u g h t os u p p l y a l l t h e s t e r o l a c c u m u l a t e d i n t h e y e a s t d u r i n g t h ef e r m e n t a t i o n .I n t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s , c o n t a c t b e t w e e n t h e f e r m e n t -i n g y e a s t a n d y e a s t h u l l s wa s e s s e n t i a l t o o b t a i n i m p r o v e dg r o w t h a n d f e r m e nt a t i o n r a t e . T h e e n z y m e s r e q u i r e d f o rl i p i d h y d r o l y s i s a n d / o r u p t a k e w e r e most p r o b a b l y m e m -b r a n e b o u n d . T h e p r e s e n c e o f m e m b r a n e - b o u n d l i p a s e s a n dp h o s p h o l i p a s e s i n b a k e r s ' y e a s t h a s b e e n r e p o r t e d ( 2 6 ) .U n d e r m i c r o s c o p y , t h e y e a s t c e l l s were s e e n t o f o r m a g g r e -g a t e s a r o u n d y e a s t h u l l s ( c e l l d e b r i s ) . The l i p i d f r a c t i o n o fm a l t s p e n t g r a i n ( 2 9 ) a n d A s p e r g i l l i u s o r v z c a e p r o t e o l i p i d s ( 1 1 )h a v e b e e n r e p o r t e d t o e n h a n c e g r o w t h , f e r m e n t a t i o n r a t e ,a n d e t h a n o l t o l e r a n c e i n b r e w e r y i n s a k e f e r m e n t a t i o n . I nb o t h c a s e s , a s was s e e n i n t h e p r e s e n t w o r k , u n s a t u r a t e df a t t y a c i d s w e r e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e y e a s t . I n t h e b e e rf e r m e n t a t i o n , e n o u g h f r e e s i t o s t e r o l f r o m s p e n t g r a i n s w a sp r e s e n t t o s u p p l y a l l t h e s t e r o l i n c o r p o r a t e d i n membranes( 2 9 ) . T h e p r e s e n c e o f l i p o l y t i c a c t i v i t y i n t h e y e a s t w as

V O L . 5 5 , 1 9 8 9

8/2/2019 Effect of Yeast Hulls on Stuck and Sluggish Wine Ferment at Ions

5/5

1 5 6 4 MUNOZ AND I NGL ED EWs p e c u l a t e d u p o n ( 2 9 ) , o r t h e a g g r e g a t i o n o f y e a s t c e l l sa r o u n d p h o s p h o l i p i d f r a g m e n t s was se e n ( 1 2 ) .S t u c k f e r m e n t at i o n s a re a s e r i o u s p r o b l e m i n t h e w i n ei n d u s t r y . Th e p r o b l e m i s more a c u t e wh e n w h i t e w i n e s ( i nw h i c h t h e l i p i d s o f gr ape s k i n s are n o t p r e s e n t ) or j u i c e s w i t hh i g h sugar c o n c e n t r a t i o n s a re f e r m e n t e d . To p r e v e n t s t u c kf e r m e n t a t i o n s , a l a r g e nu mber o f y e a s t c e l l s s h o u l d b ep r e s e n t i n t h e f e r m e n t a t i o n t a n k . T h i s c a n b e a c h i e v e d b yu s i n g l a r g e i n o c u l a o r b y p r o v i d i n g a d e q u a t e y e a s t n u t r i t i o nt o a l l o w t h e y e a s t t o g r o w t o d e s i r e d h i g h c e l l d e n s i t y . I nv i n i f i c a t i o n , e s p e c i a l l y i n E u r o p e , w h e r e t h e n a t u r a l f l o r a i so f t e n u s e d w i t h o u t a p u r e - c u l t u r e y e a s t , h i g h i n o c u l u m l e v e l sare n o t p o s s i b l e . Under w i n e - m a k i n g c o n d i t i o n s , i n w h i c h a i ri s i n t r o d u c e d t o t h e j u i c e o n l y d u r i n g t h e h a n d l i n g o f j u i c eb e f o r e i n o c u l a t i o n , oxygen e a s i l y becomes a l i m i t i n g n u t r i e n tf o r s u b s e q u e n t y e a s t g r o w t h , a n d t h e l a c k o f o x y g e n c a nc a u s e a c e s s a t i o n o f f e r m e n t a t i o n . The use o f y e a s t h u l l s ass u g g e s t e d b y L a f o n - L a f o u r c a d e ( 1 7 ) , R i b e r e a u - G a y o n ( 2 7 ) ,and o t h e r s ( 2 0 , 2 1 ) c a n p a r t l y overcome t h e p r o b l e m o f l a c ko f oxygen. A more e c o n o m i c a l way w o u l d b e t o p r o v i d e t h ef e r m e n t a t i o n w i t h a h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f o x yg e n b ya e r a t i o n o r o x y g e n a t i o n i n i t i a l l y ; t h i s p r a c t i c e i s c a r r i e d o u ti n t h e b r e w i n g i n d u s t r y , a n d t h e t e c h n i q u e h a s me t w i t hs o m e s u c c e s s i n C a l i f o r n i a ( 2 3 ) . A s s i m i l a b l e n i t r o g e n ( n i -t r o g e n u s a b l e b y y e a s t s s u c h a s a m i n o a c i d s , ammoniums a l t s , o r t h e now b a n n e d u r e a ) i s t h e o t h e r e s s e n t i a l n u t r i e n tr e q u i r e d t o i n c r e a s e c e l l y i e l d . Some j u i c e s ar e v e r y l o w i na s s i m i l a b l e n i t r o g e n ( < 4 0 m g / l i t e r [ 1 4 ] ) , a n d i n c r e a s i n g t h el e v e l o f t h i s n u t r i e n t , t o g e t h e r w i t h p r o v i s i o n o f a n a d e q u a t eoxygen c o n c e n t r a t i o n , e n h a n c e s b o t h y e a s t g r o w t h a n df e r m e n t a t i o n r a t e , t h u s p r e v e n t i n g s t u c k f e r m e n t a t i o n ( 1 4 ) .T h e q u a l i t y o f t h e r e s u l t a n t w i n e a f t e r i n c r e a s i n g t h e n i t r o g e nl e v e l s b y v i n e f e r t i l i z a t i o n ( 7 ) o r a f t e r n i t r o g e n s u p p l e m e n -t a t i o n d u r i n g t h e f e r m e n t a t i o n ( 3 0 ) was r e p o r t e d t o b ei m p r o v e d .P r o v i s i o n o f oxygen a n d e x t r a a s s i m i l a b l e n i t r o g e n p r o -m o t es y e a s t g r o w t h , i n cr e a s e s t h e r a t e o f f e r me n t at i o n , a n de l i m i n a t e s s t u c k f e r m e n t a t i o n s ( 1 4 ) . I t a l s o a l l o w s w h i t e w i n ef e r m e n t a t i o n t a n k a g e t o b e u s e d more t h a n o n c e p e r y e a r .

ACKNOWLEDGMENTWe t h a n k t h e N a t u r a l S c i e n c e a n d E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C o u n c i l

o f C a n a d a f o r r e s e a r c h s u p p o r t f o r t h i s p r o j e c t .L I T E R A T U R E C I T E D

1 . A m e r i n e , M. A . , a n d C . S . O u g h . 1 9 8 0 . Me t ho ds o f a n a l y s i s o fmusts and w i n e s , p . 1 8 . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , N e w Y o r k .2 . A n d r e a s e n , A . A . , a n d T . J . B . S t i e r . 1 9 5 3 . A n a e r o b i c n u t r i t i o no f S a c c h a c r o m y c e s c e r e v i s i a c e . E r g o s t e r o l r e q u i r e m e n t f o rg r o w t h i n a d e f i n e d m e d i u m . J . C e l l . Comp. P h y s i o l . 4 1 : 2 3 - 3 6 .3 . A n d r e a s e n , A . A . , a n d T . J . B . S t i e r . 1 9 5 4 . A n a e r o b i c n u t r i t i o no f S a c c h a r o m y c e s c e r e i i s i a e . U n s a t u r a t e d f a t t y a c i d r e q u i r e -m e n t f o r g r o w t h i n a d e f i n e d m e d i u m . J . C e l l . C o m p . P h y s i o l .4 3 : 2 7 1 - 2 8 1 .

4 . A r i e s , V . , and B . H . K i r s o p . 1 9 7 7 . S t e r o l s y n t h e s i s i n r e l a t i o n tog r o w t h and f e r m e n t a t i o n b y b r e w i n g y e a s t s i n o c u l a t e d a t d i f -f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s . J . I n s t . B r e w . 8 3 : 2 2 0 - 2 2 3 .5 . A r i e s , V . , and B . H . K i r s o p . 1 9 7 8 . S t e r o l b i o s y n t h e s i s by s t r a i n so f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e i n t h e presence an d absence o fd i s s o l v e d oxygen. J . I n s t . B r e w . 8 4 : 1 1 8 - 1 2 2 .6 . A r i e s , V . , B . H . K i r s o p , and G . T . T a y l o r . 1 9 7 7 . Yeast l i p i d s , p.2 5 5 - 2 6 6 . I n P r o c e e d i n g s o f t h e 1 6 t h C o n g r e s s , A m s t e r d a m .E u r o p e a n B r e w e r y C o n v e n t i o n , Z o e t e r w o n d e , Th e N e t h e r l a n d s .7 . B e l l , A . A . , C . S . O u g h , a n d W. M. K l i e v e r . 1 9 7 9 . E f f e c t s onmust a n d w i n e c o m p o s i t i o n , r a t e s o f f e r m e n t a t i o n , an d w in eq u a l i t y o f n i t r o g e n f e r t i l i z a t i o n o f V i t i s i ' n i f e r a v a r . T h o m s o ns e e d l e s s g r a p e s . Am . J . E n o l . V i t i c . 3 0 : 1 2 4 - 1 2 9 .

8 . C a s e y , G . P . , a n d W. M . I n g l e d e w . 1 9 8 6 . E t h a n o l t o l e r a n c e i ny e a s t s . C r i t . R e v . M i c r o b i o l . 1 3 : 2 1 9 - 2 8 0 .9 . C a s e y , G . P . , C . A . M a g n u s , a n d W. M. I n g l e d e w . 1 9 8 4 .H i g h - g r a v i t y b r e w i n g : e f f e c t s o f n u t r i t i o n o n y e a s t c o m p o s i t i o n ,f e r m e n t a t i v e a b i l i t y , a n d a l c o h o l p r o d u c t i o n . A p p l . E n v i r o n .M i c r o b i o l . 4 8 : 6 3 9 - 6 4 6 .1 0 . G i u d i c i , P . , a n d M. E . G u e r z o n i . 1 9 8 2 . S t e r o l c o n t e n t a s ac h a r a c t e r f o r s e l e c t i n g y e a s t s t r a i n s i n e n o l o g y . V i t i s 2 1 : 5 - 1 4 .1 1 . H a y a s h i d a , S . , D . D . F e n g , a n d M. H o n g o . 1 9 7 4 . F u n c t i o n o f t h eh i g h c o n c e n t r a t i o n a l c o h o l - p r o d u c i n g f a c t o r . A g r i c . B i o l . C h e m .3 8 : 2 0 0 1 - 2 0 0 6 .1 2 . H a y a s h i d a , S . , D . D . F e n g , K . O h t a , S . C h a i t i u m v o n g , a n d M.H o n g o . 1 9 7 6 . C o m p o s i t i o n a n d r o l e o f A s p e r g i l l u s o r y z a e p r o -t e o l i p i d a s a h i g h c o n c e n t r a t i o n a l c o h o l - p r o d u c i n g f a c t o r . A g r i c .B i o l . C h e m . 4 0 : 7 3 - 7 8 .1 3 . H i t c h c o c k , C . , a n d E . W. Hammond. 1 9 7 8 . T h e d e t e r m i n a t i o n o fl i p i d s i n f o o d s , p . 1 8 5 - 2 2 3 . I n R . D . K i n g ( e d . ) , D e v e l o p m e n t s i nf o o d a n a l y s i s t e c h n i q u e s , v o l . 2 . A p p l i e d S c i e n c e P u b l i s h e r s ,L o n d o n .1 4 . I n g l e d e w , W. M . , a n d R . E . K u n k e e . 1 9 8 5 . F a c t o r s i n f l u e n c i n gs l u g g i s h f e r m e n t a t i o n s o f g r a p e j u i c e . Am. J . E n o l . V i t i c . 3 6 :6 5 - 7 5 .1 5 . K e m p , P . , a n d R . W. W h i t e . 1 9 7 5 . T h e h y d r o g e n a t i o n o fu n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s b y f i v e b a c t e r i a l i s o l a t e s f r o m t h e s h e e pr u m e n i n c l u d i n g a ne w s p e c i e s . J . G e n . M i c r o b i o l . 9 0 : 1 0 0 - 1 1 4 .1 6 . L a f o n - L a f o u r c a d e , S . 1 9 8 3 . W i n e a n d b r a n d y , p . 8 1 - 1 6 3 . I nH . - J . Reh m a n d G . R e e d ( e d . ) , B i o t e c h n o l o g y , v o l . 5 . F o o d a n df e e d p r o d u c t i o n a n d m i cr o o r g an i s ms . V e r l ag C h e m i e , D e e r f i e l dB e a c h , F l a .1 7 . L a f o n - L a f o u r c a d e , S . 1 9 8 4 . S o u c h e s d e l e v u r e s . B u l l . 0 . I . V .

6 3 7 : 1 8 5 - 2 0 3 .1 8 . L a f o n - L a f o u r c a d e , S . , C . G e n e i x , a n d P . R i b e r e a u - G a y o n . 1 9 8 4 .L e s m o d a l i t e s d e m i s e e n o eu v r e d e s e c o r c e s d e l e v u r e e nv i n i f i c a t i o n . C o n n a i s s . V i g n e V i n 1 8 : 1 1 1 - 1 2 5 .1 9 . L a f o n - L a f o u r c a d e , S . , F . L a r u e , a n d P . R i b e r e a u - G a y o n . 1 9 7 9 .E v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e o f " s u r v i v a l f a c t o r s " a s a n e x p l a n a -t i o n f o r s o m e p e c u l a r i t i e s o f y e a s t g r o w t h , e s p e c i a l l y i n g r a p em u s t o f h i g h s u g a r c o n c e n t r a t i o n . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .3 8 : 1 0 6 9 - 1 0 7 3 .2 0 . L a r u e , F . , C . G en ei x, S . L a f o n - L a f o u r c a d e , A . B e t r a n d , a n d P .R i b e r e a u - G a y o n . 1 9 8 4 . P r e m i e r s o b s e r v a t i o n s s u r l e m o d e d ' a c -t i o n d es e co r c es d e l e v u r e . C o n n a i s s . V i g n e V i n 1 8 : 1 5 5 - 1 6 3 .2 1 . L a r u e , F . , a n d S . L a f o n - L a f o u r c a d e . 1 9 8 9 . S u r v i v a l f a c t o r s i nw i n e f e r m e n t a t i o n , p . 1 9 3 - 2 1 5 . I n N . v a n Uden ( e d . ) , A l c o h o lt o l e r a n c e i n y e a s t s a n d b a c t e r i a . C R C P r e s s , I n c . , B o c a R a t o n ,F l a .2 2 . L a r u e , F . , S . L a f o n - L a f o u r c a d e , a n d P . R i b e r e a u - G a y o n . 1 9 8 0 .R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e s t e r o l c o n t e n t o f y e a s t c e l l s a n d t h e i rf e r m e n t a t i o n a c t i v i t y i n g r ap e m us t . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .3 9 : 8 0 8 - 8 1 1 .2 3 . L o n g , Z . , a n d B . L i n d b l o m . 1 9 8 6 . J u i c e o x i d a t i o n e x p e r i m e n t s .W i n e s V i n e s 6 7 ( 1 1 ) : 4 4 - 4 9 .2 4 . M o n k , P . R . 1 9 8 2 . E f f e c t o f n i t r o g e n a n d v i t a m i n s u p p l e m e n t so n y e a s t g r o w t h a n d r a t e o f f e r m e n t a t i o n o f R h i n e R i e s l i n g g r a p ej u i c e . F o o d T e c h n o l . A u s t . 3 4 : 3 2 8 - 3 3 2 .2 5 . M u n o z , E . , a n d W. M. I n g l e d e w . 1 9 8 9 . An a d d i t i o n a l e x p l a n a -t i o n f o r t h e p r o m o t i o n o f m o r e r a p i d , c o m p l e t e f e r m e n t a t i o n b yy e a s t h u l l s . Am. J . E n o l . V i t i c . 4 0 : 6 1 - 6 4 .2 6 . N u r m i n e n , T . , a n d H . S u o m a l a i n e n . 1 9 7 0 . T h e l i p o l y t i c a c t i v i t yo f t h e i s o l a t e d c e l l e n v e l o p e f r a c t i o n s o f b a k e r ' s y e a s t . B i o -c h e m . J . 1 1 8 : 7 5 9 - 7 6 3 .2 7 . R i b e r e a u - G a y o n , P . 1 9 8 5 . N e w d e v e l o p m e n t s i n w i n e m i c r o b i -o l o g y . Am . J . E n o l . V i t i c . 3 6 : 1 - 1 0 .2 8 . T a y l o r , G . T . , a n d B . H . K i r s o p . 1 9 7 7 . The o r i g i n o f t h e mediumc h a i n l e n g t h f a t t y a c i d s p r e s e n t i n b e e r . J . I n s t . B r e w . 8 3 :2 4 1 - 2 4 3 .2 9 . T a y l o r , G . T . , P . A . T h u r s t o n , a n d B . H . K i r s o p . 1 9 7 9 . T h ei n f l u e n c e o f l i p i d d e r i v e d f r o m m a l t s p e n t g r a i n s o n y e a s tm e t a b o l i s m a n d f e r m e n t a t i o n . J . I n s t . B r e w . 8 5 : 2 1 9 - 2 2 7 .3 0 . V o s , P . J . A . , W. Z e e m a n , a n d H . H e y m a n . 1 9 7 8 . T h e e f f e c t o nw i n e q u a l i t y o f diammonium p h o s p h a t e a d d i t i o n s t o m u s t . P r o c .S . A f r . E n o l . S o c . 1 9 7 8 : 8 7 - 1 0 4 .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .