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Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen
Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2012
© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,
Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-121-9
Verlag: DVG Service GmbH
Friedrichstraße 17
35392 Gießen
0641/24466
www.dvg.net
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Tierärztliche Hochschule Hannover
Die Rolle von Multidrug-Transportern an der Blut-Hirn-Schranke im In-vivo-Pilocarpin-Maus-Modell für Epilepsie und
In-vitro-Transportuntersuchungen zu potenziellen PET-Tracern
THESE zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY - Ph.D. -
durch die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und das Zentrum für Systemische Neurowissenschaften (ZSN) Hannover
vorgelegt von Kerstin Römermann
aus Hannover
Hannover 2012
Supervisor: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. W. Löscher
Univ.-Prof. Dr. H. Hildebrandt
Univ.-Prof. Dr. P. Claus
1. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher (Institut für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)
Univ.-Prof. Dr. H. Hildebrandt (Institut für Zelluläre Chemie der
Medizinischen Hochschule Hannover)
Univ.-Prof. Dr. P. Claus (Institut für Neuroanatomie der Medizinischen
Hochschule Hannover)
2. Gutachten: Univ.-Prof. Dr. G. Fricker (Institut für Pharmazie und Molekulare
Biotechnologie der Universität Heidelberg)
Datum der mündlichen Prüfung: 05.10.2012
Diese Arbeit wurde durch das EU-unterstützte FP7-Projekt “EUropean Research
initiative to develop Imaging Probes for early In-vivo Diagnosis and Evaluation of
response to therapeutic Substances” (EURIPIDES) gefördert.
Für meine Familie
INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG .............................................................................................................. 1 2 LITERATURÜBERSICHT .............................................................................................. 3
2.1 Epilepsien ....................................................................................................... 3 2.1.1 Definition und Bedeutung .................................................................... 3 2.1.2 Epileptogenese .................................................................................... 5 2.1.3 Therapie .............................................................................................. 7
2.2 Pharmakoresistenz ........................................................................................ 8 2.2.1 Definition und Bedeutung .................................................................... 8 2.2.2 Mögliche Ursachen .............................................................................. 9
2.3 Multidrug-Transporter an der Blut-Hirn-Schranke .................................... 10 2.3.1 Multidrug-Transporter-Hypothese ...................................................... 10 2.3.2 Blut-Hirn-Schranke ............................................................................ 12 2.3.3 Multidrug-Transporter ........................................................................ 13 2.3.4 In-vitro-Modelle .................................................................................. 21 2.3.5 Bildgebende Verfahren ...................................................................... 24
2.4 Tiermodelle ................................................................................................... 28 2.4.1 Pilocarpin-Modell für Epilepsie .......................................................... 29 2.4.2 Genetisch veränderte Mausstämme .................................................. 30
3 ZIELSETZUNG UND ARBEITSHYPOTHESEN ................................................................. 33 4 MATERIALIEN UND METHODIK .................................................................................. 36
4.1 Tierexperimentelle Untersuchungen .......................................................... 36 4.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung ........................................................... 36 4.1.1 Implantation einer bipolaren Elektrode in den Hippocampus............. 38 4.1.2 Elektroenzephalographie- und Videoüberwachung ........................... 40 4.1.3 Induktion des Status epilepticus mittels Pilocarpin ............................ 42 4.1.4 Klassifikation der Anfallsschwere ...................................................... 43 4.1.5 Substanz-Applikation für die Quantifizierung mittels HPLC ............... 44
4.2 In-vitro-Transport-Experimente .................................................................. 47 4.2.1 Kultivierung der Zelllinien .................................................................. 47 4.2.2 Aussäen der Zellen ........................................................................... 50 4.2.3 Überprüfung der ABC-Transporter-Expression und Funktionalität .... 52 4.2.4 Transzelluläre Transport-Experimente .............................................. 53 4.2.5 Akkumulations-Assay ........................................................................ 57 4.2.6 Quantifizierung von Substanzen mittels Szintillationscounter ............ 58
4.3 Quantifizierung von Substanzen mittels HPLC ......................................... 58 4.3.1 Aufbereitung der Proben ................................................................... 59 4.3.2 Aufbau der HPLC-Anlage .................................................................. 59
INHALTSVERZEICHNIS
II
4.4 Statistische Auswertung ............................................................................. 61 5 RESULTATE ............................................................................................................ 63
5.1 Einfluss von Multidrug-Transportern auf die Induktion eines Status epilepticus und die Epileptogenese im Pilocarpin-Modell ....................... 63 5.1.1 Etablierung des Pilocarpin-Modells ................................................... 63 5.1.2 Vergleich der Pilocarpin-Dosis bis zur Auslösung des Status
epilepticus ......................................................................................... 65 5.1.3 Quantifizierung der Pilocarpin-Gehirnkonzentration .......................... 66 5.1.4 In-vitro-Untersuchungen zum Transport von Pilocarpin..................... 73 5.1.5 Charakterisierung des Pilocarpin-Modells für die FVB/N-Maus ......... 76 5.1.6 Phenytoin-Gehirngängigkeit in naiven und chronisch epileptischen
Pgp-knockout- und Wildtyp-Mäusen .................................................. 80 5.2 In-vitro-Untersuchungen von PET-Tracern zur Darstellung von Multidrug-
Transportern an der Blut-Hirn-Schranke.................................................... 82 5.2.1 Mephobarbital .................................................................................... 83 5.2.2 Verapamil .......................................................................................... 85 5.2.3 Tariquidar .......................................................................................... 87 5.2.4 Elacridar ............................................................................................ 91 5.2.5 Laniquidar .......................................................................................... 93 5.2.6 Ciprofloxacin ...................................................................................... 94 5.2.7 Übersicht der Resultate aus den In-vitro-Versuchen ......................... 96
6 DISKUSSION ........................................................................................................... 98 6.1 Pilocarpin-Modell ......................................................................................... 98
6.1.1 Etablierung des Protokolls ................................................................. 98 6.1.2 Einfluss von Pgp und BCRP auf die Pilocarpin-Gehirngängigkeit ..... 99 6.1.3 Epileptogenese .................................................................................103 6.1.4 Vergleich der Phenytoin-Gehirngängigkeit in naiven und chronisch
epileptischen FVB/N- und Pgp-Knockout-Mäusen ...........................105 6.2 In-vitro-Untersuchungen ............................................................................106
6.2.1 Mephobarbital ...................................................................................106 6.2.2 Verapamil .........................................................................................108 6.2.3 Tariquidar und Elacridar ...................................................................110 6.2.4 Laniquidar .........................................................................................114 6.2.5 Ciprofloxacin .....................................................................................115
6.3 Schlussbetrachtung ....................................................................................116 7 ZUSAMMENFASSUNG ..............................................................................................118 SUMMARY .................................................................................................................121 8 LITERATURVERZEICHNIS .........................................................................................124 9 ANHANG ...............................................................................................................141
9.1 Puffer und Lösungen ..................................................................................141 9.2 Protokoll zur Durchführung des Western Blots .......................................142
INHALTSVERZEICHNIS
III
9.2.1 Herstellung der Proteinlysate ...........................................................142 9.2.2 Vorbereitung der Proben ..................................................................143 9.2.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ........................143 9.2.4 Western Blot und Antikörperbelegung ..............................................144
9.3 Substanzen, Konzentrationen und Lösungsmittel für die Zellkulturversuche ......................................................................................145
9.4 Substanzen, Dosierungen und Applikationsvolumina für die In-vivo-Studien .........................................................................................................146
9.5 Substanzen und Medien .............................................................................146 9.6 Verbrauchsmaterialien und Geräte ............................................................149
PUBLIKATIONEN .........................................................................................................153 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG...................................................................................154 DANKSAGUNG ...........................................................................................................155
ABKÜRZUNGEN
IV
ABKÜRZUNGEN
AUC Fläche unter der Kurve (Area Under the Curve)
BCRP Humanes Breast Cancer Resistance Protein
Bcrp Murines Breast Cancer Resistance Protein
BHS Blut-Hirn-Schranke
CETA Konzentrations-Gleichgewicht-Transport-Assay (Concentration
Equilibrium Transport Assay)
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EEG Elektroenzephalographie
g Gravitationsbeschleunigung
HIV Humanes Immundefizienz Virus
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (High Performance Liquid
Chromatography)
i. p. intraperitoneal
IBE Internationales Büro für Epilepsie (International Bureau for Epilepsy)
ILAE Internationale Liga gegen Epilepsie (International League Against
Epilepsy)
MDR1 Mulidrug Resistance Protein (human)
Mdr1 Multidrug Resistance Protein (murin)
MRP Multidrug Resistance Associated Protein
PBS Phosphat-gepufferte Saline (Phosphate Buffered Saline)
PET Positronen-Emissions-Tomographie
Pgp P-Glykoprotein
SE Status epilepticus
SEM Standardfehler (Standard Error of the Mean)
TLE Temporallappenepilepsie
WHO Weltgesundheitsorganisation (World Health Organisation)
EINLEITUNG
1
1 EINLEITUNG Epilepsie ist mit über 50 Millionen betroffenen Menschen eine der häufigsten
chronisch neurologischen Erkrankungen weltweit (World Health Organisation; WHO
2005). Epilepsiekranke erleiden wiederholte, spontan auftretende konvulsive oder
nichtkonvulsive Anfälle mit oder ohne Bewusstseinsverlust. Der Begriff Epilepsie
fasst verschiedenste Syndrome und Symptome zusammen, welche sich im
wiederholten Auftreten von epileptischen Anfällen äußern (FISHER et al. 2005). Die
Ursachen, welche sich in spontanen epileptischen Anfällen manifestieren, können
bisher nicht behandelt werden. Die symptomatische Epilepsiebehandlung erster
Wahl erfolgt durch die Applikation antikonvulsiv wirkender Pharmaka (Antiepileptika).
Eine Pharmakotherapie führt jedoch bei 20 - 40 % der Epilepsiepatienten zu keiner
Langzeitverbesserung. Bei der Temporallappenepilepsie (TLE) liegt die Prävalenz
pharmakoresistenter Patienten sogar bei bis zu 75 % (SCHMIDT & LÖSCHER 2005;
SILLANPÄÄ & SCHMIDT 2006; PATI & ALEXOPOULOS 2010).
Die Definition für Pharmakoresistenz setzt voraus, dass Therapieversuche mit
mindestens zwei Antiepileptika stattfinden, welche durch unterschiedliche
Wirkmechanismen agieren und in maximal tolerabler Dosierung zu keiner
anhaltenden Anfallsfreiheit führen (KWAN et al. 2010). Eine der Hypothesen zum
Mechanismus der Pharmakoresistenz ist die Multidrug-Transporter-Hypothese
(SCHMIDT & LÖSCHER 2009). Hier wird von einer erhöhten Expression von
Multidrug-Transportern an der Blut-Hirn-Schranke (BHS) im epileptischen Fokus
ausgegangen. Physiologisch verhindern die Multidrug-Transporter an der BHS, dass
potentiell gefährliche Xenobiotika in das Gehirn gelangen können. Wird die
Expression dieser Transporter hochreguliert, kann durch einen verstärkten Efflux der
Substrate aus den Endothelzellen der Gehirnkapillaren in das Blut verhindert werden,
dass ausreichend Wirkstoff in das Gehirn gelangt. Voraussetzung hierfür ist, dass
Antiepileptika Substrate der Multidrug-Transporter sind. In entsprechenden Studien
wurde Transport einiger Antiepileptika durch den Multidrug-Transporter
P-Glykoprotein (Pgp) identifiziert (LÖSCHER & POTSCHKA 2005b; LUNA-TORTÓS
et al. 2008).
EINLEITUNG
2
In humanen Patienten mit pharmakoresistenter Epilepsie wurde eine
Überexpression des Multidrug-Transporters Pgp in reseziertem epileptischem
Gewebe nachgewiesen (zur Übersicht siehe KWAN & BRODIE 2005). Ein Vergleich
der Pgp-Expression mittels Immunhistologie in postmortalem epileptischem
Gehirngewebe von pharmakoresistenten und -sensitiven Patienten mit derselben
Epilepsieform ergab eine erhöhte Pgp-Expression in pharmakoresistenten
Epilepsiepatienten (LIU et al. 2012). Nicht-invasive Untersuchungen könnten mittels
Positronen-Emissions-Tomographie (PET) unter Verwendung von radioaktiv
markierten Substraten oder Inhibitoren als Tracer ermöglicht werden (LÖSCHER &
LANGER 2010; LÖSCHER et al. 2011). Die Ursachen für eine Hochregulation von
Pgp im epileptischen Gehirngewebe sind noch nicht abschließend geklärt. Diverse
Studien in Tiermodellen führen zu der Hypothese, dass Pgp in Gliazellen, Neuronen
und Endothelzellen der Gehirnkapillaren anfallsbedingt hochreguliert wird, um
Neurone im Gehirn vor Glutamat zu schützen (ZHU & LIU 2004; LÖSCHER &
POTSCHKA 2005b; BANKSTAHL et al. 2008a). Glutamat ist ein Substrat von Pgp,
wie mittels In-vivo- sowie In-vitro- Untersuchungen gezeigt wurde (LIU & LIU 2001).
Im Rahmen dieser PhD-Arbeit sollte zum einen die Rolle von Pgp in der
Epilepsieentstehung untersucht werden. Dazu wurde die Anfallshäufigkeit zwischen
Wildtyp- (wt-) und Pgp-Knockout-Mäusen nach einem initialen Status epilepticus
(SE), welcher durch Pilocarpin induziert wurde, verglichen. Zweitens sollte die
Gehirnaufnahme des Antiepileptikums Phenytoin in chronisch epileptischen wt- und
Pgp-Knockout-Mäusen verglichen werden. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit
war es, potentielle Tracer zur Darstellung der Funktion und Expression von Pgp an
der BHS für PET mittels In-vitro-Studien auf Substrateigenschaften ausgesuchter
Multidrug-Transporter zu untersuchen.
LITERATURÜBERSICHT
3
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1 Epilepsien
2.1.1 Definition und Bedeutung
Epilepsien zählen weltweit zu den häufigsten chronisch neurologischen
Erkrankungen des zentralen Nervensystems für Mensch, aber auch Hund und Katze
(LÖSCHER 1994; ELGER 2002; LÖSCHER 2003). Über 50 Millionen Menschen,
dies entspricht etwa einem Prozent der Weltbevölkerung, sind von dieser Erkrankung
betroffen (WHO 2005). Die von der Internationalen Liga gegen Epilepsie
(International League Against Epilepsy; ILAE) und dem Internationalen Büro für
Epilepsie (International Bureau for Epilepsy; IBE) gemeinsam erarbeitete Definition
für Epilepsien, in welcher berücksichtigt wird, dass eine erhöhte Anfallsneigung von
verschiedensten Störungen im Gehirn ausgehen kann, lautet: „Epilepsie ist eine
Störung des Gehirns, die durch eine dauerhafte Neigung zur Entwicklung
epileptischer Anfälle sowie durch die neurobiologischen, kognitiven, psychologischen
und sozialen Konsequenzen dieses Zustands gekennzeichnet ist. Die Definition einer
Epilepsie setzt das Auftreten mindestens eines epileptischen Anfalls voraus.“
(FISHER et al. 2005). Ein epileptischer Anfall wird von der ILAE und dem IBE als
„[…] ein vorübergehendes Auftreten von krankhaften Befunden und/oder Symptomen
aufgrund einer pathologisch exzessiven oder synchronen neuronalen Aktivität im
Gehirn“ definiert (FISHER et al. 2005).
Epileptische Anfälle können fokal oder generalisiert auftreten (ENGEL 2006b).
Bei einer primär generalisierten Epilepsie ist während des Anfalls das ganze Gehirn
betroffen und es bestehen keine Hinweise eines lokalen Beginns. Bei fokalen
Epilepsien geht der epileptische Anfall von einer umschriebenen Gehirnregion aus,
die als epileptischer Fokus bezeichnet wird. Die epileptischen Anfälle können hier auf
die ausgehende Gehirnregion beschränkt bleiben (fokal) oder sekundär
generalisieren und damit auf das ganze Gehirn übergreifen (ENGEL 2006b). Die
sogenannte TLE ist die häufigste der humanen Epilepsien im Erwachsenenalter und
gehört zu den fokalen Epilepsien (ENGEL 2001; SCHMIDT & LÖSCHER 2005). Das
LITERATURÜBERSICHT
4
Anfallsgeschehen der TLE beginnt in Regionen des Temporallappens wie
beispielsweise dem Hippocampus oder der Amygdala (BERTRAM 2009).
Die Symptomatik bei fokalen Anfällen hängt von der Gehirnregion des Fokus
ab. Fokale Anfälle können mit Erhaltung des Bewusstseins (einfach fokal) oder mit
Beeinträchtigung des Bewusstseins als komplex fokale Anfälle auftreten.
Generalisieren die fokalen Anfälle sekundär oder ist der Anfall primär generalisiert,
können sich Absencen (Bewusstseinsverlust), tonische (Streckkrämpfe), klonische
(Ruderkrämpfe), tonisch-klonische oder myoklonische (Muskelzuckungen) Anfälle
anschließen. Des Weiteren kann es bei generalisierten Anfällen zu einer plötzlichen
Atonie (Verlust des Muskeltonus) kommen (WESTBROOK 2000). Eine besondere
Form eines generalisierten Anfalls ist der SE, welcher durch die ILAE als
selbsterhaltender Anfall definiert wird, in dem das Bewusstsein über 30 Minuten oder
längerer Dauer nicht vollständig wiedererlangt wird (DODSON et al. 1993; NOE &
MANNO 2005).
Da der Begriff Epilepsie die Symptome verschiedener Syndrome
zusammenfasst, existieren mehrere Ursachen für Epilepsien. Als idiopathisch
werden Epilepsien bezeichnet, die sich in generalisierten Anfällen äußern, aber keine
Hinweise auf strukturelle Hirnläsionen oder andere neurologische Zeichen oder
Symptome existieren. Diese sind im Allgemeinen altersabhängig und es wird
angenommen, dass genetische Faktoren zugrunde liegen (ENGEL 2006a; BERG et
al. 2010). Epileptische Anfälle zeigen sich häufig auch symptomatisch infolge von
nachweisbaren Traumata oder Erkrankungen. Fokale Anfälle können auch kryptogen
auftreten, das heißt die Anfalls-Ursache kann nicht identifiziert werden. Dies wird als
vermutlich symptomatische Epilepsie bezeichnet (LÖSCHER & BRANDT 2010).
Epilepsie kann für die Betroffenen mit diversen psychischen Belastungen
einhergehen. Auch heute führt Epilepsie teilweise zu einer Stigmatisierung
Erkrankter, was für die Betroffenen berufliche und gesellschaftliche Folgen hat. Des
Weiteren leiden über 50 % der erwachsenen Epilepsiepatienten an psychischen
Komorbiditäten (MACHLEIDT 2004). Dies sind häufig Epilepsie-assoziierte
Depressionen und Angst- sowie kognitive Störungen (DEVINSKY 2003).
LITERATURÜBERSICHT
5
Aufgrund der Häufigkeit von Epilepsie werden außerdem volkswirtschaftlich
relevante Kosten verursacht (HAMER et al. 2011). In Europa wurden im Jahr 2004
die Gesamtkosten für Epilepsien auf rund 5.332 Euro pro Patient und Jahr geschätzt
(ANDLIN-SOBOCKI et al. 2005). In Deutschland beliefen sich die Gesamtkosten auf
alle Epilepsiepatienten umgelegt im selben Jahr auf 3.808 Millionen Euro (ANDLIN-
SOBOCKI et al. 2005). Dabei entfällt ein Großteil auf indirekte Kosten, welche
Faktoren wie vorzeitige Berentung, Produktivitätsverlust und Arbeitsausfall wegen
Epilepsie beinhalten (HAMER et al. 2006).
2.1.2 Epileptogenese Bei symptomatischen Epilepsien führt ein aktiver Prozess nach einem initialen
oder bestehenden Insult zu nachhaltigen Veränderungen im Gehirn und letztendlich
zur Epilepsie mit klinisch sichtbaren epileptischen Anfällen. Dies kann unter anderem
durch Schädel-Hirn-Traumata, Schlaganfälle, Tumoren, Fieberkrämpfe oder
Infektionen bedingt sein. Nach Schlaganfällen kann zwischen frühen Anfällen,
welche innerhalb der ersten Woche nach dem Schlaganfall auftreten, und späten
Anfällen (ab der zweiten Woche nach dem Schlaganfall) unterschieden werden
(KELLY 2002). Die Phase zwischen dem initiierenden Ereignis und dem Beginn der
symptomatischen Epilepsie wird als Latenzzeit bezeichnet, in der noch keine Anfälle
auftreten, aber das nicht-epileptische Gehirn so transformiert wird, dass es spontane
wiederkehrende Anfälle generiert. Dieser Prozess, welcher mit dem Insult beginnt
und variabel in seiner Länge ist, aber letztendlich zu einer chronischen Epilepsie
führt, wird Epileptogenese genannt (LÖSCHER & BRANDT 2010). In den betroffenen
Gehirnregionen beinhalten die chronischen Veränderungen unter anderem Zelltod,
Reorganisation neuronaler Netzwerke und Veränderungen in der Ausschüttung von
Neurotransmittern. Der fortschreitende Verlust von Neuronenstruktur oder –funktion
wird unter dem Begriff Neurodegeneration zusammengefasst (PRZEDBORSKI et al.
2003). TLE ist die am häufigsten vorkommende Insult-induzierte Epilepsie, welche
Lokalisationsabhängig ist. Sie entsteht im Mittel 7,5 Jahre nach dem initialen Insult
mit einer großen individuellen Schwankung (FRENCH et al. 1993).
Um ein besseres Verständnis für den Prozess der Epileptogenese zu
gewinnen und Zielstrukturen für frühzeitige therapeutische Interventionen nach
LITERATURÜBERSICHT
6
einem initiierenden Ereignis zu identifizieren, werden Tiermodelle eingesetzt. Die
Nationalen US-Gesundheitsinstitute (National Institutes of Health; NIH) und das
Nationale Institut für Neurologische Erkrankungen und Schlaganfälle (National
Institute of Neurological Disorders and Stroke; NINDS) empfehlen zwei Gruppen von
Tiermodellen. Dies sind Kindling- und Post-SE-Modelle in Nagern für TLE (STABLES
et al. 2003). In Kindling-Modellen werden fokale Anfälle durch wiederholte elektrische
Stimuli induziert. Dabei nimmt die Anfallsschwere mit kontinuierlicher Stimulation zu.
In Post-SE-Modellen wird durch elektrische Stimulation oder Applikation konvulsiv
wirkender Substanzen wie Pilocarpin oder Kainat ein SE induziert, welcher als
initiierendes Ereignis die Epileptogenese zur Folge hat.
Sowohl Pilocarpin als auch das darauffolgende Erleiden eines SE lösen
neuroinflammatorische Reaktionen aus (VOUTSINOS-PORCHE et al. 2004;
VEZZANI & GRANATA 2005; MARCHI et al. 2007; LÖSCHER & BRANDT 2010). In
Nagern wird nach Pilocarpin- oder Kainat-induziertem SE auch die Ausschüttung des
exzitatorischen Neurotransmitters Glutamat erhöht (HOLMES 2002). Mittels
Mikrodialyse-Untersuchungen wurde auch im Menschen gezeigt, dass die
extrazellulären Glutamat-Konzentrationen während epileptischer Anfälle bis in
potenziell neurotoxische Konzentrationen ansteigen (DURING & SPENCER 1993). In
Ratten-Modellen für Epilepsie werden die anfallsbedingt erhöhten extrazellulären
Glutamat-Konzentrationen mit dem Tod von Neuronen in Hippocampus und
parahippocampalen Strukturen assoziiert (HOLMES 2002; LÖSCHER & POTSCHKA
2005a, b). Durch In-vitro-Experimente wurde von ZHU & LIU ein Zusammenhang
zwischen hoher Glutamat-Ausschüttung und Hochregulation des Multidrug-
Transporters Pgp in Endothelzellen von Gehirnkapillaren gezeigt (ZHU & LIU 2004).
Glutamat konnte mittels In-vivo- sowie In-vitro-Experimenten als Pgp-Substrat
identifiziert werden (LIU & LIU 2001). In der hiesigen Arbeitsgruppe wurde durch
BANKSTAHL et al. (2008a) gezeigt, dass die Applikation des Glutamat-Antagonisten
MK-801 in epileptischen Ratten die erhöhte Pgp-Expression in den Endothelzellen
der Gehirnkapillaren im Hippocampus nach SE vollständig verhindert. Damit
verbunden wurde die Neurodegeneration in Hippocampus und parahippocampalen
Strukturen reduziert. Diese Studien führten zu der Hypothese, dass Pgp in
LITERATURÜBERSICHT
7
Gliazellen, Neuronen und Endothelzellen der Gehirnkapillaren hochreguliert wird, um
Neurone und Astrozyten im Gehirn vor Glutamat zu schützen (BANKSTAHL et al.
2008a).
2.1.3 Therapie
Epilepsien werden in erster Linie pharmakologisch therapiert. Eine
pharmakologische Behandlung kann bisher nicht gegen die Ursachen der Epilepsien
vorgenommen werden, sondern findet ausschließlich symptomatisch statt. Die
Pharmakotherapie erfolgt durch die Applikation antikonvulsiv wirkender Substanzen
(Antiepileptika), welche die BHS passieren müssen, um im epileptischen Gehirn
wirken zu können. Im Allgemeinen wirken Antiepileptika entweder durch die
Modulation spannungsgesteuerter Ionenkanäle, durch Verstärkung synaptischer
Inhibition oder Abschwächung synaptischer Exzitation (ROGAWSKI & LÖSCHER
2004). Um in das Gehirn gelangen zu können, sind die meisten Antiepileptika kleine,
lipophile und ungeladene Substanzen, die aufgrund dieser Eigenschaften in der
Lage sind, die BHS durch passive Diffusion, dem Konzentrationsgefälle folgend, zu
überwinden (PARDRIDGE 2003; ABBOTT et al. 2006).
Für die Wahl einer adäquaten Pharmakotherapie ist die korrekte Diagnose
des epileptischen Syndroms und der epileptischen Anfälle unabdingbar. Die
Diagnose sollte nach den Empfehlungen der ILAE unter Einbeziehung auslösender
Faktoren, der Ursachen, dem Alter bei Beginn der Epilepsie,
elektroenzephalographischer (EEG) Befunde und der Anfallsmuster erfolgen
(ENGEL 2006b). Bei Epilepsiepatienten, welche pharmakologisch nicht
zufriedenstellend therapiert werden können, kann die operative Entfernung des
epileptischen Fokus eine letzte Option darstellen. Weitere operative Eingriffe wie die
Nervus vagus-Stimulation oder die Tiefenhirn-Stimulation werden ebenfalls als
Therapieoptionen betrachtet, sofern die epileptischen Anfälle der Patienten nicht
pharmakologisch kontrolliert werden können (HOLMES et al. 2004; ZHONG et al.
2011). Dennoch werden viele Epilepsiepatienten durch diese Behandlungen nicht
anfallsfrei und müssen weiterhin mit Antiepileptika therapiert werden (LÖSCHER &
SCHMIDT 2006; ZHONG et al. 2011).
LITERATURÜBERSICHT
8
2.2 Pharmakoresistenz
2.2.1 Definition und Bedeutung
In der Vergangenheit wurden Begriffe wie therapieresistente-, medizinisch
refraktäre- oder pharmakoresistente Epilepsie häufig verwendet, wenn eine
pharmakologische Therapie nicht zur deutlichen Reduktion der Anfälle führte. Eine
einheitlich festgelegte Definition dieser Bezeichnungen existierte lange nicht, obwohl
ein Epilepsiepatient im Allgemeinen dann als pharmakoresistent galt, wenn
mindestens zwei Antiepileptika in maximal tolerabler, therapeutischer Dosierung und
mit unterschiedlichem Wirkmechanismus über eine ausreichend lange
Behandlungsdauer verabreicht wurden (SCHMIDT & LÖSCHER 2005). Zur
Erarbeitung einer international gültigen Definition wurde von der ILAE eine
Projektgruppe ernannt, welche pharmakoresistente Epilepsie wie folgt definierte:
„Adäquate Behandlungsversuche mit zwei tolerierten und angemessen
ausgewählten sowie angewandten Antiepileptika-Behandlungsprotokollen, in
Monotherapie oder in Kombination, führen zu keiner anhaltenden Anfallsfreiheit“
(KWAN et al. 2010).
Insbesondere therapieresistente Epilepsiepatienten leiden unter
schwerwiegenden neuropsychiatrischen und sozialen Beeinträchtigungen,
verbunden mit einer geringeren Lebensqualität, erhöhter Morbidität und erhöhtem
Mortalitätsrisiko (PATI & ALEXOPOULOS 2010). Pharmakoresistenz betrifft etwa
20 % aller Patienten mit primär generalisierender Epilepsie und wird bei Patienten
mit fokalen Epilepsien mit bis zu 60 % und bei TLE sogar mit bis zu 75 % aller
Patienten beschrieben (SCHMIDT & LÖSCHER 2005; SILLANPÄÄ & SCHMIDT
2006; PATI & ALEXOPOULOS 2010). Die Schwankungen der Prävalenz von
pharmakoresistenten Epilepsiepatienten in verschiedenen Studien sind durch die
lange nicht klar umrissene Definition begründet, da in jeder Studie etwas andere
Kriterien zur Definition von Pharmakoresistenz Berücksichtigung fanden (SCHMIDT
& LÖSCHER 2005).
LITERATURÜBERSICHT
9
2.2.2 Mögliche Ursachen
Es werden derzeit hauptsächlich drei Hypothesen als Ursache einer
Pharmakoresistenz bei Epilepsiepatienten diskutiert (REGESTA & TANGANELLI
1999; SCHMIDT & LÖSCHER 2005). In der Target-Hypothese wird von intrinsischen
(genetischen) oder erworbenen Veränderungen der Angriffspunkte von Antiepileptika
und einer davon verursachten veränderten Pharmakodynamik ausgegangen. Von
chronischen Veränderungen des Gehirns mit strukturellen und/oder funktionellen
Unterschieden zwischen pharmakoresistenten und pharmakosensitiven
Epilepsiepatienten in den betroffenen Regionen wird in der Netzwerk-Hypothese
ausgegangen (SCHMIDT & LÖSCHER 2009). Besonders große Aufmerksamkeit und
intensive Forschungsarbeit wurde in den letzten Jahren der Multidrug-Transporter-
Hypothese zuteil. Dieser Hypothese zufolge entsteht Pharmakoresistenz durch die
Überexpression von Multidrug-Transportern an der BHS, die den Wirkstoff verstärkt
zurück ins Blut transportieren. Dadurch wird verhindert, dass eine wirksame
Konzentration des Antiepileptikums am Zielort erreicht wird (LÖSCHER &
POTSCHKA 2005a; SCHMIDT & LÖSCHER 2009).
Um eine Hypothese als Ursache für Pharmakoresistenz akzeptieren zu
können, publizierte SISODIYA (2003) in Anlehnung an die bekannten Koch’schen
Postulate (FALKOW 1988), die die Rolle von Bakterien bei Infektionskrankheiten
beschreiben, vier Kriterien, welche erfüllt werden sollten. Der Mechanismus muss:
1. in epileptischem Gehirngewebe nachweisbar sein
2. entsprechende Funktion zeigen
3. bei Medikamentenresistenz aktiv sein
4. bei seiner Ausschaltung die Pharmakoresistenz reduzieren.
Die Ursachen einer Pharmakoresistenz sind noch nicht ausreichend
aufgeklärt. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass dabei nicht nur eine der
Hypothesen eine Rolle spielt, sondern eine Kombination aus mehreren Faktoren
zusammenkommt (REGESTA & TANGANELLI 1999; KWAN & BRODIE 2000;
SCHMIDT & LÖSCHER 2009).
LITERATURÜBERSICHT
10
2.3 Multidrug-Transporter an der Blut-Hirn-Schranke
2.3.1 Multidrug-Transporter-Hypothese
In der Multidrug-Transporter-Hypothese wird von einer Überexpression der
Multidrug-Transporter an der BHS im epileptischen Gehirngewebe ausgegangen, so
dass durch den Efflux der Antiepileptika keine wirksame Konzentration des
Antiepileptikums am Zielort erreicht wird (SCHMIDT & LÖSCHER 2009). Abbildung
2.1 stellt die Überexpression von Multidrug-Transportern im epileptischen
Gehirngewebe schematisch dar. Eine solche Überexpression scheint durch die
epileptischen Anfälle selbst ausgelöst zu werden: In verschiedenen Ratten-Modellen
für TLE wurde eine transiente Überexpression von Pgp in Endothelzellen der
Gehirnkapillaren, Astroglia und Neurone nach epileptischen Anfällen gefunden
(LÖSCHER & POTSCHKA 2005b). Dies stimmt auch damit überein, dass eine hohe
Anfallsfrequenz vor Therapiebeginn eine der Hauptvorhersagen für eine
pharmakoresistente Epilepsie ist (REGESTA & TANGANELLI 1999).
Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der physiologischen Expression von Multidrug-Transportern an der BHS (links) und der Überexpression von Multidrug-Transportern im epileptischen Gehirngewebe (rechts). Bei physiologischer Expression sind die Multidrug-Transporter auf der luminalen Seite der Gehirnkapillarendothelien lokalisiert. Wirkstoffe können in diesem Zustand durch Diffusion aus dem Blutstrom in das Gehirngewebe gelangen. Im epileptischen Fokus werden die Multidrug-Transporter in der luminalen Membran der Gehirnkapillarendothelien hochreguliert und außerdem von Astroglia und Neuronen exprimiert. Dadurch können Wirkstoffe nicht ausreichend in das Gehirngewebe gelangen. Abbildung aus LÖSCHER & POTSCHKA (2005b).
LITERATURÜBERSICHT
11
Die Multidrug-Transporter-Hypothese erfüllt in Tiermodellen für Epilepsie alle
vier Voraussetzungen, welche durch SISODIYA (2003) publiziert wurden (SCHMIDT
& LÖSCHER 2009).
1. In Tiermodellen für TLE konnte gezeigt werden, dass Anfallsaktivität eine
transiente Erhöhung der Expression von Pgp in den Endothelzellen der
Gehirnkapillaren, Astroglia und Neuronen der betroffen Gehirnregionen zur
Folge hat (RIZZI et al. 2002; SEEGERS et al. 2002; BANKSTAHL &
LÖSCHER 2008). Des Weiteren ist in Ratten aus demselben Modell für
TLE die Pgp-Expression in Antiepileptika-resistenten im Vergleich zu
-sensitiven Tieren erhöht (VOLK & LÖSCHER 2005).
2. Dies ist mit einer geringeren Aufnahme der Antiepileptika in das Gehirn
dieser Tiere assoziiert (RIZZI et al. 2002; VAN VLIET et al. 2007).
3. Einige Antiepileptika sind Substrate von Pgp (LÖSCHER & POTSCHKA
2005b; LUNA-TORTÓS et al. 2008).
4. Als wichtigster Punkt kann durch die Ko-Administration eines selektiven
Multidrug-Transporter-Inhibitors die Antiepileptika-Resistenz überwunden
werden. Dies zeigten BRANDT et al. (2006) aus der hiesigen
Arbeitsgruppe, indem Phenobarbital-resistente Ratten mit dem selektiven
Pgp-Inhibitor Tariquidar und Phenobarbital behandelt wurden, was in einer
vollständigen Wiedererlangung der antikonvulsiven Wirkung von
Phenobarbital resultierte.
Ob und inwiefern sich alle diese Faktoren auf den Menschen übertragen
lassen, ist noch unklar (LÖSCHER & SILLS 2007). In humanen Patienten mit
pharmakoresistenter Epilepsie wurde bereits eine Überexpression von Pgp in
reseziertem epileptischem Gewebe nachgewiesen (KWAN & BRODIE 2005). In
diesem Zusammenhang ist noch nicht bekannt, ob diese Überexpression kausal mit
der Antiepileptika-Resistenz zusammenhängt oder lediglich ein Epiphänomen,
verursacht durch schwere epileptische Anfälle, darstellt (LÖSCHER et al. 2011). Ein
nächster Schritt sollte der Vergleich der Pgp-Expression in epileptischem
Gehirngewebe von pharmakoresistenten und sensitiven Patienten mit derselben
Epilepsieform sein. Dies ist durch immunhistologische Untersuchungen der Pgp-
LITERATURÜBERSICHT
12
Expression in post-mortem gewonnenem Gehirngewebe bereits erfolgt. In
pharmakoresistenten Epilepsiepatienten wurde im Vergleich zu pharmakosensitiven
Epilepsiepatienten oder nicht-Epileptikern eine erhöhte Pgp-Expression festgestellt
(DURING & SPENCER 1993). In-vivo könnte eine Quantifizierung der Multidrug-
Transporter-Expression durch nicht-invasive PET-Studien mit radioaktiv markierten
Substraten oder Inhibitoren als Tracern ermöglicht werden (LÖSCHER & LANGER
2010; LÖSCHER et al. 2011). Ob die Überexpression auch mit niedrigen
Wirkstoffkonzentrationen assoziiert ist, ist noch nicht hinreichend geklärt. In einer
Studie wurde gezeigt, dass die Gehirn-Plasma-Ratio des aktiven Hauptmetaboliten
des Antiepileptikums Oxcarbazepin negativ mit der Gehirnexpression von Pgp in
pharmakoresistenten Epilepsiepatienten korreliert (MARCHI et al. 2005). Ob
Pharmakoresistenz mit der Applikation von spezifischen Inhibitoren überwunden
werden kann, ist der wichtigste Faktor, welcher gleichzeitig die größten
Schwierigkeiten in der Untersuchung mit sich bringt. Es ist noch nicht eindeutig
erwiesen, welche Antiepileptika Substrate der Multidrug-Transporter an der BHS sind
(LÖSCHER et al. 2011). Dies hängt vor allem mit einer Reihe von Schwierigkeiten in
der Wahl, Durchführung und Interpretation von In-vitro-Assays zur Identifikation von
Substraten der Multidrug-Transporter ab. Dies wird in Abschnitt 2.3.4 ausführlicher
erläutert.
2.3.2 Blut-Hirn-Schranke
Die BHS gewährleistet den Schutz des Gehirns vor potentiell gefährlichen
Fremdsubstanzen, sogenannten Xenobiotika, welche im Blut zirkulieren. Über
Diffusion oder selektive, gerichtete Transportprozesse können im Gehirn benötigte
Substanzen über diese hochselektive Barriere ins Gehirn gelangen und
Stoffwechselprodukte aus dem Gehirn in das Blut transportiert werden (ABBOTT et
al. 2006). Wesentlicher Bestandteil der BHS sind Endothelzellen, welche die
Gehirnkapillaren zur luminalen Seite auskleiden. Sie sind durch Tight-Junctions (TJs)
eng miteinander verknüpft (ABBOTT et al. 2006). Durch die Endothelzellen mit ihren
Verbindungen über TJs entsteht eine zum Blutgefäß gerichtete, kontinuierliche
Lipidschicht, wodurch die BHS außergewöhnliche physikalische Barriere-
Eigenschaften aufweist. Durch das Fehlen von Poren sowie pinozytotischen Vesikeln
LITERATURÜBERSICHT
13
in dieser Zellschicht wird der Durchtritt von großen, hydrophilen Molekülen
verhindert, wohingegen kleine, lipophile, nicht-ionisierte Moleküle leicht durch die
Lipidschicht der BHS diffundieren können (OBY & JANIGRO 2006). Neben den
Endothelzellen der Gehirnkapillaren kommt angrenzenden Perizyten und Astrozyten
ebenfalls eine wichtige Rolle in der Barriere-Funktion der BHS zu. An der BHS
zeichnen sich diese Zelltypen durch außergewöhnlich intensive Zell-Zell-
Interaktionen aus (ABBOTT et al. 2006).
Grundsätzlich können Moleküle auf zwei Arten durch Zellschichten hindurch
gelangen: Zwischen den Zellen (parazellulär) oder durch die Zellen hindurch
(transzellulär) (ABBOTT et al. 2006). Durch die BHS können Moleküle aus dem
Blutstrom überwiegend auf dem transzellulären Wege in das Gehirn gelangen. Dies
kann einerseits durch aktiven Transport oder andererseits durch passive Diffusion
erfolgen. Für Arzneimittel nimmt die Diffusion den größten Stellenwert ein, da Influx-
Transporter nur wenige körperfremde Stoffe in das Gehirn transportieren.
2.3.3 Multidrug-Transporter
Neben der physikalischen Barriere stellt die BHS auch eine funktionelle
Barriere dar. Dies wird erreicht, indem Efflux-Transporter einige der
membrangängigen Moleküle selektiv zurück in die Blutbahn transportieren (TSUJI &
TAMAI 1999; ABBOTT et al. 2006). Zum einen schützt dieser Mechanismus das
Gehirn vor potentiell gefährlichen Xenobiotika, zum anderen können auf diese Weise
Wirkstoffe, welche im Gehirn wirken sollen, nicht an ihren Wirkungsort gelangen.
Multidrug-Transporter können, abhängig von ihrer Membranlokalisation in
polarisierten Zellen, für den Efflux aber auch den Influx ihrer Substrate verantwortlich
sein. Sie kommen in Organen mit Ausscheidungsfunktion wie Leber, Niere, Darm
aber auch in Geweben mit Barriere-Eigenschaften, wie dem Gehirn, den Hoden und
der Plazenta vor. Dort schützen sie den Organismus vor potentiell gefährlichen
Xenobiotika, indem der Durchtritt von lipophilen Fremdstoffen in das betreffende
Gewebe limitiert wird (LÖSCHER & POTSCHKA 2005b).
Die Multidrug-Transporter gehören der Superfamilie der Adenosintriphosphat-
(ATP) Binding Cassette- (ABC-) Transporter an, welche durch eine stark konservierte
ATP-Bindungsdomäne charakterisiert sind (HIGGINS 1995). Epilepsie war die erste
LITERATURÜBERSICHT
14
Gehirnerkrankung, in welcher Pharmakoresistenz mit einer gesteigerten Expression
von ABC-Transportern assoziiert wurde (TISHLER et al. 1995; LÖSCHER et al.
2011). Alle Mitglieder dieser Familie fungieren als ATP-abhängige, aktive
Membrantransporter und gewährleisten den Substanztransport auch entgegen eines
Konzentrationsgefälles. Die Superfamilie der ABC-Transporter lässt sich in sieben
Subfamilien gliedern, die mit hinten angestellten Buchstaben von „A“ bis „G“ benannt
werden. Die meisten funktionellen ABC-Transporter bestehen aus zwei ATP-
Bindungsdomänen und zwei Bereichen, welche die Transmembrandomänen
enthalten. Bei den Mitgliedern der kleineren Gruppe der Halbtransporter (ABCG-
Subfamilie) liegen lediglich eine ATP-Bindungsdomäne und ein Membrandomänen-
Bereich vor. Um ein funktionelles Protein zu bilden, kommen Halbtransporter
typischerweise als Heterodimere vor (DOYLE & ROSS 2003).
Abbildung 2.2: Lokalisation verschiedener Multidrug-Transporter mit Richtung des Transports in Gehirnkapillarendothelien an der BHS. Abbildung aus LÖSCHER & POTSCHKA (2005b).
Die verschiedenen Multidrug-Transporter, welche in der BHS lokalisiert sind,
weisen niedrige Substratspezifitäten und teilweise überlappende Substratspektren
auf. Die Membranlokalisationen der Multidrug-Transporter in den Endothelzellen der
Gehirnkapillaren sind in Abbildung 2.2 gezeigt. Im Falle von Pharmakoresistenz
aufgrund einer Überexpression dieser Transporter wird davon ausgegangen, dass in
LITERATURÜBERSICHT
15
den epileptischen Hirngeweben trotz ausreichend hoher Dosierungen und
Plasmakonzentrationen der Antiepileptika keine wirksamen Konzentrationen erreicht
werden. Aufgrund des breiten Substratspektrums sind von diesem
Resistenzmechanismus viele Antiepileptika trotz unterschiedlicher chemischer
Strukturen und Wirkungsmechanismen betroffen (LÖSCHER & POTSCHKA 2005b).
Pgp, Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) und einige Multidrug Resistance-
Associated Proteine (MRPs) sind derzeit diskutierte Kandidaten in der Multidrug-
Transporter-Hypothese (LÖSCHER & POTSCHKA 2005b).
2.3.3.1 P-GLYKOPROTEIN
Pgp wurde erstmals von JULIANO & LING (1976) in Colchizin-resistenten,
immortalisierten Ovarienzellen des chinesischen Hamsters beschrieben. Mittlerweile
ist Pgp als ABC-Transporter der ABCB-Subfamilie gut charakterisiert. Das humane
Pgp wird in zwei Typen unterschieden: das Multidrug-Resistance- (MDR-) 1-Protein,
codiert vom MDR1-Gen und MDR2, codiert vom MDR2-Gen. MDR1 ist unter
anderem in den Endothelzellen der Gehirnkapillaren lokalisiert, während MDR2 in
Hepatozyten exprimiert wird und dort in der kanalikulären Membran lokalisiert ist
(LÖSCHER & POTSCHKA 2005b). Im Weiteren ist mit Pgp immer das von MDR1
beziehungsweise Mdr1 codierte Protein gemeint. Pgp besteht aus 1280
Aminosäuren und liegt in seiner phosphorylierten und glykosylierten Form mit einem
apparenten Molekulargewicht von 170 kDa vor. Pgp ist ein einziges Polypeptid und
aus zwei homologen Hälften mit je sechs α-helikalen Transmembrandomänen und
einer ATP-Bindungsstelle aufgebaut (GOTTESMAN et al. 1996; ROSENBERG et al.
1997; JONES & GEORGE 2000). Eine Substratbindungstasche ermöglicht die
simultane Bindung von zwei Substraten (LOO et al. 2003). Pgp bindet seine
Substrate in der zytosolischen Membran und dreht sie unter ATP-Hydrolyse in die
äußere Zellmembran (NERVI et al. 2010).
Das Pgp vom Mdr1-Typ in Nagern wird von zwei Genen, Mdr1a und Mdr1b,
codiert. Beide sind im Gehirn von Ratte und Maus lokalisiert, aber lediglich Mdr1a
kommt in den Endothelzellen der Gehirnkapillaren vor. Im naiven Rattengehirn wird
Mdr1a in allen Hirnregionen exprimiert, während Mdr1b hauptsächlich im
Hippocampus lokalisiert ist (KWAN et al. 2003). Mdr1a und Mdr1b verfügen über
LITERATURÜBERSICHT
16
unterschiedliche, aber teilweise überlappende Substratspezifitäten (LÖSCHER &
POTSCHKA 2005b).
Die bedeutende Rolle von Pgp für den Wirkstofftransport wurde insbesondere
durch die Verwendung von In-vitro-Modellen und Untersuchungen an Pgp-Knockout-
Mäusen aufgeklärt. Pgp transportiert strukturell nicht verwandte, hydrophobe und
amphiphatische Substanzen. Darunter sind gebräuchliche Chemotherapeutika,
Immunsupressiva, Humanes Immundefizienz Virus- (HIV-) Protease-Inhibitoren,
Calciumkanal-Blocker, Antiepileptika und andere Wirkstoffklassen (SCHINKEL &
JONKER 2003; LÖSCHER & POTSCHKA 2005b).
Zur Modulation der Pgp-Transportaktivität wurden in der Tumorforschung
bereits Inhibitoren in klinischen Studien eingesetzt, um eine Transporter-basierte
Pharmakoresistenz zu überwinden. Intensive Untersuchungen wurden mit dem Pgp-
Inhibitor Verapamil durchgeführt, welcher pharmakologisch als Calciumkanalblocker
bei Herzerkrankungen eingesetzt wird. Aufgrund der pharmakologischen
Eigenschaften von Verapamil wurden in den klinischen Studien keine ausreichenden
Plasmakonzentrationen für eine Pgp-Inhibition erreicht, ohne eine Herztoxizität zu
provozieren (DALTON et al. 1989; MILLER et al. 1991). Ähnlich verhalten sich auch
weitere Pgp-Inhibitoren der ersten Generation. Sie wurden für andere Therapien
entwickelt, und Plasmakonzentrationen zur Inhibition von Pgp können ohne nicht-
tolerierbare Toxizität selten erreicht werden. Daher wurden in der nächsten
Generation Wirkstoffe entwickelt, welche Pgp mit einer großen Selektivität und
Spezifität inhibieren, ohne andere pharmakologische Effekte auf den Organismus
auszuüben. Unter den Pgp-Inhibitoren der zweiten Generation sind Dexverapamil
oder das nicht-immunsuprimierende Cyclosporin A-Derivat PSC833 zu nennen
(BOESCH et al. 1991a; BOESCH et al. 1991b; THÜRLIMANN et al. 1995). Diese
Inhibitoren waren tatsächlich selektiver und besser tolerabel, ihre Applikation war
aber mit unvorhersehbaren pharmakokinetischen Wechselwirkungen und
Interaktionen mit anderen Transportern verbunden (BATES et al. 2002; LÖSCHER &
POTSCHKA 2005b). Das Acridoncarboxamid-Derivat Elacridar und das
Anthranilsäure-Derivat Tariquidar sind Pgp-Inhibitoren der dritten Generation und
galten als sehr spezifische Pgp-Inhibitoren ohne klinisch relevante Interaktionen mit
LITERATURÜBERSICHT
17
gebräuchlichen Chemotherapeutika (HYAFIL et al. 1993; MISTRY et al. 2001;
BATES et al. 2002; THOMAS & COLEY 2003). In weiteren Studien wurde jedoch
eine Interaktion mit BCRP aufgezeigt (DE BRUIN et al. 1999; ROBEY et al. 2004;
KANNAN et al. 2011). Eine Übersicht gebräuchlicher Pgp- und Bcrp-Inhibitoren mit
inhibitorisch wirksamen Konzentrationen auf Pgp und Bcrp in-vitro befindet sich in
Tabelle 2.1.
Tabelle 2.1: Inhibitorisch wirksame Konzentrationen gebräuchlicher Pgp- und Bcrp-Inhibitoren auf murines sowie humanes Pgp und Bcrp in-vitro. IC50 (inhibitorische Konzentration): Konzentration des Inhibitors, bei der die halbmaximale Inhibition des Transporters erreicht wird. EC90 (effektive Konzentration): Konzentration des Inhibitors, bei der eine 90 %ige Inhibition des Transporters erreicht wird.
Assay Inhibitorische Konzentration auf Pgp und Bcrp Referenzen Verapamil
Pgp Bcrp murin human murin human
Calcein-AM-Assay
10 µM (IC50)
6,3 µM (IC50)
SCHWAB et al. (2003)
Calcein-AM-Assay
60,9 µM (IC50)
RAUTIO et al. (2006)
Efflux-Assay Kein Effekt ZHANG et al. (2005)
Transport-Assay
Substrat-abhängig 10,7 µM- 34 µM (IC50)
RAUTIO et al. (2006)
Transport-Assay
1,1 µM (IC50)
PAULI-MAGNUS et al. (2000)
Tariquidar Pgp Bcrp
murin human murin human Efflux-Assay 0,223 µM
(IC50) 0,916 µM
(IC50) KÜHNLE et al. (2009)
Efflux-Assay 0,223 µM (IC50)
HUBENSACK et al. (2008)
Transport-Assay
0,015 µM (IC50)
CHOO et al. (2006)
LITERATURÜBERSICHT
18
Elacridar Pgp Bcrp
murin human murin human Efflux-Assay 0,25 µM
10 µM DE BRUIN et al.
(1999) Efflux-Assay 0,193 µM
(IC50)
0,250 µM (IC50)
KÜHNLE et al. (2009)
Efflux-Assay 0,193 µM (IC50)
HUBENSACK et al. (2008)
Zytotoxizität-Assay
0,0045 µM (EC90)
0,0051 µM (EC90)
ALLEN et al. (2002)
Laniquidar Pgp Bcrp
murin human murin human Transport-Assay
Kein Effekt bis 20 µM
BARDELMEIJER et al. (2004)
PSC833 Pgp Bcrp
murin human murin human Efflux-Assay 2,64 µM
(IC50) HUBENSACK et al.
(2008) Transport-Assay
Kein Effekt Kein Effekt ALLEN et al. (2003)
Transport-Assay
0,078 µM (IC50)
Evtl. Substrat-abhängig ab 10 µM (IC50)
MÜNSTER et al. (2008)
Ko143 Pgp Bcrp
murin human murin human Efflux-Assay Kein Effekt
unter 10 µM
0,225 µM (IC50)
KÜHNLE et al. (2009)
Zytotoxizität-Assay
5,5 µM (EC90)
0,025 µM (EC90)
0,025 µM (EC90)
ALLEN et al. (2002)
2.3.3.2 BREAST CANCER RESISTANCE PROTEIN
Die Entdeckung von BCRP fand im Jahr 1998 in einer Multidrug-resistenten
humanen Brustkrebs-Zelllinie (MCF/AdrVp) durch DOYLE und Kollegen statt
(DOYLE et al. 1998). BCRP ist nahe verwandt mit dem „white protein“ aus
Drosophila melanogaster, welches dort den ersten genetischen Marker darstellte.
Wie alle Mitglieder der ABCG- beziehungsweise white-Subfamilie ist BCRP ein
Halbtransporter (DOYLE & ROSS 2003). Humanes BCRP besteht aus 655
LITERATURÜBERSICHT
19
Aminosäuren und liegt unter Verwendung reduzierender Agenzien mit einem
apparenten Molekulargewicht von 70 kDa vor. Wird auf reduzierende Bedingungen
verzichtet, beträgt das apparente Molekulargewicht 140 kDa (DOYLE & ROSS
2003).
Mitglieder der ABCG-Subfamilie sind die einzigen bekannten ABC-
Transporter, in welchen die ATP-Bindungsstelle den Transmembrandomänen
vorangeht. Funktionelles BCRP ist ein Homodimer, welches durch Disulfidbrücken
verbunden ist (DOYLE & ROSS 2003). Die Aminosäuresequenzen des Bcrp1 der
Maus und des humanen BCRP sind zu 81 % identisch und zu 86 % homolog mit
einer sehr hohen Homologie in der ATP-Bindungsregion. Mit einer 85 %igen Identität
und 90 %igen Homologie ist das porzine BCRP dem humanen BCRP noch ähnlicher
und wurde im Schwein Brain Multidrug Resistance Protein genannt (DOYLE & ROSS
2003).
BCRP ist für den Efflux einer Reihe von Wirkstoffen wie Chemotherapeutika,
Antibiotika oder Calciumkanalblocker aus den Endothelzellen der Gehirnkapillaren
verantwortlich (ROBEY et al. 2009). Dabei liegt ein teilweise überlappendes
Substratspektrum mit Pgp vor (DOYLE & ROSS 2003; LÖSCHER & POTSCHKA
2005b). Ob auch Antiepileptika von BCRP transportiert werden, ist noch nicht
eindeutig geklärt.
Eine chemische Modulation von BCRP wurde bereits vor seiner Entdeckung in
der Überwindung von Mitoxantron-Resistenz und -Transport durch den Einsatz des
Mycotoxins Fumitremorgin C beschrieben (RABINDRAN et al. 1998). Der Pgp-
Inhibitor Elacridar wirkt ebenfalls auf BCRP inhibitorisch, muss dazu aber in höherer
Konzentration eingesetzt werden als für die Inhibition von Pgp (vergleiche Tabelle
2.1). Vorteil gegenüber Fumitremorgin C ist, das keine Neurotoxizität eintritt. Der
Nachteil ist, dass Elacridar weniger spezifisch für BCRP als Fumitremorgin C ist (DE
BRUIN et al. 1999). Der bisher vielversprechendste BCRP-Inhibitor ist das
Fumitremorgin C-Analogon Ko143. Dieser wirkt bereits in niedrigen Konzentrationen
inhibitorisch auf BCRP und zeigt keine Nebenwirkungen. Eine Inhibition von Pgp tritt
in deutlich höheren Konzentrationen auf (ALLEN et al. 2002).
LITERATURÜBERSICHT
20
2.3.3.3 MULTIDRUG RESISTANCE-ASSOCIATED PROTEIN 1
MRP1 war in der Familie der multispezifischen Organischen-Anion-
Transportproteine (MOAT) der erste identifizierte Transporter (BORST et al. 1999).
Dieser ABC-Transporter wurde erstmalig durch COLE et al. (1992) charakterisiert.
MRP1 ist ein Mitglied der ABCC-Subfamilie, welche eine der größten Unterfamilien in
der Superfamilie der ABC-Transporter darstellt (CHEN & TIWARI 2011). Dieser
Transporter besteht aus 1351 Aminosäuren, und das apparente Molekulargewicht
beträgt 190 kDa (BAKOS & HOMOLYA 2007). Anders als Pgp und BCRP ist MRP1
in der basolateralen Membran polarisierter Zellen lokalisiert (EVERS et al. 1996;
PENG et al. 1999; LESLIE et al. 2005). Eine Ausnahme stellt die MRP1-Lokalisation
an der BHS dar: In den Endothelzellen der Gehirnkapillaren kommt MRP1 ebenso
wie Pgp und BCRP in der apikalen Membran vor (SUGIYAMA et al. 2003; NIES et al.
2004; ZHANG et al. 2004).
MRP1 ist ein Transporter für Glutathion und organische Anionen, welche an
Glukuronate sowie an Sulfate konjugiert sein können. Diverse therapeutisch
wirksame Agentien wie Chemotherapeutika oder HIV-Protease-Inhibitoren werden
durch MRP1 transportiert (RENES et al. 1999; BAKOS & HOMOLYA 2007). Der
MRP1-vermittelte Transport ist komplex, denn es besteht eine Kreuz-Stimulation mit
Glutathion. Dies heißt, dass die Anwesenheit von Glutathion zum Transport diverser
Substanzen zwingend notwendig ist. Vincristin beispielsweise stimuliert den
Transport von Glutathion und vice versa (LOE et al. 1998; BAKOS & HOMOLYA
2007). Daneben existieren auch Substanzen, welche ausschließlich in Anwesenheit
von Glutathion durch MRP1 transportiert werden, aber selbst nicht verstärkend auf
den Glutathion-Transport wirken (LESLIE et al. 2001). Andere Substanzen wiederum
interagieren mit MRP1, ohne dass sie selbst transportiert werden. Dies betrifft
Verapamil oder Bioflavonoide, welche den Glutathion-Transport verstärken (LOE et
al. 2000; LESLIE et al. 2003). Verapamil verstärkt zwar den Glutathion-Transport,
wirkt aber gleichzeitig inhibitorisch auf den MRP1-vermittelten Transport anderer
Substanzen, wie Leukotrien C4 (LOE et al. 1996; LOE et al. 2000). Diverse
Flavonoide und einige weitere Pgp-Inhibitoren wirken ebenfalls inhibitorisch auf
MRP1 (BOUMENDJEL et al. 2005). MK-571 (5-(3-(2-(7-Chloroquinolin-2-
LITERATURÜBERSICHT
21
yl)ethenyl)phenyl)-8-dimethylcarbamyl-4,6-dithiaoctansäure) stellt einen selektiven
MRP-Inhibitor dar, welcher jedoch alle MRPs inhibiert. Mitglieder der MRP-Familie
werden auch durch Probenecid inhibiert, welches ebenfalls inhibitorisch auf
Transportproteine wirkt, die nicht zu den ABC-Transportern gehören (SUGIYAMA et
al. 2001; LÖSCHER & POTSCHKA 2005b).
2.3.4 In-vitro-Modelle
In-vitro-Transport-Experimente haben in verschiedensten Bereichen der
Forschung einen hohen Stellenwert erlangt. Sie werden verwendet, um Substrate
von Multidrug-Transportern identifizieren zu können (HOCHMAN et al. 2002). Es
können direkte und indirekte Verfahren unterschieden werden (SZERÉMY et al.
2011). Eine indirekte Methode ist der ATPase-Assay, in welchem die ATPase-
Aktivität des Transporters quantifiziert wird, um Substrate zu ermitteln. Direkte
Methoden sind Akkumulations-Assays, in denen die Akkumulation der Testsubstanz
in Transporter-überexprimierenden Zellen unter Verwendung spezifischer Inhibitoren
bestimmt wird, oder transzelluläre Transport-Assays (POLLI et al. 2001). Essentiell
für transzelluläre Transport-Experimente ist ein konfluenter und dichter Monolayer,
welcher praktisch keine parazelluläre Diffusion erlaubt. Endothelzellen der BHS
verfügen in-vivo über Barriere-Eigenschaften wie kein anderer Zelltyp im
Organismus. Werden die Endothelzellen der Gehirnkapillaren aber in-vitro als
immortalisierte Zelllinien kultiviert, gehen diese Eigenschaften weitgehend verloren
(DELI et al. 2005; LÖSCHER et al. 2011).
Als In-vitro-Modelle zur Untersuchung von Substanztransport an der BHS
haben sich deshalb polare Epithelzellen wie MDCK-II- oder LLC-PK1-Zellen bewährt.
Die MDCK-II- und LLC-PK1-Zellen stammen aus der Hunde- beziehungsweise der
Schweineniere und lassen sich einfach mit Fremdgenen transfizieren, was die
gezielte Überexpression bestimmter Transporter ermöglicht (LÖSCHER &
POTSCHKA 2005b). Diese Zellen bilden auch in-vitro einen dichten Monolayer aus,
was die Durchführung transzellulärer Transport-Experimente ermöglicht. Für die
transzellulären Transport-Assays werden die Zellen im Transwell®-System auf eine
semi-permeable Membran ausgesät, welche die Kammer in ein apikales und
basolaterales Kompartiment teilt (Abbildung 2.3). Beim konventionell durchgeführten
LITERATURÜBERSICHT
22
bidirektionalen Transport-Assay wird die Testsubstanz entweder in die apikale oder
in die basolaterale Kammer gegeben und kontralateral beprobt (SCHWAB et al.
2003). Im neueren Konzentrations-Gleichgewichts-Transport-Assay (CETA) wird die
Testsubstanz in gleicher Konzentration in beiden Kammern zugesetzt und die
Proben zeitgleich aus beiden Kammern entnommen (LUNA-TORTÓS et al. 2008).
Dies hat den Vorteil, dass der Transport weniger durch passive Diffusion beeinflusst
wird. Daneben hat dieser Assay gegenüber dem bidirektionalen Transport-Assay den
Vorteil, dass nur halb so viele Inserts benötigt werden. Die Analyse der Substanzen
wird durch die höhere Konzentration in beiden Kammern zudem zuverlässiger
(LUNA-TORTÓS et al. 2008).
Abbildung 2.3: Schematische Darstellung des Transwell®-Systems.
2.3.4.1 IDENTIFIKATION VON SCHWACHEN PGP-SUBSTRATEN
Bei einer physiologischen Pgp-Expression wird die Gehirnaufnahme von
Arzneimitteln, welche schwache Substrate sind, nicht kritisch herabgesetzt.
Allerdings kann eine Überexpression von Pgp auch bei schwachen Substraten dazu
führen, dass diese nur noch subtherapeutische Konzentrationen im Gehirn erreichen.
Eine einfache Dosiserhöhung würde zu nicht-tolerierbaren Nebenwirkungen führen,
da die Überexpression lediglich in epileptischem Gehirngewebe vorliegt und andere
Gewebe nicht in dem Ausmaß durch Pgp geschützt sind (LÖSCHER et al. 2011).
Die In-vitro-Assays wurden für die Identifikation starker Pgp-Substrate
optimiert und validiert, so dass schwache Substrate eventuell nicht erkannt werden
können (LÖSCHER et al. 2011). Da Pgp durch die Überexpression in multidrug-
resistenten Tumorzellen identifiziert wurde, wurden zunächst Transport-Studien
LITERATURÜBERSICHT
23
durchgeführt, um Zytostatika auf Pgp-Substrateigenschaften zu untersuchen
(HOCHMAN et al. 2002). Die Zytostatika, welche als Pgp-Substrate identifiziert
wurden, zeigen eine moderate passive Permeabilität, die für die Erkennung von Pgp-
Effekten in bidirektionalen Transport-Assays wichtig ist (LENTZ et al. 2000).
Typische Pgp-Substrate sind große Moleküle (> 400 Da), welche zwar lipophil sind,
aber aufgrund der Größe nicht so schnell durch die Membran permeieren und somit
gut an die Substratbindungstasche in der zytosolischen Membran binden können
(SCHINKEL 1999; SEELIG & LANDWOJTOWICZ 2000). Antiepileptika sind kleine,
lipophile und ungeladene Substanzen, welche aufgrund dieser Eigenschaften schnell
durch Lipidschichten diffundieren (LÖSCHER et al. 2011). Diese schnelle Diffusion
könnte den Pgp-Transport in-vitro durch erschwerte Bindung an die
Substratbindungstasche verdecken oder verhindern (LÖSCHER & POTSCHKA
2005a). Somit wird in bidirektionalen Transport-Versuchen ein eventuell vorhandener
Transport durch den Konzentrationsausgleich maskiert (LENTZ et al. 2000). In der
hiesigen Arbeitsgruppe konnte durch LUNA-TORTÓS et al. (2008) gezeigt werden,
dass unter Verwendung des CETA auch Substrate nachgewiesen werden können,
welche konventionell nicht als solche erkannt werden. Im direkten Vergleich von
bidirektionalen Transport-Assays und CETAs konnten Phenytoin und Phenobarbital
lediglich mittels CETA als Pgp-Substrate identifiziert werden. Zu ähnlichen
Schussfolgerungen kamen auch ZHANG et al. (2010), welche ebenfalls den
Transport von Phenobarbital und Phenytoin in beiden Assays verglichen.
Ob auch BCRP den Transport von Antiepilepetika vermittelt, ist weniger gut
untersucht. CERVENY et al. (2006) führten in-vitro bidirektionale Transport-
Experimente und Akkumulations-Studien mit Primidon, Phenobarbital, Phenytoin,
Carbamazepin, Lamotrigin, Clonazepin, Ethosuximid sowie Valproat in BCRP-
überexprimierenden MDCK-II-Zellen durch und fanden keine Hinweise auf Transport
der getesteten Antiepileptika. In diesen Studien könnte, ähnlich wie bei Pgp, ein
eventuell vorhandener, schwacher BCRP-vermittelter Transport durch die Wahl der
Assays verdeckt sein.
LITERATURÜBERSICHT
24
2.3.5 Bildgebende Verfahren
Nicht-invasive bildgebende Methoden haben in der klinischen Praxis zur
Diagnose diverser Erkrankungen einen hohen Stellenwert erlangt. Auch in der
Forschung werden bildgebende Verfahren zunehmend eingesetzt, da sie
Untersuchungen am lebenden Versuchstier ermöglichen. Eine Einteilung kann nach
der Art der Bilderzeugung sowie nach anatomischer und funktioneller Bildgebung
erfolgen. Anatomische Strukturen lassen sich beispielsweise mittels Computer-
Tomographie (CT), welche durch computergestützte Auswertung Schnittbilder auf
der Basis von Röntgen-Aufnahmen generiert, oder mittels Magnetresonanz-
Tomographie (MRT) darstellen. Funktionelle Bildgebung kann durch funktionelle
MRT oder durch die Radiotracer-basierten Verfahren Einzelphotonen-Emissions-
Computertomographie (Single Photon Emission Computed Tomographie; SPECT)
oder PET erfolgen (ABRAHAM & FENG 2011).
PET wurde Mitte der 70iger Jahre des 20. Jahrhunderts erstmalig als solche
erwähnt und zur medizinischen Diagnostik seither ständig weiterentwickelt (TER-
POGOSSIAN et al. 1975; BROWNELL 1999). Dieses molekulare
Bildgebungsverfahren beruht auf der Verwendung von radioaktiv markierten
Molekülen (Tracern), welche zur Darstellung der gewünschten Strukturen
entsprechend binden und von einem Scanner erfasst werden müssen. Die Isotope,
die in der PET Verwendung finden (zum Beispiel 11C), senden Positronen aus und
haben oft eine kurze Halbwertszeit. Daher hängt dieses Verfahren stark von der
Verfügbarkeit eines lokal gelegenen Teilchenbeschleunigers (Cyclotrons) ab
(BROOKS 2005).
2.3.5.1 FUNKTIONELLE DARSTELLUNG VON PGP
Bisher wurden drei verschiedene Methoden vorgestellt, welche die Evaluation
der Pgp-Funktion in-vivo mittels PET ermöglichen (KANNAN et al. 2009). Die Efflux-
Rate durch die BHS in das Blut eines intrakranial applizierten Tracers wird mittels
Blut-Efflux-Index-Methode gemessen (KAKEE et al. 1996). Die Applikationsart macht
diese Methode klinisch nicht praktikabel. Eine zweite Methode ist die metabolische
Extrusion, in welcher ein Vorläufersubstanz/Substanz-Ansatz verfolgt wird. Die
radioaktiv markierte Vorläufersubstanz muss dabei zügig die BHS passieren ohne
LITERATURÜBERSICHT
25
durch Transporter ausgeschleust zu werden, wenn sie intravenös verabreicht wird.
Im Gehirn findet eine Metabolisierung zur radioaktiv-markierten Substanz statt,
welche ein Pgp-Substrat sein muss. Dadurch kann die Efflux-Rate der Substanz
ohne Einfluss durch die Influx-Rate und die Notwendigkeit arterieller Blutentnahmen
gemessen werden. Voraussetzung hierfür ist, dass die Vorläufersubstanz innerhalb
eines kurzen Zeitraums vollständig metabolisiert wird. Limitierende Faktoren dieser
Methode sind die Synthese der Vorläufersubstanzen und die Identifikationen
spezifischer Transporter-Substrate (KANNAN et al. 2009). In der am weitesten
verbreiteten Methode wird ein radioaktiv-markiertes Pgp-Substrat eingesetzt, um die
Aufnahme in verschiedene Zielgewebe vor und nach der Applikation eines
spezifischen Inhibitors zu messen. Ein Gewebe, welches durch die Funktion von Pgp
geschützt wird, akkumuliert minimale Mengen des radioaktiven Substrates. Nach der
Pgp-Inhibition wird weit mehr Substrat in die betreffenden Organe aufgenommen
(BANKSTAHL et al. 2008b; LIOW et al. 2009). In Geweben, in welchen Pgp nicht
vorhanden oder dysfunktional ist, sollte die Substrataufnahme in geringerem Maße
durch eine Inhibition beeinflusst werden (KANNAN et al. 2009; LIOW et al. 2009). Es
sollten die drei folgenden Kriterien beachtet werden, bevor eine Substanz als
Radiotracer zur Darstellung der Pgp-Funktion ausgewählt wird:
1. Als wesentlicher Faktor muss sichergestellt sein, dass die Substanz ein
selektives Pgp-Substrat ist. Dazu sollten die potentiellen Tracer zunächst
mittels In-vitro-Assays charakterisiert werden (KANNAN et al. 2009).
2. Das zweite Kriterium ist die Auflösung des Signals, welche durch die Ratio
der Substratmenge im Gewebe zwischen Baseline-Scan und dem Scan
nach Pgp-Inhibition ermittelt wird. Insbesondere in kleinen Organen kann
es aufgrund der begrenzten anatomischen Auflösung durch In-vivo-
Bildgebung zu Unschärfe kommen (KANNAN et al. 2009).
3. Das dritte Kriterium ist die radiochemische Reinheit des Signals. Durch
PET- und SPECT wird die Gesamtradioaktivität gemessen, welche nicht
zwischen Radioligand und radioaktiven Metaboliten unterscheiden kann.
Bisher wurde noch kein Radiotracer identifiziert, welcher in allen drei Kriterien
uneingeschränkt geeignet erscheint. Diverse Pgp-Substrate wurden als PET-Tracer
LITERATURÜBERSICHT
26
in Versuchstieren evaluiert. Für die Anwendung im Menschen wurden bisher lediglich
[18F]-MPPF (2'-Methoxyphenyl-(N-2'-pyridinyl)-p-fluoro-benzamidoethyipiperazin),
[11C]-Loperamid, [11C]-N-Desmethyl-Loperamid und [11C]-Verapamil in Studien
einbezogen (KANNAN et al. 2009; DIDELOT et al. 2010; LÖSCHER & LANGER
2010). Ob [18F]-MPPF aber tatsächlich ein Pgp-Substrat ist, wird in der Literatur
derzeit kontrovers diskutiert (TOURNIER et al. 2012). Die Radiotracer [11C]-
Loperamid, [11C]-N-Desmethyl-Loperamid und [11C]-Verapamil sind starke Pgp-
Substrate und werden daher an der BHS am Durchtritt in das Gehirn gehindert.
Daraus ergibt sich der Nachteil, dass bereits bei einer schwachen Pgp-Expression
und –Funktion eine geringe Gehirnaufnahme besteht. Regionale Unterschiede von
Pgp im Gehirngewebe können nicht erkannt werden, da sich dann auch bei einer
hohen Pgp-Expression und -Funktion das Signal des Radiotracers kaum verändert
(LÖSCHER & LANGER 2010).
Besonders intensiv wurde [11C]-Verapamil in Tier und Mensch untersucht,
obwohl diese Substanz nicht alle drei Kriterien erfüllt (KANNAN et al. 2009). Zum
einen interagiert Verapamil auch mit MRP1, zum anderen wird Verapamil im
Menschen durch die Cytochrom-P450-Enzyme einer oxidativen Metabolisierung
unterworfen (LOE et al. 2000). Dadurch entstehen Radiometabolite, welche ebenfalls
Pgp-Substrate sind und somit die Quantifizierung der Pgp-Funktion erheblich
einschränken (IKOMA et al. 2006). Vorteil bei der Verwendung von Verapamil ist,
dass es ein hochauflösendes Signal produziert (KANNAN et al. 2009).
2.3.5.2 WEITERENTWICKLUNG
In der Ratte wurden bereits Studien mit [11C]-Verapamil als PET-Tracer unter
halbmaximaler Pgp-Inhibition durch Tariquidar durchgeführt. In den Untersuchungen
wurde die Gehirnaufnahme von [11C]-Verapamil zwischen Post-SE- und Kontroll-
Ratten verglichen. Mit diesem Ansatz wurde gezeigt, dass eine verminderte [11C]-
Verapamil-Aufnahme in den Gehirnregionen mit einer erhöhten Pgp-Expresssion
korreliert (BANKSTAHL et al. 2011). Für die klinische Verwendung könnte es
schwierig werden, die erforderliche Vorbehandlung mit therapeutischen Dosen von
Tariquidar in die Routine-PET einzubeziehen. Hinzu kommt, dass die Verfügbarkeit
der Substanz für den klinischen Einsatz eingeschränkt ist (MAIRINGER et al. 2012).
LITERATURÜBERSICHT
27
Daher besteht weiterer Forschungsbedarf, um die Entwicklung von geeigneten
Radiotracern zur Darstellung der Pgp-Funktion zu ermöglichen (LÖSCHER &
LANGER 2010).
In diesem Zusammenhang wurde die „Europäische Forschungsinitiative zur
Entwicklung von Bildgebungs-Sonden für frühe In-vivo-Diagnosen und Evaluation der
Resonanz auf therapeutische Substanzen“ („EUropean Research initiative to develop
Imaging Probes for early In-vivo Diagnosis and Evaluation of response to therapeutic
Substances“; EURIPIDES) ins Leben gerufen, welche vom siebten
Rahmenprogramm der Europäischen Union unterstützt wird. Untersucht werden die
Ursachen für Medikamenten-Resistenz von Patienten mit häufigen neurologischen
Erkrankungen, einschließlich Epilepsie. Unter anderem, ist ein Ziel die
[11C]-Markierung von Antiepileptika, um die Veränderungen der Pgp-Funktion mittels
PET direkt zu untersuchen. Die hiesige Arbeitsgruppe ist an der Evaluation des
Antiepileptikums Mephobarbital als PET-Tracer beteiligt, welches zur Gruppe der
Barbiturate gehört. Mephobarbital ist ein N-Methyl-Analogon des Antiepileptikums
Phenobarbital und dadurch an der Methylgruppe einfach radioaktiv zu markieren
(MAIRINGER et al. 2012). Ziel der Studien war es zu untersuchen, ob [11C]-
Mephobarbital analog zu Phenobarbital ein Substrat von Pgp ist und ob es genutzt
werden kann, um die Pgp-Funktion an der BHS mittels PET darzustellen
(MAIRINGER et al. 2012). Dies könnte letztendlich der Identifikation von
Epilepsiepatienten dienen, welchen durch die Ko-Administration von Pgp-Inhibitoren
geholfen werden kann (LÖSCHER et al. 2011).
Bei PET-Studien muss zwischen der Bestimmung von Pgp-Funktion (zum
Beispiel mittels [11C]-Verapamil) und -Expression unterschieden werden. Bisher ist
die direkte Darstellung der Pgp-Expression durch PET noch nicht möglich, da
geeignete Radiotracer fehlen (KANNAN et al. 2009; LÖSCHER & LANGER 2010).
Daher beinhalten neue Forschungsansätze die Pgp-Inhibitoren Tariquidar, Elacridar
und Laniquidar als Tracer, welche als hochaffin für Pgp und bisher als nicht-
transportiert angesehen werden. [11C]-Tariquidar und [11C]-Elacridar wurden unlängst
als PET-Tracer entwickelt, um die Pgp-Expression zu visualisieren (DÖRNER et al.
2009; BAUER et al. 2010). Diese Radiotracer wurden in der Maus und der Ratte im
LITERATURÜBERSICHT
28
zeitlichen Verlauf eines PET-Scans kaum metabolisiert. In einer ersten präklinischen
Studie konnte die Pgp-Expression an der Nager-BHS weder durch [11C]-Tariquidar
noch durch [11C]-Elacridar als PET-Tracer dargestellt werden. In Pgp- sowie Bcrp1-
Knockout-Mäusen und insbesondere Pgp/Bcrp1-Knockout-Tieren fiel gegenüber wt-
Mäusen unerwarteterweise eine erhöhte Aufnahme der beiden Tracer in das Gehirn
auf (DÖRNER et al. 2009; BAUER et al. 2010). Auch KAWAMURA et al. (2010;
2011) führten PET-Scans mit [11C]-Tariquidar und [11C]-Elacridar als Tracer in Pgp-
und/oder Bcrp1-Knockout-Mäusen durch und fanden eine Korrelation zwischen
steigender Gehirnaufnahme und der Abwesenheit von Pgp und/oder Bcrp1. Diese
Untersuchungen lieferten erste Hinweise darauf, dass Tariquidar und Elacridar
zumindest in Tracerkonzentrationen eventuell durch Pgp und BCRP transportiert
werden könnten. Auch [11C]-Laniquidar wurde bereits als PET-Tracer synthetisiert
und die Gewebeverteilung wurde post-mortem in Ratten untersucht. Dabei ergab
sich eine geringe In-vivo-Metabolisierung und eine schwache Aufnahme in das
Gehirn (LUURTSEMA et al. 2009). Somit sind noch weitere Studien notwendig, um
eventuell vorhandene Substrateigenschaften der genannten Inhibitoren für Pgp und
BCRP zu klären.
Während zur Pgp-Bildgebung schon einige Studien durchgeführt wurden,
existieren weniger Untersuchungen zu anderen Multidrug-Transportern an der BHS.
Für die Bildgebung der BCRP-Funktion werden durch das Austrian Institute of
Technology GmbH, Seibersdorf und die Medizinische Universität Wien (Österreich)
erste PET-Scans in der Maus mit dem Breitspektrum-Antibiotikum [11C]-Ciprofloxacin
aus der Gruppe der Fluorchinolone durchgeführt. Ciprofloxacin wurde mittels In-vitro-
Transport-Assays bereits als Substrat von murinem Bcrp1 sowie humanem BCRP
identifiziert (MERINO et al. 2006).
2.4 Tiermodelle Tiermodelle für Epilepsie sind essentiell, um ein besseres Verständnis für die
Mechanismen zur Entstehung einer Epilepsie zu gewinnen. Dies könnte der
Entwicklung von Präventionstherapien für Risikogruppen sowie
krankheitsmodifizierenden Therapien, um das Voranschreiten von Epilepsie zu
verhindern, dienen (LÖSCHER 2002). Weiterhin sind diese Modelle von großem
LITERATURÜBERSICHT
29
Nutzen zur besseren Aufklärung biologischer Mechanismen der Pharmakoresistenz,
welches die Entwicklung von Medikamenten zur Prävention oder Behandlung von
refraktärer Epilepsie ermöglichen könnte. Unterschieden werden zum einen akute
Anfallsmodelle, in denen die Anfälle durch elektrische oder chemische Stimulation
provoziert werden. Zweitens existieren chronische Epilepsiemodelle, in welchen die
Epilepsie elektrisch oder chemisch induziert wird, oder die Epilepsieentwicklung
durch entsprechende genetische Veränderungen bedingt ist. Es sind viele
Tiermodelle für Epilepsie oder epileptische Anfälle verfügbar, aber nur wenige
chronische Modelle finden Verwendung in pharmakologischen Studien (LÖSCHER
2002).
Chronische Epilepsiemodelle können in Modelle für erworbene
(symptomatische) und genetische (idiopathische) Epilepsie unterschieden werden
(LÖSCHER 2002). Die Epilepsieinduktion im chronischen Tiermodell erfolgt oft durch
die Erzeugung eines SE. Dieser kann durch elektrische Stimulation oder durch die
Applikation von konvulsiv wirkenden Substanzen wie Pilocarpin oder Kainat induziert
werden. Nach einer Latenzphase von einigen Tagen bis Wochen beginnt die
chronische Epilepsie, und die Tiere zeigen spontane wiederkehrende epileptische
Anfälle (TURSKI et al. 1984; MCINTYRE & RACINE 1986; BOUILLERET et al.
1999).
2.4.1 Pilocarpin-Modell für Epilepsie
Pilocarpin ist ein parasympathomimetisch wirkendes Alkaloid, welches
natürlich vorkommt und aus Jaborandiblättern (Pilocarpus jaborandi) gewonnen wird.
Die Applikation von Pilocarpin zur Induktion eines SE wurde 1983 von TURSKI et al.
zunächst im Rattenmodell und daraufhin auch für die Maus beschrieben (TURSKI et
al. 1983; TURSKI et al. 1984). Nach dem initialen SE schließt sich eine Latenzzeit
an, in der keine Anfälle beobachtet werden können. Jedoch kann es in den ersten
Tagen nach dem SE zu sogenannten Insult-assoziierten Anfällen kommen
(CAVALHEIRO et al. 1991; CURIA et al. 2008). Die Latenzzeit kann bis zu sechs
Wochen andauern. Daran schließt sich mit spontanen wiederkehrenden
epileptischen Anfällen die Phase der chronischen Epilepsie an (CURIA et al. 2008).
In der hiesigen Arbeitsgruppe wurde ein Pilocarpin-Protokoll mit fraktionierter
LITERATURÜBERSICHT
30
Applikation in der Ratte etabliert (GLIEN et al. 2001). Später wurde ein solches
Protokoll ebenfalls für die Maus angewandt (GRÖTICKE et al. 2007; MÜLLER et al.
2009b). Dies ermöglicht eine individuelle Dosierung bis der SE eintritt, verbunden mit
einer geringeren Mortalität im Vergleich mit einer Bolus-Applikation (GLIEN et al.
2001; GRÖTICKE et al. 2007).
Die Wirkungsweise von Pilocarpin zu Auslösung eines SE ist nicht
abschließend geklärt. Derzeit wird angenommen, dass Pilocarpin einen SE durch die
Aktivierung des M1-Subtyps muskarinerger Rezeptoren induziert (HAMILTON et al.
1997). Dies wird auch durch Studien von CLIFFORD und Kollegen (1987)
unterstützt, in welchen die Applikation des muskarinergen Antagonisten Atropin
einen Pilocarpin-induzierten SE verhindert. Ist ein SE bereits ausgelöst, wird dieser
durch andere Mechanismen aufrechterhalten, da Atropin dann keinen Einfluss mehr
auf den SE nimmt (CLIFFORD et al. 1987). Vielmehr wird angenommen, dass nach
einer Initiierung der Anfälle durch die Aktivierung am M1-Rezeptor diese durch N-
Methyl-D-Aspartat- (NMDA-) Rezeptor-Aktivierung aufrechterhalten werden
(SMOLDERS et al. 1997). Durch in-vitro kultivierte hippocampale Neurone wurde ein
Ungleichgewicht zwischen exzitatorischer und inhibitorischer Transmission durch die
Aktivierung der muskarinergen Rezeptoren mittels Pilocarpin demonstriert, was in
der Generierung eines SE resultierte (PRIEL & ALBUQUERQUE 2002). Pilocarpin
führt auch zu einer erhöhten Glutamat-Ausschüttung im Hippocampus, was zur Folge
hat, dass Anfälle entstehen (SMOLDERS et al. 1997).
2.4.2 Genetisch veränderte Mausstämme
Genetisch veränderte Tiere, welchen ein oder mehrere Multidrug-Transporter
fehlen, haben erheblich dazu beigetragen, den Kenntnisstand über physiologische
und pharmakologische Funktionen der entsprechenden Transporter zu erweitern
(SCHINKEL & JONKER 2003). In Transporter-Knockout-Tieren wurde diese
Expression mittels genetischer Knockout-Technologie unterbunden. Die Rolle von
Pgp an der BHS wurde intensiv an Mäusen untersucht, welchen die Pgp-Isoformen
Mdr1a (Mdr1a(-/-)-Maus) oder Mdr1a und Mdr1b (Mdr1a/b(-/-)-Maus) fehlen
(SCHINKEL et al. 1995; SCHINKEL et al. 1996; SCHINKEL et al. 1997; LÖSCHER &
POTSCHKA 2005b). Diese Knockout-Mausstämme zeigen eine normale
LITERATURÜBERSICHT
31
Lebenserwartung, Fertilität und keine physiologischen Abnormalitäten (SCHINKEL et
al. 1997). Neben den Mäusen, in welchen Pgp-Isoformen ausgeschaltet wurden,
existieren weitere Mausstämme, wie Mrp1- oder Bcrp1-defiziente (Mrp1(-/-)- oder
Bcrp1(-/-)-) Mäuse (LORICO et al. 1997; WIJNHOLDS et al. 1997). Untersuchungen
zum Zusammenspiel mehrerer Transporter werden durch die Verwendung von
Mehrfach-Knockout-Tieren ermöglicht, wie Mdr1a/b(-/-)- oder Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-
Mäuse es sind (SCHINKEL et al. 1997; JONKER et al. 2005).
Besonders häufig verwendet werden die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse, um die Rolle von
Pgp für die Gehirngängigkeit von Substanzen zu untersuchen (LÖSCHER &
POTSCHKA 2005b). Cutler et al. (2006) zeigten beispielsweise, dass in Mdr1a/b(-/-)-
Mäusen ein über 70facher Anstieg der Gehirn-Blut-Ratio des erwiesenen Pgp-
Substrates SB-487946 im Vergleich zu wt-Mäusen erreicht wird. In wt-Mäusen
erhöhte die kontinuierliche intravenöse Applikation des selektiven Pgp-Inhibitors
Elacridar die Gehirn-Blut-Ratio desselben Pgp-Substrates in ähnlicher Weise
(CUTLER et al. 2006). Die Gehirnaufnahme der Antiepileptika Carbamazepin und
Phenytoin wurde ebenfalls bereits in nicht-epileptischen Pgp-Knockout-Mäusen
untersucht. In einer Studie von SCHINKEL et al. (1996) wurden im Gewebe, inklusive
dem Gehirn, keine Unterschiede der Phenytoin-Aufnahme zwischen wt- und
Mdr1a(-/-)-Mäusen, welche die Mdr1b-Isoform weiterhin exprimieren, festgestellt.
RIZZI et al. (2002) verwendeten Mdr1a/b(-/-)-Mäuse, welchen beide Pgp-Isoformen
fehlen. Außerdem wurden, anders als in den Untersuchungen von SCHINKEL et al.
(1996), verschiedene Gehirnregionen, nämlich Hippocampus, Cortex und
Cerebellum, präpariert. Die Hippocampus-Plasma-Ratios von Phenytoin waren in
den Mdr1a/b(-/-)-Mäusen im Vergleich zu wt-Mäusen um 46 % erhöht. Signifikante
Unterschiede waren ebenfalls in der Cerebellum-Plasma- und der Cortex-Plasma-
Ratio nachweisbar. Carbamazepin wurde in derselben Studie untersucht, wobei sich
keine Unterschiede zwischen den Mdr1a/b(-/-)- und wt-Mäusen ergaben. Diese
Resultate stimmen mit anderen In-vivo- sowie In-vitro-Untersuchungen überein, in
welchen Phenytoin, aber nicht Carbamazepin, als Pgp-Substrat identifiziert wurde
(OWEN et al. 2001; VAN VLIET et al. 2007; LUNA-TORTÓS et al. 2008).
LITERATURÜBERSICHT
32
Letztendlich sollte in Studien mit Transporter-Knockout-Tieren beachtet
werden, dass in den jeweiligen Knockout-Mäusen kompensatorische Änderungen
der Expression anderer Transporter auftreten können, weil die Transporter sich unter
Umständen gegenseitig funktionell ersetzen (LÖSCHER & POTSCHKA 2005b). In
dem Zusammenhang war in Mdr1a(-/-)-Mäusen eine fünffache Hochregulation der
Mdr1b-Isoform in Leber und Niere feststellbar, aber nicht in anderen Geweben,
inklusive dem Gehirn (SCHINKEL et al. 1994). CISTERNINO et al. (2004) fanden in
Mdr1a-defizienten Mäusen ebenfalls erhöhte mRNA-Level von Bcrp an der BHS.
ZIELSETZUNG UND ARBEITSHYPOTHESEN
33
3 ZIELSETZUNG UND ARBEITSHYPOTHESEN Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sollen zu
einem besseren Verständnis der Mechanismen zum Zustandekommen
pharmakoresistenter Epilepsien führen. Auf der Grundlage des bisherigen
Kenntnisstandes wurden folgende Hypothesen erarbeitet:
1. Es ist bekannt, dass das Antiepileptikum Phenytoin ein Pgp-Substrat ist und
die Phenytoin-Gehirnaufnahme in nicht-epileptischen Pgp-Knockout-Mäusen im
Vergleich zu wt-Mäusen signifikant erhöht ist (RIZZI et al. 2002). Des Weiteren wird
in Nagern nach einem Kainat- oder Pilocarpin-induziertem SE die Pgp-Expression
auf mRNA- und Proteinebene hochreguliert (RIZZI et al. 2002; VOLK & LÖSCHER
2005; KUTEYKIN-TEPLYAKOV et al. 2009). Die Pgp-Hochregulation geht außerdem
mit einer reduzierten Phenytoin-Akkumulation im Gehirn einher (RIZZI et al. 2002;
VAN VLIET et al. 2007). Daraus ergab sich die Frage, ob zwischen chronisch
epileptischen und naiven wt- sowie Pgp-Knockout-Mäusen Unterschiede in der
Gehirngängigkeit von Phenytoin bestehen. Wir erwarteten, dass chronisch
epileptische wt-Mäuse aufgrund einer Hochregulation von Pgp weniger Phenytoin im
Gehirn akkumulieren als naive wt-Tiere. Zwischen chronisch epileptischen und
naiven Pgp-Knockout-Mäusen erwarteten wir keine Unterschiede.
2. Es ist bekannt, dass der exzitatorische Neurotransmitter Glutamat durch
einen SE vermehrt im Gehirn ausgeschüttet wird (HOLMES 2002). Dies wird als eine
von mehreren Ursachen für den Tod von Neuronen im Hippocampus und in
parahippocampalen Strukturen betrachtet. Es wurde außerdem gezeigt, dass im
Tiermodell Phenobarbital-resistente Ratten eine stärker ausgeprägte
Neurodegeneration und häufig auch eine erhöhte Anfallsfrequenz gegenüber
Phenobarbital-sensitiven Tieren aufweisen (VOLK et al. 2006). Pgp transportiert
Glutamat und wird bei einer verstärkten Glutamat-Ausschüttung an der BHS
hochreguliert (LIU & LIU 2001; ZHU & LIU 2004; BANKSTAHL et al. 2008a). Daraus
ergab sich die Hypothese, dass Pgp die Neurone im Gehirn vor Glutamat schützt
ZIELSETZUNG UND ARBEITSHYPOTHESEN
34
(BANKSTAHL et al. 2008a). Um dies zu untersuchen wurde eine chronische
Epilepsie in Pgp-Knockout- und wt-Mäusen induziert. Hier war die Erwartung, dass
Pgp-Knockout-Mäuse Anfälle in höherer Frequenz als die wt-Mäuse entwickeln, da
diese Mäuse kein Pgp exprimieren, welches das Gehirn vor Glutamat schützen kann.
3. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst das Pilocarpin-Modell
für Epilepsie in Pgp-Knockout- und Mäusen des Hintergrundstammes etabliert. Dabei
fiel auf, dass die Pgp-Knockout-Tiere weniger Pilocarpin zur SE-Induktion benötigten
als die wt-Mäuse. Bisher liegen noch keine Untersuchungen dazu vor, ob Pilocarpin
von Multidrug-Transportern an der BHS transportiert wird. Daraus ergab sich die
Frage, ob Pilocarpin ein Pgp-Substrat ist und dadurch am Durchtritt durch die BHS
gehindert wird. Daher wurde die Pilocarpin-Aufnahme in das Gehirn von Mäusen mit
genetischem oder chemischem Pgp-Knockout mit wt-Mäusen verglichen. Hier war
die Erwartung, dass Pgp-Knockout-Mäuse mehr Pilocarpin im Gehirn akkumulieren
als wt-Mäuse.
4. Mittels PET wurden bereits Fortschritte erzielt, um eine Darstellung der
Multidrug-Transporter-Funktion an der BHS zu ermöglichen (KANNAN et al. 2009;
LÖSCHER & LANGER 2010). Dies ist insbesondere von Bedeutung, um eine
Identifikation von pharmakoresistenten Epilepsiepatienten zu ermöglichen, welchen
durch eine Ko-Applikation von Pgp-Inhibitoren geholfen werden könnte. Dennoch
besteht weiterer Forschungsbedarf. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher
der Frage nachgegangen werden, ob Substanzen, welche als PET-Tracer für die
Darstellung von Funktion und/oder Expression von Multidrug-Transportern an der
BHS eingesetzt werden könnten, auch Substrate der Transporter sind. Wir
erwarteten, dass das Antiepileptikum Mephobarbital durch Pgp transportiert wird, da
es ein N-Methyl-Derivat von Phenobarbital ist, welches ebenfalls ein Antiepileptikum
und nachweislich ein Pgp-Substrat ist (LUNA-TORTÓS et al. 2008). Die Pgp-
Inhibitoren Tariquidar, Elacridar und Laniquidar gelten in der Literatur als Inhibitoren,
die nicht transportiert werden, obwohl neuere PET-Studien Hinweise auf Transport
durch Pgp und BCRP lieferten (DÖRNER et al. 2009; LUURTSEMA et al. 2009;
ZIELSETZUNG UND ARBEITSHYPOTHESEN
35
BAUER et al. 2010). Dennoch wurde aufgrund früherer In-vitro-Untersuchungen kein
Pgp- oder BCRP-vermittelter Transport erwartet (HYAFIL et al. 1993; MARTIN et al.
1999; WANG et al. 2003).
MATERIALIEN UND METHODIK
36
4 MATERIALIEN UND METHODIK Hinweis: Im Anhang sind alle verwendeten Substanzen, Verbrauchsmaterialien und Geräte sowie deren Bezugsquelle gelistet. Ferner befinden sich im Anhang die Herstellungsprotokolle verwendeter Puffer und Lösungen, sofern diese nicht im Text genannt werden.
4.1 Tierexperimentelle Untersuchungen Alle folgend genannten Substanzen, welche den Mäusen verabreicht wurden,
sind mit ihren Lösungsmitteln, Dosierungen und Applikationsvolumina im Anhang
angegeben.
4.1.1 Versuchstiere und Tierhaltung
Für die In-vivo-Untersuchungen wurden FVB/N-wt-, Mdr1a/b(-/-)-, Bcrp1(-/-)- und
Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Mäuse des gleichen Stammes verwendet. Die Mäuse wurden im
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover in einem entsprechenden Maushaltungsraum durch
Geschwisterverpaarungen gezüchtet. Die initialen Zuchtpaare wurden
freundlicherweise von Professor P. Borst und Dr. A. Schinkel (Division of Molecular
Biology, Netherlands Cancer Institute, Amsterdam) zur Verfügung gestellt. Nach dem
Absetzen von den Elterntieren im Alter von 18 bis 21 Tagen wurden die Mäuse nach
Geschlechtern getrennt in unterschiedlichen Maushaltungsräumen gehalten.
Außerdem wurden C57BL/6-, NMRI- und weitere FVB/N-Mäuse verwendet, welche
von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bezogen wurden. Eine Übersicht der
verwendeten Mausstämme und Testsubstanzen ist in Tabelle 4.1 zusammengestellt.
In den Tierhaltungsräumen wurde eine Lufttemperatur von 23 °C ± 1°C bei
einer Luftfeuchtigkeit von 50 – 60 % aufrechterhalten. Die Tiere waren zwischen
06:00 Uhr und 18:00 Uhr einer 12 stündigen Hellphase mit einer Leuchtstärke von 19
– 30 Lux in den Makrolonkäfigen ausgesetzt.
MATERIALIEN UND METHODIK
37
Tabelle 4.1: Übersichtstabelle der In-vivo-Versuche.
Mausstamm Knockout Testsubstanz Untersuchung/Bemerkungen C57BL/6 - Pilocarpin Gehirn-Akkumulation
FVB/N -
Pilocarpin SE-Induktion Pilocarpin Gehirn-Akkumulation: Unbehandelt,
mit Tariquidar- oder LiCl-Vorbehandlung
Phenytoin Gehirn-Akkumulation
FVB/N Mdr1a/b(-/-) Pilocarpin SE-Induktion Pilocarpin Gehirn-Akkumulation Phenytoin Gehirn-Akkumulation
FVB/N Bcrp1(-/-) Pilocarpin Gehirn-Akkumulation FVB/N Mdr1a/b(-/-)/
Bcrp1(-/-) Pilocarpin Gehirn-Akkumulation
Tabelle 4.2: Schema zur Kennzeichnung der Mäuse dauerhaft durch Ohrlochung und vorübergehend durch Schwanzmarkierung.
Maus-Nummer
Dauerhafte Ohrmarkierung Transiente Schwanzmarkierung
1 Kein Loch
2 Links 1 Loch
3 Rechts 1 Loch
4 Beide 1 Loch
5 Links 2 Löcher
6 Rechts 2 Löcher
7 Links 2 Löcher, rechts 1 Loch
8 Links 1 Loch, rechts 2 Löcher
9 Beide 2 Löcher
10 Links 3 Löcher
11 Rechts 3 Löcher
In Gruppen mit bis zu 10 Tieren wurden die Mäuse in Typ III- und Einzeltiere
in Typ II-Makrolonkäfigen gehalten. Leitungswasser und eine pelletierte Alleindiät
(Altromin 1324 Standarddiät, Altromin GmbH, Lage, Deutschland) wurde den
Mäusen ad libitum zur Verfügung gestellt. Dabei wurden die Mäuse auf Einstreu aus
MATERIALIEN UND METHODIK
38
Weichholzgranulat (Rettenmaier & Söhne GmbH & Co. KG, Rosenberg,
Deutschland) gehalten und je nach Gruppengröße mindestens einmal wöchentlich in
einen frischen Käfig umgesetzt.
Um die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse nachhaltig identifizieren zu können, wurden unter
Verwendung einer Lochzange Löcher in die Ohren der Tiere gestanzt. Für eine
transiente Markierung wurden die Mausschwänze mit einem wasserfesten Stift
gekennzeichnet. Eine numerische Zuordnung erfolgte wie in Tabelle 4.2 gezeigt. Alle
Tierversuche wurden nach der Genehmigung durch das Niedersächsische
Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) vom
01.12.2009 unter dem Aktenzeichen 33.9-42502-04-09/1769 durchgeführt. Dabei
wurden alle Bemühungen unternommen, um die Anzahl und die Leiden der Tiere
möglichst gering zu halten.
4.1.1 Implantation einer bipolaren Elektrode in den Hippocampus Weibliche Mäuse aus eigener Zucht wurden ab einem Alter von 21 Wochen
für den Versuch verwendet, welcher mit der Elektrodenimplantation begann. Dabei
wurde eine bipolare Elektrode in den rechten dorsalen Hippocampus der Maus
implantiert, um eine EEG-Überwachung während der Pilocarpin-Applikation und
anschließend über einen Zeitraum von 43 Tagen zu ermöglichen. Über einen
Zeitraum von insgesamt sieben Tagen (zwei Tage vor, fünf Tage nach der
Implantation) wurden die Mäuse einmal täglich mit einer Antibiose durch 4 mg/kg
Marbofloxacin subcutan versorgt, um einer Infektion vorzubeugen. Um eine exakte
Platzierung der Elektrode zu gewährleisten, wurde die Operation in einem
stereotaktischen Rahmen durchgeführt. Die Mäuse wurden zunächst mit 400 mg/kg
Chloralhydrat intraperitoneal (i. p.) narkotisiert. Je nach Bedarf wurde Chloralhydrat
in einer Dosis von 2,4 mg pro Maus nachinjiziert, wobei die Narkosetiefe durch den
Zwischenzehenreflex überprüft wurde. Den Tieren wurde das Fell über der
Schädelkalotte mit einer Schere gekürzt. Anschließend wurden die Mäuse durch
zwei Ohrstifte und einen Schneidezahnbalken in dem stereotaktischen Rahmen
fixiert und zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur auf einem Wärmekissen
abgelegt. Dabei durfte der Kopf keinen Spielraum nach lateral aufweisen, und das
Schädelplateau wurde so ausgerichtet, dass sich Bregma (rostraler Kreuzungspunkt
MATERIALIEN UND METHODIK
39
der Knochenähte) und Lambda (caudaler Kreuzungspunkt der Knochennähte)
zueinander in der Waagerechten befanden (zu sehen in Abbildung 4.1).
Abbildung 4.1: Aufsicht auf einen Mausschädel. Dargestellt sind die Kreuzungspunkte der Knochennähte Bregma und Lambda, sowie die Positionen der Elektrode, Halte- und Erdungsschrauben. Modifiziert nach PAXINOS & FRANKLIN (2001).
Bevor mit einem Skalpell ein Hautschnitt entlang der Medianen der
Kopfoberfläche geführt wurde, wurde die Haut mit 70 % Ethanol desinfiziert. Die Haut
wurde von den Faszien gelöst und mit vier Klemmen fixiert. Daraufhin wurde zur
lokalen Analgesie Bupivacain-Lösung auf das Periost geträufelt. Das Periost wurde
zunächst mit einem Periost-Schaber entfernt und danach mit einer 35 %iger
Wasserstoffperoxid-Lösung nachbehandelt. So wurden die Knochennähte
dargestellt, um eine Orientierung an Bregma nach PAXINOS & FRANKLIN (2001) für
die Lokalisation des Bohrlochs zu ermöglichen (Abbildung 4.1). Bregma wurde
mithilfe des Stereotakten mit einer Nadel angefahren, auf dem Schädel markiert und
die Werte notiert. Daraus wurde der Bohrpunkt für die Elektrode berechnet, welcher
aus der Literatur für die FVB/N-Maus nach HECK et al. (2004) leicht modifiziert
wurde. Die Werte lagen anteriorposterior -1,8 mm und laterolateral -1,6 mm zu
Bregma. Nachdem die Position des Bohrpunktes markiert war, wurden Löcher für die
Elektrode und die Halteschrauben des Hutaufbaus mittels eines 1,1 mm starken
MATERIALIEN UND METHODIK
40
Dentalbohrers gebohrt. Zwei Bohrlöcher für die Halteschrauben wurden rostral zur
Elektrodenposition im Os frontale sinister und dexter, zwei weitere Löcher wurden
lateral zur Elektrodenposition im Os laterale sinister gesetzt (Abbildung 4.1). Bei den
Bohrungen wurde die Dura mater intakt gelassen, welche daraufhin vorsichtig mit
einer spitzen Pinzette eröffnet wurde. Dies geschah, um das darunter befindliche
Gehirngewebe zu schonen. Die Elektrode wurde, ebenfalls an Bregma ausgerichtet,
über dem Bohrloch positioniert und langsam abgesenkt, bis ein dorsoventraler Wert
von -2,0 mm zu Bregma erreicht war. Die Halteschrauben wurden mit etwa zwei
Umdrehungen befestigt. Daraufhin wurde Draht um eine Halteschraube im Os
laterale sinister geführt, welche als Erdungselektrode dienen sollte. Zur Fixation der
Elektrode wurde Kunststoff-Kaltpolymerisat (Dental-Zement) verwendet, welchem
5 mg/g Marbofloxacin zur Vorbeugung einer Wundinfektion beigemengt war. Dazu
wurden die Halteschrauben mit einbezogen ohne das umliegende Gewebe zu
benetzen. Nach einer Aushärtungszeit von zehn Minuten wurde eine zweite Schicht
Dental-Zement zur vollständigen Bedeckung des Elektrodensteckers und
Modellierung des Aufbaus aufgetragen. Nach einer weiteren Aushärtungszeit wurden
die Klemmen entfernt, das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen entnommen und
die Hautwunde rostral sowie caudal der Operationsstelle mit zwei bis drei
Knopfheften genäht. Nach der Operation wurden die Mäuse in Einzelkäfige gelegt
und in Zellstoff eingewickelt, um ein Auskühlen in der Nachschlafphase zu
vermeiden. Eine postoperative Analgesie erfolgte durch die intramuskuläre
Applikation von 0,1 mg/kg Buprenorphin, welches in der Aufwachphase verabreicht
wurde, um einer Atemdepression vorzubeugen.
4.1.2 Elektroenzephalographie- und Videoüberwachung
Die EEG- und Videoüberwachung der Mäuse während und nach dem SE,
verursacht durch die Applikation von Pilocarpin, diente dem Vergleich der
Epileptogenese zwischen Mdr1a/b(-/-)-Mäusen und Mäusen des Hintergrundstammes.
Die Mäuse wurden über einen Zeitraum von bis zu 43 Tagen (24 Stunden/Tag;
sieben Tage/Woche) inklusive der SE-Induktion kontinuierlich überwacht.
MATERIALIEN UND METHODIK
41
Abbildung 4.2: Darstellung repräsentativer EEG-Aufnahmen. Oben ist die Basislinie vor der Pilocarpin-Applikation gezeigt. Mittig ist die EEG-Veränderung während eines spontanen Anfalls zu sehen. Unten ist die Veränderung im EEG während eines SE zu sehen.
In der EEG- und Videoüberwachungsanlage war eine simultane Überwachung
von maximal 16 Mäusen möglich. Dabei wurden die Mäuse einzeln in
Plexiglaskäfigen mit den Maßen von 28,5 cm Länge x 19,0 cm Breite x 28,0 cm Höhe
gehalten, welche im Institut entworfen und hergestellt wurden. Die EEG-
Überwachungsanlage bestand aus 16 Ein-Kanal-Verstärkern, zwei Acht-Kanal-
Analog-Digitalwandlern und einem Computer mit der Software LabChart6
(ADInstruments GmbH, Spechbach, Deutschland) zur Aufzeichnung. Die EEGs
wurden mit 60 Hz Low-Pass- und 0,1 Hz High-Pass-Filter mit einer Rate von 200 Hz
aufgenommen. Störsignale im Frequenzbereich des Netzstroms von 50 Hz wurden
durch einen Notch-Filter ausgeschlossen. Die Kabel zur EEG-Aufzeichnung
zwischen dem Tier und dem Ein-Kanal-Verstärker wurden zur besseren
Beweglichkeit der Mäuse durch einen Entwirrer für Kabel geführt. Parallel zur EEG-
MATERIALIEN UND METHODIK
42
Überwachung fand die Videoüberwachung statt. Dafür wurden zwei Infrarot-Kameras
verwendet, wobei jeweils acht Mäuse mit einer Kamera aufgenommen wurden. Für
die Nachtaufnahmen wurden Infrarotdioden verwendet. Die Kameras waren mit dem
Computer verbunden und die Videos wurden, wie auch die EEG-Aufnahmen, mit der
Software LabChart6 aufgezeichnet. Die Auswertung der EEG-Aufzeichnungen
erfolgte zur Bestimmung der Anfallshäufigkeit in zehnfacher Geschwindigkeit mit der
Möglichkeit, zu jedem Zeitpunkt zwischen EEG- und Videosequenzen zu wechseln.
Hierfür wurden charakteristische Veränderungen im EEG für die Erkennung der
Anfälle hinzugezogen (Abbildung 4.2).
4.1.3 Induktion des Status epilepticus mittels Pilocarpin Für die Studien in der EEG- und Videoüberwachung fand die Induktion des SE
bereits in den Überwachungskäfigen mit EEG- und Videoüberwachung statt. Die
weiblichen Mäuse wurden spätestens einen Tag vor der Pilocarpin-Applikation zur
Habituation in die Überwachungskäfige gesetzt. Hierfür wurde das Pilocarpin-
Protokoll Nummer 3 oder das Protokoll Nummer 5 angewandt (Details können
Tabelle 4.3 entnommen werden). Die Etablierung des fraktionierten Pilocarpin-
Protokolls, welches für die Mdr1a/b(-/-)-Maus und die FVB/N-Maus gleichermaßen
anwendbar sein sollte, wurde ohne anschließende Überwachung durchgeführt.
Hierfür wurden männliche und weibliche Mäuse mindesten eine Stunde vor
Versuchsbeginn in den Versuchsraum gebracht und zur besseren Beobachtung
einzeln in Makrolonkäfige des Typs II gesetzt. Am Versuchstag wurden die Mäuse
am Schwanz markiert und gewogen.
Um die peripheren Effekte des Pilocarpins zu antagonisieren, wurde den
Tieren Methylscopolaminin einer Dosierung von 1 mg/kg i. p. appliziert. Die erste
Pilocarpin-Injektion erfolgte i. p. 30 Minuten nach der Methylscopolamingabe.
Daraufhin wurde das Pilocarpin, je nach Protokoll, alle 20 oder 30 Minuten bis zum
Eintritt des SE verabreicht. Entwickelte eine Maus keinen SE, erhielt das Tier
maximal zehn Pilocarpin-Applikationen. Zur Etablierung des fraktionierten Pilocarpin-
Protokolls für die FVB/N-Maus wurden verschiedene Dosierungen und Intervalle
getestet. Die verwendeten Pilocarpin-Dosierungen und -Intervalle sind Tabelle 4.3 zu
entnehmen.
MATERIALIEN UND METHODIK
43
Tabelle 4.3: Verwendete Pilocarpin-Protokolle mit der Bolus-Dosis, der Folge-Dosis und der Zeit zwischen den einzelnen Applikationen.
Protokoll-Nr. Bolus-Dosis (mg/kg)
Folge-Dosis (mg/kg)
Zeit zwischen Applikationen
(Minuten)
1 100 100 20
2 200 50 20
3 100 50 30
4 100 50 20
5 150 50 20
Nach 90 minütiger Dauer wurde der SE durch eine i. p. Injektion von
Diazepam abgebrochen. Diazepam wurde als Fertigarzneimittel (Faustan®) 1:5
verdünnt, was zu einer Dosierung von 10 mg/kg führte. Nach dem Abklingen der
Krämpfe sowie am Abend des Versuchstages wurden den Mäusen 0,5 ml
Sterofundin® VG-5 als Flüssigkeit-, Elektrolyt- und Kohlenhydratsubstitution subcutan
verabreicht. Den Tieren wurden an den darauffolgenden Tagen in Wasser
aufgeweichte Pellets angeboten und je nach Verfassung bis zu drei Mal täglich
Sterofundin® VG-5 appliziert.
4.1.4 Klassifikation der Anfallsschwere Die Bewertung der Intensität der Anfälle während der Pilocarpin-Applikation
und der anschließenden EEG- und Videoüberwachung erfolgte, modifiziert, nach
RACINE (1972). RACINE (1972) bewertete die Krampfintensitäten von gekindelten
Ratten anhand der motorischen Anfallsausprägung und teilte sie in fünf Stadien ein.
Fokale Anfälle werden mit den Anfallstypen 1 bis 3 beschrieben, während die Typ 4-
und 5-Anfälle generalisierte klonische Anfälle darstellen. Diese Klassifikation findet
üblicherweise auch Verwendung in anderen Epilepsiemodellen und auch zur
Beurteilung der Anfallsschwere bei der Maus. Typ 1-Anfälle äußern sich demnach in
auftretender Immobilität und einem schwachen Fazialklonus, welcher sich durch
MATERIALIEN UND METHODIK
44
Blinzeln mit den Augen, stereotypes Schnüffeln oder Zittern der Tasthaare
präsentieren kann. Anfälle des Typs 2 gehen mit schweren Fazialklonien einher;
kommen noch unilaterale Vorderextremitäten-Klonien hinzu, wird dies als Typ 3-
Anfall beschrieben. Bei einem Typ 4-Anfall liegen bilaterale Klonien der
Vorderextremitäten vor, wobei die Stellreflexe erhalten bleiben. Erleiden die Tiere
beidseitige Klonien der Vorderextremitäten mit Verlust der Stellreflexe, wodurch sie
zur Seite oder nach hinten umfallen, wird dieser Anfall als Typ 5 klassifiziert. In den
Untersuchungen der vorliegenden Arbeit erfolgte die Bewertung der Anfallstypen an
RACINE (1972) orientiert, durchgängige EEG-Aktivität mit Konvulsion von mehr als
fünf Minuten Dauer war ausschlaggebend für die Einordnung als SE.
4.1.5 Substanz-Applikation für die Quantifizierung mittels HPLC
Um die Phenytoin-Aufnahme in das Gehirn von chronisch epileptischen
Mdr1a/b(-/-)- und wt-Mäusen mit nicht-epileptischen Tieren zu vergleichen, wurden die
Phenytoin-Konzentrationen im Gehirn mittels Hochleistungsflüssigkeits-
chromatographie (High Performance Liquid Chromatography; HPLC) quantifiziert.
Die Aufnahme von Pilocarpin in das Gehirn von Mdr1a/b(-/-)-, Bcrp1(-/-)-,
Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)- und wt-Mäusen wurde ebenfalls unter Verwendung der HPLC
analysiert.
4.1.5.1 PHENYTOIN
Es wurden weibliche und männliche Mdr1a/b(-/-)-Mäuse und FVB/N-Mäuse für
die Phenytoin-Applikation verwendet. Die Tiere waren zum Zeitpunkt des Versuchs
etwa 49 Wochen alt. Bei einer Teil-Gruppe von Mdr1a/b(-/-)- sowie FVB/N-Mäusen
wurde fünf Monate zuvor durch die Auslösung eines SE durch Pilocarpin entweder
unter Anwendung von Protokoll 1 oder Protokoll 3 (Tabelle 4.3) eine chronische
Epilepsie induziert. Den Tieren wurden 30 mg/kg Phenytoin i. p. appliziert. Nach 70
Minuten wurden die Mäuse getötet und die Gehirngewebe für die HPLC-Analytik
homogenisiert.
4.1.5.2 PILOCARPIN
Um den Zeitpunkt der höchsten Pilocarpin-Aufnahme in das Gehirn zu
identifizieren, wurde zunächst die Gehirnpharmakokinetik von Pilocarpin bestimmt.
MATERIALIEN UND METHODIK
45
Dies geschah, um im fraktionierten Pilocarpin-Protokoll die Zeitabstände zwischen
den Pilocarpin-Applikationen zum Zeitpunkt der maximalen Gehirnaufnahme wählen
zu können. Dazu wurden weibliche FVB/N-Mäuse verwendet. Den Mäusen wurde
Pilocarpin in einer Dosierung von 50 mg/kg i. p. verabreicht. Die Tiere wurden nach
5, 10, 15, 20, 30, 60 und 120 Minuten dekapitiert, um die Aufnahme in das
Gehirngewebe zu untersuchen. Es ist bekannt, dass verschiedene Mausstämme
unterschiedlich empfindlich auf Pilocarpin reagieren (BORGES et al. 2003; CHEN et
al. 2005; WINAWER et al. 2007). Daher wurde ein Stammvergleich zwischen
C57BL/6, NMRI und FVB/N-Mäusen durchgeführt, um zu untersuchen, ob die
Unterschiede in der Pilocarpin-Gehirngängigkeit begründet sind. Hier wurden
weibliche Tiere im Alter von sieben bis neun Wochen verwendet. Die Dosierung des
Pilocarpins wurde beibehalten, und die Tötung aller weiteren Tiere fand 20 Minuten
nach der Applikation statt.
Weibliche und männliche wt-, Mdr1a/b(-/-)-, Bcrp1(-/-)- und Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-
Mäuse aus eigener Zucht sowie wt-Mäuse, welche von Charles River (Sulzfeld,
Deutschland) bezogen wurden, wurden im Alter zwischen 27 und 80 Wochen in den
Versuch einbezogen. Für den Vergleich zwischen Wildtyp- und den oben genannten
Knockout-Mäusen, wurde Pilocarpin in einer Dosierung von 50 mg/kg i. p.
verabreicht. Einer Gruppe von sechs Wildtyp-Tieren wurde 60 Minuten vor der
Pilocarpin-Injektion 15 mg/kg Tariquidar intravenös appliziert. Diese Tariquidar-
Dosierung führt zu einer vollständigen Pgp-Inhibition in-vivo (KUNTNER et al. 2010).
Einer weiteren Gruppe von männlichen wt-Mäusen wurde etwa 17 Stunden vor der
Pilocarpin-Injektion 10 Milliäquivalente (mEq)/kg (423,3 mg/kg) Lithium-Chlorid (LiCl)
i. p. verabreicht. Lithium wird üblicherweise als Stimmungsstabilisator bei manisch-
depressiven Erkrankungen, aber auch zur Behandlung von akuten Gehirninsulten
und neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt (CURIA et al. 2008). In der Ratte
ermöglicht die Vorbehandlung mit LiCl eine erhebliche Reduktion der Pilocarpin-
Dosis bis zur SE-Induktion (CLIFFORD et al. 1987). Auch in Mäusen existieren
Studien die dies zeigen, allerdings unter Verwendung höherer LiCl-Dosen als bei
Ratten (SHALDUBINA et al. 2007). Daher sollte untersucht werden, ob die LiCl-
Vorbehandlung Effekte auf die Gehirngängigkeit von Pilocarpin hat. In einem
MATERIALIEN UND METHODIK
46
weiteren Vergleich zwischen männlichen wt- und Mdr1a/b(-/-)-Tieren wurden 200
mg/kg Pilocarpin i. p. appliziert.
4.1.5.3 TÖTUNG DER TIERE UND GEWEBE- SOWIE BLUTENTNAHME
Die Mäuse wurden durch CO2 narkotisiert. Daraufhin erfolgte eine retrobulbäre
Blutentnahme. Hierfür wurden die Tiere sicher fixiert und der retrobulbäre
Venenplexus mit einer Hämatokrit-Kapillare punktiert. Etwa 500 µl Blut wurden in
einem 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß aufgefangen, in welches 20 µl
Ethylendiamintetraacetat- (EDTA-) Lösung (5 mmol/ml) zur Gerinnungshemmung
vorgelegt worden waren. Nachdem die Mäuse durch cervikale Dislokation getötet
wurden, wurde der Kopf unter Zuhilfenahme einer Schere abgetrennt. Mit einer
Schere wurde der dorsale Bereich der Schädelkalotte eröffnet, ohne das darunter
liegende Gehirngewebe zu beschädigen. Nach vorsichtiger Abtrennung der Bulbi
olfactorii und der Gehirnnerven wurde das Gehirn entnommen. Für die HPLC-
Analyse nach der Phenytoin-Applikation wurden verschiedene Gehirnregionen
präpariert. Unterschieden wurden hierbei Hippocampus, Cerebellum, frontaler und
temporaler Cortex (Abbildung 4.3).
Abbildung 4.3: Darstellung der präparierten Gehirnregionen für die Phenytoin-Quantifizierung. Präpariert wurden Cerebellum, Hippocampus (Hippoc), temporaler und frontaler Cortex. Der temporale Cortex ist auf der Abbildung nicht zu sehen. Modifiziert nach PAXINOS & FRANKLIN (2001).
MATERIALIEN UND METHODIK
47
Nach der Pilocarpin-Injektion wurde das Gesamtgehirn ohne Bulbus
olfactorius entnommen und teilweise wurde auch der linke Hippocampus präpariert.
Die Präparation der Einzelregionen fand auf einem Gefrierblock statt, auf welchem
das Gehirn aufgefroren wurde. Mittels feiner gebogener Pinzette und einer Skalpell-
Klinge wurden die Gehirnregionen vorsichtig von rostral nach caudal präpariert.
Daraufhin wurden die Gehirnregionen gewogen und in 5 ml-Polypropylen-Röhrchen
auf Eis überführt, in welche 0,5 ml bidestilliertes Wasser vorgelegt worden war.
Gesamtgehirn sowie Gehirnhälften wurden auf Eis in 20 ml-Glasröhrchen gegeben,
in welchen 5 ml beziehungsweise 2,5 ml bidestilliertes Wasser vorgelegt waren. Die
Proben wurden homogenisiert und für die Quantifizierung mittels HPLC weiter
aufbereitet.
4.2 In-vitro-Transport-Experimente
4.2.1 Kultivierung der Zelllinien
Alle Arbeiten in der Zellkultur wurden unter sterilen Bedingungen und
ausschließlich unter der Sterilbank durchgeführt. Verwendete Chemikalien, Puffer
und Pufferlösungen wurden autoklaviert oder sterilfiltriert. Alle Reaktionsgefäße und
Kryokonservierungsgefäße wurden vor ihrer Verwendung mit 70 % Ethanol
desinfiziert.
Für die Transportuntersuchungen wurden immortalisierte, polare
Epithelzelllinien verwendet, um die Endothelien einer BHS in-vitro nachzustellen.
Kultiviert wurden MDCK-II-Zellen (im Folgenden MDCK-Zellen genannt), welche im
Jahr 1958 von MADIN & DARBY aus der Niere einer adulten Cocker Spaniel Hündin
(Canis familiaris) isoliert wurden und von GAUSCH et al. (1966) charakterisiert
wurden. Des Weiteren waren LLC-PK1-Zellen (im Folgenden als LLC-Zellen
bezeichnet) in Kultur, welche aus einer Schweineniere (Sus scrofa) stammen und
von HULL et al. (1976) erstmals beschrieben wurden. Für die Untersuchungen mit
den entsprechenden Multidrug-Transportern wurden diese Zellen als Wildtyp (wt)
und transfiziert verwendet. Die Zelllinien können Tabelle 4.4 entnommen werden.
MATERIALIEN UND METHODIK
48
Tabelle 4.4: Für die In-vitro-Versuche verwendete Zelllinien.
Ursprungszelllinie Transfiziertes
Gen Spezies Bezeichnung
MDCK
BCRP Mensch MDCK-BCRP
Bcrp1 Maus MDCK-Bcrp1
MDR1 Mensch MDCK-MDR1
MRP1 Mensch MDCK-MRP1
LLC
MDR1 Mensch LLC-MDR1
Mdr1a Maus LLC-Mdr1a
MRP1 Mensch LLC-MRP1
Alle Zelllinien wurden freundlicherweise von Professor P. Borst und Dr. A.
Schinkel (Division of Molecular Biology, Netherlands Cancer Institute, Amsterdam,
Niederlande) zur Verfügung gestellt. Für die Transportstudien wurden transfizierte
Zelllinien nach dem Auftauen maximal zehn Mal passagiert, die wt-Zelllinien wurden
bis zu 20 Passagen nach dem Auftauen verwendet. Die Zellen wurden jedoch
frühestens nach der dritten Passage für den Versuch ausgesät. Die MDCK-BCRP-
Zellen zeigten bereits in frühen Passagen eine deutliche Abnahme der BCRP-
Expression und exprimierten zudem viel endogenes Pgp, weshalb mit dieser Zelllinie
keine weiteren Versuche durchgeführt wurden. Eine Übersicht der verwendeten
Zelllinien, einschließlich der Testsubstanzen und eingesetzten Inhibitoren kann
Tabelle 4.5 entnommen werden.
Alle Zelllinien waren in Kryokonservierungsgefäßen in flüssigem Stickstoff
gelagert. Zunächst wurden die Zellen im Einfriermedium im Wasserbad bei 37°C
aufgetaut. Anschließend wurden die Zellen zügig, je nach Zelllinie im
entsprechenden Medium aufgenommen und im 15 ml-Reaktionsgefäß 1 Minute bei
800xg sedimentiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml vorgewärmtem Medium
resuspendiert und auf 10 cm-Gewebekulturschalen überführt. Daraufhin wurden die
Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Am nächsten Tag fand ein Mediumwechsel
statt, wie später beschrieben.
MATERIALIEN UND METHODIK
49
Tabelle 4.5: Übersichtstabelle der verwendeten Zelllinien, Testsubstanzen und Inhibitoren in den In-vitro-Versuchen.
Zelllinie tranfiziertes Transporter-Gen
Testsubstanz +/- Inhibitor
Bemerkungen
LLC-MDR1 MDR1 (human)
Ciprofloxacin Tariquidar Ko143 zur Inhibition von endogenem Bcrp
Elacridar PSC833 Laniquidar PSC833 Mephobarbital Tariquidar Tariquidar PSC833 Verapamil Tariquidar
LLC-Mdr1a Mdr1a (murin)
Ciprofloxacin Tariquidar Ko143 zur Inhibition von endogenem Bcrp
Elacridar PSC833 Laniquidar PSC833 Mephobarbital Tariquidar Pilocarpin PSC833 teilw. Ko143 zur
Inhibition von endogenem Bcrp
Tariquidar PSC833
LLC-MRP1 MRP1 (human)
Mephobarbital MK571
MDCK-Bcrp1 Bcrp1 (murin)
Ciprofloxacin Ko143 Tariquidar zur Inhibition von endogenem Pgp
Elacridar Ko143 Laniquidar Ko143 Pilocarpin Ko143 teilw. Tariquidar zur
Inhibition von endogenem Pgp
Tariquidar Ko143
MDCK-MDR1 MDR1 (human)
Tariquidar -
MDCK-MRP1 MRP1 (human)
Ciprofloxacin MK571 Tariquidar zur Inhibition von endogenem Pgp
Die MDCK-Zellen wurden in DMEM® kultiviert, während die LLC-Zellen in
Medium199® kultiviert wurden. Beiden Medien wurde 10 % fetales Kälberserum und
1 % Penicillin/Streptomycin zugesetzt. Vor dem Erreichen der Konfluenz wurden die
Zellen abhängig von der Zelldichte 1:4 bis 1:12 gesplittet. Dazu wurde zunächst das
MATERIALIEN UND METHODIK
50
Medium von den Zellen abgesaugt und mindestens 5 ml Phosphat-gepufferte Saline
(Phosphate Buffered Saline; PBS) auf die Zellen pipettiert. PBS wurde ebenfalls
wieder abgesaugt. Die Zellen wurden ein weiteres Mal, wie zuvor, mit PBS
gewaschen. Im Anschluss wurde 1 ml angewärmte Trypsin-EDTA-Lösung auf die
Zellen gegeben und bis zum Ablösen der Zellen im Inkubator inkubiert. Die Zellen
wurden in Medium aufgenommen und in 15 ml-Reaktionsgefäßen 1 Minute bei 800xg
sedimentiert. Währenddessen wurden frische 10 cm-Gewebekulturschalen mit 9 ml
Medium vorbereitet. Das Medium auf den sedimentierten Zellen wurde
abgenommen. Hinterher wurden die Zellen dem Passagier-Verhältnis entsprechend
in frischem Medium resuspendiert. Anschließend wurde je 1 ml Zellsuspension auf
die vorbereiteten Gewebekulturschalen pipettiert. Die Schalen wurden einige
Sekunden lang vorsichtig manuell geschwenkt, um die Zellen gleichmäßig zu
verteilen. Spätestens alle drei Tage fand ein Mediumwechsel statt. Dazu wurde das
alte Medium von der Gewebekulturschale abgesaugt und 10 ml frisches Medium
wurden hinzugegeben.
4.2.2 Aussäen der Zellen
Alle Zelllinien wurden so ausgesät, dass die In-vitro-Versuche im dreifach-
Ansatz erfolgen konnten. Die LLC-Zellen wurden mit einer Million Zellen pro ml auf
transparente Corning-Transwells® (0,4 µm Porengröße; 4 x 106 Poren/cm2) ausgesät.
Mit 1,3 Millionen Zellen pro ml wurden die MDCK-Zellen auf transluzente Greiner-
Inserts (0,4 µm Porengröße; 1 x 108 Poren/cm2) gebracht. Zuvor wurde mit
Referenzsubstraten im CETA experimentell ermittelt, welche Inserts für die jeweiligen
Zelllinien am besten geeignet waren (siehe Abschnitt 5.2). Für die Akkumulations-
Assays wurden die Zellen auf 6-Well-Platten ausgesät, welche mit einem Volumen
von 3 ml Medium pro Kammer kultiviert wurden. Dabei wurden die LLC-Zellen mit 0,8
Millionen Zellen/ml und die MDCK-Zellen mit einer Million Zellen/ml in die Kammern
gesät. Die Zelllinien wurden frühestens mit einer Konfluenz von 70 % ausgesät. Alle
verwendeten Membranen bestanden aus Polyethylenterephthalat und die Inserts
wurden im 6-Well-Format verwendet. Die ausgesäten Zellzahlen sollten am
folgenden Tag zu einer 100 %igen Konfluenz der Monolayer führen. Die Inserts
wurden mit den entsprechenden Zellmedien mindestens eine Stunde vor Aussaat der
MATERIALIEN UND METHODIK
51
Zellen im Brutschrank inkubiert. Dabei wurde in die apikalen Kammern 1,5 ml und in
die basolateralen Kammern 2,5 ml Zellkulturmedium pipettiert (Abbildung 4.5 A).
Diese Volumina wurden für die gesamte Dauer der Kultivierung auf den Inserts
beibehalten. Die Zellen wurden wie im vorherigen Abschnitt beschrieben abgelöst
und in 50 ml Reaktionsgefäße überführt. Daraufhin wurden die Zellen bei 800xg
pelletiert und das Medium wurde abgesaugt. Die Zellen wurden in 10 ml Medium
aufgenommen und für die anschließend durchgeführte Zellzählung 1:5 mit
Kulturmedium verdünnt, welchem Trypan-Blau (1:5 verdünnt) zur Identifikation toter
Zellen beigemengt war. Mittels Fuchs-Rosenthal-Kammer wurden ausschließlich
lebende Zellen in vier diagonalen und zwei Groß-Quadraten in den Ecken gezählt.
Die Berechnung der tatsächlichen Zellzahl pro ml erfolgte nach folgender Formel:
Zellzahl/ml=gezählte Zellzahl
Anzahl gezählter Quadrate ×Verdünnung (5)×Kammerfaktor (5000)
Die Zellsuspension wurde zum Einstellen der gewünschten Zellzahl mit einem
entsprechenden Volumen an Medium aufgefüllt. Nachdem das Medium aus der
apikalen Kammer wieder abgesaugt wurde, wurden 1,5 ml Zellsuspension in die
Kammer gegeben. Wurden die Zellen auf 6-Well-Platten ausgesät, wurden 3 ml
Zellsuspension in jede Kammer pipettiert. Am darauffolgenden Tag wurde die
Konfluenz der Zellen auf den transparenten Corning-Transwells® oder 6-Well-Platten
beurteilt und die Monolayer auf allen Inserts beziehungsweise in allen Kammern
wurden zur Entfernung abgestorbener Zellen einmal mit PBS gewaschen. Nach dem
Erreichen der 100 %igen Konfluenz wurden die Zellen bis zum Versuch fünf bis
sieben Tage weiterkultiviert. Während dieser Zeit fand jeden zweiten Tag ein
kompletter Austausch des Mediums statt. Hierfür wurde in den Transwell-Platten das
Medium zunächst aus der basolateralen Kammer abgesaugt, um ein Aufschwemmen
der Monolayer durch den Druck der Flüssigkeit zu verhindern. Dann wurde das
Medium aus der apikalen Kammer entfernt. In gleicher Reihenfolge wurde frisches
Medium in die Kammern pipettiert.
MATERIALIEN UND METHODIK
52
4.2.3 Überprüfung der ABC-Transporter-Expression und Funktionalität
Um die Pgp- und Bcrp-Expression auf Proteinebene in den verwendeten
Zelllinien zu überprüfen, wurden in regelmäßigen Abständen Western Blots
durchgeführt. In
Abbildung 4.4 sind die Pgp- und die Bcrp-Banden sowie die Proteinbanden
des ubiquitär vorhandenen Aktins zu sehen, welches als Housekeeping-Protein
mitgeführt wurde. Die Beschreibung und Durchführung der Methode befindet sich im
Anhang. Die Funktionalität der Transporter wurde mit der Zugabe von 640 nM
Vincristinsulfat auf Pgp-überexprimierende Zellen (in Anlehnung an SCHINKEL et al.
1995) beziehungsweise von 20 µM Mitoxantron auf Bcrp1-überexprimierende Zellen
(experimentell ermittelt) evaluiert. Weiterhin wurden bekannte Referenzsubstrate
(siehe Anhang) während des jeweiligen transzellulären Transport-Experiments
repräsentativ mitgeführt oder in den genutzten Zellen für Akkumulations-Assays in
anderer Passage verwendet.
Abbildung 4.4: Darstellung repräsentativer Western Blots zur Überprüfung der Pgp- und Bcrp-Expression auf Proteinebene. A zeigt die Pgp-Banden in den LLC-MDR1- und LLC-Mdr1a-Zellen, in B ist die Bcrp-Bande der MDCK-Bcrp1-Zellen zu sehen.
Als Referenzsubstrat für die Pgp-überexprimierenden Zellen wurde Digoxin,
für die Bcrp-überexprimierenden Zellen Mitoxantron und für die MRP1-
überexprimierenden Zellen Calcein-AM verwendet. Die verwendeten Transporter-
Inhibitoren, Referenzsubstrate und getesteten Substanzen sowie deren
A B
MATERIALIEN UND METHODIK
53
Lösungsmittel können mit den entsprechenden Konzentrationen dem Anhang
entnommen werden.
4.2.4 Transzelluläre Transport-Experimente
4.2.4.1 BIDIREKTIONALER TRANSPORT-ASSAY
Für die Untersuchungen zum Verapamil- und Tariquidar-Transport durch Pgp
wurden bidirektionale Transport-Assays mit den entsprechenden LLC-Zelllinien
durchgeführt. Die Zellen wurden, wie im Abschnitt 4.2.2 beschrieben, auf Corning-
Transwells® im 6-Well-Format ausgesät und fünf bis sieben Tage nach Erreichen der
100 %igen Konfluenz für den Versuch verwendet. Am Versuchstag wurde die
Qualität der Monolayer mikroskopisch überprüft und die Optimem®-Medien für die
einstündige Vorinkubation eingefüllt. Die Vorinkubationsmedien enthielten bereits die
verwendeten Inhibitoren oder deren Lösungsmittel (siehe Anhang). Während des
gesamten Versuchsverlaufes wurden die Zellen im Brutschrank bei 50
Umdrehungen/Minute auf einem Akku-Schüttler inkubiert. Während der
Vorinkubation wurde das Versuchsmedium angesetzt, welches ebenfalls Optimem®
zur Grundlage hatte. Die Versuchsmedien enthielten die Testsubstanz und/oder
Inhibitoren oder deren Lösungsmittel. Bevor ein Wechsel auf das Versuchsmedium
mit Volumina von 2 ml in den apikalen und 2,7 ml in den basolateralen Kammern
erfolgte (um einen Einfluss durch hydrostatischen Druck zu vermeiden), wurde der
transepitheliale elektrische Widerstand (transepithelial electrical resistance; TEER)
mittels einer entsprechenden Messkammer ermittelt. Auch bei der Beendigung des
Versuchs erfolgte eine TEER-Messung. Eine weitere Kontrolle zur Integrität der
Monolayer war der parazelluläre Flux von [14C]-markiertem Mannitol in einem
repräsentativen Transwell® pro Zelllinie und Versuchsansatz. Dabei wurden
Monolayer mit einem apparenten parazellulären Permeabilitäts-Koeffizienten (Papp)
für Mannitol von der basolateralen in die apikale Kammer (b-A) von mehr als 12 nm/s
sowie Monolayer mit TEER-Werten unter 100 Ωcm2 nicht in die Auswertung
einbezogen. Ein Ausschlusskriterium war außerdem eine TEER-Abnahme von >
25 % des Ausgangswertes. Im bidirektionalen Transport-Assay wurde die Substanz,
welche getestet werden sollte, entweder in die apikale oder in die basolaterale
MATERIALIEN UND METHODIK
54
Kammer gegeben (Abbildung 4.5). Wenn Pgp-Inhibitoren eingesetzt wurden, wurden
diese in gleicher Konzentration in beiden Kammern zugesetzt. Die Probenentnahmen
erfolgten nach 60, 120, 240 und 360 Minuten aus der jeweils kontralateralen
Kammer. In den Assays mit über 600 Minuten Dauer fanden zwei weitere
Probenentnahmen statt, welche, sofern nicht anders angegeben, nach 480 und 600
Minuten durchgeführt wurden. Das entnommene Probenvolumen aus beiden
Kompartimenten betrug 100 µl. Um die Flüssigkeitsstände auf gleichem Niveau zu
halten, wurden aus den kontralateralen Kammern Ausgleichsvolumina entnommen
(130 µl apikal, 77 µl basolateral) und verworfen. Mannitol wurde ausschließlich in die
basolateralen Kammern pipettiert und in den apikalen Kammern beprobt. Die Proben
wurden in 1,5 ml-Eppendorf-Gefäßen gesammelt und für die Messung im β-
Szintillationscounter weiter aufbereitet.
Abbildung 4.5: Bidirektionaler Transport-Assay. A: Die Zellen werden auf einer semi-permeablen Membran zu einem konfluenten Monolayer ausgesät, welcher das Well in eine basolaterale (luminal) und eine apikale (abluminal) Kammer teilt. Im Versuch wird die Testsubstanz entweder in die basolaterale oder die apikale Kammer gegeben und über einen definierten Zeitraum werden die Proben kontralateral entnommen. B: Konzentrationsveränderungen des bekannten Pgp-Substrats Digoxin in Pgp-überexprimierenden LLC-Zellen in der apikalen (rot) und der basolateralen (blau) Kammer über 600 Minuten. Es ist Pgp-vermittelter Transport von Digoxin vorhanden, denn die cTR ist mit 4,82 > 1,5 (bewertet nach SCHWAB et al. 2003). Abbildung A ist aus LÖSCHER & POTSCHKA (2005b) entnommen, Abbildung B zeigt eigene Daten.
Dargestellt werden die Substanz-Konzentrationen in beiden Kammern in
Prozent, wobei die initial eingesetzte Konzentration 100 % entspricht. In Abbildung
MATERIALIEN UND METHODIK
55
4.5 ist ein bidirektionaler Transport-Assay am Beispiel des bekannten Pgp-Substrats
Digoxin in LLC-MDR1 Zellen gezeigt. Der Papp der getesteten Substanzen wurde von
der basolateralen in die apikale Kammer und vice versa (a-B) nach ARTURSSON
(1990) berechnet, welcher in nm/s angegeben wurde und im Folgenden dargestellt
ist:
Papp [nm/s]=dQr/dt
A × C0×60
wobei dQr/dt (DPM/Minute) die Steigung der Konzentration über die Zeit in der
beprobten Kammer, A die Wachstumsfläche der Monolayer und C0 die
Initialkonzentration der Substanz zum Zeitpunkt t=0 war. Der Quotient der Papp (b-A)
durch Papp (a-B) gab die Transportratio (TR) an. Die korrigierte Transportratio
(corrected transport-ratio; cTR) ergab sich aus der TRüberexprimierend dividiert durch die
TRwt (SCHWAB et al. 2003). Nach SCHWAB et al. (2003) wurde eine cTR von über
1,5 als Pgp-spezifischer Transport bewertet. Des Weiteren musste ein spezifischer
Inhibitor auf den überexprimierenden Zellen zu einer deutlichen Verringerung der TR
verglichen mit den Zellen ohne Inhibition führen.
4.2.4.2 KONZENTRATIONS-GLEICHGEWICHT-TRANSPORT-ASSAY (CETA)
Der CETA wurde für die Untersuchungen zum Transport der Substanzen
Mephobarbital, Verapamil, Tariquidar, Elacridar, Pilocarpin und Ciprofloxacin
verwendet. Dazu wurden, je nach Fragestellung, MDCK- beziehungsweise LLC-
Zellen eingesetzt, welche die entsprechenden Transporter überexprimierten. Das
Aussäen der Zellen erfolgte wie im Abschnitt 4.2.2 beschrieben. Fünf bis sieben
Tage nach dem Erreichen der Konfluenz von 100 % wurde der CETA durchgeführt.
Die Vorinkubation fand wie beim bidirektionalen Transport-Assay statt. Ebenso
fanden die Kriterien zum Ausschluss der LLC-Monolayer durch den Papp (b-A) von
Mannitol und den TEER-Wert Anwendung. MDCK-Monolayer wurden in der
Auswertung des Versuchs nicht berücksichtigt, wenn Mannitol einen Papp (b-A) von
12 nm/s überstieg, der TEER-Wert < 80 Ωcm2 war oder bis zum Versuchsende über
25 % abnahm. Die Substanzen, welche im CETA getestet werden sollten, wurden
initial im Konzentrationsgleichgewicht in die apikale sowie die basolaterale Kammer
MATERIALIEN UND METHODIK
56
gegeben. Die Probenentnahmen erfolgten aus beiden Kammern mit 130 µl aus dem
apikalen und 100 µl aus dem basolateralen Kompartiment zu den Zeitpunkten,
welche im vorherigen Abschnitt bereits genannt wurden. Abhängig von der
Quantifizierungs-Methode der jeweiligen Testsubstanz wurden die Proben in den
1,5 ml-Eppendorf-Gefäßen weiter aufbereitet.
Die Daten wurden, wie von LUNA-TÓRTOS et al. (2008) beschrieben, für jede
Kammer in Prozent der initialen Konzentration über die Zeit dargestellt. In Abbildung
4.6 ist beispielhaft ein CETA mit dem bekannten Pgp-Substrat Digoxin in LLC-MDR1-
Zellen dargestellt. Um Transport zu beschreiben, wurde die Fläche unter der Kurve
(Area Under the Curve; AUC) des Konzentrationsanstiegs in der apikalen Kammer in
Prozent gegen die Zeit über der Initialkonzentration nach der Trapezregel berechnet.
Abbildung 4.6: CETA mit dem bekannten Pgp-Substrat Digoxin in Pgp-überexprimierenden LLC-Zellen. Hier ist Pgp-vermittelter Transport von Digoxin vorhanden. Die Digoxin-Konzentration steigt über 600 Minuten in der apikalen Kammer kontinuierlich an, während diese in der basolateralen Kammer stetig abnimmt. Die AUC wird nach der Trapezregel aus dem Konzentrationsanstieg in der apikalen Kammer über die Zeit berechnet und als AUC pro Stunde (AUC/h) angegeben. Gezeigt sind eigene Daten.
Für die MRP1-überexprimierenden Zellen wurde der Konzentrationsanstieg in
der basolateralen Kammer in die Berechnung einbezogen, da MRP1, anders als Pgp
und BCRP, in der basolateralen Membran der Zellen exprimiert wurde und somit
nach basolateral transportierte. Die AUC der Transporter-überexprimierenden Zellen
wurde gegen die AUC dieser Zellen mit spezifischem Inhibitor und die AUC der wt-
MATERIALIEN UND METHODIK
57
Zellen verglichen. Transport wurde dann als spezifisch bewertet, wenn die AUC der
überexprimierenden Zellen durch den Einsatz eines entsprechenden Inhibitors um >
50 % abnahm.
4.2.5 Akkumulations-Assay
Für die Studien zum Tariquidar- und Elacridar-Transport durch Pgp und BCRP
wurden Akkumulations-Assays eingesetzt. Die entsprechenden Zellen wurden dazu
wie in Abschnitt 4.2.2 beschrieben auf 6-Well-Platten ausgesät. Am Versuchstag
wurde das Kulturmedium aus den Wells abgesaugt und durch 3 ml
Vorinkubationsmedium, welches die verwendeten Inhibitoren oder deren
Lösungsmittel enthielt, ersetzt. Zuvor wurden die Monolayer zweifach mit PBS
gewaschen. Die Zellen wurden eine Stunde bei 50 Umdrehungen/Minute auf einem
Akku-Schüttler im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das
Vorinkubationsmedium abgenommen und 3 ml Versuchsmedium mit den
Testsubstanzen und/oder Inhibitoren beziehungsweise Lösungsmitteln hinzugefügt.
Nach einer weiteren Inkubation über 120 Minuten, welche wie zuvor durchgeführt
wurde, wurden die Platten auf Eis überführt. Es wurden 100 µl Mediumproben in
Szintillationsröhrchen pipettiert und die Monolayer wurden mit kaltem PBS
gewaschen. Nachdem die Flüssigkeit entfernt wurde, wurden die Zellen in 500 µl
PBS auf Eis abgeschabt und in 1,5 ml-Eppendorfgefäße überführt, welche zuvor
gewogen wurden. Im Anschluss an eine siebenminütige Zentrifugation bei 4°C und
250xg wurde der Überstand abgenommen und die Zellpellets gewogen. Dies diente
dazu, in der Datenberechnung die Menge der akkumulierten Substanz auf das
Pelletgewicht beziehen zu können. Die Zelllyse fand durch die Zugabe von 150 µl
eiskaltem Lysispuffer (Zusammensetzung ist im Anhang beschrieben) statt. Nach der
Homogenisierung mittels Pipette wurden 100 µl Lysat in Szintillationsröhrchen
überführt. Für die Proteinbestimmung, welche erfolgte, um akkumulierte Substanz
auf den Gesamtproteingehalt beziehen zu können, wurde das Restlysat in den
1,5 ml-Eppendorfgefäßen 15 Minuten bei 18550xg und 4°C zentrifugiert. Der
Überstand wurde 1:5 verdünnt auf eine durchsichtige 96-Well-Platte pipettiert und die
Proteinbestimmung wurde mit dem BCATM Protein Assay Kit (Thermo Scientific,
Rockford, USA) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Messung der
MATERIALIEN UND METHODIK
58
optischen Dichte erfolgte mittels MRX-Microplate-Reader (Dynatech Deutschland
GmbH, Denkendorf). Die Substanz-Akkumulation in den Zellen wurde als
radioaktiver Zerfall pro Minute (Disintegrations Per Minute; DPM) pro mg
Gesamtproteingehalt dargestellt.
4.2.6 Quantifizierung von Substanzen mittels Szintillationscounter
Die Substanzen Verapamil, Laniquidar, Tariquidar und Elacridar sowie die
Referenzsubstrate Digoxin und Mitoxantron waren [3H]-markiert. [3H]-Elacridar und
[3H]-Laniquidar wurden freundlicherweise von Dr. A. D. Windhorst (Nuclear Medicine
& PET Research, VU Medical Centre, Amsterdam, Niederlande) zur Verfügung
gestellt. Ciprofloxacin sowie Mannitol wurden [14C]-markiert verwendet. Dies
ermöglichte die Quantifizierung der Substanzen mittels Messung des radioaktiven
Zerfalls im β-Szintillations-Counter.
Für die Messungen der Radioaktivität wurden 40 µl der Proben aus den
transzellulären Transport-Assays in Szintillationsröhrchen pipettiert und mit 4,5 ml
Szintillationsflüssigkeit aufgefüllt. Die Flüssigkeiten wurden durch Invertierung
vermischt und bis zur Messung etwa eine Stunde inkubiert. Aus den Akkumulations-
Assays wurden 100 µl Mediumproben und 100 µl Zelllysat in die
Szintillationsröhrchen gegeben und ebenso weiterverfahren. Je nach radioaktivem
Isotop wurden die DPM mit dem entsprechenden Programm im β-Szintillations-
Counter gemessen.
4.3 Quantifizierung von Substanzen mittels HPLC Die Substanzen Pilocarpin, Phenytoin und Mephobarbital in Plasma und
Gehirnhomogenat beziehungsweise Zellmedium-Überständen wurden mittels HPLC-
Analyse aufgetrennt. Die Aufbereitung der Proben sowie die Quantifizierung der
Substanzkonzentration wurden von Martina Gramer und Maria Hausknecht im Institut
für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover durchgeführt. Die Methode zur Phenytoin-Auftrennung war vollständig
etabliert. Für Pilocarpin und Mephobarbital wurden die Methoden neu etabliert.
MATERIALIEN UND METHODIK
59
4.3.1 Aufbereitung der Proben
4.3.1.1 PLASMAPROBEN UND GEHIRNHOMOGENAT
Die Vollblut-EDTA-Gemische in den 1,5 ml-Eppendorfgefäßen wurden zwei
Minuten bei 13.400xg abzentrifugiert. Der gewonnene Plasmaüberstand wurde in
frische 1,5 ml-Eppendorfgefäße überführt. Davon wurden 50 µl mit 150 µl Acetonitril
versetzt und eine Minute auf einem Schüttler vermischt. Die Proben wurden bei
16.200xg für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde bis zur Analyse bei -20°C
gelagert.
Die Gesamtgehirne oder Gehirnregionen wurden zunächst homogenisiert. Für
die Pilocarpin-Quantifizierung wurden 200 µl Homogenat mit 200 µl Acetonitril
vermengt. Die weitere Aufbereitung der Proben für die Phenytoin-Analyse erfolgte
mit 200 µl Homogenat, gemischt mit 100 µl internem Standard (gelöst in Methanol)
und 100 µl Methanol. Die Gehirnhomogenat-Mischungen wurden anschließend bei
4°C und 24.700xg für 15 Minuten zentrifugiert. Dreihundert µl des Überstandes
wurden in Zentrifugen-Filtereinheiten mit einem Durchmesser von 0,2 µm 30 Minuten
bei 4.000xg und 4°C zentrifugiert und bis zur Analyse bei -20°C gelagert.
4.3.1.2 ZELLMEDIUM-ÜBERSTÄNDE
Für die Quantifizierung der Substanzkonzentrationen aus dem Zellmedium
wurden 40 µl Mediumüberstand mit 60 µl Acetonitril vermischt. Nach einer
fünfminütigen Zentrifugation bei 16.200xg wurden die Überstände bis zur weiteren
Verwendung bei -20°C gelagert.
4.3.2 Aufbau der HPLC-Anlage
Die Substanzen wurden in einem Reversed-Phase-System aufgetrennt.
Zunächst wurde die Mobile Phase durch einen Entgaser geführt, um Luft in der
Anlage zu vermeiden. Durch ein Pumpensystem gelangten die Proben in die Anlage,
wobei immer 20 µl Probe injiziert wurden. Dabei betrug die Temperatur im System
35°C, welches durch einen Säulenofen konstant gehalten wurde. Die Proben aus
den Transport-Assays gelangten für die Analyse durch ein automatisches
Einspritzsystem in die Anlage. Die mobile Phase lief über die Nucleosil Trennsäulen
(Vor- und Hauptsäule) der stationären Phase. Die Zusammensetzung der mobilen
MATERIALIEN UND METHODIK
60
Phase war abhängig von der analysierten Substanz (siehe Abschnitt 4.3.2.1 bis
4.3.2.3). Ebenso wurden auch die Wellenlängen zur UV-Detektion am Ende der
Hauptsäule angepasst. Zur quantitativen Auswertung wurden die Signale, welche
vom UV-Detektor empfangen wurden, an einen computergestützten Analog-Digital-
Wandler übermittelt. Mittels der Software LCsolution (Shimadzu, Duisburg,
Deutschland) wurden die Messdaten als Chromatogramm dargestellt. Die
Konzentration der Proben wurde durch folgende Berechnung ermittelt:
Probenkonzentration[µg/ml]= KonzentrationStandard×AUCProbe×Verdünnungsfaktor
AUCStandard×1000
AUC: Area Under the Curve
Einheit KonzentrationStandard: ng/µl
1000: Einheiten-Umrechnungsfaktor
Der Standard wurde in bekannter Konzentration täglich zu Beginn und Ende der
Messungen mitgeführt.
4.3.2.1 PILOCARPIN
Die mobile Phase für alle Pilocarpinproben setzte sich aus 70 %
Phosphatpuffer, 30 % Acetonitril und 0,1 % Triethylamin zusammen. Für die Plasma-
und Gehirnhomogenatproben wurde der pH-Wert auf 7,5 und für die
Zellmediumproben auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt. Die UV-Detektion am Ende
der Hauptsäule erfolgte mit einer Wellenlänge von 213 nm nach einer Retentionszeit
von 6,8 Minuten. Die Wiederfindung, Nachweisgrenze sowie die Wiederholbarkeit im
Plasma, Gehirngewebe und Zellmedium können Tabelle 4.6 entnommen werden.
Tabelle 4.6: Wiederfindung, Nachweisgrenze und Wiederholbarkeit (Variationskoeffizient) der Pilocarpin-Auftrennung mittels HPLC in Plasma, Gehirngewebe und Zellmedium.
Plasma Gehirngewebe Zellmedium
Wiederfindung 99,8 % 100,7 % 102,8%
Nachweisgrenze 200 ng/ml 1,1 µg/mg 0,625 µg/ml
Wiederholbarkeit 2,87 % 1,21 % 3,39 %
MATERIALIEN UND METHODIK
61
4.3.2.2 PHENYTOIN
Für die Phenytoinproben aus Plasma und Gehirnhomogenat bestand die
mobile Phase aus 65 % Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 5,6 und 35 %
Acetonitril. Bei einer Retentionszeit von 8,0 Minuten und einer Wellenlänge von
215 nm fand die UV-Detektion statt. Details zur Methode können aus POTSCHKA &
LÖSCHER (2001) entnommen werden.
4.3.2.3 MEPHOBARBITAL
Zur Messung der Mephobarbital-Konzentration im Zellmedium wurden die
Proben nach einer Retentionszeit von 8,7 Minuten mit einer Wellenlänge von 210 nm
detektiert. Die mobile Phase setzte sich aus 58 % Natriumphosphatpuffer (pH 5,6)
und 42 % Acetonitril zusammen. Die Nachweisgrenze von Mephobarbital im
Zellmedium lag bei 31,25 ng/ml Medium, mit einer Wiederfindung von 99,1 % und
einer Wiederholbarkeit von 1,67 % (Variationskoeffizient).
4.4 Statistische Auswertung Mit dem Programm Excel® (Microsoft, Unterschleißheim, Deutschland) wurden
die Daten aus allen Versuchen berechnet. Die tierexperimentell gewonnenen Daten
sowie die Daten aus den In-vitro-Akkumulationsstudien wurden mittels Student’s
t-test statistisch untersucht, wenn zwei Gruppen miteinander verglichen wurden. Bei
der Etablierung des Pilocarpin-Protokolls für FVB/N- und Mdr1a/b(-/-)-Mäuse wurde
der Fisher’s Exact Test eingesetzt, um die zwei Gruppen miteinander zu vergleichen.
Wurden drei oder mehr Gruppen gegenüber gestellt, fand die One-Way-Analysis of
Variance (ANOVA) und der Post-Hoc-Test nach Bonferroni for Selected Pairs
Anwendung. Mit Hilfe der Two-Way-ANOVA sowie Bonferroni‘s Post-Hoc-Test for
Multiple Comparisons wurden die Daten der durchgeführten CETAs statistisch
analysiert. Die statistischen Untersuchungen der Daten sowie die Erstellung der
Graphen fanden mit der Software Prism5® (GraphPad, CA, USA) statt. Alle
statistischen Test’s wurden zweiseitig durchgeführt und ein P-Wert ≤ 0,05 wurde als
signifikant angenommen. Die genannten parametrischen Tests wurden gewählt, da
von einer Normalverteilung der Daten ausgegangen wurde. In den Graphen wurde,
MATERIALIEN UND METHODIK
62
sofern nicht anders angegeben, der Mittelwert + Standardfehler (Standard Error of
the Mean; SEM) gezeigt.
RESULTATE
63
5 RESULTATE
5.1 Einfluss von Multidrug-Transportern auf die Induktion eines Status epilepticus und die Epileptogenese im Pilocarpin-Modell
5.1.1 Etablierung des Pilocarpin-Modells
Zunächst sollte ein Pilocarpin-Protokoll für die Induktion eines SE etabliert
werden, welches gleichermaßen für die Mdr1a/b(-/-)- und die FVB/N-Maus anwendbar
sein sollte. Dies sollte einen etwaigen Einfluss verschiedener Pilocarpin-Dosen auf
die Epileptogenese in den zwei Gruppen verhindern.
Insgesamt wurden fünf verschiedene fraktionierte Pilocarpin-Protokolle zur
Auslösung eines SE bei den Mäusen verwendet, welche Tabelle 4.3 entnommen
werden können. In allen Protokollen wurden maximal 10 Pilocarpin-Applikationen
verabreicht. Die Anzahl der Tiere mit erfolgreicher SE-Induktion sowie die Anzahl der
überlebenden Tiere nach dem SE ist in Tabelle 5.1 dargestellt. Protokoll Nummer 1
war in der hiesigen Arbeitsgruppe bereits für die C57BL/6- und die NMRI-Maus
etabliert (GRÖTICKE et al. 2007; MÜLLER et al. 2009b). Unter Verwendung des
Protokolls 1 wurde bei allen Mäusen ein SE induziert. Diesen überlebten in der
Mdr1a/b(-/-)-Gruppe jedoch nur eine Maus und in der FVB/N-wt-Gruppe drei Mäuse.
Im Protokoll Nummer 2 wurde bei allen vier FVB/N-wt-Mäusen ein SE ausgelöst,
welchen alle Tiere überlebten. Die vier Mdr1a/b(-/-)-Mäuse bekamen ebenfalls alle
einen SE, den jedoch kein Tier überlebte. Durch die Anwendung von Protokoll 3
konnte ein SE in neun wt-Mäusen induziert werden, welchen acht Tiere überlebten.
In der Mdr1a/b(-/-)-Gruppe konnte der SE mit einer Überlebensrate von 100 % in allen
Mäusen induziert werden. Unter Verwendung von Protokoll 4 konnte in der
Mdr1a/b(-/-)-Gruppe ebenfalls ein SE mit einer Überlebensrate von 100 % bei allen
Tieren induziert werden, während in der wt-Gruppe nur eine Maus den SE erreichte
und überlebte. Durch das Protokoll 5 erlitten in der Mdr1a/b(-/-)-Gruppe 21 von
insgesamt 27 Mäusen einen SE, welchen 15 Tiere überlebten. In der wt-Gruppe
wurde in 15 von 21 Tieren ein SE ausgelöst, welchen nur neun Mäuse überlebten.
RESULTATE
64
Tabelle 5.1: Erreichen des SE und überlebende Mäuse nach SE in wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen unter Verwendung verschiedener Protokolle. Pilocarpin wurde bis zum Eintritt des SE in jedem Protokoll fraktioniert i. p. appliziert, es erfolgten maximal zehn Applikationen. # zum Protokoll: wt-Mäusen wurde nach der fünften oder sechsten (300 – 400 mg/kg Pilocarpin) Applikation teilweise wieder die Bolus-Dosis von 100 bzw. 150 mg/kg Pilocarpin verabreicht. Signifikante Unterschiede zwischen wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen wurden mittels Fisher’s Exact Test berechnet. Der entsprechende P-Wert ist in den Spalten der Mdr1a/b(-/-)-Gruppe aufgeführt, wenn eine Berechnung möglich war.
FVB/N-wt Mdr1a/b(-/-)
Protokoll-Nr.
Anzahl Mäuse (n)
Mäuse mit SE
Überlebende Mäuse nach SE
Anzahl Mäuse (n)
Mäuse mit SE
Überlebende Mäuse nach SE
1 4 () 4 (100 %) 3 (75 %) 4 () 4 (100 %) 1 (25 %)
P=0,4857
2 4 () 4 (100 %) 4 (100 %) 4 () 4 (100 %) 0 (0 %) *
P=0,0286
3 # 3 ()
7 ()
2 (67 %)
7 (100 %)
2 (67 %)
6 (86 %) 13 ()
13 (100 %)
P=0,4348 13 (100 %)
P=0,4091
4 # 3 () 1 (33 %) 1 (33 %) 4 () 4 (100 %)
P=0,1429 4 (100 %)
5 # 3 ()
18 ()
3 (100 %)
12 (67 %)
3 (100 %)
6 (33 %)
4 ()
23 ()
4 (100 %)
17 (74 %)
P=0,7406
3 (75 %)
12 (52 %)
P=0,4991
Gesamt 42
(&) 33 (79 %) 25 (60 %) 52
46 (88 %)
P=0,2593 33 (63 %)
P=0,7986
In den Pilocarpin-Protokollen 3 bis 5 wurde den wt-Mäusen nach der fünften
Applikation teilweise wieder die Bolus-Dosis verabreicht, da die Pilocarpin-induzierte
Symptomatik (wie Tremor, Immobilität oder stereotypes Kauen) bereits wieder
nachließ. Die Protokolle 1 und 2 waren geeignet, um einen SE in FVB/N-wt-Tieren
auszulösen, welchen auch 75 % beziehungsweise 100 % der Mäuse überlebten. Die
höchsten Überlebensraten in der Mdr1a/b(-/-)-Gruppe wurden nach Protokoll 3 und 4
erzielt, welche bei 100 % der Mäuse einen SE induzierten, den alle Tiere überlebten.
RESULTATE
65
Die Protokolle 1 und 2 hingegen führten zu einer hohen Mortalität der Mdr1a/b(-/-)-
Mäuse nach der SE-Induktion. Insgesamt kann keines der Pilocarpin-Protokolle für
die Statusinduktion uneingeschränkt gleichermaßen für die FVB/N-wt- und die
Mdr1a/b(-/-)-Maus verwendet werden.
5.1.2 Vergleich der Pilocarpin-Dosis bis zur Auslösung des Status epilepticus
Bei der Verwendung der Pilocarpin-Protokolle fiel auf, dass die Mdr1a/b(-/-)-
Mäuse durchweg weniger Pilocarpin benötigten als die Mäuse des
Hintergrundstammes, bis ein SE induziert war.
Abbildung 5.1: Applizierte Pilocarpin-Dosis (mg/kg) in Mdr1a/b(-/-)- und wt-Mäusen bis zum Eintritt des SE. Gezeigt sind Mittelwerte + SEM. Die Sternchen zeigen signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05), welche mittels Student’s t-Test ermittelt wurden. Im Vergleich benötigen die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse Geschlechts-unabhängig signifikant weniger Pilocarpin bis zum Eintritt des SE als die wt-Mäuse.
In der Auswertung wurden die Mäuse berücksichtigt, bei welchen ein SE
ausgelöst werden konnte, wobei ebenfalls Mäuse einbezogen wurden, welche den
SE nicht überlebten. Wie in Abbildung 5.1 gezeigt, wurden die wt-Mäuse gegen die
Mdr1a/b(-/-)-Mäuse nach Geschlecht getrennt verglichen. Sowohl bei den männlichen
RESULTATE
66
als auch den weiblichen Tieren benötigten die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse signifikant weniger
Pilocarpin zur SE-Induktion als die wt-Tiere. Die zwei Gruppen wurden ebenfalls
gemischtgeschlechtlich verglichen, wobei mit 291,3 mg/kg ± 9,7 mg/kg signifikant
weniger Pilocarpin in den Mdr1a/b(-/-)-Mäusen benötigt wurde, als in den wt-Mäusen
mit 418,2 mg/kg ± 24,6 mg/kg, um einen SE auszulösen.
5.1.3 Quantifizierung der Pilocarpin-Gehirnkonzentration
5.1.3.1 PILOCARPIN-PHARMAKOKINETIK IM GEHIRN
Die Pilocarpin-Pharmakokinetik im Gehirn wurde untersucht, um den Zeitpunkt
nach der Pilocarpin-Applikation zu ermitteln, an welchem die höchste Konzentration
im Gehirn erreicht war. Dies ist für die Etablierung des fraktionierten Pilocarpin-
Protokolls von Belang um den optimalen Zeitpunkt für die Folge-Applikationen
wählen zu können. Weiblichen FVB/N-Mäusen wurden 50 mg/kg Pilocarpin
appliziert. Diese Pilocarpin-Dosis induzierte während der Etablierung des Pilocarpin-
Protokolls bei keiner Maus Anfälle. Dadurch sollte ein Einfluss auf die Gehirn-
Pharmakokinetik von Pilocarpin durch eine eventuelle Anfalls-induzierte Öffnung der
BHS verhindert werden. Wie in Abbildung 5.2 zu sehen ist, war die maximale
Pilocarpin-Konzentration im Gehirn etwa 20 bis 30 Minuten nach der Injektion
nachweisbar.
Abbildung 5.2: Pilocarpin-Pharmakokinetik im Gehirn nach Applikation von 50 mg/kg Pilocarpin i. p. in weiblichen FVB/N-Mäusen. Drei Mäuse je Zeitpunkt wurden 5, 10, 15, 20, 30, 60 und 120 Minuten nach der Applikation für die Gewebeentnahme getötet. In rot ist die Plasmakonzentration (µg/ml), in blau die Gehirnkonzentration (µg/mg) und in schwarz die Gehirn-Plasma-Ratio dargestellt. Angegeben sind Mittelwerte ± SEM.
RESULTATE
67
Auffällig war, dass zu diesem Zeitpunkt die Pilocarpin-Konzentration in Plasma
und Gehirn annähernd ausgeglichen war. Anschließend nahmen die Plasma- sowie
Gehirnkonzentrationen des Pilocarpins über die Zeit kontinuierlich ab. Für alle
weiteren Versuche wurden daher 20 Minuten zwischen der Pilocarpin-Applikation
und der Dekapitation gewählt.
Um zu untersuchen, ob Unterschiede zwischen Mausstämmen in der
Pilocarpin-Empfänglichkeit zur Induktion eines SE durch unterschiedliche
Gehirngängigkeiten verursacht werden, wurden weibliche Mäuse dreier Stämme
verglichen. Je drei FVB/N-, C57BL/6- und NMRI-Mäuse wurden 20 Minuten nach der
Applikation von 50 mg/kg Pilocarpin dekapitiert. In allen Mausstämmen war die
Pilocarpin-Konzentration in Plasma und Gehirn annähernd ausgeglichen. In diesem
Vorversuch ergaben sich keine Hinweise auf Unterschiede zwischen den Pilocarpin-
Konzentrationen in Plasma und Gehirngewebe der drei Mausstämme (Abbildung
5.3).
Abbildung 5.3: Stammvergleich der Pilocarpin-Konzentration in Plasma (µg/ml), Gehirn (µg/mg) und die Gehirn-Plasma-Ratio in weiblichen FVB/N-, C57BL/6- (Bl6) und NMRI-Mäusen. Je drei Mäusen pro Gruppe wurden 50 mg/kg KGW Pilocarpin i. p. appliziert. Abgebildet sind Mittelwerte + SEM.
RESULTATE
68
5.1.3.2 UNTERSUCHUNGEN IN PGP-DEFIZIENTEN MÄUSEN
Bei der Induktion des SE durch Pilocarpin stellte sich bereits heraus, dass die
Mdr1a/b(-/-)-Mäuse signifikant niedrigere Pilocarpin-Dosen benötigten als die wt-
Mäuse bis der SE ausgelöst war (beschrieben in Abschnitt 5.1.3). Um zu
untersuchen, ob Pgp einen Einfluss auf die Pilocarpin-Aufnahme in das Gehirn hat,
wurde wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen (je n=6) 50 mg/kg Pilocarpin i. p. appliziert. Einer
zusätzlichen Gruppe wt-Mäusen (n=6) wurde eine Stunde vor der Pilocarpin-
Applikation 15 mg/kg Tariquidar intravenös verabreicht. Die gewählte Tariquidar-
Dosierung führt zu einer vollständigen Pgp-Hemmung (KUNTNER et al. 2010).
Abbildung 5.4: Vergleich der Pilocarpin-Aufnahme zwischen weiblichen wt-, Mdr1a/b(-/-)- und Tariquidar-behandelten wt-Mäusen. Die Tariquidar-Gabe (15 mg/kg) erfolgte intravenös 60 Minuten vor der Pilocarpin-Injektion (50 mg/kg i. p.). Dargestellt sind die Mittelwerte + SEM der Pilocarpin-Konzentration im Plasma (µg/ml) und Gehirn (µg/mg), sowie die Gehirn-Plasma-Ratio. Die Gruppengröße betrug jeweils n=6. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) an. Die statistische Auswertung erfolgte mittels One-way-ANOVA und Bonferroni’s Post-Hoc-Test.
Zwischen den wt- und den Mdr1a/b(-/-)-Mäusen bestanden keine Unterschiede
in der Pilocarpin-Aufnahme in das Gehirn. Lediglich in der Tariquidar-behandelten
RESULTATE
69
Gruppe ließ sich eine signifikant höhere Pilocarpin-Konzentration im Gehirn sowie
eine signifikant höhere Gehirn-Plasma-Ratio als in der wt-Gruppe feststellen
(Abbildung 5.4).
Abbildung 5.5: Pilocarpin-Konzentration im Plasma (µg/ml), Gehirn (µg/mg) und Hippocampus (µg/mg), sowie die Gehirngewebe-Plasma-Ratios in männlichen Mdr1a/b(-/-)- und wt-Mäusen. Es wurden 50 mg/kg Pilocarpin appliziert. Außerdem sind die Körpergewichte der Tiere aller Gruppen vergleichend dargestellt. Abgebildet sind die Mittelwerte + SEM. Die Gruppengröße betrug jeweils n=6. Für die statistische Untersuchung wurde eine One-way-ANOVA gefolgt von Bonferroni’s Post-Hoc-Test durchgeführt. Signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) sind durch Sternchen angezeigt.
RESULTATE
70
Um eventuell bestehende Geschlechterunterschiede in der Pilocarpin-
Aufnahme in das Gehirn abzuklären, wurden ebenfalls männliche Mdr1a/b(-/-)- und
wt-Mäuse untersucht. Eine weitere Gruppe von wt-Tieren wurde mit LiCl
vorbehandelt, um den Einfluss auf die Pilocarpin-Akkumulation im Gehirn zu
überprüfen. Es wurde berücksichtigt, dass Mäuse eine höhere LiCl-Dosis als Ratten
benötigen, um eine Senkung der Pilocarpin-Dosis für eine SE-Induktion
herbeizuführen (CLIFFORD et al. 1987; SHALDUBINA et al. 2007).
Daher wurde den Mäusen im Rahmen dieser Studie 10 mEq/kg LiCl appliziert,
während der Ratte üblicherweise 3 mEq/kg LiCl verabreicht werden (CLIFFORD et
al. 1987). Entnommen wurden die rechte Gehirnhälfte und der linke Hippocampus,
um einen Vergleich der Pilocarpin-Aufnahme zwischen Gesamtgehirn und
Hippocampus zu ermöglichen. Die Resultate sind in Abbildung 5.5 dargestellt. In der
Gehirn- und Hippocampus-Plasma-Ratio bestanden keine Unterschiede zwischen
den drei Gruppen. Im Hippocampus wurden ebenfalls keine Unterschiede zwischen
den Gruppen festgestellt. Hier traten hohe Schwankungen der Pilocarpin-
Konzentration der einzelnen Tiere innerhalb der Gruppen auf. Die Pilocarpin-
Konzentration in Plasma und Gehirn war in den Mdr1a/b(-/-)-Mäusen signifikant höher
als in den wt-Mäusen. Hinzu kommt, dass die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse mit 33,8 g ± 0,9 g
signifikant mehr als die Tiere in den wt-Gruppen (25,1 g ± 0,7 g bzw. 25,1 g ± 0,2 g)
wogen.
Durch eine Pilocarpin-Dosis von 200 mg/kg wurden während der Etablierung
des Pilocarpin-Protokolls bereits Anfälle in einzelnen Mäusen ausgelöst. Um die
Gehirn-Akkumulation von Pilocarpin in einer konvulsiven Dosis zu untersuchen,
wurden in einem weiteren Versuch männlichen wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen
200 mg/kg Pilocarpin injiziert. In den Mdr1a/b(-/-)-Tieren wurde in allen analysierten
Geweben und Plasmaproben eine signifikant höhere Pilocarpin-Konzentration
festgestellt als in den wt-Mäusen (Abbildung 5.6). Wie Abbildung 5.6 zu entnehmen
ist, waren die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse zum Versuchszeitpunkt schwerer als die wt-Tiere,
welches zu den höheren Plasmakonzentrationen in der Gruppe geführt haben
könnte. Dennoch waren die Gehirn-Plasma- und die Hippocampus-Plasma-Ratio in
der Mdr1a/b(-/-)-Gruppe im Vergleich zu den wt-Tieren signifikant höher. Bei der
RESULTATE
71
Beobachtung der Tiere, welche nicht kontinuierlich erfolgte, wurden bei vier
Mdr1a/b(-/-)-Mäusen und zwei wt-Mäusen von jeweils sechs Tieren pro Gruppe
epileptische Anfälle nach der Pilocarpin-Applikation festgestellt.
Abbildung 5.6: Vergleich der Pilocarpin-Konzentration im Gehirngewebe von je sechs männlichen wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen. Appliziert wurden 200 mg/kg Pilocarpin. Gezeigt sind die Pilocarpin-Konzentrationen im Plasma (µg/ml), Gehirn (µg/mg), Hippocampus (µg/mg) und die Gehirngewebe-Plasma-Ratios als Mittelwerte + SEM. Ebenfalls dargestellt sind die Körpergewichte der Tiere. Signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden mittels Student’s t-Test analysiert und durch Sternchen gekennzeichnet.
RESULTATE
72
5.1.3.3 UNTERSUCHUNGEN IN BCRP1-DEFIZIENTEN MÄUSEN
Der Einfluss von Bcrp1 auf die Gehirnaufnahme von Pilocarpin wurde unter
Verwendung von weiblichen Bcrp1(-/-)- und Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)- im Vergleich zu wt-
Mäusen untersucht. Pilocarpin wurde in einer Dosis von 50 mg/kg sechs Tieren in
jeder Gruppe i. p. verabreicht.
Abbildung 5.7: Pilocarpin-Aufnahme in Plasma und Gehirngewebe von wt-, Bcrp1(-/-)- und Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Mäusen. Jeweils sechs Mäusen pro Gruppe wurden 50 mg/kg Pilocarpin appliziert. Gezeigt sind die Pilocarpin-Konzentrationen im Plasma (µg/ml), Gehirn (µg/mg), Hippocampus (µg/mg) und die Gehirngewebe-Plasma-Ratios als Mittelwerte + SEM. Die Statistik erfolgte durch eine One-way-ANOVA mit anschließendem Bonferroni’s Post-Hoc-Test. Untersucht wurde die wt-Gruppe gegen die Bcrp1(-/-)- und Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Gruppe. Signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) zwischen den Gruppen wurden mit Sternchen markiert.
RESULTATE
73
Hier fiel auf, dass die Gehirn-Plasma-Ratio in den Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Tieren
im Vergleich zu den wt-Mäusen signifikant erhöht war (Abbildung 5.7). In den
Bcrp1(-/-)-Mäusen hingegen war die Gehirn-Plasma-Ratio signifikant kleiner als in den
wt-Mäusen. Die Pilocarpin-Konzentrationen im Plasma, Gehirn und Hippocampus
unterschieden sich zwischen den drei Gruppen nicht. Ebenfalls keine signifikanten
Unterschiede bestanden in der Hippocampus-Plasma-Ratio, welche innerhalb der
Gruppen, ebenso wie die Pilocarpin-Konzentration im Hippocampus, starken
Schwankungen unterlag.
5.1.4 In-vitro-Untersuchungen zum Transport von Pilocarpin
5.1.4.1 P-GLYKOPROTEIN
Um Substrateigenschaften von Pilocarpin für murines Pgp zu untersuchen,
wurden CETAs unter Verwendung von LLC-wt- und LLC-Mdr1a-Zellen durchgeführt
(Abbildung 5.8). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde durch In-vitro-Methoden
ein konzentrationsabhängiger Transport von Verapamil, Tariquidar und Elacridar
gefunden (vergleiche Abschnitte 5.2.2, 5.2.3 und 5.2.4). Dieser fand in niedrigen
Substanzkonzentrationen statt und war bei höheren Konzentrationen nicht mehr
nachweisbar. Für die Pilocarpin-CETAs wurde Pilocarpin in einer Konzentration von
25 µM eingesetzt. Dies entspricht einer niedrigen Pilocarpin-Konzentration, denn die
Pilocarpin-Konzentration im Plasma der Maus betrug 20 Minuten nach der
Applikation von 50 mg/kg Pilocarpin etwa 105 µM. Es wurde für die In-vitro-Versuche
zunächst eine niedrige Pilocarpin-Konzentration gewählt, da, wie oben erwähnt,
Transport in-vitro häufig in niedrigen Substanzkonzentrationen nachweisbar war. Als
Pgp-Inhibitor wurde PSC833 in der Konzentration von 10 µM verwendet, welche zu
einer vollständigen Inhibition von Pgp führt (SMITH et al. 1998). Um einen Transport
durch endogenes Bcrp auszuschließen, wurde in einem Versuch 0,1 µM des Bcrp-
Inhibitors Ko143 hinzugefügt. Diese Konzentration ist in-vitro ausreichend, um Bcrp
vollständig zu inhibieren ohne dabei inhibitorisch auf Pgp zu wirken (ALLEN et al.
2002).
RESULTATE
74
Abbildung 5.8: Pilocarpin-CETA über 600 Minuten unter Verwendung von LLC-wt und LLC-Mdr1a Zellen. PSC833 wurde in einer Konzentration von 10 µM als Pgp-Inhibitor verwendet. In den Graphen B und C wurde Ko143 (0,1 µM) als BCRP-Inhibitor hinzugegeben. Gezeigt sind die Mittelwerte ± SEM (n=3 in A und C, n=6 in B). Die statistische Auswertung fand mittels Two-Way-ANOVA und anschließendem Post-Hoc-Test nach Bonferroni statt. Signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) sind durch Sternchen markiert.
In den Transwells® mit den LLC-Mdr1a-Zellen fand ein signifikanter Transport
von Pilocarpin statt (Abbildung 5.8 A). Dabei stieg die Pilocarpin-Konzentration über
RESULTATE
75
die 600 Minuten in der apikalen Kammer leicht an, während diese in der
basolateralen Kammer leicht abnahm (AUC/h: 190,8). Die Zugabe des Pgp-Inhibitors
bewirkte, dass keine Konzentrationsunterschiede in beiden Kammern nachweisbar
waren (Abbildung 5.8 A). Die Zugabe von Ko143 auf die LLC-Mdr1a Zellen hatte
keinen Effekt auf den Pilocarpin-Transport (AUC/h: 343,7), wie in Abbildung 5.8 B zu
sehen ist. Mit Pgp-Inhibition durch PSC833 wurde der Transport vollständig inhibiert.
In den LLC-wt-Zellen bestand auch unter der Zugabe von Ko143 ein signifikanter
Transport von der basolateralen in die apikale Kammer (AUC/h: 537,0), wie in
Abbildung 5.8 C dargestellt. Der Konzentrationsunterschied wurde in den LLC-wt
Zellen nicht durch PSC833 beeinflusst (AUC/h: 428,1). Da der Pgp-Inhibitor PSC833
in den LLC-Mdr1a-Zellen aber nicht den LLC-wt-Zellen Wirkung zeigte, ist von einem
Pgp-vermittelten Transport von Pilocarpin auszugehen.
5.1.4.2 BREAST CANCER RESISTANCE PROTEIN
Die Substrateigenschaften von Pilocarpin für murines Bcrp1 wurden mittels
CETA untersucht. Hierfür wurden MDCK-wt- und MDCK-Bcrp1-Zellen eingesetzt. Der
CETA fand über einen Zeitraum von 360 Minuten mit 25 µM Pilocarpin statt. Ein
eventuell vorhandener Transport durch endogenes Pgp wurde durch die Zugabe von
0,2 µM Tariquidar unterbunden (KUTEYKIN-TEPLYAKOV et al. 2010). Als Bcrp-
Inhibitor wurde Ko143 in einer Konzentration von 0,1 µM verwendet. Die Pilocarpin-
Konzentration stieg mit einer AUC/h von 574,7 in der apikalen Kammer über den
MDCK-Bcrp1-Zellen an. Gleichzeitig nahm die Konzentration von Pilocarpin in der
basolateralen Kammer ab. Die Zugabe von Ko143 führte zu einer Inhibition des
Transportes (Abbildung 5.9 A). Wie in Abbildung 5.9 B dargestellt ist, zeigten die
MDCK-wt-Zellen keine Pilocarpin-Transportaktivität. Aus den Daten wird ersichtlich,
dass Pilocarpin durch murines Bcrp1 transportiert wird.
RESULTATE
76
Abbildung 5.9: Pilocarpin-CETA mit MDCK-wt (B) und MDCK-Bcrp1 (A) Zellen über 360 Minuten. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (n=3). Eingesetzt wurden 25 µM Pilocarpin. Als Pgp-Inhibitor wurden 0,2 µM Tariquidar verwendet. Ko143 wurde in einer Konzentration von 0,1 µM als BCRP-Inhibitor hinzugegeben. Statistisch signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden durch Sternchen gekennzeichnet und mittels Two-way-ANOVA gefolgt von Bonferroni’s Post-Hoc-Test ermittelt.
5.1.5 Charakterisierung des Pilocarpin-Modells für die FVB/N-Maus Um das Pilocarpin-Modell bezüglich der Epileptogenese und der Latenzzeit
bis zum Auftreten der ersten spontanen wiederkehrenden epileptischen Anfälle zu
charakterisieren, wurden Mdr1a/b(-/-)- und wt-Mäuse unmittelbar während des
Pilocarpin-induzierten SE und darüber hinaus über einen Zeitraum von 43 Tagen
kontinuierlich mittels EEG und Video überwacht. Insgesamt wurde 19 Mdr1a/b(-/-)-
und 20 wt-Tieren Pilocarpin verabreicht. Daraufhin konnten in der Mdr1a/b(-/-)-Gruppe
neun und in der wt-Gruppe sechs Mäuse weiter überwacht werden, da viele Tiere
verstarben oder keinen SE erlangten (siehe Tabelle 5.1). Die Anfälle pro Tag
während der Überwachung für die wt-Tiere sind in Abbildung 5.10 dargestellt. Anfälle
wurden anhand charakteristischer Veränderungen im EEG detektiert (vergleiche
Abbildung 4.2), daher sind generalisierte sowie nicht-generalisierte Anfälle
RESULTATE
77
aufgeführt. Drei der wt-Mäuse erlitten in den ersten fünf Tagen nach dem SE mehr
als 20 Anfälle an einem Tag, wobei bei allen drei Mäusen am Tag 4 mindestens ein
weiterer SE auftrat. Dieser wurde nicht pharmakologisch beendet. Darauf folgte bei
allen wt-Mäusen eine Latenzzeit, in der keine Anfälle detektiert werden konnten.
Nach 9 bis 35 Tagen post-SE wurden epileptische Anfälle festgestellt, welche etwa
alle zwei bis drei Tage auftraten.
Abbildung 5.10: Epileptische Anfälle der FVB/N-wt-Mäuse pro Tag über einen Zeitraum von 43 Tagen. Der initiale SE wurde durch eine fraktionierte Applikation von Pilocarpin induziert und ist nicht unter den Anfällen aufgeführt.
In Abbildung 5.11 sind die Anfälle der Mdr1a/b(-/-)-Mäuse dargestellt. In der
Mdr1a/b(-/-)-Gruppe wurden bei fünf der neun Tiere über 20 Anfälle an einem Tag
innerhalb der ersten Woche nach dem SE detektiert. Ein weiterer SE trat bei keinem
der Tiere auf. Eine Maus zeigte nach vier Anfällen am zweiten Tag nach dem SE
über den gesamten Überwachungszeitraum keine weiteren Anfälle mehr. Auf die
Phase mit den häufigen Anfällen nach dem SE schloss sich die Latenzzeit ohne das
RESULTATE
78
Auftreten weiterer Anfälle an, welche je nach Tier vom 11ten bis zum 27ten Tag post-
SE andauerte.
Abbildung 5.11: Epileptische Anfälle der EEG- und videoüberwachten Mdr1a/b(-/-)-Mäuse pro Tag. Die Überwachung erfolgte über einen Zeitraum von 43 Tagen. Durch die fraktionierte Applikation von Pilocarpin wurde der initiale SE induziert, welcher nicht unter den Anfällen aufgeführt ist.
RESULTATE
79
Insgesamt konnten mittels EEG- und Videoüberwachung zwischen den
Mdr1a/b(-/-)- und wt-Mäusen keine offensichtlichen Unterschiede hinsichtlich der
Dauer der Latenzzeit oder der Anzahl der Anfälle festgestellt werden (Abbildung
5.12). Die Anzahl der Anfälle pro Woche wurde für die Auswertung in frühe Anfälle
(innerhalb der ersten Woche nach SE, zu sehen in Abbildung 5.12 B) und späte
Anfälle (ab Tag acht nach SE, zu sehen in Abbildung 5.12 C und D) eingeteilt
(KELLY 2002).
Abbildung 5.12: Vergleich der Latenzzeit bis zum Auftreten der ersten spontanen wiederkehrenden Anfälle (A) und der Anzahl der frühen (B) und späten Anfälle (B und D) nach dem initialen SE zwischen wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen (PGP-KO). Als frühe Anfälle wurden alle Anfälle während der ersten sieben Tage nach dem initialen SE gezählt (B). Anfälle ab dem achten Tag nach SE wurden als späte Anfälle bewertet (C; vergleiche KELLY 2002). In D wurden nur die Anfälle berücksichtigt, welche in den letzten zwei Wochen der Überwachung bei den Tieren auftraten. Dargestellt sind Mittelwerte + SEM. Die Gruppen in B bis D wurden mittels Student’s t-test statistisch miteinander verglichen. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede.
Die Dauer der Latenzzeit konnte bei fünf wt-Mäusen, aber nur bei zwei
Mdr1a/b(-/-)-Mäusen (Tiernummer 3MM1/F2 und 3MM3/F3) bestimmt werden
(Abbildung 5.12 A). Dem lag zugrunde, dass einige Tiere vor Beginn der chronischen
Epilepsie verstarben oder die Dauer der Latenzzeit nicht einwandfrei bestimmt
RESULTATE
80
werden konnte (siehe Abbildung 5.10 und Abbildung 5.11). Letzteres betraf die
Mdr1a/b(-/-)-Mäuse 3MM1/F2, 3MM2/F3 und 3MM2/F4. Bei diesen Tieren trat
zwischen frühen (innerhalb der ersten Woche nach SE) und späten Anfällen (ab Tag
acht nach SE) keine Latenzzeit auf. Außerdem konnte eine Mdr1a/b(-/-)-Maus nicht in
die Auswertung einbezogen werden, da sie zwischen Tag sechs und 21 nach SE
aufgrund ihres Allgemeinzustandes nicht mittels EEG überwacht werden konnte.
5.1.6 Phenytoin-Gehirngängigkeit in naiven und chronisch epileptischen Pgp-knockout- und Wildtyp-Mäusen Die Phenytoin-Aufnahme in das Gehirn wurde in wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen
untersucht. Hierfür wurden sechs chronisch epileptische wt- und fünf chronisch
epileptische Mdr1a/b(-/-)-Mäuse mit naiven Mäusen (je n=6) verglichen. Phenytoin
wurde in einer Dosis von 30 mg/kg i. p. appliziert. 70 Minuten nach der Applikation
wurden die Tiere getötet und Cerebellum, Hippocampus, frontaler- und temporaler
Cortex präpariert, um die Phenytoin-Konzentrationen zu quantifizieren. Die
Phenytoin-Konzentrationen im Plasma und Gehirngewebe sind in Tabelle 5.2
zusammengestellt.
Tabelle 5.2: Phenytoin-Konzentrationen im Plasma, Hippocampus, temporalen und frontalen Cortex. Die Tiere wurden 70 Minuten nach der Applikation von 30 mg/kg Phenytoin getötet. Signifikante Unterschiede wurden mittels One-Way-ANOVA und dem Post-Hoc-Test nach Bonferroni ermittelt. Durch Sternchen sind signifikante Unterschiede zwischen naiven wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen gekennzeichnet. Signifikante Unterschiede zwischen epileptischen wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen sind durch Rauten markiert.
wt Mdr1a/b(-/-) naiv (n=6)
epileptisch (n=6)
naiv (n=6) epileptisch (n=5)
Plasma [µg/ml] 20,7 ± 0,9 20,4 ± 1,0 18,5 ± 0,6 18,8 ± 0,7 Hippocampus [µg/g] 16,6 ± 0,9 14,7 ± 1,2 20,1 ± 0,8 * 19,6 ± 1,5 # Temporaler Cortex [µg/g] 19,9 ± 1,0 21,4 ± 0,8 23,5 ± 0,3 * 24,5 ± 0,4 # Frontaler Cortex [µg/g] 19,6 ± 0,8 19,7 ± 0,8 24,2 ± 0,4 * 21,8 ± 0,7 Cerebellum [µg/g] 20,4 ± 1,1 21,6 ± 0,9 24,9 ± 0,6 * 25,6 ± 0,6 #
RESULTATE
81
Abbildung 5.13: Gehirngewebe-Plasma-Ratios von Phenytoin vergleichend zwischen naiven sowie chronisch epileptischen wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen (PGP-KO). Gezeigt sind die Cerebellum-, Hippocampus-, frontaler- und temporaler Cortex-Plasma-Ratios. Gezeigt sind die Mittelwerte + SEM (n=6, außer epileptische Mdr1a/b(-/-)-Gruppe, n=5). Statistisch signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden durch Sternchen gekennzeichnet und mittels One-Way-ANOVA und dem Post-Hoc-Test nach Bonferroni ermittelt.
Weder in der Mdr1a/b(-/-)- noch in der wt-Gruppe unterschieden sich die
Gewebe-Plasma-Ratios zwischen epileptischen und naiven Tieren (Abbildung 5.13).
In allen untersuchten Gehirnregionen war die Gewebe-Plasma-Ratio von Phenytoin
in den Mdr1a/b(-/-)-Mäusen signifikant höher als in den wt-Tieren. Dies war in naiven
sowie chronisch epileptischen Tieren der Fall.
RESULTATE
82
5.2 In-vitro-Untersuchungen von PET-Tracern zur Darstellung von Multidrug-Transportern an der Blut-Hirn-Schranke
Durch Veränderungen des Produktionsprozesses der Transwell®-Membranen
durch den Hersteller Corning Costar GmbH (nachfolgend als Corning bezeichnet)
konnten ab Oktober 2009 vorangegangene Resultate mit bekannten Pgp-Substraten
(Digoxin, Phenytoin) im CETA nicht mehr reproduziert werden, sondern führten zu
ungewöhnlichen Ergebnissen. Nach mündlichen Informationen auf einem BHS-
Treffen (Bad Herrenalb, 2010) führten die veränderten Membranen neben
ungewöhnlichen Resultaten in Transport-Assays sogar zu einem Durchwachsen der
Zellen durch die Membranporen. In der hiesigen Arbeitsgruppe wurden daraufhin
Membraneinsätze verschiedener Hersteller (Greiner Bio-One GmbH; BD
Biosciences) mit Pgp-überexprimierenden LLC- und MDCK-Zellen und den Pgp-
Substraten Digoxin (und Phenytoin nur mit LLC-MDR1-Zellen) getestet. Dies fand
immer im Vergleich zur entsprechenden Ursprungszelllinie und durch den Einsatz
des Pgp-Inhibitors Tariquidar statt. Mit dieser Vorgehensweise zeigte sich, dass für
CETAs mit MDCK-MDR1- und LLC-MDR1-Zellen Membraneinsätze der Firma
Greiner Bio-One wieder zu verlässlichen Resultaten mit führten (siehe Tabelle 5.3).
Durch erneute Veränderungen im Herstellungsprozess der Corning-Transwell®-
Membranen konnte ab Februar 2011 mit LLC-MDR1-Zellen und bekannten Pgp-
Substraten auf diesen Einsätzen wieder an vorhergehende Daten angeknüpft
werden. Die Eignung der Corning-Transwells® (ab Februar 2011) für
Transportversuche mit MDCK-MDR1- sowie MDCK-Bcrp1-Zellen wurde ebenfalls
überprüft (Digoxin als Pgp-Substat und Mitoxantron als Bcrp-Substrat). Dabei stellte
sich heraus, dass mit Pgp- sowie Bcrp1-überexprimierenden MDCK-Zellen auf
Membraneinsätzen von Greiner Bio-One die zuverlässigsten Daten mit den
Referenzsubstraten produzierbar waren. Daraufhin wurden für alle Transporter-
transfizierten LLC-Zelllinien Corning-Transwells® und für die Transporter-
überexprimierenden MDCK-Zelllinien Inserts von Greiner Bio-One verwendet (zur
Übersicht siehe Tabelle 5.3).
RESULTATE
83
Tabelle 5.3: Zeitliche Abfolge der Verwendung von Membraneinsätzen der Firmen Corning und Greiner Bio-One für die in der vorliegenden Arbeit genutzten Zelllinien. Grund für den Wechsel von Corning-Transwells® waren nicht reproduzierbare Daten von Oktober 2009 bis Mai 2010. In dem gesamten Zeitraum fand eine Fehlersuche statt, die damit endete, dass die Membranen als Grund für die Schwierigkeiten identifiziert wurden. Ab Juni 2010 wurden Greiner-Inserts verwendet, die für alle Zelllinien zuverlässige Resultate im Transport-Assay lieferten. Nachdem bestätigt wurde, dass die Membranen der Corning-Transwells® in anderen Arbeitsgruppen wieder verwendet wurden, wurden ab Februar 2011 auch in der hiesigen Arbeitsgruppe wieder Transwells® getestet.
Zelllinie Membraneinsatz-Hersteller Bemerkungen
LLC Bis Mai 2010 Ab Juni 2010 Ab Februar
2011
LLC-MDR1 Corning Greiner Corning LLC-Mdr1a Corning Greiner Corning LLC-MRP1 Corning - Corning Keine Membranen
getestet MDCK
Bis Mai 2010 Ab Juni 2010 Ab Februar 2011
MDCK-MDR1 Corning Greiner Greiner Corning (ab Februar 2011) wurde getestet, nicht geeignet
MDCK-Bcrp1 - Greiner Greiner Corning (ab Februar 2011) wurde getestet, nicht geeignet
MDCK-MRP1 Corning Greiner Greiner Keine Membranen getestet, direkt auf Greiner umgestiegen
5.2.1 Mephobarbital
Um Transport von Mephobarbital durch humanes sowie murines Pgp zu
untersuchen, wurden CETAs über einen Zeitraum von 360 Minuten mit LLC-wt-,
LLC-Mdr1a- und LLC-MDR1-Zellen durchgeführt. Mephobarbital wurde in einer
Konzentration von 50 µM hinzugefügt.
RESULTATE
84
Abbildung 5.14: Mephobarbital-CETA über 360 Minuten. Verwendet wurden LLC-Mdr1a- (A), LLC-MDR1- (B), LLC-wt- (C) und LLC-MRP1-Zellen (D). Mephobarbital wurde in einer Konzentration von 50 µM eingesetzt. Als Pgp-Inhibitor wurde 0,5 µM Tariquidar eingesetzt. MK571 wurde als MRP1-Inhibitor in einer Konzentration von 50 µM hinzugefügt. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (n=3). Die Daten wurden in der Publikation von MAIRINGER et al. (2012) veröffentlicht.
RESULTATE
85
Dies geschah, um eine Vergleichbarkeit mit Phenobarbital zu ermöglichen, da
Phenobarbital in der hiesigen Arbeitsgruppe zuvor ebenfalls in einer Konzentration
von 50 µM im CETA untersucht wurde (vergleiche LUNA-TORTÓS et al. 2008).
Als Pgp-Inhibitor wurde 0,5 µM Tariquidar verwendet. In allen Zellen wurden mit und
ohne Tariquidar keine Konzentrationsunterschiede von Mephobarbital über die Zeit in
der apikalen und basolateralen Kammer festgestellt (Abbildung 5.14 A-C).
Mephobarbital-CETAs wurden ebenfalls unter Verwendung von MRP1-
überexprimierenden LLC-Zellen durchgeführt, um einen Transport von Mephobarbital
durch humanes MRP1 zu untersuchen. MK571 wurde als MRP1-Inhibitor in einer
Konzentration von 50 µM eingesetzt. Weder ohne noch mit MK571 fand ein
Transport von der apikalen in die basolaterale Kammer statt (Abbildung 5.14 D).
Mephobarbital wird im CETA weder durch murines oder humanes Pgp, noch durch
humanes MRP1 transportiert.
5.2.2 Verapamil
Der Verapamil-Transport wurde im CETA und im bidirektionalen Transport-
Assay in LLC-wt und LLC-MDR1 Zellen in Konzentrationen von 5 nM, 10 nM, 0,5 µM,
1 µM und 2 µM untersucht. Die Verapamil-Konzentrationen wurden so gewählt, dass
Konzentrationen unter der inhibitorischen Wirkung sowie Konzentrationen im Bereich
der IC50 für humanes Pgp in-vitro verglichen werden konnten (vergleiche Tabelle
2.1). In beiden Assays wurde signifikanter Transport von 5 nM bis 1 µM Verapamil
von basolateral nach apikal festgestellt (gezeigt sind stellvertretend Transport-
Assays mit 5 nM Verapamil in Abbildung 5.15 und Abbildung 5.16). Dies war bei
2 µM Verapamil nicht nachweisbar. Der Einsatz des Pgp-Inhibitors Tariquidar
inhibierte den Transport von Verapamil vollständig. Bei einer Erhöhung der
eingesetzten Verapamil-Konzentration im CETA, nahm das Ausmaß des Transportes
fortschreitend ab. Nach einer nicht-linearen Korrelations-Analyse nach Spearman
zwischen Verapamil-Konzentration und Transport-Ausmaß ergab sich ein
Korrelations-Koeffizient (Spearman r) von -1, welcher signifikant (P = 0,0167) war
(Abbildung 5.16 F).
RESULTATE
86
Abbildung 5.15: Bidirektionale Transport-Assays mit 5 nM (oben) und 2 µM (unten) Verpamil in LLC-wt- (links) und LLC-MDR1-Zellen (rechts). Die Assays wurden über 600 Minuten durchgeführt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM (n=3) dargestellt. Die Daten wurden in der Publikation von LÖSCHER et al. (2011) veröffentlicht.
Abbildung 5.16: Verapamil-CETA über 600 Minuten mit LLC-wt- und LLC-MDR1-Zellen, dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=3). Verapamil wurde in einer Konzentration von 5 nM (A-C) und 2 µM (D und E) eingesetzt. Statistisch signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden durch Sternchen gekennzeichnet und mittels Two-Way-ANOVA und anschließendem Post-Hoc-Test nach Bonferroni berechnet. Eine nichtlineare Korrelationsanalyse nach Spearman zwischen Verapamil-Konzentration und Transport-Ausmaß resultierte in einem signifikanten (P = 0,0167) Korrelationskoeffizient von -1 (F). Die Daten wurden in LÖSCHER et al. (2011) publiziert.
RESULTATE
87
5.2.3 Tariquidar Transzelluläre Transport-Assays sowie Akkumulations-Assays wurden mit
Pgp- und BCRP-überexprimierenden Zellen durchgeführt, um Transport von
Tariquidar in (subpharmakologischen) PET-Tracer- sowie inhibitorisch wirksamen
Konzentrationen zu untersuchen. Dies geschah, da sich in Studien mit Tariquidar als
PET-Tracer in Mäusen erste Hinweise auf Pgp- und Bcrp-vermittelten Transport von
Tariquidar in Tracer-Dosen ergaben (BAUER et al. 2010).
5.2.3.1 TRANSPORT-ASSAYS
Um Transport von Tariquidar durch Pgp im Transwell®-System zu
untersuchen, wurden bidirektionale Transport-Assays sowie CETAs durchgeführt.
Tariquidar wurde in einer Konzentration von 1 nM eingesetzt. Dies ist eine niedrigere
Konzentration als die in der Literatur beschriebene IC50 für humanes Pgp (vergleiche
Tabelle 2.1). Im bidirektionalen Transport-Assay wurden LLC-wt- und LLC-Mdr1a-
Zellen verglichen. Hier waren keine Unterschiede zwischen den Zelltypen
nachweisbar. Die Transport-Ratios lagen bei 0,60 (LLC-wt) und 0,61 (LLC-Mdr1a),
was eine cTR von 1,02 ergab. In Anlehnung an SCHWAB et al. (2003) wurde eine
cTR ab 1,5 als gerichteter Transport angenommen, somit konnte hier kein
Tariquidar-Transport nachgewiesen werden. In einem weiteren Ansatz wurde in LLC-
Mdr1a-Zellen 1 nM Tariquidar gegen 1 µM Tariquidar verglichen. Auch hier war kein
Tariquidar-Transport nachweisbar und es bestanden keine Unterschiede zwischen
den zwei eingesetzten Tariquidar-Konzentrationen. Zur Absicherung der Resultate
wurden für weiterführende Studien CETAs verwendet. Zwischen LLC-wt- und LLC-
MDR1-Zellen wurden keine Unterschiede im Tariquidar-Transport festgestellt. Daher
konnte auch mittels CETA kein Pgp-vermittelter Tariquidar-Transport gezeigt werden.
Zu jedem Zeitpunkt bestanden signifikante Unterschiede in der Konzentration in der
apikalen und basolateralen Kammer (Abbildung 5.17). Daneben fiel eine
ungewöhnliche Konzentrationsabnahme in beiden Kompartimenten auf, welche mit
anderen Substanzen in der hiesigen Arbeitsgruppe bisher nicht beobachtet wurde.
Außerdem wurde in der apikalen Kammer zum Zeitpunkt der ersten
Probenentnahme eine Tariquidar-Konzentration von deutlich über 100 % der initial
eingesetzten Konzentration gemessen, was nicht erklärt werden kann.
RESULTATE
88
Abbildung 5.17: Tariquidar-CETA unter Verwendung von LLC-wt- und LLC-MDR1-Zellen. Tariquidar wurde in einer Konzentration von 1 nM verwendet. Dargestellt sind die Tariquidar-Konzentrationen in der apikalen sowie basolateralen Kammer über einen Zeitraum von 240 Minuten als Mittelwert ± SEM (n=3). Signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden durch Sternchen markiert und mittels Two-way-ANOVA, gefolgt von Bonferroni’s Post-Hoc-Test analysiert.
Des Weiteren wurden CETAs unter Verwendung von MDCK-Zellen
durchgeführt, welche Bcrp1 oder MDR1 überexprimierten. Es wurden Tariquidar-
Konzentrationen von 1 nM und 1 µM eingesetzt. In den Transwells® aller Zelltypen
unterschied sich die Tariquidar-Konzentration zwischen der basolateralen und der
apikalen Kammer zu mindestens drei Zeitpunkten signifikant (Abbildung 5.18). Da die
Tariquidar-Konzentration in der apikalen Kammer über die Zeit, außer bei den
MDCK-Bcrp1-Zellen, nicht anstieg, konnte keine AUC/h berechnet werden. Dies
erschwerte eine Interpretation der Ergebnisse. Zur Absicherung des eventuell
vorhandenen Tariquidar-Transportes durch Pgp und Bcrp1 wäre der Einsatz von
Pgp- beziehungsweise Bcrp-Inhibitoren notwendig. In weiteren Versuchen mit den
Inhibitoren Ko143 und PSC833 und ihren Lösungsmitteln (DMSO beziehungsweise
Ethanol/Tween, 9:1) zeigte sich ein Einfluss der Lösungsmittel auf die Resultate der
CETAs mit Tariquidar und Elacridar, weshalb dieser Ansatz nicht weiter verfolgt
werden konnte. Dieser Befund kann nicht erklärt werden, weil der Einsatz der
gleichen Inhibitoren bei anderen Substraten (zum Beispiel Pilocarpin) zu den
erwarteten Effekten führte (siehe Abbildung 5.8 und Abbildung 5.9)
5.2.3.2 AKKUMULATIONS-ASSAYS
Die Akkumulation von Tariquidar wurde in Pgp-überexprimierenden und
Bcrp1-überexprimierenden Zellen untersucht. Als Pgp-Inhibitor wurde PSC833 in
RESULTATE
89
einer Konzentration von 10 µM hinzugefügt. Ko143 wurde als Bcrp1-Inhibitor in einer
Konzentration von 0,1 µM verwendet (Abbildung 5.19). Bei 1 nM Tariquidar steigerte
die Inhibition durch PSC833 die Akkumulation in den LLC-MDR1- und LLC-Mdr1a-
Zellen signifikant.
Abbildung 5.18: Tariquidar-CETA unter Verwendung von MDCK-wt- (A), MDCK-Bcrp1- (B) und MDCK-MDR1-Zellen (C). Tariquidar wurde in einer Konzentration von 1 nM (links) und 1 µM (rechts) eingesetzt. Dargestellt sind die Tariquidar-Konzentrationen in der apikalen sowie basolateralen Kammer über einen Zeitraum von 240 Minuten als Mittelwert ± SEM (n=3). Signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden durch Sternchen markiert und mittels Two-way-ANOVA, gefolgt von Bonferroni’s Post-Hoc-Test analysiert.
Die Konzentration von 1 µM Tariquidar führte in allen Zelllinien zu einer
höheren Tariquidar-Akkumulation als in der Konzentration von 1 nM (P < 0,05;
RESULTATE
90
ermittelt durch One-Way-ANOVA und Bonferroni’s Post-Hoc-Test). Signifikante
Unterschiede in den Pgp-überexprimierenden Zellen mit und ohne PSC833-Inhibition
waren nicht nachweisbar.
Abbildung 5.19: Tariquidar-Akkumulations-Assays mit humanen sowie murinen Pgp-überexprimierenden LLC-Zellen (A-C) und murinen Bcrp1 überexprimierenden MDCK-Zellen (D-F). Die Akkumulation wurde in den LLC-MDR1- und LLC-Mdr1a-Zellen in Konzentrationen von 1 nM (A) und 1 µM (B und C) Tariquidar untersucht. In den Bcrp1-überexprimierenden Zellen wurde die Akkumulation von Tariquidar in Konzentrationen von 1 nM (D), 1 µM (E) und 5 µM (F) ermittelt. Alle Daten sind als Mittelwerte + SEM (n=3) dargestellt. Statistisch signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden mittels One-Way-ANOVA sowie anschließendem Bonferroni’s Post-Hoc-Test berechnet und durch Sternchen gekennzeichnet.
RESULTATE
91
In den Bcrp1-überexprimierenden Zellen führte eine Inhibition durch Ko143 in
den Tariquidar-Konzentrationen von 1 nM und 1 µM zu signifikanten Unterschieden
in der Akkumulation (Abbildung 5.19 D und E). Dieser Unterschied war bei einer
Tariquidar-Konzentration von 5 µM nicht nachweisbar (Abbildung 5.19 F).
5.2.4 Elacridar
Die Substrateigenschaften von Elacridar für Pgp und Bcrp1 wurden mittels
CETAs und Akkumulations-Assays in Tracer- (1 nM) und inhibitorisch wirksamen
Konzentrationen (1 µM) ermittelt (vergleiche Tabelle 2.1). Dies wurde untersucht, da
sich in ersten PET-Studien am Nager andeutete, dass Elacridar ein Substrat der
beiden Multidrug-Transporter sein könnte (DÖRNER et al. 2009). Dazu wurden LLC-
wt-, LLC-Mdr1a-, LLC-MDR1- sowie MDCK-wt- und MDCK-Bcrp1-Zellen verwendet.
5.2.4.1 TRANSPORT-ASSAYS
Transportuntersuchungen von Elacridar fanden zunächst mittels CETA statt.
Tariquidar wurde in einer Konzentration von 1 nM verwendet. Es wurden keine
Transportunterschiede zwischen den LLC-wt- und LLC-MDR1-Zellen festgestellt. In
beiden Zelltypen bestanden zu jedem Zeitpunkt signifikante Unterschiede der
Elacridar-Konzentration zwischen der apikalen und basolateralen Kammer
(Abbildung 5.20).
Abbildung 5.20: Elacridar-CETA über 240 Minuten mit LLC-wt und LLC-MDR1 Zellen. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM (n=3). Elacridar wurde in einer Konzentration von 1 nM eingesetzt. Mittels Two-way-ANOVA, gefolgt von Bonferroni’s Post-Hoc-Test wurden statistisch signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) berechnet. Diese wurden durch Sternchen markiert.
RESULTATE
92
Wie in Abbildung 5.21 dargestellt ist, fand in den Bcrp1-überexprimierenden
MDCK Zellen ein signifikanter Elacridar-Transport von der basolateralen in die
apikale Kammer statt, welcher in den MDCK-wt-Zellen nicht nachweisbar war.
Abbildung 5.21: Elacridar-CETA über 240 Minuten mit MDCK-wt und MDCK-Bcrp1 Zellen, dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=3). Elacridar wurde in einer Konzentration von 1 nM eingesetzt. Statistisch signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden durch Sternchen gekennzeichnet und mittels Two-way-ANOVA und anschließendem Post-Hoc-Test nach Bonferroni berechnet.
5.2.4.2 AKKUMULATIONS-ASSAYS
Die Akkumulation von Elacridar wurde in Pgp- und Bcrp1-überexprimierenden
LLC beziehungsweise MDCK Zellen untersucht. Als Pgp-Inhibitor wurde PSC833 in
einer Konzentration von 10 µM hinzugefügt. Ko143 wurde als Bcrp1-Inhibitor in einer
Konzentration von 0,1 µM verwendet. Die Inhibition durch PSC833 steigerte die
Akkumulation von 1 nM Elacridar in den LLC-MDR1- und LLC-Mdr1a-Zellen
signifikant (Abbildung 5.22). In den Bcrp1-überexprimierenden Zellen führte eine
Inhibition durch Ko143 ebenfalls zu signifikanten Unterschieden in der Elacridar-
Akkumulation.
Als 1 µM Elacridar verwendet wurde, zeigten sich keine signifikanten
Unterschiede in den Pgp-überexprimierenden Zellen mit und ohne Zugabe von
PSC833. Auch im Vergleich zu den LLC-wt-Zellen bestand keine signifikant
reduzierte Elacridar-Akkumulation. In den Bcrp1-überexprimierenden Zellen kam es
im Vergleich zu den MDCK-wt-Zellen zu einer signifikant höheren Elacridar-
Akkumulation. In der Akkumulation mit und ohne Ko143-Zugabe waren keine
Unterschiede nachweisbar.
RESULTATE
93
Abbildung 5.22: Elacridar-Akkumulations-Assays mit Mdr1a- und MDR1-überexprimierenden LLC-Zellen (A und B) und Bcrp1 überexprimierenden MDCK-Zellen (C und D). Die Akkumulation wurde in Konzentrationen von 1 nM (A und C) und 1 µM Elacridar (B und D) untersucht. Alle Daten sind als Mittelwerte + SEM (n=3) dargestellt. Statistisch signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden mittels One-Way-ANOVA sowie anschließendem Bonferroni’s Post-Hoc-Test berechnet und durch Sternchen gekennzeichnet.
5.2.5 Laniquidar Die Studien zum Laniquidar-Transport durch Pgp und Bcrp1 fanden mittels
Akkumulations-Assays statt. Diese sollten ergänzend zu bereits erhobenen In-vivo-
Daten durchgeführt werden (LUURTSEMA et al. 2009). Hierfür wurden LLC-wt-,
LLC-Mdr1a- und LLC-MDR1-Zellen sowie MDCK-wt- und MDCK-Bcrp1-Zellen
verwendet. Als Pgp-Inhibitor wurde PSC833 in einer Konzentration von 10 µM, und
als Bcrp1-Inhibitor wurde Ko143 in einer Konzentration von 0,1 µM hinzugefügt. Die
Resultate sind in Abbildung 5.23 dargestellt. Die Laniquidar-Akkumulation in den
Pgp-überexprimierenden Zellen veränderte sich durch den Einsatz von PSC833
nicht, und es bestanden auch keine Unterschiede zu den LLC-wt-Zellen. In den
MDCK-Bcrp1-Zellen bestanden ebenfalls keine Unterschiede mit und ohne BCRP-
Inhibition durch Ko143. Im Vergleich zu MDCK-wt-Zellen war die Laniquidar-
RESULTATE
94
Akkumulation in den Bcrp1-überexprimierenden Zellen signifikant erhöht. Es deutet
sich weder ein Pgp- noch ein Bcrp1-vermittelter Transport von Laniquidar an.
Abbildung 5.23: Laniquidar-Akkumulations-Assays in murinen sowie humanen Pgp-überexprimierenden LLC- und in Bcrp1-überexprimierenden MDCK-Zellen. Laniquidar wurde in einer Konzentration von 1 nM eingesetzt. Als Pgp-Inhibitor wurde 10 µM PSC833 (PSC), als BCRP-Inhibitor 0,1 µM Ko143 (Ko) hinzugefügt. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM dargestellt. Statistisch signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden durch Sternchen gekennzeichnet und mittels One-way-ANOVA mit anschließendem Bonferroni’s Post-Hoc-Test analysiert.
5.2.6 Ciprofloxacin Der Transport von Ciprofloxacin durch Bcrp, Pgp und MRP1 wurde untersucht,
da sich in PET-Studien im Nager andeutete, dass Bcrp1 nicht der einzige
Transporter an der BHS ist, welcher Ciprofloxacin transportiert (unveröffentlichte
Daten aus dem Austrian Institute of Technology GmbH, Seibersdorf und der
Medizinischen Universität Wien in Österreich). Im Ciprofloxacin-CETA mit MDCK-
Bcrp1-Zellen ergab sich ein signifikanter Transport von der basolateralen in die
apikale Kammer (Abbildung 5.24 B). Verwendet wurden 5 µM Ciprofloxacin, und es
wurden 0,2 µM Tariquidar hinzugefügt, um eventuellen Transport durch endogenes
Pgp auszuschließen. In den MDCK-wt-Zellen und den Bcrp1-überexprimierenden
Zellen unter Zugabe des BCRP-Inhibitors Ko143 fand kein Transport statt. Ebenfalls
kein Transport von Ciprofloxacin war in den MRP1-überexprimierenden MDCK Zellen
vorhanden (Abbildung 5.24). Im CETA mit MDR1- sowie Mdr1a-überexprimierenden
LLC-Zellen war kein Pgp-vermittelter Transport von Ciprofloxacin nachweisbar. Es
ließen sich keine Unterschiede zwischen den Zelltypen sowie mit und ohne Pgp-
Inhibitor PSC833 nachweisen (Abbildung 5.25). Zu allen Zellen der Versuche in
RESULTATE
95
Abbildung 5.25 wurde 0,1 µM Ko143 hinzugegeben, um einen Transport durch
endogenes BCRP zu verhindern. Durch die Verwendung der CETAs wurde ein
Ciprofloxacin-Transport durch murines Bcrp1, nicht aber durch murines sowie
humanes Pgp und humanes MRP1 gezeigt.
Abbildung 5.24: Ciprofloxacin-CETA über 360 Minuten mit MDCK-wt- (A), MDCK-Bcrp1- (B und C) und MDCK-MRP1-Zellen (D und E), dargestellt als Mittelwerte ± SEM (n=3). Statistisch signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) wurden durch Sternchen gekennzeichnet und mittels Two-Way-ANOVA und anschließendem Post-Hoc-Test nach Bonferroni analysiert.
RESULTATE
96
Abbildung 5.25: Ciprofloxacin-CETA über 360 Minuten mit LLC-wt- (A), LLC-Mdr1a- (B) und LLC-MDR1-Zellen (C). Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM (n=3). Mittels Two-Way-ANOVA und Bonferroni‘s Post-Hoc-Test wurden statistisch signifikante Unterschiede (P ≤ 0,05) ermittelt und durch Sternchen markiert.
5.2.7 Übersicht der Resultate aus den In-vitro-Versuchen
Nachfolgend sind die Resultate der im Rahmen der vorliegenden Arbeit
durchgeführten Transportversuche dargestellt. Tabelle 5.4 können die mittels CETA
untersuchten Substanzen und Multidrug-Transporter entnommen werden.
Tabelle 5.4: Übersicht der CETA-Ergebnisse. n.u.: nicht untersucht, k.A. mögl.: keine Aussage möglich
Substanz Transport durch
Bemerkungen murines Pgp
humanes Pgp
murines Bcrp1
humanes MRP1
Ciprofloxacin Nein Nein Ja Nein Elacridar n.u. Nein Ja
(1 nM) n.u. Kein Inhibitor
verwendet Mephobarbital Nein Nein n.U. Nein Pilocarpin Ja n.U. Ja n.u. Tariquidar k.A. mögl. k.A. mögl. Ja
(1 nM, 1 µM) n.u. Kein Inhibitor
verwendet Verapamil Ja
(0,5 µM) Ja (5 nM-1 µM) Nein (2 µM)
n.u. n.u. Konzentrations-abhängiger Transport
RESULTATE
97
Es sind auch Daten berücksichtigt, welche in dieser Arbeit nicht dargestellt wurden
(Verapamil-Transport durch murines Pgp in LLC-Mdr1a-Zellen). In Tabelle 5.5 sind
die Ergebnisse der Akkumulations-Assays zusammenfassend dargestellt.
Tabelle 5.5: Übersicht der Ergebnisse aus den Akkumulations-Assays.
Substanz Transport durch Bemerkungen murines Pgp humanes Pgp murines Bcrp1 Elacridar Ja (1 nM)
Nein (1 µM) Ja (1 nM) Nein (1 µM)
Ja (1 nM) Nein (1 µM)
Konzentrations-abhängiger Transport
Laniquidar Nein (1 nM) Nein (1 nM) Nein (1 nM) Tariquidar Ja (1 nM)
Nein (1 µM) Ja (1 nM) Nein (1 µM)
Ja (1 nM, 1 µM) Nein (5 µM)
Konzentrations-abhängiger Transport
DISKUSSION
98
6 DISKUSSION
6.1 Pilocarpin-Modell
6.1.1 Etablierung des Protokolls
Für Mdr1a/b(-/-)- und FVB/N-Mäuse sollte das fraktionierte Pilocarpin-Protokoll
etabliert werden, welches in der hiesigen Arbeitsgruppe bereits für die Ratte und die
Mausstämme C57BL/6 und NMRI angewendet wird (GLIEN et al. 2001; GRÖTICKE
et al. 2007; MÜLLER et al. 2009b). Der Vorteil ist, dass durch die individuelle
Dosierung die SE-Induktionsrate erhöht und die Mortalität verringert werden kann
(GLIEN et al. 2001; GRÖTICKE et al. 2007). In einer Studie von CHEN et al. (2005)
wurden die Mausstämme C57BL/6, CD1 und FVB/N auf die Pilocarpin-induzierte
Anfallsfrequenz und Mortalität vergleichend untersucht. Nach einer Bolus-Applikation
von 272 – 340 mg/kg Pilocarpin zeigten sich die C57BL/6- und CD1-Mäuse nahezu
anfallsresistent, während die FVB/N-Mäuse hochempfänglich für Pilocarpin-
induzierte Anfälle waren. Außerdem war in den FVB/N-Mäusen im Vergleich zu den
C57BL/6-Mäusen die Mortalität signifikant erhöht (CHEN et al. 2005). In einem
weiteren Vergleich zwischen FVB/N- und C57BL/6-Mäusen im Pilocarpin-Modell
zeigten MOHAJERI et al. (2004), dass hippocampale Neurone der C57BL/6-Mäuse
resistenter gegen Zelltod als die Neurone der FVB/N-Mäuse waren.
Für die FVB/N-wt-Tiere konnte das fraktionierte Pilocarpin-Protokoll (Protokoll
Nr. 1) verwendet werden, welches in der hiesigen Arbeitsgruppe bereits für die
C57BL/6 und die NMRI Maus etabliert war (GRÖTICKE et al. 2007; MÜLLER et al.
2009b). Ebenfalls geeignet erschien Protokoll Nummer 2. In beiden Protokollen
betrug die SE-Induktionsrate 100 % mit einer geringen Mortalität. Die Überlebensrate
lag nach Anwendung von Protokoll 1 bei 75 % und bei Protokoll 2 sogar bei 100 %.
Nach einer Bolus-Applikation von Pilocarpin wurde von 40,7 % Überlebensrate für
die FVB/N-Maus berichtet (CHEN et al. 2005). Im Vergleich mit einer Bolus-
Applikation scheint auch für die FVB/N-Maus das fraktionierte Pilocarpin-Protokoll die
Überlebensrate zu steigern.
DISKUSSION
99
Für Mdr1a/b(-/-)-Mäuse wurde eine SE-Induktion durch die systemische
Applikation von Pilocarpin noch nicht gezeigt. Die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse zeigen eine
normale Lebenserwartung und keine physiologischen Abnormalitäten, und bisher
lagen keine Hinweise auf einen Einfluss von Pgp auf das Pilocarpin-Modell vor
(SCHINKEL et al. 1997). Daher wurde in den Untersuchungen der vorliegenden
Arbeit davon ausgegangen, dass ein fraktioniertes Pilocarpin-Protokoll etabliert
werden kann, welches für die Mdr1a/b(-/-)- sowie die wt-Mäuse anwendbar ist. Eine
SE-Induktion von 100 % mit den höchsten Überlebensraten in der Mdr1a/b(-/-)-Gruppe
wurde unter Verwendung von Protokoll 3 und 4 erzielt. Diese Protokolle waren nicht
für eine SE-Induktion der wt-Tiere geeignet, da den Tieren nach der fünften oder
sechsten Pilocarpin-Applikation wieder die Bolus-Dosis verabreicht werden musste,
um einen SE zu induzieren. Anscheinend war die Folgedosis von 50 mg/kg für wt-
Tiere zu gering, um ausreichende Pilocarpin-Konzentrationen für eine SE-Induktion
aufrecht zu erhalten, denn Pilocarpin-induzierte Symptome wie Tremor, Immobilität
oder stereotypes Kauen nahmen wieder ab. Für die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse schienen die
Protokolle Nummer 1 und 2 aufgrund der niedrigen Überlebensrate (25 % und 0 %)
nach dem SE nicht geeignet. Die Etablierung von Pilocarpin-Protokollen für die SE-
Induktion der Tiere beider Gruppen gelang, aber das Ziel ein Protokoll zu
identifizieren, welches für beide Gruppen gleichermaßen anwendbar ist, konnte nicht
erreicht werden. Die Ergebnisse zeigten, dass FVB/N-wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäuse
unterschiedlich empfindlich auf Pilocarpin reagieren. Dies deutet auf einen Einfluss
von Pgp auf das Ausmaß der zentralnervösen Pilocarpin-Wirkung hin.
6.1.2 Einfluss von Pgp und BCRP auf die Pilocarpin-Gehirngängigkeit
Durch die Etablierung des Pilocarpin-Protokolls für FVB/N-wt- und Mdr1a/b(-/-)-
Mäuse fiel auf, dass die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse anscheinend empfindlicher auf Pilocarpin
reagieren und signifikant weniger Pilocarpin zur SE-Induktion benötigten als die wt-
Tiere (Abbildung 5.1). Dies deutete auf einen Einfluss des Multidrug-Transporters
Pgp auf die Gehirngängigkeit von Pilocarpin hin. Studien an Ratte und
Meerschweinchen, in welchen die Gehirngängigkeit von Pilocarpin untersucht wurde,
ergaben eine geringere Gehirn-Plasma-Ratio als aufgrund der Struktur und des Öl-
Wasser-Koeffizienten zu erwarten gewesen wäre (MARCHI et al. 2007; UVA et al.
DISKUSSION
100
2008). Auch hier wäre es möglich, dass Pilocarpin durch aktive Mechanismen am
Durchtritt durch die BHS gehindert wird. Daher sollte untersucht werden, welchen
Einfluss Pgp auf die Gehirngängigkeit von Pilocarpin hat. Vergleichende Studien zur
Aufnahme von Pilocarpin in das Gehirn von Multidrug-Transporter-Knockout- und wt-
Mäusen haben bisher noch nicht stattgefunden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die Gehirn-Plasma-
Ratios von Pilocarpin in FVB/N-wt und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen verglichen. Eine
signifikant erhöhte Gehirn-Plasma-Ratio wurde nach der Applikation von 50 mg/kg
Pilocarpin in Tariquidar-vorbehandelten wt-Tieren nachgewiesen. Geschlechts-
unabhängig waren zwischen unbehandelten wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen keine
Unterschiede in der Gehirn-Plasma-Ratio feststellbar. Dass der Pgp-Inhibitor
Tariquidar Unterschiede bewirkt, aber nicht das Fehlen der Pgp-Isoformen Mdr1a
und Mdr1b, könnte damit zusammenhängen, dass Tariquidar in etwas geringerem
Ausmaß auch inhibitorisch auf BCRP wirkt (ROBEY et al. 2004). Um einen Einfluss
von Bcrp1 auf die Gehirn-Gängigkeit von Pilocarpin zu untersuchen, fanden weitere
Untersuchungen an Bcrp1(-/-)- und Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Mäusen statt. Im Vergleich mit
wt-Tieren war die Gehirn-Plasma-Ratio in Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Mäusen signifikant
erhöht, was in den Bcrp1(-/-)-Mäusen nicht nachweisbar war. Dies deutete darauf hin,
dass sowohl Pgp als auch Bcrp1 an der Verminderung der Gehirn-Aufnahme von
Pilocarpin beteiligt sind. In den Pgp- und auch den Bcrp1-Knockout-Mäusen wurde
aber keine Erhöhung der Gehirn-Plasma-Ratio im Vergleich zu wt-Tieren festgestellt.
Dies könnte darin begründet sein, dass der Pilocarpin-Efflux in den Mdr1a/b(-/-)-
Mäusen durch Bcrp1 und in den Bcrp1(-/-)-Mäusen durch Pgp bewerkstelligt wird. In
Pgp-defizienten Mäusen ist bereits bekannt, dass das Fehlen des Transporters zu
einer Hochregulation von Bcrp1 auf mRNA-Ebene führt (CISTERNINO et al. 2004).
Die signifikant erhöhte Gehirn-Aufnahme von Pilocarpin in den Mdr1a/b(-/-)-Mäusen
nach der Applikation von 200 mg/kg Pilocarpin könnte damit zusammenhängen, dass
Bcrp1 das fehlende Pgp bei niedrigen Pilocarpin-Konzentrationen, aber nicht bei
hohen Konzentrationen, kompensieren konnte.
Die Ergebnisse der In-vitro-CETAs unterstützten die In-vivo-Daten. Es wurde
Bcrp-vermittelter Transport von Pilocarpin und schwächerer Transport durch Pgp
DISKUSSION
101
gefunden. Zwischen den LLC-wt- und den LLC-Mdr1a-Zellen schienen Unterschiede
in der Expression und/oder Funktion endogener Transporter zu bestehen. Die LLC-
wt-Zellen zeigten Pilocarpin-Transport von der basolateralen in die apikale Kammer,
der weder durch den Pgp-Inhibitor PSC833 noch durch den Bcrp-Inhibitor Ko143
beeinflusst wurde. Daher wäre es möglich, dass Multidrug-Transporter in den LLC-
wt-Zellen den Pilocarpin-Transport vermitteln, welche nicht Pgp oder Bcrp sind. Die
Mdr1a-überexprimierenden LLC-Zellen zeigten Transport im gleichen Ausmaß wie
die wt-Zellen, reagierten aber auf PSC833. Dass endogene Transporter aufgrund der
Überexpression anderer Transporter reguliert werden, wurde in der hiesigen
Arbeitsgruppe bereits gezeigt (KUTEYKIN-TEPLYAKOV et al. 2010).
Verschiedene Mausstämme und sogar gleiche Mausstämme verschiedener
Züchter, oder eines Züchters in verschiedenen Barrieren reagieren unterschiedlich
empfindlich auf Pilocarpin (BORGES et al. 2003; WINAWER et al. 2007;
BANKSTAHL et al. 2012). Außerdem werden verschiedene Pilocarpin-Dosierungen
im Bereich von 200 - 360 mg/kg Pilocarpin für unterschiedliche Mausstämme
beschrieben (TURSKI et al. 1984; CAVALHEIRO et al. 1996; SHIBLEY & SMITH
2002; BORGES et al. 2003; WINOKUR et al. 2004). Um zu untersuchen, ob diese
Unterschiede durch die Gehirngängigkeit von Pilocarpin entstehen, wurde im
Rahmen dieser Arbeit die Gehirnaufnahme von Pilocarpin in den Mausstämmen
C57BL/6, NMRI und FVB/N verglichen. Da die Gehirn-Plasma-Ratio in allen drei
Mausstämmen ähnlich war, sind die Unterschiede anscheinend nicht durch die
Pilocarpin-Gehirngängigkeit bedingt.
Die Aktivierung des zentralen Nervensystems durch Pilocarpin über M1-
Rezeptoren wird derzeit als hauptsächlicher Faktor zur Initiierung einer Kaskade von
Abläufen gesehen, welche letztendlich zu einer pro-epileptogenen Aktivität führen
(MARCHI et al. 2007). Die M1-Rezeptor-Expression spielt eine kritische Rolle zur
Pilocarpin-induzierten Anfallsgenerierung. HAMILTON et al. (1997) zeigten, dass
Mäuse, welchen homo- oder heterozygot der M1-Rezeptor-Subtyp fehlt, im Vergleich
zu wt-Mäusen nahezu resistent gegen Pilocarpin-induzierte Anfälle sind. Hinweise
auf weitere Faktoren lieferten Studien von CHEN et al. (2005). Hier wurden die
Mausstämme C57BL/6, CD1 und FVB/N bezüglich ihrer Empfindlichkeit für
DISKUSSION
102
Pilocarpin-induzierte Anfälle und der damit assoziierten Regulation von
Glutamatrezeptoren untersucht. Dabei zeigten sich die FVB/N-Mäuse signifikant
empfindlicher als die beiden anderen Mausstämme. Das Überleben der FVB/N-
Mäuse war im Vergleich zu den C57BL/6-Mäusen signifikant reduziert. Damit
assoziiert, blieb die Expression der Glutamatrezeptoren in der FVB/N-Maus nach
dem Pilocarpin-induziertem SE unverändert. In der C57BL/6- sowie der CD1-Maus
führte die systemische Pilocarpin-Applikation zu einer Herunterregulation der
Expression exzitatorischer Glutamatrezeptoren im Gyrus dentatus. Gleichzeitig war
im CD1-Stamm eine Hochregulation der Expression von inhibitorischen
Glutamatrezeptoren nachweisbar. Die Regulation der Glutamatrezeptoren wurde
auch mit Neurodegeneration im Hippocampus und Gyrus dentatus in Verbindung
gebracht. In der FVB/N-Maus stellte sich die schwerste Neurodegeneration dar
(CHEN et al. 2005).
In diesem Teil der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls untersucht, ob eine
Vorbehandlung mit LiCl eine Erhöhung der Pilocarpin-Aufnahme in das Gehirn der
Mäuse bewirkt. Es ist bekannt, dass LiCl durch Induktion entzündlicher Prozesse die
Barriere-Eigenschaften der BHS beeinträchtigt (MARCHI et al. 2009). In der Ratte
senkt eine Vorbehandlung mit LiCl die Pilocarpin-Dosis bis zur SE-Induktion um das
zehnfache. Damit verbunden, konnten in der Ratte bessere Überlebensraten und ein
höherer Prozentsatz an Tieren erreicht werden, welche einen SE entwickelten
(CLIFFORD et al. 1987). Zugrunde liegt die Hypothese, dass eine LiCl-induzierte
Schädigung der BHS verantwortlich für die Senkung der Pilocarpin-Dosis zur SE-
Auslösung ist (MARCHI et al. 2009). Außerdem wird davon ausgegangen, dass LiCl
durch eine Inhibition der Inositol-Monophosphatase in den Phosphatidylinositol-
Zyklus eingreift, und dadurch die konvulsive Dosis von Pilocarpin verringert werden
kann (BELMAKER & BERSUDSKY 2007). Üblicherweise werden in der Ratte
3 mEq/kg LiCl verabreicht. Jedoch zeigten Untersuchungen der hiesigen
Arbeitsgruppe, dass die Pilocarpin-Empfindlichkeit zur SE-Induktion durch 3 mEq/kg
LiCl in der Maus nicht gesteigert wird, wie es in der Ratte bekannt ist (GRÖTICKE et
al. 2007; MÜLLER et al. 2009a). In der C57BL/6-Maus konnten mit der
Vorbehandlung von 10 mEq/kg LiCl durch 100 mg/kg Pilocarpin bereits limbische
DISKUSSION
103
Anfälle induziert werden, wohingegen 200 mg/kg Pilocarpin ohne LiCl-
Vorbehandlung in Kontrollmäusen keine Anfälle auslöste (SHALDUBINA et al. 2007).
In einer Studie von LI et al. (2008) war in C57BL/6-Mäusen bei einer Vorbehandlung
von 3 mEq/kg LiCl eine höhere Pilocarpin-Dosis (280 – 340 mg/kg) nötig, um einen
SE zu induzieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ergaben sich keine
Unterschiede in der Aufnahme von Pilocarpin in das Gehirn von FVB/N-Mäusen
ohne oder mit LiCl-Vorbehandlung (10 mEq/kg). In weiterführenden Studien wird die
Aufnahme von Pilocarpin in das Gehirn der Ratte untersucht. Hierfür sollen
Vergleiche mit unbehandelten Tieren gegen LiCl-vorbehandelte sowie mit dem Pgp-
Inhibitor Tariquidar-behandelte Ratten stattfinden.
6.1.3 Epileptogenese
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Epileptogenese nach
Pilocarpin-induziertem SE zwischen Mdr1a/b(-/-)- und wt-Mäusen verglichen. Um eine
bessere Vergleichbarkeit zwischen den beiden Gruppen zu erhalten, wurde für die
SE-Induktion Protokoll Nummer 3 und Protokoll Nummer 5 verwendet. Dieser Studie
lag die Hypothese zu Grunde, dass das Gehirn durch Pgp vor Glutamat geschützt
wird, da Pgp Glutamat effektiv aus den Zellen heraustransportieren kann (LIU & LIU
2001). Das Zellsterben in Hippocampus und parahippocampalen Strukturen sowie
die Überexpression von Pgp wurden bereits mit einer anfallsbedingt erhöhten
Glutamat-Ausschüttung in Zusammenhang gebracht (HOLMES 2002; ZHU & LIU
2004; LÖSCHER & POTSCHKA 2005a, b). In der hiesigen Arbeitsgruppe konnte
gezeigt werden, dass der Tod von Neuronen sowie die Hochregulation von Pgp in
den genannten Gehirnregionen durch die Applikation des Glutamat-Antagonisten
MK-801 in Ratten-Modellen für Epilepsie verhindert werden konnte (BANKSTAHL et
al. 2008a).
Die Erwartung in dieser Studie war, dass Pgp-Knockout-Mäuse Anfälle in
höherer Frequenz als die wt-Mäuse entwickeln. Durch die kontinuierliche EEG- und
Videoüberwachung wurde erstmals eine lückenlose Charakterisierung der
Epileptogenese in der FVB/N-Maus ermöglicht. Bisher lagen ebenfalls noch keine
vergleichenden Untersuchungen der Epileptogenese zwischen wt- und Pgp-
Knockout-Mäusen vor. Zwischen den beiden Gruppen ergaben sich keine Hinweise
DISKUSSION
104
auf Unterschiede bezüglich der Anfallshäufigkeit oder Länge der Latenzzeit
(Abbildung 5.10 und Abbildung 5.11). Die meisten Tiere beider Gruppen erlitten
Insult-assoziierte Anfälle, die in der ersten Woche nach dem SE auftraten. Die
Mdr1a/b(-/-)- sowie die wt-Mäuse zeigten eine Latenzzeit von variabler Dauer, in
welcher keine Anfälle auftraten. Die Dauer der Latenzzeit schwankte zwischen neun
und 35 Tagen, in der Literatur ist für Albino-Mäuse eine mittlere Latenzzeit von 14
Tagen beschrieben (CURIA et al. 2008). Im Anschluss daran erlitten alle wt- und die
Mdr1a/b(-/-)-Tiere mit einer Ausnahme spontane wiederkehrende epileptische Anfälle.
Das Auftreten spontaner epileptischer Anfälle in den Wochen nach Pilocarpin-
induziertem SE wurde auch in anderen Studien mit diversen Mausstämmen bei
nahezu 100 % der Tiere beobachtet (SHIBLEY & SMITH 2002; CHEN et al. 2005;
MÜLLER et al. 2009b). Aufgrund der hohen Mortalität in beiden Tiergruppen,
insbesondere während des SE (siehe Tabelle 5.1) und in den ersten Wochen post-
SE, konnten nur wenige Tiere in die Auswertung einbezogen werden, was eine
Aussage aus den gewonnenen Daten erschwert. Die Länge, Dauer und Schwere der
Anfälle sowie die Zahl der Anfälle in den Hell- und Dunkel-Phasen wurden
aufgenommen und werden noch vergleichend analysiert. Eventuell ergeben sich
Unterschiede zwischen wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen lediglich darin, dass die
Mdr1a/b(-/-)-Tiere schwerere und längere Anfälle erleiden als die wt-Tiere. Es wäre
ebenfalls möglich, dass die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse eine ausgeprägtere
Neurodegeneration als die wt-Mäuse zeigen, welche sich nicht in der
Anfallshäufigkeit widerspiegelt. In einem Stammvergleich durch SCHAUWECKER &
STEWARD (1997) im systemischen Kainat-Modell wurde schon gezeigt, dass
FVB/N-Mäuse gegenüber C57BL/6- und BALB/c-Mäusen sehr anfällig für Kainat-
induzierten exzitotoxischen Zelltod sind. Dabei waren zwischen den Mausstämmen
keine Unterschiede in der Anfallsdauer und –Schwere feststellbar (SCHAUWECKER
& STEWARD 1997). Daher wird die Neurodegeneration in Hippocampus und
parahippocampalen Strukturen zwischen den beiden Gruppen ebenfalls noch
untersucht.
DISKUSSION
105
6.1.4 Vergleich der Phenytoin-Gehirngängigkeit in naiven und chronisch epileptischen FVB/N- und Pgp-Knockout-Mäusen Durch Studien von RIZZI et al. (2002) wurde gezeigt, dass in naiven
Mdr1a/b(-/-)-Mäusen 46 % mehr Phenytoin in den Hippocampus aufgenommen wird,
als in Mäusen des Hintergrundstammes (FVB/N). Im Cerebellum und im Cortex
wurde eine Erhöhung von 23 % festgestellt (RIZZI et al. 2002). In Untersuchungen
mit Mdr1a(-/-)-Mäusen, welche noch die Mdr1b-Isoform exprimieren, bestanden in der
Aufnahme von Phenytoin in das Gesamtgehirn keine Unterschiede zu den wt-Tieren
(SCHINKEL et al. 1996). Die Diskrepanzen der beiden Studien könnten damit
zusammenhängen, dass in den Studien von SCHINKEL et al. (1996) Gesamtgehirn
analysiert wurde, während von RIZZI et al. (2002) Gehirnregionen untersucht wurden
(LÖSCHER & POTSCHKA 2005b). Des Weiteren ist es möglich, dass in den
Mdr1a(-/-)-Mäusen die Mdr1b-Isoform die Phenytoin-Aufnahme in das Gehirn
beeinflusst hat. Untersuchungen von KWAN et al. (2003) in der Ratte ergaben eine
Expression von Mdr1b im Hippocampus, aber nicht in anderen Gehirnregionen. In
der vorliegenden Arbeit wurden die Gehirngewebe-Plasma-Ratios von Phenytoin aus
mehreren Gehirnregionen, namentlich dem Cerebellum, Hippocampus, frontalem
und temporalem Cortex gebildet. In allen untersuchten Regionen in naiven und
epileptischen Mdr1a/b(-/-)-Mäusen war die Gehirngewebe-Plasma-Ratio verglichen
mit den wt-Tieren signifikant erhöht. Dies entsprach den Erwartungen und wurde von
RIZZI et al. (2002) in naiven Tieren auch gezeigt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Phenytoin-Aufnahme in das Gehirn
zwischen naiven und epileptischen wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen verglichen. Dies
diente der Untersuchung, inwiefern sich eine chronische Epilepsie eventuell auf die
Pgp-Expression und damit auch auf die Phenytoin-Aufnahme in das Gehirn auswirkt.
Im Kainat-Modell für Epilepsie in Mäusen wurde gefunden, dass wenige Stunden
nach den induzierten Anfällen die mRNA-Level von Pgp ansteigen und damit
assoziiert die Phenytoin-Aufnahme in das Gehirn um 30 % abnimmt (RIZZI et al.
2002). Weder in der Mdr1a/b(-/-)-Gruppe noch in der wt-Gruppe wurden Unterschiede
zwischen naiven und epileptischen Tieren festgestellt. Dass in den Mdr1a/b(-/-)-
Mäusen keine Unterschiede zwischen naiven und epileptischen Tieren bestanden,
DISKUSSION
106
entsprach den Erwartungen. In den epileptischen wt-Tieren wurde im Vergleich zu
naiven wt-Mäusen eine Verringerung der Gehirngewebe-Plasma-Ratio erwartet, da
davon ausgegangen wurde, dass Pgp im Gehirn der epileptischen Tiere
überexprimiert wird.
In einer Studie an epileptischen Ratten wurden nach einer Selektion durch
Phenobarbital Tiere identifiziert, welche pharmakosensitiv und –resistent auf die
Behandlung reagierten. Darüber hinaus wurde in den Phenobarbital-resistenten
Ratten eine Hochregulation von Pgp festgestellt (VOLK & LÖSCHER 2005). Eine
Selektion fand in den Untersuchungen der vorliegenden Arbeit nicht statt und könnte
für weitere Untersuchungen sinnvoll sein. In Untersuchungen an der Maus nach
Kainat- sowie Pilocarpin-induziertem SE wurde gezeigt, dass die Hochregulation von
Pgp im Gehirngewebe vorübergehend stattfindet und nach wenigen Tagen wieder
die Ausgangswerte erreicht (RIZZI et al. 2002; KUTEYKIN-TEPLYAKOV et al. 2009).
6.2 In-vitro-Untersuchungen
6.2.1 Mephobarbital
Die Verwendung eines Antiepileptikums als Radiotracer für die Darstellung der
Pgp-Funktion an der BHS bei Epilepsiepatienten mittels PET könnte gegenüber
bisher entwickelten Tracern einige Vorteile bieten. In dieser Studie wurden
Substrateigenschaften von Mephobarbital für Pgp und MRP1 untersucht, da die
[11C]-Markierung erfolgreich mit einer hohen radiochemischen Reinheit (> 98 %)
durch Anfügen der markierten N-Methylgruppe an Phenobarbital ermöglicht wird
(MAIRINGER et al. 2012). Daher ist die [11C]-Markierung von Mephobarbital
einfacher durchführbar als Phenobarbital radioaktiv zu markieren. Bisher werden
ausschließlich hochaffine Pgp-Substrate für PET im Menschen genutzt, wie [11C]-
Verapamil, [11C]-Loperamid oder [11C]-N-desmethyl-Loperamid (KANNAN et al. 2009;
LÖSCHER & LANGER 2010). Diese Radiotracer werden sehr effizient von Pgp an
der BHS transportiert und haben dadurch selbst bei geringer Expression und/oder
Funktion eine geringe Gehirnaufnahme. Das macht diese Substanzen nicht geeignet,
um regionale Unterschiede der Pgp-Funktion im Gehirn zu erkennen, da sich das
Signal kaum verändert (MAIRINGER et al. 2012). Die Ansätze mit [11C]-Verapamil
DISKUSSION
107
als Tracer unter halbmaximaler Inhibition von Pgp durch Tariquidar waren in der
Ratte geeignet, um regionale Unterschiede darzustellen (BANKSTAHL & LÖSCHER
2008; BANKSTAHL et al. 2011). Nachteil des Ansatzes ist, dass eine Vorbehandlung
mit therapeutischen Dosen Tariquidar erforderlich ist. Dies könnte für die klinische
Verwendung in der Routine-PET impraktikabel werden, insbesondere weil die
Verfügbarkeit für den klinischen Einsatz begrenzt ist (MAIRINGER et al. 2012). Der
Vorteil von Antiepileptika als Radiotracer wäre, dass sie schwache Pgp-Substrate
sind, und dadurch eine bessere Gehirngängigkeit als bei hochaffinen Substraten
vorliegt (LÖSCHER & LANGER 2010). Dies könnte eine Visualisierung von Pgp bei
voller Funktionalität ermöglichen, ohne mit Inhibitoren vorbehandeln zu müssen.
Daraus könnten bei Epilepsiepatienten bereits Vorhersagen des
Behandlungserfolges getroffen werden. Außerdem könnte auf diese Weise die
Multidrug-Transporter-Hypothese weiter untersucht werden, um zu klären, ob die
Überexpression von Pgp auch im Menschen mit niedrigen Gehirn-Leveln der
Antiepileptika assoziiert ist.
In PET-Studien an der Ratte mit [11C]-Mephobarbital als Tracer wurden die
Tiere gepaarten PET-Scans unterzogen, das heißt, es wurde ein Scan vor und ein
Scan nach der Applikation des Pgp-Inhibitors Tariquidar aufgenommen. Im Vergleich
zu [11C]-Verapamil wurde eine zweifach erhöhte AUC0-60 von [11C]-Mephobarbital in
den 60 Minuten des ersten Scans gefunden. Das entsprach der Erwartung für eine
hochpermeable Substanz. Nach der Tariquidar-Applikation veränderte sich die
Gehirnaufnahme im zweiten Scan im Gegensatz zum Pgp-Substrat Verapamil nicht
(MAIRINGER et al. 2012). Im direkten Vergleich gegen wt-Mäuse war die
Aktivitätsaufnahme in das Gehirn vom Pgp- und MRP1-knockout-Mäusen nicht
verändert. Ebenso wenig änderte die Applikation des Pgp-Inhibitors Tariquidar oder
die Verabreichung des MRP-Inhibitors MK571 in wt-Tieren die Aufnahme in das
Gehirn. Insgesamt deuteten die Resultate aus den PET-Untersuchungen nicht auf
Transport von Mephobarbital durch murines Pgp und Mrp1 hin. Durch die im
Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten CETAs wurde ebenfalls kein
Transport von Mephobarbital durch murines, humanes Pgp sowie humanes MRP1
gefunden (MAIRINGER et al. 2012). Dies war überraschend, da das verwandte N-
DISKUSSION
108
Desmethyl-Derivat Phenobarbital mittels CETA als Pgp-Substrat identifiziert wurde
(LUNA-TORTÓS et al. 2008). Es scheint, dass die N-Methylierung die Pgp-Affinität
für Phenobarbital aufhebt. Durch diesen Umstand ist [11C]-Mephobarbital nicht als
PET-Tracer für die Darstellung der Pgp-Funktion geeignet (MAIRINGER et al. 2012).
In Zukunft sollen Versuche zur [11C]-Markierung von Phenobarbital erfolgen
um eine Charakterisierung im selben In-vivo-Design wie bei [11C]-Mephobarbital zu
ermöglichen (MAIRINGER et al. 2012). In den 80iger Jahren wurden bereits [11C]-
Phenobarbital und [11C]-Phenytoin synthetisiert (ROEDA & WESTERA 1981; BARON
et al. 1983). Daraufhin wurde die In-vivo-Verteilung von [11C]-Phenytoin in PET-
Studien mit Mensch und Affe weiter untersucht. Es wurden acht Patienten mit
pharmakoresistenter Epilepsie und zwei Patienten ohne Epilepsie in die Studie
einbezogen (BARON et al. 1983). Hierbei wurde nicht untersucht, ob die Verteilung
der Phenytoin-Konzentration im epileptischen Fokus geringer ist als im
nichtepileptischen Gehirngewebe. Dennoch deuteten die Daten darauf hin, dass in
den untersuchten Epilepsiepatienten keine Unterschiede in der Phenytoin-
Gehirnaufnahme zwischen dem epileptischen Fokus und der kontralateralen
homologen Gehirnregion bestehen. In den damaligen Untersuchungen war die
Auflösung der mittels PET gewonnen Bilder eventuell nicht hoch genug, und somit
werden neuere Studien mit hochauflösendem PET benötigt (LÖSCHER & LANGER
2010).
6.2.2 Verapamil
In hohen Konzentrationen ist Verapamil bereits früh in-vitro als Pgp-Inhibitor
eingesetzt worden (TSURUO et al. 1981). Klinische Trials zur Pgp-Inhibition durch
Verapamil scheiterten aber, da schwere Intoxikationen keine ausreichenden
Plasmakonzentrationen für eine Pgp-Inhibition erlaubten (DALTON et al. 1989;
MILLER et al. 1991). Zum Verapamil-Transport durch Pgp existieren
widersprüchliche Daten in der Literatur (POLLI et al. 2001; LUURTSEMA et al. 2003;
SCHWAB et al. 2003; TAKEUCHI et al. 2006). POLLI et al. (2001) mutmaßten, dass
Verapamil nicht eindeutig als Pgp-Substrat identifiziert werden konnte, weil es eine
hohe Membran-Permeabilität aufweist und transzelluläre Transport-Assays für solche
Substanzen nicht sensitiv genug wären. Daher wurde in dieser Arbeit der
DISKUSSION
109
bidirektionale Transport-Assay mit dem sensitiveren CETA direkt verglichen, welcher
auch geeignet war, um schwache Pgp-Substrate als solche zu identifizieren, wenn
der bidirektionale Assay scheiterte. Die Resultate aus beiden Transport-Assays
zeigen, dass die Identifikation von Verapamil als Pgp-Substrat von seiner
Konzentration abhängt (Abbildung 5.15 und Abbildung 5.16). In niedrigen Verapamil-
Konzentrationen (5 - 500 nM) wurde gerichteter Transport vom basolateralen in das
apikale Kompartiment festgestellt. Bei Einsatz der hohen Konzentration von 2 µM
Verapamil war ein gerichteter Transport nicht nachweisbar. Einen solchen
konzentrationsabhängigen Transport von Verapamil, aber auch Quinidin und
Vinblastin, zeigten SHIRASAKA et al. (2008). Auch durch ATPase-Assays wurde ein
biphasischer Transport von Verapamil in niedrigen, aber nicht in hohen
Konzentrationen, gezeigt (KARWATSKY et al. 2003). In den Untersuchungen dieser
Arbeit ging die Transport-Aktivität zurück, bis kein Transport mehr nachweisbar war.
Daher ist es unwahrscheinlich, dass eine Sättigung von Pgp durch Verapamil
eingetreten ist. Es wäre möglich, dass Verapamil in niedrigen Konzentrationen an die
Substratbindungstasche bindet und in hohen Konzentrationen an eine andere
Tasche bindet, welche die Inhibition von Pgp vermittelt (LÖSCHER et al. 2011). Zu
dieser Schlussfolgerung sind auch YAO et al. (2011) gekommen. Sie führten in-vitro
und in-vivo Studien zum Transport von Phenobarbital und Verapamil durch.
Verwendet wurden Endothelzellen aus dem Ratten-Gehirn für
Akkumulationsversuche und transzelluläre Transport-Assays mit Phenobarbital in
Anwesenheit von Verapamil. Die Effekte von Verapamil auf die pharmakologische
Aktivität von Phenobarbital auf das zentrale Nervensystem wurden in Mäusen
untersucht. Die Akkumulationsstudien zeigten in niedrigen Verpamilkonzentrationen
(1-25 µM) eine Abnahme der Phenobarbital-Akkumulation und erst bei hohen
Verapamilkonzentrationen (50-300 µM) eine Zunahme der Phenobarbital-
Akkumulation. Die Transport-Studien unterstützten dies. Ebendieser biphasische
Effekt war auch auf die Rhodamin123-Akkumulation in den Zellen zu sehen (YAO et
al. 2011). Insgesamt deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass
In-vitro-Assays mit mindestens zwei verschiedenen Konzentrationen durchgeführt
werden sollten, um Pgp-Substrateigenschaften von Substanzen zu untersuchen. Für
DISKUSSION
110
pharmakologisch aktive Substanzen sollten diese idealerweise im therapeutisch
relevanten Bereich gewählt werden (LÖSCHER et al. 2011).
6.2.3 Tariquidar und Elacridar
Die In-vitro-Untersuchungen zum Transport von Tariquidar und Elacridar
durch Pgp und BCRP wurden ergänzend zu PET-Studien durchgeführt, an welchen
die hiesige Arbeitsgruppe kooperativ mit PD Dr. O. Langer vom Austrian Institute of
Technology GmbH, Seibersdorf und der Medizinischen Universität Wien, Österreich
beteiligt war. Ein Einsatz von Pgp-Inhibitoren als PET-Tracer sollte die In-vivo-
Darstellung der Expression von Pgp ermöglichen. Die Annahme war, dass Tariquidar
und Elacridar als Pgp-Inhibitoren neuerer Generation an Pgp binden, ohne selbst
transportiert zu werden (DÖRNER et al. 2009; BAUER et al. 2010).
Um die Eignung der Pgp-Inhibitoren als potenzielle Radiotracer für PET zu
evaluieren, wurde die Gehirnverteilung der [11C]-markierten Pgp-Inhibitoren
Tariquidar und Elacridar in Tracerkonzentrationen bereits mittels PET untersucht.
Hierfür wurden Mdr1a/b(-/-)-, Bcrp1(-/-)- und Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Mäuse und Mäuse
des Hintergrundstammes PET-Scans unterzogen. Beide Tracer wurden in den
Knockout-Mäusen im Vergleich zu den wt-Tieren verstärkt in das Gehirn
aufgenommen (DÖRNER et al. 2009; BAUER et al. 2010). Zu ähnlichen
Schlussfolgerungen kamen auch KAWAMURA et al. (2010; 2011). Neuere, noch
nicht publizierte PET-Untersuchungen an Mäusen, welche am Austrian Institute of
Technology GmbH durchgeführt wurden, beinhalten die Applikation von nicht-
markiertem Tariquidar beziehungsweise Elacridar im Verlaufe des PET-Scans. Die
eingesetzten Dosierungen sollten zu einer vollständigen Pgp- und zumindest
teilweisen Bcrp-Inhibition führen. Die Resultate sind in Abbildung 6.1 und Abbildung
6.2 dargestellt. Für beide [11C]-markierte Inhibitoren in Tracerkonzentrationen zeigte
sich die niedrigste Aktivitätsaufnahme in die Gehirne der wt- und Bcrp1(-/-)-Mäuse.
Die Aktivitätsaufnahme war etwa doppelt so hoch in Mdr1a/b(-/-)-Mäusen und fünf- bis
sechsfach höher in Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Mäusen. Nach 60 Minuten wurde nicht-
markierter Inhibitor appliziert. Daraufhin stieg die [11C]-Elacridar-Aufnahme in das
Gehirn der Bcrp1(-/-)-Mäuse am stärksten an, so dass sich die Aktivitätsaufnahme in
DISKUSSION
111
Bcrp1(-/-)- und Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Mäusen im gleichen Bereich bewegte (Abbildung
6.1).
Abbildung 6.1: PET-Scans mit [11C]-Elacridar als Tracer in wt-, Mdr1a/b(-/-) (rot)-, Bcrp1(-/-) (grün)- und Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)-Mäusen (blau). Nach 60 Minuten wurde nichtmarkiertes Elacridar in einer Dosis von 5 mg/kg verabreicht. Gezeigt sind unveröffentlichte Daten, welche aus einer Kooperation der hiesigen Arbeitsgruppe, dem Austrian Institute of Technology GmbH, Seibersdorf und der Medizinischen Universität Wien (Österreich) entstanden sind.
In den wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen stieg die Aktivitätsaufnahme in das Gehirn
nur leicht an. Im Laufe der 90 Minuten nach Applikation des nicht-markierten
Elacridars näherte sich die Aktivitätsaufnahme in beiden Gruppen an. Die Daten
zeigten, dass Elacridar in der applizierten Dosierung von 5 mg/kg Pgp sowie Bcrp1
inhibierte. Die Applikation von nicht-markiertem Tariquidar in einer Dosis, die Pgp
hemmt, bewirkte eine deutlich verstärkte Aktivitätsaufnahme lediglich in die Gehirne
der Bcrp1(-/-)-Mäuse (Abbildung 6.2). Das heißt, dass Tariquidar Pgp vollständig
inhibierte, aber für Bcrp1 nahezu kein inhibitorischer Effekt zu sehen war. Die
Resultate deuteten darauf hin, dass Elacridar und Tariquidar in
subpharmakologischen Tracer-Konzentrationen durch Pgp und Bcrp transportiert
werden könnten.
DISKUSSION
112
Abbildung 6.2: PET-Scans in wt-, Mdr1a/b(-/-) (rot)-, Bcrp1(-/-) (grün)- und Mdr1a/b(-/-)/ Bcrp1(-/-)-Mäusen (blau) mit [11C]-Tariquidar als Tracer. Nach 60 Minuten wurden 15 mg/kg nicht-markiertes Tariquidar injiziert. Gezeigt sind unveröffentlichte Daten, welche aus einer Kooperation der hiesigen Arbeitsgruppe, dem Austrian Institute of Technology GmbH, Seibersdorf und der Medizinischen Universität Wien (Österreich) entstanden sind.
Die Akkumulationsstudien, welche im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt
wurden, deuten ebenfalls auf einen Transport beider Inhibitoren durch Pgp und Bcrp
hin (Abbildung 5.19 und Abbildung 5.22). Dieser zeigte sich konzentrationsabhängig,
denn die Elacridar- sowie Tariquidar-Akkumulation in die Zellen wurde in niedriger
Konzentration durch beide Multidrug-Transporter beeinflusst. In den Pgp- und Bcrp1-
überexprimierenden Zellen unterschied sich die Elacridar-Aufnahme in hoher
Konzentration (1 µM) durch den Einsatz spezifischer Inhibitoren nicht. Ebenso wenig
stellte sich ein Einfluss von Pgp in hoher Tariquidar-Konzentration (1 µM) dar. In den
Bcrp1-überexprimierenden Zellen wurden zwei hohe Tariquidar-Konzentrationen
(1 µM und 5 µM) im Akkumulations-Assay untersucht. Erst beim Einsatz von 5 µM
Tariquidar wurde kein Bcrp1-Einfluss mehr auf die Akkumulation festgestellt.
Insgesamt kann aus den PET-Daten und den Akkumulationsstudien geschlossen
werden, dass Tariquidar und Elacridar konzentrationsabhängig von Pgp und auch
Bcrp transportiert werden. Im Gegensatz zu Pgp ist Bcrp anscheinend in der Lage,
DISKUSSION
113
Tariquidar auch in höheren Konzentrationen noch transportieren zu können. Durch
Akkumulationsstudien kamen auch KANNAN et al. (2011) zu der Schlussfolgerung,
dass Tariquidar in niedrigen Konzentrationen (1 nM) ein Bcrp-Substrat ist. Verwendet
wurden eine humane Adenokarzinom-Zelllinie und eine humane embryonale
Nierenzelllinie als wt und transfiziert mit humanem BCRP. Die BCRP-
überexprimierenden Zellen akkumulierten signifikant weniger [3H]-Tariquidar als wt-
sowie durch Fumitremorgin C inhibierte BCRP-Zellen. Die Akkumulation von 1 nM
[3H]-Tariquidar wurde in der Studie ebenfalls in humanen Pgp-überexprimierenden
Zellen und der entsprechenden Ursprungszelllinie überprüft. Hierbei wurde sogar
eine vermehrte Tariquidar-Akkumulation in den Pgp-überexprimierenden Zellen
gefunden. Daher kamen die Autoren zu der Schlussfolgerung, dass kein Pgp-
vermittelter Transport von Tariquidar vorlag (KANNAN et al. 2011). Studien mit
spezifischen Pgp-Inhibitoren wurden aber nicht durchgeführt.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten transzellulären Transport-Assays
hingegen schienen weniger geeignet zu sein, um Pgp- und Bcrp-vermittelten
Transport von Tariquidar und Elacridar zu untersuchen. Weder mittels
bidirektionalem Transport-Assay noch mittels CETA wurden Unterschiede zwischen
wt- und überexprimierenden Zellen festgestellt (Abbildung 5.17, Abbildung 5.18,
Abbildung 5.20 und Abbildung 5.21). Im CETA bestanden in allen untersuchten
Zelllinien große Konzentrationsunterschiede zwischen der basolateralen und der
apikalen Kammer. Eventuell werden die transzellulären Transport-Assays dadurch
beeinflusst, dass Tariquidar und Elacridar an der Membran der Transwells®
adsorbieren und/oder sich stark in den Zellmembranen anreichern.
Obwohl Tariquidar im Rahmen der vorliegenden Arbeit als Pgp- und Bcrp-
Substrat identifiziert wurde, könnte der Einsatz als PET-Tracer zur Identifikation von
Pgp-Überexpression an der BHS noch von Bedeutung sein. In PET-Untersuchungen
an Mäusen wurden [11C]-Tariquidar, [11C]-Elacridar und [11C]-Verapamil als Tracer
eingesetzt, um die Identifikation von Pgp-überexprimierenden Tumoren zu
ermöglichen (WANEK et al. 2012). Mit [11C]-Elacridar und [11C]-Verapamil konnten
keine Unterschiede zwischen Tumoren mit niedriger und erhöhter Pgp-Expression
und –Funktion dargestellt werden. Durch den Einsatz von [11C]-Tariquidar wurde eine
DISKUSSION
114
höhere Aktivität in den Pgp-überexprimierenden Tumoren festgestellt (WANEK et al.
2012). PET-Studien zur Darstellung von Pgp oder Bcrp an der BHS wurden bisher
mit Knockout- und wt-Tieren durchgeführt. Letztendlich könnten noch PET-Studien
mit Pgp-überexprimierenden Tieren durchgeführt werden, um zu beantworten, ob
eine Pgp-Hochregulation an der BHS mittels [11C]-Tariquidar oder [11C]-Elacridar als
Tracer dargestellt werden kann.
6.2.4 Laniquidar
Akkumulationsstudien zum Transport von Laniquidar fanden im Rahmen des
EU-Projektes EURIPIDES statt, um die Interpretation von In-vivo-Daten zu
erleichtern. In Studien von LUURTSEMA et al. (2009) wurde Laniquidar [11C]-
markiert und Ratten verabreicht. Die Tiere wurden 5, 15, 30 und 60 Minuten nach der
Injektion getötet und die Radioaktivität in den Geweben untersucht. Dies waren Herz,
Lunge, Leber, Milz, Niere, Muskel und verschiedene Gehirnregionen. Die höchste
Aufnahme fand in Herz, Lunge, Leber und Niere statt. Dreißig Minuten nach der
Applikation war die maximale Aufnahme in das Gehirn erreicht. Diese war in allen
untersuchten Gehirnregionen (Bulbus olfactorius, Cerebellum, Hippocampus,
Striatum, Cerebraler Cortex, Restgehirn) ähnlich gering. Die Aufnahme in das Gehirn
war sogar geringer als die des Pgp-Substrates Verapamil. Dies war überraschend,
da Laniquidar als Pgp-Inhibitor und nicht als Substrat gilt (LUURTSEMA et al. 2009).
Die Ratten, welche in der Studie mit dem Pgp-Inhibitor Cyclosporin A vorbehandelt
wurden, zeigten signifikant mehr Aufnahme in das Gehirn als die unbehandelten
Tiere. Eine Vorbehandlung mit dem spezifischen Pgp-Inhibitor PSC833 hingegen
zeigte keinen Effekt (LUURTSEMA et al. 2009). Durch Cyclosporin A werden neben
Pgp auch Bcrp und MRP2 inhibiert (MATSSON et al. 2009). Daher wurden
Akkumulationsversuche mit Pgp und BCRP-überexprimierenden Zellen durchgeführt,
in welchen weder durch Pgp noch durch BCRP Laniquidar-Transport nachweisbar
war. Aufgrund der geringen Gehirnaufnahme von Laniquidar ist es wahrscheinlich,
dass die Substanz durch andere Multidrug-Transporter aktiv am Durchtritt durch die
BHS gehindert wird.
DISKUSSION
115
6.2.5 Ciprofloxacin
Den Ciprofloxacin-Transportuntersuchungen lagen preliminäre,
unveröffentlichte Daten aus PET-Scans der Maus mit [11C]-Ciprofloxacin als Tracer
zugrunde, welche durch das Austrian Institute of Technology GmbH, Seibersdorf und
die Medizinische Universität Wien, Österreich durchgeführt wurden, um die Eignung
für die Darstellung der BCRP-Funktion an der BHS zu evaluieren. Aus In-vitro-
Studien ist bekannt, dass Ciprofloxacin ein Substrat von humanem sowie murinem
Bcrp ist (HASLAM et al. 2011). Für die PET-Untersuchungen wurde die
Gewebeverteilung von Ciprofloxacin in wt-, Mdr1a/b(-/-)-, Bcrp1(-/-)-,
Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-)- und Mrp1(-/-)-Mäusen untersucht. Im Gehirn war die Aufnahme
des [11C]-Ciprofloxacin in allen untersuchten Tieren gering, was darauf hindeutete,
dass neben Bcrp auch andere Transporter am Efflux von Ciprofloxacin, welche
wahrscheinlich nicht Pgp und MRP1 sind, beteiligt sind. Um dies abzusichern,
wurden die Substrateigenschaften von Ciprofloxacin für die Multidrug-Transporter
Pgp, MRP1 und Bcrp mittels CETA untersucht. Auch hier wurde Ciprofloxacin-
Transport durch murines Bcrp1, nicht aber murines Mdr1a und humanes MRP1
gefunden.
In einer Studie mit humanen Probanden wurde die Verteilung von [18F]-
Ciprofloxacin mittels PET im Organismus untersucht (BRUNNER et al. 2004). Die
höchste Verteilung wurde in Geweben mit Ausscheidungsfunktion, nämlich Leber
und Niere gemessen. Nach kurzer Zeit war Ciprofloxacin in den Organen Niere, Herz
und Milz nicht mehr nachweisbar. Etwas länger detektierbar war Ciprofloxacin im
Muskel, in der Leber und in der Lunge. Die radioaktiven Konzentrationen im Gehirn
waren in der Studie so niedrig, dass sie nicht quantifiziert werden konnten
(BRUNNER et al. 2004). Hinweise auf gerichteten In-vitro-Ciprofloxacin-Transport
vom basolateralen in das apikale Kompartiment ergaben sich erstmals in Caco-2
Zellen (GRIFFITHS et al. 1993). Durch den Einsatz entsprechender Inhibitoren
wurde ein Einfluss von Pgp und MRP2 in diesen Zellen ausgeschlossen (CAVET et
al. 1997; LOWES & SIMMONS 2002). HASLAM et al. (2011) fanden heraus, dass in
den Caco-2 Zellen neben BCRP noch mindestens ein weiterer
Transportmechanismus existieren muss. Durch In-vivo- sowie In-vitro-Studien konnte
DISKUSSION
116
dieser noch nicht abschließend identifiziert werden. Es bestehen Hinweise darauf,
dass Transporter für organische Anionen und/oder Kationen sowie MRP4 am
Ciprofloxacin-Transport beteiligt sind (DAUTREY et al. 1999). Aufgrund der im
Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnen Daten konnte ein Transport von
Ciprofloxacin durch Pgp und MRP1 ausgeschlossen werden. Obwohl BCRP
Ciprofloxacin transportiert, ist Ciprofloxacin als PET-Tracer für die Darstellung der
BCRP-Funktion an der BHS nicht geeignet, da die Gehirnaufnahme sehr gering ist.
Des Weiteren sind nicht alle zugrunde liegenden Transportmechanismen
ausreichend aufgeklärt.
6.3 Schlussbetrachtung Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war der Vergleich der Epileptogenese
zwischen FVB/N-wt- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen im Pilocarpin-Modell. Das fraktionierte
Pilocarpin-Modell konnte für die FVB/N-Maus etabliert werden und damit auch die
Überlebensrate dieses Stammes gegenüber der Bolus-Applikation von Pilocarpin
gesteigert werden. Dadurch fiel aber auf, dass Pgp-Knockout-Mäuse empfindlicher
auf Pilocarpin reagierten und weniger Pilocarpin zur SE-Induktion benötigten als wt-
Tiere. Durch die Kombination von In-vivo-Studien an Knockout-Mäusen und In-vitro-
CETAs wurde erstmals gezeigt, dass Pgp und Bcrp Pilocarpin transportieren und
somit einen Einfluss auf das Pilocarpin-Modell haben können. Für Untersuchungen
zu Transporter-basierter Pharmakoresistenz bei Epilepsie im Pilocarpin-Modell sollte
dies beachtet werden. Entgegen der Erwartungen waren beim Vergleich der
Anfallshäufigkeit und der Dauer der Latenzzeit zwischen wt- und Pgp-Knockout-
Mäusen in der EEG- und Videoüberwachung keine offensichtlichen Unterschiede
feststellbar. Dennoch steht durch die Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit nun
ein Pilocarpin-Protokoll zur Verfügung, welches mit geringer Mortalitätsrate der Tiere
für weitere Studien genutzt werden kann.
Die Darstellung von Multidrug-Transportern an der BHS mittels PET könnte
eine Identifikation von pharmakoresistenten Epilepsiepatienten ermöglichen, denen
durch die Ko-Applikation von Inhibitoren geholfen werden könnte. Zur Entwicklung
von geeigneten PET-Tracern besteht noch weiterer Forschungsbedarf. Die im
Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten In-vitro-Transportstudien führten zu
DISKUSSION
117
dem unerwarteten Ergebnis, dass Mephobarbital nicht von Pgp transportiert wird. Da
Mephobarbital ein N-Methyl-Derivat von Phenobarbital ist und Phenobarbital ein
nachgewiesenes Pgp-Substrat ist, war die Erwartung, dass auch Mephobarbital
durch Pgp transportiert wird. Dies macht [11C]-Mephobarbital als PET-Tracer zur
Darstellung der Pgp-Funktion an der BHS ungeeignet, so dass weitere
Forschungsarbeit zur Identifikation geeigneter Tracer notwendig wird. Bis vor kurzem
galten die Pgp-Inhibitoren Tariquidar und Elaridar als Pgp-spezifisch und wurden
nicht als Substrat angesehen. Inzwischen ist bekannt, dass beide Inhibitoren auch
BCRP inhibieren. Durch den Einsatz von [11C]-Tariquidar und [11C]-Elacridar als PET-
Tracer im Nager deutete sich an, dass die Inhibitoren durch Pgp und BCRP
transportiert werden könnten. Der In-vitro-Akkumulations-Assay stellte sich als die
zuverlässigste Methode heraus, um die Substrateigenschaften zu untersuchen. Es
wurde konzentrationsabhängiger Transport von Tariquidar sowie Elacridar durch Pgp
und Bcrp gefunden, was die In-vivo-Daten unterstützte. Damit konnte erstmals
gezeigt werden, dass Tariquidar und Elacridar nicht nur Pgp und Bcrp inhibieren,
sondern auch von diesen transportiert werden. Für die Entwicklung weiterer Tracer
sind die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten In-vitro-Methoden geeignet, um
Substrateigenschaften der Substanzen zu untersuchen.
ZUSAMMENFASSUNG
118
7 ZUSAMMENFASSUNG
Kerstin Römermann
Die Rolle von Multidrug-Transportern an der Blut-Hirn-Schranke im In-vivo-Pilocarpin-Maus-Modell für Epilepsie und In-vitro-Transportuntersuchungen zu potenziellen PET-Tracern
Epilepsien zählen zu den häufigsten chronisch neurologischen Erkrankungen
weltweit. Die Ursachen, welche der Erkrankung zugrunde liegen, können nicht
behandelt werden. Daher erfolgt die Therapie symptomatisch und in erste Linie
pharmakologisch durch die Applikation von Antiepileptika. Jedoch führt die
Pharmakotherapie bei bis zu 75 % der Temporallappenepilepsiepatienten zu keiner
anhaltenden Anfallsfreiheit. Eine solche Pharmakoresistenz bei Epilepsien ist noch
immer nicht hinreichend verstanden. Eine von mehreren möglichen Hypothesen zur
Entstehung der Pharmakoresistenz ist die Multidrug-Transporter-Hypothese, in der
von einer erhöhten Expression der Multidrug-Transporter an der Blut-Hirn-Schranke
(BHS) im epileptischen Fokus ausgegangen wird. Studien im Tiermodell ergaben
einen Zusammenhang zwischen der anfallsbedingten Hochregulation von
P-Glykoprotein (Pgp) und der erhöhten Ausschüttung des exzitatorisch wirkenden
Neurotransmitters Glutamat. Pgp transportiert nicht nur Glutamat, sondern auch
einige gebräuchliche Antiepileptika wie Phenytoin oder Phenobarbital.
Diverse Studien an Tier und Mensch zeigten, dass durch den Einsatz
geeigneter Radiotracer mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) die
Funktion von Multidrug-Transportern an der BHS dargestellt werden kann. Die
derzeit für Studien im Menschen zur Verfügung stehenden Tracer sind noch mit
Nachteilen behaftet, weshalb weiterer Forschungsbedarf besteht. Letztendlich könnte
der Einsatz von PET in der klinischen Diagnostik eine Identifikation von
pharmakoresistenten Epilepsiepatienten ermöglichen, denen durch die Ko-
Administration von Pgp-Inhibitoren geholfen werden könnte.
ZUSAMMENFASSUNG
119
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Epileptogenese im Pilocarpin-
Modell für FVB/N-Wildtyp- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen zu vergleichen. Hierfür wurde
zunächst das fraktionierte Pilocarpin-Modell für die FVB/N-Maus etabliert. Dabei
benötigten die Mdr1a/b(-/-)-Mäuse signifikant weniger Pilocarpin zur Induktion des
Status epilepticus (SE) als die Wildtyp-Tiere. Daher schloss sich eine Untersuchung
der Pilocarpin-Aufnahme in das Gehirn von Mdr1a/b(-/-)-, Bcrp1(-/-)-, Mdr1a/b/Bcrp1(-/-)-
und Wildtyp-Mäusen an. Die Gehirn-Plasma-Ratio war in den Mdr1a/b/Bcrp1(-/-)-
Mäusen und einer Teil-Gruppe von Wildtyp-Tieren, welche mit dem Pgp-Inhibitor
Tariquidar vorbehandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Wildtyp-Tieren
signifikant erhöht. Ergänzend dazu wurden In-vitro-Konzentrations-Gleichgewichts-
Transport-Assays (CETAs) durchgeführt. Dadurch wurde gezeigt, dass sowohl Pgp
als auch das Breast Cancer Resistance Protein (Bcrp) Pilocarpin transportieren und
dadurch einen Einfluss auf das Pilocarpin-Modell haben können. Des Weiteren
wurden Mdr1a/b(-/-)- und Wildtyp-Mäuse nach einem Pilocarpin-induzierten SE über
einen Zeitraum von 43 Tagen kontinuierlich mittels Elektroenzephalographie (EEG)
und Video überwacht. Dies diente der Untersuchung der Hypothese, dass Pgp die
Neurone im Gehirn vor der anfallsbedingt erhöhten Glutamat-Ausschüttung schützt
und somit Pgp-defiziente Mäuse eine ausgeprägtere Neurodegenration erleiden und
dadurch häufigere Anfälle zeigen. Entgegen der Erwartungen waren beim Vergleich
der Anfallshäufigkeit und der Dauer der Latenzzeit keine offensichtlichen
Unterschiede feststellbar.
Ein weiteres Ziel bestand darin, die Phenytoin-Akkumulation im Gehirn
zwischen naiven und chronisch epileptischen Wildtyp- und Mdr1a/b(-/-)-Mäusen zu
vergleichen. Es ist wahrscheinlich, dass in den chronisch epileptischen FVB/N-
Mäusen keine anfallsbedingte Pgp-Überexpression auftrat, da im Vergleich zu naiven
Tieren keine Unterschiede in der Gehirn-Plasma-Ratio bestanden. Die naiven und
epileptischen Mdr1a/b(-/-)-Mäuse nahmen signifikant mehr Phenytoin in das Gehirn
auf als die Wildtyp-Tiere.
Zur Klärung, ob mögliche PET-Tracer zu Darstellung und/oder Funktion von
Multidrug-Transportern an der BHS Substrate dieser Transporter sind, wurden In-
vitro-Transportstudien durchgeführt. Bidirektionale Transport-Assays sowie CETAs
ZUSAMMENFASSUNG
120
mit Verapamil führten zu dem Ergebnis, dass die Identifikation von Pgp-Substraten
von der eingesetzten Substanz-Konzentration abhängt. Ein unerwartetes Ergebnis
war, dass das N-Methyl-Derivat von Phenobarbital, das Mephobarbital, nicht durch
Pgp transportiert wird, wohingegen Phenobarbital ein nachgewiesenes Pgp-Substrat
ist. Dies macht [11C]-Mephobarbital als PET-Tracer zur Darstellung der Pgp-Funktion
an der BHS ungeeignet. Ebenfalls unerwartet wurde mittels In-vitro-Akkumulations-
Assays konzentrationsabhängiger Transport von Tariquidar sowie Elacridar durch
Pgp und Bcrp gefunden. In der Literatur werden die Pgp- und Bcrp-Inhibitoren
Tariquidar und Elacridar bisher als nicht-transportiert beschrieben. Durch den Einsatz
von [11C]-Tariquidar und [11C]-Elacridar als PET-Tracer im Nager deutete sich an,
dass die Inhibitoren durch Pgp und Bcrp transportiert werden könnten. Daher
unterstützten die Resultate der vorliegenden Arbeit die In-vivo-Daten. Laniquidar
wurde weder als Pgp- noch als Bcrp-Substrat identifiziert. Da in-vivo nur eine geringe
Gehirn-Akkumulation von Laniquidar besteht, sind wahrscheinlich andere aktive
Transporter für den Efflux verantwortlich. Transport-Experimente mit Ciprofloxacin
wurden durchgeführt, da [11C]-Ciprofloxacin in ersten Studien am Nager als PET-
Tracer für die Darstellung von Bcrp-Funktion an der BHS getestet wird. Mittels CETA
wurde Ciprofloxacin-Transport durch Bcrp, nicht aber durch Pgp und MRP1
nachgewiesen. Aus In-vivo-Studien geht hervor, dass Bcrp vermutlich nicht der
einzige Ciprofloxacin-Transporter ist, daher könnten andere, noch unbekannte
Transportmechanismen vorhanden sein.
Die vorliegende Arbeit liefert neue Erkenntnisse zur Rolle von Pgp und Bcrp
im Pilocarpin-Modell für Epilepsie und zeigt auf, dass eine Identifikation von
Multidrug-Transporter-Substraten in-vitro von der Wahl geeigneter Methoden und
Substanzkonzentrationen abhängig ist.
SUMMARY
121
SUMMARY
Kerstin Römermann
The role of multidrug transporters at the blood-brain barrier in the in vivo pilocarpine mouse model for epilepsy and in vitro transport studies of potential PET tracers
Epilepsy is one of the most common chronic neurologic disorders.
Symptomatic pharmacological treatment occurs primarily with antiepileptic drugs
(AEDs). Up to 75 % of patients with temporal lobe epilepsy are not permanently
seizure-free under AED treatment. The mechanism of pharmacoresistance in
epilepsy is not yet completely understood. One possible hypothesis in the
development of pharmacoresistance is the multidrug transporter hypothesis. It is
believed that the overexpression of multidrug transporters at the blood-brain barrier
(BBB) in the epileptic focus is responsible for enhanced efflux of AEDs. Therefore,
AEDs cannot reach effective concentrations in epileptogenic brain regions. In animal
models, coherence between the increased expression of P-glycoprotein (Pgp) due to
seizures and the enhanced release of the excitatory neurotransmitter glutamate
could be shown. Glutamate is accepted as a substrate of Pgp.
Studies in animals and humans showed that appropriate radiotracers can be
used for positron emission tomography (PET) in order to image multidrug transporter
function at the BBB. Still, there exist disadvantages for tracers, which can be used in
human trials. Therefore, further research is necessary. Eventually, the introduction of
PET imaging as clinical diagnostic tool could be suitable to identify patients with
parmacoresistant epilepsy, which would benefit from co-administration with Pgp-
inhibitors.
One object of this thesis was to compare the epileptogenesis between FVB/N
wildtype and Mdr1a/b(-/-) mice in the pilocarpine model. During establishment of the
pilocarpine model, the Mdr1a/b(-/-) mice needed significantly less pilocarpine to induce
status epilepticus than wildtype animals. Therefore, the brain accumulation of
SUMMARY
122
pilocarpine was examined in Mdr1a/b(-/-) , Bcrp1(-/-) , Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-) and wildtype
mice. The brain-plasma-ratio was significantly increased in Mdr1a/b(-/-)/Bcrp1(-/-) and
wildtype mice, which were pretreated with the Pgp inhibitor tariquidar compared to
untreated wildtype animals. Additionally performed concentration equilibrium
transport assays (CETAs) and the in vivo results show that Pgp and breast cancer
resistance protein (Bcrp) transport pilocarpine. This suggests an influence of Pgp and
Bcrp in the pilocarpine model for epilepsy. Furthermore, Mdr1a/b(-/-) and wildtype
mice were continuously monitored with electroencephalography (EEG) and video for
43 days. This was done to investigate the hypothesis that Pgp protects neurons in
the brain from enhanced glutamate release due to seizures. It was expected that Pgp
deficient mice suffer from more severe neurodegeneration and as a consequence
develop more frequent seizures than wildtype mice. As result, there existed no
obvious differences between wildtype and Mdr1a/b(-/-) mice in seizure frequency and
duration of the latency period.
Another aim of this thesis was to compare the phenytoin accumulation in the
brain between naïve and chronic epileptic wildtype and Mdr1a/b(-/-) mice. The brain-
plasma-ratios in naïve and epileptic wildtype animals were virtually the same.
Therefore it is possible that there was no seizure related overexpression of Pgp in
epileptic FVB/N mice. As expected, the brain-plasma-ratios of Mdr1a/b(-/-) mice were
significantly increased compared to wildtype mice in the epileptic and also the naïve
group.
In order to investigate the question if possible PET tracers for imaging of
expression and/or function of multidrug transporters at the BBB are also substrates,
in vitro transport experiments were performed. Bidirectional transport assays and
CETAs with verapamil showed that identification of Pgp substrates depend on the
drug concentration used. Unexpectedly, no transport of the phenobarbital N-methyl-
derivate mephobarbital was observed, whereas phenobarbital itself is a known Pgp
substrate. For this reason, [11C]mephobarbital is not suitable as PET tracer for
imaging Pgp function. Also unexpectedly, the accumulation assays resulted in a Pgp
and BCRP mediated transport of tariquidar and elacridar in a concentration
dependent manner. So far, the Pgp and Bcrp inhibitors tariquidar and elacridar are
SUMMARY
123
described as not transported in the literature. PET studies in rodents with
[11C]tariquidar and [11C]elacridar as tracers indicate transport of both drugs by Pgp
and BCRP. Therefore, the results obtained within this thesis support the in vivo data.
Laniquidar was not identified as Pgp or Bcrp substrate. There is a low brain uptake of
laniquidar in vivo, so it is possible that there are other active transporters responsible
for the laniquidar efflux. In first studies in rodents, the suitability of ciprofloxacin as a
PET tracer for imaging of Bcrp function is determined. Therefore, in vitro transport
assays with ciprofloxacin were performed. With CETA, transport of ciprofloxacin by
Bcrp but not Pgp or MRP1 was observed. In vivo studies showed that Bcrp is
probably not the only ciprofloxacin transporter. Therefore, it is possible that other not
yet known transport mechanisms exist.
The present results provide new insights in the role of Pgp and Bcrp in the
pilocarpine model for epilepsy and show that identification of multidrug transporter
substrates in vitro depends on selection of adequate assays and drug
concentrations.
LITERATURVERZEICHNIS
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ANHANG
141
9 ANHANG
9.1 Puffer und Lösungen EDTA-Lösung 1,86 g Titriplex III in 15 ml Aqua bidest. unter Erwärmung lösen Mit 5 M Natriumhydroxid auf pH 7,4 einstellen Ad 20 ml Aqua bidest. Lagerung bei 4°C bis zur weiteren Verwendung. Elektrophoresepuffer 25 mM Tris 250 mM Glyzin 0,1 % SDS Lysis-Puffer (pH 8,0) 25 mM Tris 50 mM NaCl 0,5 % (w/v) Natrium-deoxycholat 0,5 % (v/v) Triton X-100 Frisch zugesetzt: 1x Protease Inhibitor Cocktail Complete® Lagerung bei 4 °C Phosphat gepufferte Saline; PBS (pH 7,3) 137 mM NaCl 2,7 mM KCl 4,3 mM Na2HPO4 1,47 mM KH2PO4 Für die Verwendung in der Zellkultur wurde der Puffer autoklaviert, ansonsten unsteril verwendet. Phosphat gepufferte Saline mit Tween-20 (PBS-T) 137 mM NaCl 2,7 mM KCl 4,3 mM Na2HPO4 1,47 mM KH2PO4 0,1 % Tween-20
ANHANG
142
Phosphatpuffer (für die HPLC) 50 mM NaH2PO4 · 2 H2O Mit 1 M Natronlauge auf pH 5,6 einstellen Polyacrylamidgel Sammelgel Trenngel 4 % Acrylamid 7,5 % Acrylamid 0,5 M Tris (pH 6,8) 1,5 M Tris (pH 8,8) 0,1 % SDS 0,1 % SDS 0,1 % APS 0,1 % APS 0,1 % TEMED 0,1 % TEMED Transferpuffer 25 mM Tris 192 mM Glyzin 10 % Methanol 5x Laemmli-Puffer 2 % SDS 50 mM 0,5 M Tris, pH 6,8 0,2 mg/ml Bromphenol Blau 0,1 M DTT 10 % (v/v) Glycerol Lagerung bei -20 °C
9.2 Protokoll zur Durchführung des Western Blots
9.2.1 Herstellung der Proteinlysate
Die Zellen wurden zwei Mal mit eiskalter PBS auf der Gewebekulturschale
gewaschen, in 1 ml Lysispuffer und frisch zugesetzten Proteaseinhibitoren von der
Kulturschale geschabt und in 1,5 ml-Reaktionsgefäße überführt. Anschließend
wurden die Zellen 30 min bei 4 °C lysiert. Durch eine fünfzehnminütige Zentrifugation
bei 4°C und 14.000xg wurden Proteinlysat und weitere Zellbestandteile getrennt. Das
Proteinlysat im Überstand wurde in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Für
die Quantifizierung der Proteinmenge wurde der Überstand 1:5 verdünnt auf eine
durchsichtige 96-Well-Platte pipettiert und wurde mit dem BCATM Protein Assay Kit
nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Messung der optischen Dichte
ANHANG
143
erfolgte mittels MRX-Microplate-Reader.Die Proteinlysate wurden bis zur weiteren
Verwendung bei -20 °C aufbewahrt.
9.2.2 Vorbereitung der Proben
Die Proteinlysate wurden auf Eis aufgetaut. Es wurden 50 μg Protein mit
dreifach konzentriertem Lämmlipuffer gemischt, 30 min bei 37°C inkubiert und kurz
abzentrifugiert. Die Proben sowie ein gefärbter Proteingrößenstandard wurden auf
ein Polyacrylamidgel geladen und bei 80 bis 150 Volt elektrophoretisch aufgetrennt.
9.2.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Die Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
ermöglicht die Auftrennung von Proteinen in Proteinmischungen und die Ermittlung
des apparenten Molekulargewichtes. Durch SDS erhalten die denaturierten Proteine
mit einer negativ geladenen Hülle aus SDS-Partikeln. Dies ermöglicht die
elektrophoretische Auftrennung der Proteine in Polyacrylamidgelen ihrer Größe nach.
Für diese Versuche wurden 10 %ige Gele verwendet. Ein Sammelgel, welches
weniger konzentriert als die Trenngele ist, ermöglicht das Sammeln aller Proteine
einer Probe, um ihnen denselben Startpunkt für die Auftrennung zu schaffen. Dies
geschieht durch den niedrigen pH-Wert des Sammelgels. Glycinionen, welche im
Laufpuffer enthalten sind, erreichen bei dem niedrigen pH-Wert ihren isoelektrischen
Punkt und laufen daher sehr langsam durch das Sammelgel. Chlorionen hingegen
liegen negativ geladen vor und laufen schnell durch das Sammelgel. Die Proteine
laufen dazwischen, da diese durch die niedrige Feldstärke an der Chlorionenfront
gebremst und durch die hohe Feldstärke an der Glycinionenfront beschleunigt
werden. Im Trenngel ändert sich der pH-Wert, was eine negative Ladung der
Glycinionen bewirkt. Dadurch laufen diese, ebenso wie die Chlorionen schnell durch
das Trenngel. Somit können die Proteine ihrer Größe nach aufgetrennt werden, da
diese nun nicht mehr zwischen diesen beiden Ionen gebremst werden.
Essentiell hierbei ist die Vorbereitung der Proben. Durch das SDS, welches
die Proteine umlagert und teilweise denaturiert, werden alle Proteine mit einer
negativen Ladung versehen. SDS kann die kovalenten Sekundärstrukturen in den
Proteinen allerdings nicht denaturieren. Daher werden die Proben mittels Hitze und
ANHANG
144
dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) denaturiert und linearisiert. Dies führt
außerdem zu einer Vergleichbarkeit der Proteine, damit neben Eigenladung auch
Faltung und Struktur keine Auswirkungen auf das Laufverhalten der Proteine haben
können.
9.2.4 Western Blot und Antikörperbelegung
Für den Western Blot wurde die PVDF-Membran auf die Gelgröße
zugeschnitten, 10 Sekunden mit Methanol aktiviert und in Transferpuffer feucht
gehalten. Das Blotten erfolgte in einer Semi-Dry-Blottingapparatur über 1,5 h bei 2
mA/cm2, um die Proteine auf die Membran zu übertragen. Anschließend wurde die
Membran bei 4 °C über Nacht mit 5% Magermilchpulver in PBS-Tween (w/v)
geblockt, zwei Mal mit PBS-T gewaschen und 1 h bei Raumtemperatur mit dem
primären Antikörper in 2% Magermilchpulver/PBS-T (w/v) inkubiert. Nach erneutem
Waschen erfolgte die Zugabe des sekundären Antikörpers in 2%
Magermilchpulver/PBS-T (w/v) für 45 Minuten. Bevor die Lösungen des SuperSignal®
West Femto Kits für eine Minute auf die Membran gegeben wurden, wurde die
Membran mehrmals gewaschen. Die Pierce-Lösungen enthalten eine Peroxid-
Lösung und eine Luminol-Lösung. Werden die beiden Lösungen gemischt, dient
diese als Substrat für die Meerrettichperoxidase, welche mit dem sekundären
Antikörper gekoppelt ist. Durch die Oxidation von Luminol durch Wasserstoffperoxid
entsteht eine Chemolumineszenz, welche beispielsweise durch Schwärzung eines
Röntgenfilms sichtbar wird. Die Belichtung erfolgte auf Röntgenfilm über eine Dauer
von 10 Sekunden bis 5 Minuten.
Tabelle 9.1: Verwendete Antikörper und Verdünnungen.
Primärer Antikörper
Verdünnung Sekundärer Antikörper
Verdünnung
Pgp C219 1:200 α-Kaninchen 1:1000
BCRP BXP-53 1:500 α-Ratte 1:10.000
β-Aktin α-β-Aktin 1:1000 α-Maus 1:100.000
ANHANG
145
9.3 Substanzen, Konzentrationen und Lösungsmittel für die Zellkulturversuche
Substanz Lösungsmittel für die Stammlösung
Konzentration der Stammlsg.
Konzentration im Versuch
Referenzsubstrate Calcein-AM DMSO 1 mM 1 µM Digoxin DMSO 5 mM 10 nM Mitoxantron DMSO 10 mM 10 µM Inhibitoren Ko143 DMSO 1 mM 0,1 µM MK571 Optimem® 9,3 mM 50 µM PSC833 Ethanol/Tween80 (9:1)
1:2 verd. mit Aqua bidest. 8,23 mM 10 µM
Tariquidar DMSO 5 mM 0,2 µM, 0,5 µM Testsubstanzen Ciprofloxacin Aqua bidest. 15 mM 5 µM Elacridar DMSO 5 mM 1 nM, 1 µM Laniquidar DMSO 5,4 µM 1 nM Mephobarbital Methanol 50 mM 50 µM Pilocarpin Aqua bidest. 5 mM 25 µM Tariquidar Aqua bidest. 5 mM 1 nM, 1 µM Verapamil Ethanol 4,4 mM Abhängig vom
Versuch
ANHANG
146
9.4 Substanzen, Dosierungen und Applikationsvolumina für die In-vivo-Studien
Substanz Lösungsmittel Dosierung [mg/kg]
Applikationsvolumen [ml/kg]
Buprenorphin (Temgesic®)
NaCl 0,1 mg/kg 10 ml/kg
Chloralhydrat Aqua ad injectabilia 400 mg/kg 5 ml/kg Diazepam 6,56 ml unvergällter
Ethanol, mit NaCl auf 50 ml
10 mg/kg 10 ml/kg
Lithiumchlorid Aqua ad injectabilia 10 mEq/kg (423,3 mg/kg)
10 ml/kg
Marbofloxacin (Marbocyl®)
Aqua ad injectabilia 4 mg/kg 4 ml/kg
Methylscopolamin Aqua bidest. 1 mg/kg 10 ml/kg Phenytoin 3 % Natriumhydroxyd
(1 M) und 97 % Aqua ad injectabilia
30 mg/kg 10 ml/kg
Pilocarpin Aqua ad injectabilia Abhängig vom Versuch
10 ml/kg
Tariquidar 5 %ige Glukoselösung 15 mg/kg 10 ml/kg
9.5 Substanzen und Medien
Substanz Bezugsquelle
Acetonitril pro analysi (HPLC FarUV) Lab-Scan, Gliwice, Polen
Ammonium Persulfat (APS) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Aqua ad injectabilia B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Szintillationsflüssigkeit Aquasafe 30 plus Zinsser Analytic GmbH, Frankfurt
BCA™ Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific GmbH, Dreieich
Bupivacain (Carbostesin® 0,25 %) AstraZeneca, London, England
Buprenorphinhydrochlorid (Temgesic®) Essex Pharma, München
Calcein-AM Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Calciumchlorid-Dihydrat p.a. Merck, Darmstadt
ANHANG
147
Chloralhydrat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Desoxycholsäure Natriumsalz (DOC) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Diazepam-Fertigarzneimittel Faustan® Temmler Pharma, Marburg
Digoxin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Dinatriumhydrogenphosphat Na2HPO4 AppliChem, Darmstadt
Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
DMEM + GlutaMAX™ (+ D-Glucose, + Pyruvat)
Gibco®/Life Technologies GmbH, Darmstadt
Ethanol (100 %) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Ethanol (vergällt) CG Chemikalien, Laatzen
Fetales Kälberserum LINARIS Biologische Produkte GmbH, Wertheim-Bettingen
Glycerol AppliChem, Darmstadt
Glyzin Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Kaliumchlorid Merck, Darmstadt
Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 Merck, Darmstadt
Ko143 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Lithiumchlorid Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Magermilchpulver Sucofin (0,9 %) TSI GmbH & Co. KG, Zeven
Magnesiumsulfat-Heptahydrat p.a. Merck, Darmstadt
Marbofloxacin (Mabocyl® FD1 %) Vétroquinol GmbH, Ravensburg
Medium199® Gibco®/Life Technologies GmbH, Darmstadt
Methanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Methanol p.a. Lab-Scan, Gliwice, Polen
Methylscopolamin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Mitoxantron Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
MK571
Enzo Life Sciences GmbH, Lörrach
ANHANG
148
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamin (TEMED)
Fluka Biochemika, Deisenhofen
Natriumchlorid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Natriumchloridlösung (isotonisch, NaCl 0,9 %)
B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Opti-MEM® Gibco®/Life Technologies GmbH, Darmstadt
Precision Plus Protein Standard (Dual color)
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Penicillin/Streptomycin (10.000 E/10.000 µg/ml)
Biochrom AG, Berlin
Phenobarbital Serva, Heidelberg
Phenytoin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Pilocarpin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Primärantikörper anti-Pgp C219 (Maus, monoklonal)
Signet™ Covance, California, USA
Primärantikörper anti-ß-Aktin (Kaninchen, monoklonal)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Primärantikörper anti-BCRP BXP-53 (Ratte, monoklonal)
Abcam, Cambridge, England
Protease Inhibitor Cocktail® Tablets Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
PSC833 Novartis Pharma GmbH, Nürnberg
Rhodamin 123 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen
Rotiphorese® Gel 30 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Röntgen-Entwickler Tetenal AG & Co. KG, Norderstedt
Röntgenfixierlösung Tetenal AG & Co. KG, Norderstedt
Salzsäure p. a. (37 %ig) Merck, Darmstadt
Sekundärantikörper Ziege-anti-Kaninchen-HRP
Dako Deutschland, Hamburg
Sekundärantikörper Ziege-anti-Ratte-HRP
Dianova GmbH, Hamburg
Sekundärantikörper Kaninchen-anti-Maus-HRP
Dako Deutschland, Hamburg
ANHANG
149
Sodiumdodecylsulfat Pellets Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Sterofundin® VG-5 B. Braun Melsungen AG, Melsungen
SuperSignal® West Femto Kit Thermo Scientific, Rockford, USA
Tariquidar Xenova Ltd., Berkshire, UK
Titriplex III p.a. Merck, Darmstadt
Topiramat The R. W. Johnson Research Institute, Pennsylvania, USA
Tris AppliChem, Darmstadt
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Trypan Blue Solution (0,4 %) Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Trypsin/EDTA-Lösung 10x (0,5/0,2 %) Biochrom AG, Berlin
Tween 20 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Verapamil Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim
Wasserstoffperoxid (35 %) AppliChem GmbH, Darmstadt 3H-Digoxin Perkin Elmer LAS GmbH, Rodgau-
Jürgesheim 3H-Mitoxantron Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig 3H-Tariquidar Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig 3H-Verapamil Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig 14C-Ciprofloxacin Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA 14C-Mannitol Hartmann Analytic GmbH, Braunschweig
9.6 Verbrauchsmaterialien und Geräte
Gerät/Verbrauchsmaterial Bezugsquelle
Ableitkabel Hopa Kabelkonfektion GmbH & Co. KG, Langenhagen
Akku-Schüttler KM-2 Edmund Bühler Labortechnik GmbH, Hechingen
Altromin 1324 Standarddiät Altromin GmBH, Lage, Deutschland
Analog-Digitalwandler PowerLab/8s, ADInstruments Ltd, Hastings, England
Blottingpapier (3 mm) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Bohrer Hager & Meisinger GmbH, Neuss
ANHANG
150
CCD-Kamera-Modul Conrad Elekronik, Hannover
Computer zur EEG-, Videoüberwachung Dell GmbH, Frankfurt am Main
CO2-Inkubator Heraeus BBD 6220 Heraeus Instruments GmbH, Osterode
CO2-Inkubator NU-4500E NuAire Inc., Plymouth, USA
Dentalbohrer (Mod. 732 T1) Dremel, Leinfelden-Echterdingen
Dental-Zement (Paladur®) Heraeus Kulzer, Hanau
Ein-Kanal-Verstärker (BioAmp) ADInstruments Ltd, Hastings, England
Einmalkanülen TERUMO® Europe N.V., Leuven, Belgien
Einmalspritzen B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Eismaschine Ziegra Eismaschinen GmbH, Isernhagen
Elektronische Mikrowaagen CPA 225D Sartorius AG, Göttingen
Elektrophoresekammer und Stromgerät Biometra GmbH, Göttingen,
Elektrophoresekammer Mini-PROTEAN® Tetra Cell + PowerPac™ Basic Power Supply
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Entgaser (ERC – 3512) Erma-Elektronic, Immendingen
Eppendorfgefäße Eppendorf, Hamburg FalconTM Inserts BD Biosciences, Heidelberg Feinwaage (CPA255D) Sartorius AG, Göttingen
Feinwaage (handy) Sartorius AG, Göttingen Fluoroskan II Fluorescent Microplate Reader Labsystems, Helsinki
Gefrierblock (RKT) Lauda, Königshofen
Hauptsäule (HPLC column EC 250/4.6; Nucleosil 120-5 C18, 250 x 4,6 mm)
Macherey-Nagel, Düren
Hämatokrit-Kapillaren Brand GmbH & Co. KG, Wertheim
Infrarotstrahler Conrad Elektronik, Hannover
Kabelentwirrer Conrad Elektronik, Hannover
Kamera (Infrarot) NyctoVision, Wunstorf
Leica DM LB Mikroskop Leica Mikroskopie & Systeme GmbH, Wetzlar
Leica TCS SP5 AOBS Leica Mikroskopie & Systeme GmbH, Wetzlar
Liquid Scintillator System LS 5000 TA Beckman Coulter Inc., Brea, USA
Lochzange Faust Medizintechnik, Berlin
ANHANG
151
Magnetrührer Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach
Makrolonkäfige Ebeco, Caustrop-Rauxel
Millipore-Filtereinheit (Millipore Kit; 0,22 µm) Millipore, Billerica, MA, USA
Mini-Laborpumpe LABOPORT® neoLab® Laborbedarf-Vertriebs GmbH, Heidelberg
MRX Microplate Reader Dynatech Deutschland GmbH, Denkendorf
Multiplexer (Monacor TVMP-400) Menzel Elektronik, Hannover
Nahtmaterial (Surgicryl® PGA) SMI, Hünningen, Belgien
NIKON Eclipse TS100 NIKON instruments Inc., Melville, USA
Operationsbesteck Aesculap, B. Braun Melsungen AG, Melsungen
pH-Meter Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co., Berlin
Pipettenspitzen Carl Roth GmbH + CO. KG, Karlsruhe; Eppendorf AG, Hamburg
Pipettierhilfe accu-jet® pro Brand GmbH & Co. KG, Wertheim
Pumpen (LC – 6A) Shimadzu, Duisburg
Plastikreagenzgläser (PPN-Röhrchen) Greiner Labortechnik GmbH, Kremsmünster, Österreich
Pumpencontroller (C-R4A; Fluss: 1 ml/min) Shimadzu, Duisburg
PVDF Transfer Membran T830.1 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Röhrchen 15, 50 ml Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht
Röntgenfilm CL-XPosure Film Fisher Scientific GmbH, Schwerte
Säulenofen (Knauer Column Oven, 35°C) Knauer, Berlin
Schrauben (aus nicht rostendem Stahl) Hummer & Rieß, Nürnberg
Schüttler Mini-Rocker MR-1 PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen
Semi-Dry-Electroblotter PerfectBlue™ PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen
Sicherheitsbrenner FIREBOY plus INTEGRA Biosciences GmbH, Fernwald
Stereotakt David Kopf, Tujunga, CA, USA
Sterilbank NU-440-400E NuAire Inc., Plymouth, USA
Sterilfilter Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht
ThinCerts® Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
ANHANG
152
Transwell® Corning Costar GmbH, Bodenheim
TEER-Kammer (EndOhm-24SNAP) World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL, USA
Ultraschallbad Sonorex Super BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin
Ultra-Turrax T25 Jane & Kunkal IKA®-Labortechnik, Staufen
UV-Detektor (SPD – 6A; Wellenlänge 210 nm)
Shimadzu, Duisburg
Vorsäule (Nucleosil 120-5 C18, 60 x 4 mm) Knauer, Berlin
Vortex REAX 2000 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach
Wasserbad Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel
Wasserfester Stift Edding International GmbH, Ahrensburg
Weichholzgranulat Rettenmaier & Söhne GmbH und Co KG, Rosenberg
Zellkulturschalen Ø 60, 100 mm Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht
Zellschaber neoLab® Laborbedarf-Vertriebs GmbH, Heidelberg
Zentrifuge 4123, Zentrifuge (1 S-R Multifuge) Heraeus Instruments GmbH, Osterode
Zentrifuge (5415 D) Eppendorf, Hamburg
6 Well Platten Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
96 Well Platten Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
96 Well Platten (schwarz) Corning Costar GmbH, Bodenheim
PUBLIKATIONEN
153
PUBLIKATIONEN
Originalarbeiten
W. Löscher, C. Luna-Tortós, K. Römermann and M. Fedrowitz (2011): “Do ATP-binding cassette transporters cause pharmacoresistance in epilepsy? Problems and approaches in determining which antiepileptic drugs are affected” Current Pharmaceutical Design; 17(26):2808-28.
S. Mairinger, J. P. Bankstahl, C. Kuntner, K. Römermann, M. Bankstahl, T. Wanek, J. Stanek, W. Löscher, M. Müller, T. Erker and O. Langer (2012): „The antiepileptic drug mephobarbital is not transported by P-glycoprotein or multidrug resistance protein 1 at the blood-brain barrier: A positron emission tomography study” Epilepsy Research; 100(1-2):93-103.
Zitierfähige Kongressbeiträge
K. Römermann, M. Bankstahl, J. P. Bankstahl, C. Kuntner, T. Wanek, B. Dörner, F. Bauer, T. Erker, M. Fedrowitz, O. Langer and W. Löscher (2011): “Dose-dependent transport of 11C-labeled multidrug transporter inhibitors tariquidar and elacridar at the blood-brain barrier measured by small-animal PET and in-vitro transport assays” 41th Annual Meeting Society for Neuroscience, Washington, DC, 946.05/AAA30 K. Römermann, M. Bankstahl, J.P. Bankstahl and W. Löscher (2012): „Influence of multidrug-transporters at the blood-brain barrier on brain penetration and convulsant activity of pilocarpine” 8th FENS Forum of Neuroscience, Barcelona, 152.01/C163 M. Bankstahl, J. P. Bankstahl, S. Mairinger, C. Kuntner, K. Römermann, T. Wanek, J. Stanek, T. Erker, O. Langer and W. Löscher (2011): „Evaluation of [11C]mephobarbital as a tracer to investigate cerebral Pgp function by small-animal PET and in-vitro transport assays” 41th Annual Meeting Society for Neuroscience, Washington, DC, 559.24/L6
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG
154
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Die Rolle von Multidrug-
Transportern an der Blut-Hirn-Schranke im In-vivo-Pilocarpin-Maus-Modell für
Epilepsie und In-vitro-Transportuntersuchungen zu potenziellen PET-Tracern“
selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in
Anspruch genommen:
Frau G. Zivkovic (Tierpflegerin am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie) versorgte die Mäuse und führte alle mit der Mauszucht verbundenen
Aufgaben durch. Frau M. Gramer und Frau M. Hausknecht (Technische Angestellte
am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie) führten die Aufbereitung
der Proben und die darauf folgende HPLC-Analytik durch. Herr R. Baum
(Feinmechaniker am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie) fertigte
die Elektroden für die EEG-Überwachung an und baute die Überwachungskäfige.
Frau H. Breuer und Herr S. Langemeyer (ehemalige Tiermedizinstudenten im
praktischen Jahr) unterstützten mich bei der EEG-Auswertung. Frau H. Vodde
(ehemalige Tiermedizinstudentin im praktischen Jahr) unterstützte mich bei den
bidirektionalen Transport-Assays mit Tariquidar als Testsubstanz.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt: Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder
für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die
vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit
entsprechend gemacht habe.
_________________________
Unterschrift
DANKSAGUNG
155
DANKSAGUNG
Bedanken möchte ich mich an erster Stelle bei Herrn Prof. Dr. Löscher für die
Überlassung des interessanten Themas und die intensive fachliche Betreuung.
Ferner möchte ich mich für die hilfreichen wissenschaftlichen Diskussionen
bedanken.
Ebenfalls danken möchte ich den Co-Supervisoren Herrn Prof. Dr. Hildebrandt und
Herrn Prof. Dr. Claus für die kompetente Betreuung dieser Arbeit.
Frau PD Dr. M. Fedrowitz, Frau Jun.-Prof. Dr. M. Bankstahl und Herrn J.P.
Bankstahl, Ph.D. möchte ich für die Anleitungen zu gut organisiertem
experimentellem Arbeiten, die stete Hilfs- sowie Diskussionsbereitschaft und die
netten Gespräche danken.
Ich möchte allen Mitgliedern des Instituts für ihre Unterstützung und Hilfsbereitschaft
danken. Sie alle trugen zu einem angenehmen Arbeitsklima bei und werden mir in
sehr guter Erinnerung bleiben. Insbesondere danke ich Frau M. Gramer und Frau M.
Hausknecht für die Durchführung der HPLC-Analytik. Weiterhin möchte ich Frau
Dana Alms und Frau Sabine Klein für ihre zuverlässige Hilfe in der Zellkultur
beziehungsweise der EEG-Überwachung danken.
Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie und meinem Mann Daniel, die mich
immer und auf jede erdenkliche Weise unterstützt haben.
