El Colegio de la Frontera Sur

Perfil de resistencia a insecticidas en Aedes albopictus y Aedes aegypti (Diptera:Culicidae) en Tapachula,

Chiapas México

TESIS Presentada como requisito parcial para optar al grado de

Maestría en Ciencias en Recursos Naturales y Desarrollo Rural

por

Alma Delia López Solis

Tapachula, Chiapas, México, Junio 2016

En memoria de:

Mi madre (Luv ia )

y

Abue l i tos (Ma t i y Mi l i ta )

Agradecimientos

Al CONACYT por el apoyo otorgado mediante una beca de estudios (335843).

El Colegio de la Frontera Sur, por haberme permitido formarme en esta institución.

Dr. Alfredo Castillo Vera, M en C. Juan Cisneros Hernández, Dr. Américo Rodríguez

y Dra. Patricia Penilla por su confianza y valiosa dirección - asesoría en el desarrollo

de la investigación y elaboración del escrito.

Dr. Daniel Sánchez, Dr. Jaime Gómez y Dra. Ariane Dor, por su inversión de

conocimiento y tiempo en la lectura del manuscrito.

Gracias a todas las personas que fueron partícipes durante este proceso, de manera

directa o indirecta, con su pequeño o grande aporte, que finalmente se ve reflejado

en la culminación de esta tesis:

Amigos y compañeros de generación, Dr. José Luis Torres, Tavi, Lizbeth,

Jeovany, Angélica Aponte.

Espero que el tiempo me permita conservar su amistad y cariño sincero, que este

momento especial perdure en la mente de las personas a quién agradezco

infinitamente.

A ti amor: Frank

Por tu ayuda no solo en el desarrollo de la tesis, sino también en mi vida. Ambos

hemos logrado un éxito más a nuestras vidas, por estos y más momentos juntos, te

amo.

Siembra una buena y sincera amistad y muy probablemente el tiempo te permitirá disfrutar

de una agradable cosecha.

Contenido

Pág.

Resumen 1

Capítulo I

Introducción 2

Capítulo II

Manuscrito trabajo de Investigación 6

Resumen 7

Introducción 9

Materiales y Métodos 10

Resultados 13

Discusiones 15

Referencias 21

Lista de cuadros 29

Lista de figuras 32

Capitulo III

Conclusiones Generales 36

Referencias 37

1

RESUMEN

Aedes aegypti Linneus y Ae. albopictus Skuse son dos especies importantes de

vectores de diversas arbovirosis, como los serotipos del virus del dengue, fiebre

chikungunya y zika a nivel mundial. La aplicación de insecticidas sintéticos, podrían

ejercer la misma presión de resistencia para ambas especies, en áreas donde

coexisten. Un perfil de resistencia basado en la respuesta a tres clases de

insecticidas (piretroides, organofosforados y carbamatos) y los mecanismos

involucrados fue determinado para ambas especies en la ciudad de Tapachula,

Chiapas. La susceptibilidad a insecticidas de ambas especies se analizó aplicando

los métodos de la WHO (larvas) y CDC (adultos) sobre la F1 obtenida de capturas

con ovitrampas en dos colonias urbanas, de febrero a abril del 2015. Los resultados

mostraron que Ae aegypti fue resistente a piretroides (10 - 47% de mortalidad) y

organofosforados (0 – 80% de mortalidad) mientras que Ae albopictus solo a

organofosforados (27.5 – 78% de mortalidad). Ambas especies mostraron altos

niveles de P450 y GSTs, mientras que los niveles de esterasas variaron por especie

y sitio muestreado. Se detectó acetilcolinesterasa insensible a insecticidas en

ambas especies. Este trabajo compara por primera vez, la susceptibilidad a

insecticidas y los mecanismos de resistencia entre las poblaciones de Ae. aegypti y

Ae. albopictus que coexisten en Tapachula, Chiapas, México

Palabras claves: Aedes, acetilcolinesterasa, esterasas, resistencia, insecticidas,

2

CAPITULO I

Introducción

Aedes aegypti Linneus y Ae. albopictus Skuse (Diptera: Culicidae) son dos especies

importantes de vectores de diversas arbovirosis, como los serotipos del virus del

dengue, fiebre chikungunya (CHIK) y zika a nivel mundial (Rey & Lounibos 2015).

Las dos especies se consideran invasoras, ya que han colonizado exitosamente

muchos sitios fuera de sus ámbitos nativos (Juliano & Lounibos 2005).

El manejo de estas enfermedades está basado principalmente en el control

químico de los vectores mediante la aplicación de insecticidas organosintéticos en

los criaderos, que va dirigido contra las fases inmaduras, así como el rociado a ultra

bajo volumen (UBV) y pulverizado en espacios de interiores contra la fase adulta

(Morrison et al 2008). En el 2014, la PAHO/WHO reporto que la aplicación de los

insecticidas por grupo químico en México fue del 64% para piretroides (PYR), 18%

para organosforados (OP) y 18% para carbamatos (CARB). Dentro de los

insecticidas más utilizados en el país para el control de vectores se tiene a

cipermetrina, deltametrina, ciflutrina y bifentrina (PYR); temefos, malatión y

clorpirifos (OP); y bendiocarb un carbamato (CARB) aplicado en Tapachula durante

el reciente brote del virus CHIK.

El uso constante de estos insecticidas ha provocado el desarrollo de

resistencia en diferente proporción a todos los grupos toxicológicos usados para el

control vectorial, especialmente a los PYRs en Ae. aegypti (Saavedra et al 2007)

esto constituye uno de los principales problemas que afecta a las estrategias de

3

control para este vector (WHO 2013; Ponce et al 2009; Aponte et al 2013; López et

al 2014). También se ha reportado resistencia a OP en poblaciones de Ae. aegypti

en casi todo el continente Americano (Braga et al 2004) e inclusive en algunas

partes de México (Tovar-Zamora 2016). Sin embargo, no hay reportes de resistencia

a CARB para Ae. aegypti, (PAHO 2014) mientras que en México no se conoce el

estado de susceptibilidad o resistencia a ningún grupo toxicológico para Ae.

albopictus.

La resistencia a insecticidas en poblaciones de mosquitos es detectada de

mediante la guía de la Organización Mundial de Salud (WHO por sus siglas en

inglés). Este método ha sido ampliamente usado y con resultados satisfactorios en

la detección de resistencia a los insecticidas para fines de vigilancia) (WHO 2013).

Otro método, que obtiene resultados similares al método de la WHO es la técnica

de bioensayos en botellas del Center Desease Control (CDC por sus siglas en

inglés) (Aïzoun et al 2013). Estos métodos de susceptibilidad deducen si existe

resistencia cuando una proporción de la población experimental sobrevive a la dosis

diagnóstica en el tiempo diagnóstico (Brogdon & Chan 2012). Ambos bioensayos

proporcionan información acerca de la resistencia a ese insecticida evaluado en la

población del vector adulto y brinda evidencia temprana de que un insecticida

evaluado en particular, sobre la población del vector adulto brindando evidencia

temprana de que el insecticida está perdiendo efectividad en una población, y una

vez que se detecta la resistencia o se sospecha de su aparición, será necesario

identificar los mecanismos de resistencia involucrados usando métodos bioquímicos

y/o moleculares (Brogdon & Chan 2012).

4

Existen dos mecanismos de resistencia desarrollados en los insectos:

1) Resistencia metabólica es cuando aquellos insectos resistentes pueden

biotransformar o destruir el tóxico más rápidamente que los insectos sensibles.

Involucra un incremento de la concentración de enzimas al interior del insecto (α, β

esterasas, oxidasas de función múltiple, glutatión S-transferasas (GST)). Estas

permiten bloquear la actividad tóxica del insecticida (Brogdon & McAllister 1998;

Hemingway & Ranson 2000; Bisset 2001; Flores et al 2005), funcionando como

detoxificantes y contribuyen a disminuir la dosis efectiva de un insecticida evitando

que llegue al sitio de acción (Georghiou 1965; Brogdon & McAllister 1998; Ranson

et al 2002; Flores et al 2005). Estos son los mecanismos más comunes.

2) Alteración en el sitio blanco, existen tres principales sitios: a)

acetilcolinesterasa (AChE), el cual es blanco para los grupos toxicológicos OPs y

CARBs (Hemingway & Ranson 2000); b) los canales de sodio de la membrana de

células nerviosas, que es sitio blanco para algunos OP y PYR y finalmente c) los

receptores del ácido γ-aminobutírico (GABA) sitio activo de ciclodienos (Shotkoski

et al 1994).

Por otro lado, se sabe que la resistencia no se desarrolla a la misma

velocidad en todas las especies o poblaciones (Bisset 2002), esto se debe a tres

aspectos principalmente, el genético, biológico y operacionales. El primero está

relacionado principalmente con la frecuencia y dominancia de los alelos de

resistencia, mientras que el segundo del ciclo de vida de los organismos, número

de descendientes por generación, migración, refugio, entre otros, en tanto que los

5

operacionales (FAO 1979, Brown 1986) están asociados directamente con la

aplicación del insecticida, el tiempo, dosis y formulación del mismo (Bisset 2002,

IRAC 2016).

Por lo tanto, el seguimiento y evaluación de resistencia o susceptibilidad de

una población son elementos cruciales dentro de los programas de control de

vectores, sus impactos son esenciales para comprender los avances, retos y el éxito

de la lucha contra las enfermedades. Debe ser una parte integral de los programas

de control de plagas de vectores / salud pública; permaneciendo como requisito

básico para orientar el uso de pesticidas en los programas de control de

enfermedades y plagas transmitidas por vectores (Karunamoorthi & Sabesan 2013).

En Tapachula, Chiapas, México, coexisten dos especies reportadas del

género Aedes, Ae. aegypti y Ae. albopictus. A pesar de sus diferencias en

comportamiento y preferencias de criaderos, se esperaría que ambas especies

estén expuestas a la misma presión de selección de resistencia por los insecticidas,

ya que comparten los mismos nichos. Por lo anterior, en el presente estudio se

determinó el perfil de resistencia de estas especies mediante la respuesta a tres

clases de insecticidas: PYR (permetrina y deltametrina), OP (malatión y clorpirifos)

y CARB (bendiocarb y propoxur), así como los mecanismos de resistencia

involucrados en ellas. Los insecticidas utilizados se seleccionaron por ser los que

operativamente se usan para el control del vector en Tapachula, Chiapas.

6

CAPITULO II

Perfil de resistencia a insecticidas en Aedes albopictus y Aedes aegypti

(Diptera:Culicidae) en Tapachula, Chiapas México

Profile of insecticide resistance in Aedes albopictus and Aedes aegypti (Diptera:

Culicidae) in Tapachula, Chiapas Mexico

Resistencia de insecticidas en Aedes

1QFB. Alma Delia López-Solis adlopez@insp.mx

1PhD. Rosa Patricia Penilla Navarro penilla@insp.mx

2Dr. Alfredo Castillo Vera acastill@ecosur.mx

2M en C. Juan Cisneros jcisnero@ecosur.mx

1Dr. José Luis Torres Estrada jltorres@insp,mx

1*PhD. Américo David Rodríguez americo@insp.mx

1Instituto Nacional de Salud Pública, Centro Regional de Investigación en Salud Pública. Tapachula, Chiapas México. 4ta Norte esq 19 Poniente,

2El Colegio de la Frontera Sur. Tapachula, Chiapas México. Carretera Antiguo Aeropuerto Km. 2.5, Centro, 30700

*Autor de correspondencia

PhD. Américo David Rodríguez americo@insp.mx

7

Resumen

Objetivo. Diagnosticar el estado de susceptibilidad y mecanismos de resistencia a

tres clases de insecticidas en Aedes aegypti y Aedes albopictus de la ciudad de

Tapachula, Chiapas México. Materiales y Métodos. La susceptibilidad a

insecticidas de ambas especies se analizó aplicando los métodos de la WHO

(larvas) y CDC (adultos) sobre la F1 obtenida de capturas con ovitrampas en dos

colonias urbanas, de febrero a abril del 2015. Resultados. Ae aegypti fue resistente

a piretroides (10 - 47% de mortalidad) y organofosforados (0 – 80% de mortalidad)

mientras que Ae albopictus solo a organofosforados (27.5 – 78% de mortalidad).

Ambas especies mostraron altos niveles de P450 y GSTs, mientras que los niveles

de esterasas variaron por especie y sitio muestreado. Se detectó acetilcolinesterasa

insensible a insecticidas en ambas especies. Conclusión. Se encontró resistencia

a piretroides en Ae. aegypti y a organofosforados en ambas especies, las cuales

fueron encontradas compartiendo las ovitrampas de ambos sitios muestreados

Palabras claves: Aedes, acetilcolinesterasa, esterasas, resistencia, insecticidas,

8

Profile of insecticide resistance in Aedes albopictus and Aedes aegypti (Diptera:

Culicidae) in Tapachula, Chiapas Mexico

Abstract

Objective. Diagnostic of the susceptibility status and resistance mechanisms to

three classes of insecticides in Aedes aegypti and Aedes albopictus in Tapachula,

Chiapas Mexico. Materials and methods. The insecticide susceptibility of both

species was analyzed according to WHO (larvae) and CDC (adults) methods, on the

F1 obtained from ovitraps catches in two urban colonies, from February to April 2015.

Results. Ae aegypti was resistant to pyrethroids (10 - 47% mortality) and to

organophosphorus (27.5 – 78% mortality), while Ae albopictus only to

organophosphorus (27.5 – 78% mortality). Both species showed high levels of P450

and GST; while the esterase levels oscillated for species and site collected. Altered

acetylcholinesterase was observed in both sites collected from both species.

Conclusion. There is high resistance to pyrethroids in Ae. aegypti and an incipient

resistance to insecticides in Ae. Albopictus. In addition, both species were

encountered in the same ovitraps.

Keywords: Aedes, acetylcholinesterase, esterases, resistance, insecticides,

enzymes

9

Introducción

Los mosquitos del género Aedes son los principales vectores de los virus del

dengue, fiebre chikungunya (CHIK), zika y fiebre amarilla. Aedes aegypti (Linneo)

(Stegomyia) y Aedes albopictus (Skuse) son los principales vectores de estas

enfermedades. Ae. aegypti, vector principal de dengue en México, recientemente

reportado como vector de los virus CHIK1 y Zika en Tapachula, Chiapas, México.

Ae. albopictus no reportado como vector de alguna enfermedad en México, está

implicado en brotes de CHIK y Zika en Europa2 y con brotes de Zika en África3. Los

grupos de insecticidas más usados en México han sido piretroides “PYR” (64%),

organosforados “OP” (18%) y carbamatos “CARB” (18%)4, este último aplicado en

Tapachula durante un reciente brote del virus CHIK. Aunque los mosquitos son

resistentes a todos los grupos toxicológicos usados en el control vectorial5, la

resistencia de Ae. aegypti en México ha sido registrada a PYRs6, 7, 8 y a OPs en casi

todo el continente Americano9, incluyendo México6, 10, 11. Pocos estudios relacionan

la resistencia de Ae. aegypti all grupo CARBs y no se conoce la susceptibilidad o

resistencia de Ae. albopictus a ningún grupo toxicológico en México. Este estudio

analizó la resistencia hacia tres clases de insecticidas PYRs (permetrina y

deltametrina), OPs (malatión, clorpirifos y temefos) y CARBs (bendiocarb y

propoxur), y los mecanismos de resistencia involucrados en Ae. aegypti y Ae.

Albopictus, en Chiapas, México.

10

Materiales y Métodos

Área de estudio

El material biológico se recolectó en dos colonias de la ciudad de Tapachula,

Chiapas, Fraccionamiento Huertos de Janeiro (N14°56´26.63” W 92°15´03.74”) y

Colonia 5 de Febrero; N14°55´09.120” W 92°15´32.82.

La recolecta de huevos se realizó de febrero a abril de 2015 siguiendo las

recomendaciones de la Guía Metodológica para la Vigilancia Entomológica con

Ovitrampas12. El papel filtro (12 cm X 35 cm) colocado en interior de las ovitrampas

fue reemplazado de cada cinco días, colocándolo dentro de bolsas plásticas para

su posterior traslado al insectario del Centro Regional de Investigación en Salud

Pública (CRISP) en la ciudad de Tapachula Chiapas, México.

Cría de mosquitos

Tiras de papel con huevos recolectados en campo fueron colocadas dentro de

recipientes con agua para permitir la eclosión de las larvas. 500 larvas obtenidas de

estos huevos fueron colocadas en 1.2 L de agua, equivalente a 1.5 cm de

profundidad en charolas de 22 cm x 35 cm x 5 cm. Estas larvas fueron alimentadas

con una mezcla de proteínas, grasas, fibra y minerales, previamente molida,

tamizada y esterilizada (LabDiet 5001). Entre el quinto y séptimo día se obtuvieron

las pupas, que fueron colocadas dentro de charolas cubiertas con malla para evitar

el escape de los adultos emergidos (F0). La identificación taxonómica de los adultos

11

obtenidos fue basada en el patrón del tórax13. Cada especie fue confinada dentro

de jaulas de cría de 30 cm3 junto con una con solución de azúcar al 10 %. El número

máximo de mosquitos por animal, para alimentar a los adultos (F0) con sangre de

conejo, se realizó bajo las normas establecidas para la protección de animales14. La

obtención de huevos de la siguiente generación (F1) en ambas especies, se realizó

colocando en cada jaula un papel filtro, setenta y dos horas después de la

alimentación. Con los adultos obtenidos (F1) se realizaron los bioensayos de

susceptibilidad y ensayos bioquímicos.

Bioensayos de susceptibilidad en larvas

Estos bioensayos fueron realizados como lo describe previamente la WHO15. Una

solución etanolica (T-Mfos 1 %, Agromundo) de temefos (3 ppm) fue adicionada a

250 mL de agua destilada para obtener la concentración diagnóstica de 0.012 ppm.

Se usó un total de 300 larvas por especie/sitio de recolecta para cada bioensayo.

La mortalidad larval fue registrada 24 horas después de la aplicación, considerando

como larva muerta a toda aquella sumergida incapaz de nadar a la superficie. Como

control se usaron 100 larvas de la cepa susceptible Nueva Orleans (NO).

Bioensayos de susceptibilidad en adultos

Estos bioensayos fueron realizados para conocer la susceptibilidad de ambas

especies a los distintos plaguicidas evaluados, aplicando el protocolo de botellas

12

del CDC (Centers for Disease Control and Prevention / Atlanta, GA USA)16 con

recomendaciones y la concentración diagnóstica correspondiente (Cuadro I). Para

cada insecticida se usaron 240 adultos con 3 a 4 días de edad por especie / sitio.

Se usaron 240 adultos de la cepa susceptible (NO) como control. En el caso del

clorpirifós y propoxur, la dosis diagnóstica y tiempo letal establecido por el CDC, fue

determinado a partir de evaluaciones previas utilizando la cepa susceptible NO,

siguiendo el método de CDC16. La mortalidad de larvas y adultos, fue analizada

mediante un ANOVA de una vía, después de transformación con arcoseno17.

Ensayos bioquímicos

Para determinar si los mecanismos de resistencia estaban basados en el

metabolismo de los insecticidas y/o en la acetilcolinesterasa (AChE) insensible, se

realizó el ensayo bioquímico siguiendo el protocolo descrito por Penilla18. La

actividad enzimática de las diferentes poblaciones de mosquitos se comparó con la

cepa susceptible (NO) mediante una prueba de homogeneidad de varianzas de

Levene (ANOVA de una vía), y prueba post hoc de Dunnet para la comparación

múltiple de medias (α 0.05); construyéndose además histogramas usando el

software IBM SPSS Statistic 21.0, 2007. La frecuencia de los genes de resistencia

de AChE se calculó con la ecuación de Hardy-Weinberg asumiendo que las

poblaciones se encontraban en equilibrio.

13

Resultados

De un total de 2,092 huevos capturados en todas las ovitrampas colocadas, 25.5 %

(534) correspondieron a Ae. albopictus. La cantidad de huevos recolectados fue 1.8

veces mayor en el Fraccionamiento “Huertos de Janeiro” (1,352) que en la “5 de

Febrero” (740), el porcentaje de huevos de Ae. albopictus fue de 22.3 y 31.5 %

respectivamente.

Bioensayos de susceptibilidad en larvas

La mortalidad de larvas por temefos en ambas especies fue significativamente más

baja que en la cepa susceptible NO (Fig.1). Ae. aegypti registró significativamente

menor mortalidad en la colonia “5 de Febrero” (42 %) que en “Huertos de Janeiro”

(60%) (F=325.24; gl 2; y P˂0.0001). De manera contraria Ae. albopictus exhibió

estadísticamente mayor resistencia de larvas en “Huertos de Janeiro” (mortalidades

de 65%) que en “5 de Febrero” (mortalidades de 78 %) (F=836.75; gl 2; P˂0.0001)

(Figura 1).

La mortalidad fue significativamente mayor en Ae. aegypti que en Ae. albopictus en

“5 de Febrero” (F=435.24, gl 2, P˂0.0001); mientras que en “Huertos de Janeiro” fue

similar en ambas especies (F=702.64, gl 2, P˃0.05).

14

Bioensayos de susceptibilidad en adultos

Ambas especies mostraron un patrón de mortalidad similar entre sitios muestreados

para todos los insecticidas evaluados (Figura 2). Considerando el criterio de la OMS

respecto al porcentaje de mortalidad < 80 % para considerar a una población

resistente, un porcentaje entre 80-98 % con tendencia a ser resistente y un

porcentaje > 98 % susceptible19. Los resultados mostraron que Ae. aegypti presentó

resistencia a los PYRs (10 – 47 % de mortalidad) y OPs (0 – 80 % de mortalidad).

Respecto a los CARBs, Ae. aegypti mostró una tendencia a ser resistente al

bendiocarb (88 – 91 % de mortalidad), pero susceptible al propoxur (Fig. 2). Por su

parte, Ae. albopictus exhibió resistencia al malatión (27.5 – 47.5 % de mortalidad) y

una tendencia a ser resistente al clorpirifos (80-82.5 % de mortalidad) y deltametrina

(92.5 – 97.5 % de mortalidad) en ambos sitios muestreados. Ae. albopictus exhibió

una tendencia a ser resistente a la permetrina con un 97 % de mortalidad en

“Huertos de Janeiro”, en tanto que en “5 de Febrero” exhibió susceptibilidad al 100

% (Fig. 2). Siempre exhibió susceptibilidad a ambos insecticidas CARBs en ambos

sitios muestreados (Fig. 2).

Ensayos bioquímicos

Un total de 141 mosquitos adultos (F1) de 3 a 4 días de edad fueron procesados

para cada especie por sitio muestreado. Los histogramas nos muestran el

comportamiento y distribución de los niveles enzimáticos observados para cada una

de las especies, en cada sitio de muestreo (Fig. 3). Los resultados mostraron

15

diferencias significativas en la concentración enzimática promedio con respecto a la

cepa susceptible NO (Cuadro II).

Ae. aegypti mostró niveles enzimáticos significativamente más altos que Ae.

albopictus en las enzimas α esterasas (F=121.1, gl 2, P˂0.0001), β-esterasas

(F=84.92, gl 2 P˂0.0001) y monooxigenasas (F=43.83, gl 2, P˂0.0001) del “Huertos

de Janeiro”, y de la susceptible NO. Para las GSTs, ambas especies mostraron

niveles significativos con respecto a la cepa NO, expresando mayor significancia

Ae. aegypti en ambos sitios de recolecta. La actividad de las esterasas ρ-NPA fue

significativamente mayor en Ae. albopictus en ambos sitios muestreados (5 de

Febrero: F=60.99, gl 2, P˂0.000) (Huertos de Janeiro: F=9.60, gl 2, P˂0.0001).

Las frecuencias de la AChE insensible al propoxur fueron más altas en “5 de

Febrero” para ambas especies (Ae. aegypti 0.29, n=72; Ae. albopictus 0.40, n=56),

pero mayor en Ae. albopictus, mientras que en “Huertos de Janeiro” mostraron

similar proporción para ambas especies (Ae. aegypti 0.24, n=27; Ae. albopictus

0.22, n=85).

Discusión

En este estudio se determinó el estado de resistencia y mecanismos involucrados

de Ae. aegypti y Ae. albopictus presentes en Tapachula, Chiapas, México, donde

recientemente se reportaron brotes de chikungunya y zika, manteniéndose como

zona endémica de dengue. Estos resultados son muy importantes porque el control

16

químico sigue siendo la principal herramienta utilizada para el control de vectores

en nuestro país.

Este es el primer reporte de ambas especies compartiendo criaderos artificiales en

Tapachula, aunque Ae. albopictus no parece ser tan doméstico como Ae. aegypti,

ya que este último fue recolectado en mayor proporción (74.5 %) en las mismas

ovitrampas, con niveles de resistencia diferentes entre ellas.

La variabilidad en la resistencia de ambas especies en los dos sitios de estudio

podría tener una explicación multifactorial: por el movimiento de mosquitos

susceptibles provenientes de lugares donde no se usan insecticidas que ha sido

uno de los argumentos más aceptados20; o por el menor tiempo de presión de

selección para Ae. albopictus por ser una especie más exofílica21 y con mayor

variedad de criaderos como bromelias, huecos de árboles, huecos de bambú entre

otros22.

En este estudio presentamos también por primera vez la resistencia de larvas a

temefos y de adultos a OPs de Ae. albopictus de México. Temefos es un larvicida

de gran importancia en salud pública que se ha aplicado en las últimas décadas

para el control de Ae. aegypti. Los porcentajes de mortalidad al temefos obtenidos

en los bioensayos con larvas (42% - 78 %) indican una resistencia importante para

ambos vectores, lo que implica un problema real en el control que se realiza en esta

región de México, de acuerdo a los criterios de mortalidad de la OMS19.

Trabajos previos en Ae. albopictus realizados en Asia, Europa y Estados Unidos,

han reportado resistencia de este vector principalmente a OPs como el

17

malatión23,,24, 25 26,27,28 y clorpirifos29; y baja resistencia a PYRs30, 31. Sin embargo,

nosotros observamos que la resistencia a clorpirifos y malatión registrada en Ae.

albopictus siempre fue menor que en Ae aegypti, en ambos sitios muestreados. Fue

evidente que el malatión ha ejercido mayor presión de selección sobre Ae.

albopictus que el clorpirifos, y los mecanismos que confieren resistencia a ambos

insecticidas pueden ser independientes, así mismo existe la posibilidad de que la

marcada resistencia a malatión en esta especie se deba en parte a la presión de

selección ejercida por el insecticida durante varios años en su hábitat de origen

antes de ser introducido en la región.

En Baja California se reportaron mortalidades al malatión de 94 – 100 %11 y

CENAPRECE10 reportó resistencia a malatión y clorpirifos en Coahuila y Colima.

Las poblaciones de mosquitos han estado expuestas al malatión por décadas, lo

que puede explicar la resistencia a este insecticida en ambas especies, y que haya

aparecido rápidamente como consecuencia de las acciones de control aplicadas en

zonas endémicas de dengue y al reciente brote de CHIK, ocurridos a principios de

2014 en Tapachula, Chiapas1.

La resistencia de ambas especies al malatión observada en este estudio, fue mayor

en Ae. aegypti, entre otras razones, por el comportamiento más exofílico y selvático

de Ae. albopictus, asociado a la presencia de vegetación en las zonas urbanas y las

zonas rurales21 refugiándose en lugares lejanos a las casas, como pueden ser áreas

arboladas adyacentes al peridomicilio lo que reduce el riesgo de exposición a

insecticidas.

18

Los resultados también mostraron que Ae. aegypti de ambos sitios fueron

resistentes a PYRs. Los registros indican el uso intensivo de permetrina (Aqua

Reslin) en la década de los 90´s32 y aún se observaron mortalidades menores al 50

% en ambos sitios. Pero también se encontró resistencia (<20 % de mortalidad) a

deltametrina, enlistado dentro de los insecticidas autorizados por CENAPRECE.

La resistencia de Ae. aegypti a PYRs ya ha sido reportada en varios estados del

Sur México33, 34, 35 y los mecanismos que confieren esta resistencia también han sido

determinados.

En México se han reportado para Ae. aegypti algunos mecanismos metabólicos de

resistencia a insecticidas36, 37, aunque existe solo un estudio sobre niveles de

esterasas realizado a poblaciones de Ae. albopictus recolectadas en Coahuila38.

Nuestro estudio mostró en las dos especies niveles altos de esterasas determinadas

con los tres sustratos, lo cual pudiera explicar la resistencia a OPs, ya que la

resistencia a PYRs en Ae. aegypti ha sido mayormente correlacionada con

mutaciones en el sitio blanco, sin embargo, las GSTs pudieran también estar

involucradas en la detoxificación de los productos del metabolismo de los PYR37, 39.

Por otra parte las monooxigenasas podrían estar involucradas en la incipiente

resistencia metabólica a PYR en Ae. albopictus.

Se ha reportado que las monooxigenasas pueden contribuir a la resistencia a los

OPs y estar implicadas como factor principal en muchos casos de resistencia a

CARBs y PYRs40, pero también son activadores de algunos OPs como el malatión,

convirtiéndolos en moléculas aún más tóxicas41, para estos casos, las esterasas

19

contrarrestarían la toxicidad metabolizando a las moléculas activadas de los OPs,

antes de que éstas lleguen al sitio blanco. Molina42 reportaron que las esterasas

principalmente usando ρNPA como sustrato, son las primeras que aparecen

confiriendo resistencia a OPs. En nuestro estudio, Ae. albopictus mostró actividad

elevada de las esterasas que usan el pNPA en ambas poblaciones, mientras que

para la actividad del citocromo P450 solo se mostró incrementada en “Huertos de

Janeiro”, donde se encontró mayor resistencia a malatión que los de la colonia 5 de

Febrero.

Por otro lado, Ae. albopictus fue susceptible al bendiocarb y propoxur, y el nivel de

citocromo P450 se mostró elevado solo en las poblaciones de “Huertos de Janeiro”

comparado con los niveles presentes de la cepa NO. En poblaciones de Ae.

albopictus de New Jersey USA, ya se reportaron niveles altos de citocromos P450

(Marcombe et al 2014), mientras que en otro estudio con Ae. albopictus43 no

reportaron la expresión de ningún gen de citocromos P450 cuando se indujo con

deltametrina y permetrina, pero si se observó esta expresión cuando se indujo con

benzotiazole (un lixiviado de llantas), lo que demuestra que las enzimas

monooxigenasas han sido fundamentales para el éxito de la adaptación de los

insectos de diversos hábitats44, lo que también podría explicar de alguna manera,

los niveles de estas enzimas en Ae. albopictus de la población de “Huertos de

Janeiro”.

Se ha reportado la presencia de AChE insensible en Ae. albopictus de Malasia45 y

Singapur46 y la asocian con la resistencia a OPs y CARBs. En este estudio se

registraron frecuencias de la AChE insensible al propoxur en individuos de “5 de

20

Febrero” y “Huertos de Janeiro”, sin embargo no se observó resistencia de Ae.

albopictus al CARB, esto quizá se deba a que los resultados de los ensayos

bioquímicos no coinciden con los de susceptibilidad47, ya que la dosis estándar del

propoxur fue establecida con otras especies de mosquitos y podría no ser lo

suficientemente alta para inhibir la enzima de estas poblaciones de Ae. albopictus

que nosotros evaluamos.

Los resultados de este estudio corroboran la alta resistencia a PYR en Ae. aegypti

y señalan una incipiente resistencia en Ae. albopictus hacia los insecticidas, que

aunado a los hallazgos de encontrarla compartiendo ovitrampas con Ae. aegypti,

sugiere que esta especie está en proceso de domiciliación y por lo mismo, empieza

a entrar en mayor contacto con los insecticidas. En ese sentido, en la medida que

ésta especie vaya compartiendo con mayor intensidad el nicho de Ae. aegypti, las

estrategias de manejo de resistencia a insecticidas que pudieran implementarse

para ésta especie de mayor importancia epidemiológica, impactarían

favorablemente en los niveles de susceptibilidad de Ae. albopictus, dado que ésta

última aún no presenta niveles alarmantes de resistencia.

Se considera importante continuar con otros estudios para comprobar los

mecanismos de resistencia expresados en estas poblaciones a nivel molecular y

sobre todo, estudios que permitan monitorear la participación Ae. albopictus como

vector de dengue, chikungunya y zika.

21

Agradecimientos

A CONACYT por la beca (335843) otorgada al primer autor. A Francisco Solis por

su valiosa colaboración en este estudio. Técnicos del Instituto Nacional de Salud

Pública por apoyo en las colectas de huevos, Lizbeth, Octavia y Jeovany por su

apoyo en el insectario y laboratorio.

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29

Lista de cuadros

Cuadro I. Insecticidas empleados para la determinación de susceptibilidad/resistencia en adultos de Ae. aegypti y Ae. albopictus. Cuadro II. Concentraciones enzimáticas medias (± std) registradas en Ae. aegypti y Ae. albopictus recolectados en dos localidades urbanas de Tapachula Chiapas, México.

30

Cuadro I

*Concentración diagnóstica registrada por Brogdon y Chan (2012) a un tiempo de 30 min **Determinada en este estudio a partir de una línea base de concentraciones con la cepa susceptible New Orleans

Insecticida Grupo Nombre comercial Concentración diagnóstica (µg/botella)

Permetrina* Piretroide Tipo I AquaReslin® SUPER, Bayer 15

Deltametrina* Piretroide Tipo II K-Othrine®, Bayer 10

Malatión* Organofosforado Lethal mist, Quimix 50

Clorpirifos** Organofosforado Mosquitocida UNO/ULV 60

Bendiocarb* Carbamato Ficam W, Bayer 12.5

Propoxur** Carbamato Grado técnico Químix 10

31

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32

Lista de figuras

Figura 1. Mortalidad de larvas de Ae. aegypti y Ae. albopictus de dos colonias de

Tapachula Chiapas y una cepa succeptible (New Orleans) con el larvicida temefos.

Figura 2. Mortalidad causada por seis diferentes insecticidas en adultos de Ae.

aegypti y Ae. albopictus comparada con la cepa susceptible de laboratorio New

Orleans.

Figura 3. Actividad de esterasas sobre tres sustratos (α y β naftil acetato y ρNPA),

glutatión S-transferasa (GST) y contenido de citocromos P450 en adultos de Ae.

aegypti, Ae. albopictus de dos colonias de Tapachula Chiapas y una cepa

susceptible (New Orleans).

33

Figura 1

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100

5 de Febrero Huertos deJaneiro

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Ae. aegypti

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34

Figura 2

35

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3

36

CAPITULO III

Conclusión

En sus etapas larvarias y en ambos sitios evaluados, Aedes aegypti y Ae. albopictus

mostraron resistencia hacia el OP temefos a la dosis diagnóstica de la WHO .

En su etapa adulta, Ae. aegypti mostró ser resistente a los PYR (permetrina y

deltametrina) en ambos sitios de colecta, mientras que Ae. albopictus presentó una

incipiente resistencia a deltametrina (PYR tipo II) en el sitio de colecta 5 de Febrero.

Se observó la presencia de resistencia en ambas especies hacia los OP malatión y

clorpirifos y los adultos de Ae. albopictus fueron totalmente susceptibles a propoxur

y bendiocarb (CARB) mientras que Ae. aegypti presentó resistencia solo al

insecticida bendiocarb.

Dentro de los mecanismos de resistencia involucrados en la detoxificación de

insecticidas se observó diferencias significativas entre especies, presentando un

incremento de esterasas α y β en Ae. aegypti.

Las ρNPA fueron más altas para Ae. albopictus en ambos sitios de colecta en

comparación a los niveles de NO. Las GST y citocromo P450 se encontraron

significativamente más altas en ambas especies de los dos sitios de colecta en

comparación a la cepa susceptible, sin embargo la población de Ae. albopictus del

sitio de 5 de Febrero no presentó estas diferencias.

Las dos especies de mosquitos presentaron la presencia de AChE alterada

lo que indica que es insensible a carbamatos y OP.

37

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