endotoksin dan pirogen
TRANSCRIPT
![Page 1: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/1.jpg)
KELOMPOK 9Nama : Anggita Sarasati
Ina HafityaningsihNurfadilla Putri Dewi IndayaniSiti Fatimah Nur Hikmah Y.Wiewik Ambarwati
![Page 2: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/2.jpg)
Uji Endotoksin dan Pirogen
![Page 3: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/3.jpg)
EKSOTOKSIN• Virulensi mikroorganisme ditentukan oleh
produksi toksin, yaitu substansi racun yang di hasilkan mikroorganisme tertentu.
• Kemampuan mikroorganisme menghasilkan toksin di sebut toksigenisitas.
• Istilah toksemia menunjukkan adanya toksin dalam darah.
• Ada dua tipe toksin yaitu eksotoksin (toksin protein) dan endotoksin (toksin lipopolisakarida).
![Page 4: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/4.jpg)
EKSOTOKSIN • Eksotoksin yaitu protein toksin yang tidak
tahan panas , dan bersifat antigenik yang menginduksi pembentukan antibodi.
• Antibodi yang terbentuk akibat induksi eksotoksin disebut antitoksin.
• Toksin ini bekerja dengan cara menghancurkan bagian tertentu sel inang / menghambat fungsi metabolik tertentu.
• Mayoritas bakteri penghasil eksotoksin adalah bakteri gram positif.
• Gen pengkode pada eksotoksin terdapat pada plasmid bakteri atau fag.
• Eksotoksin larut dalam cairan tubuh, sehingga eksotoksin mudah terdifusi dalam darah dan dengan cepat diedarka ke seluruh tubuh.
![Page 5: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/5.jpg)
Tiga tipe Eksotoksin berdasarkan mekanisme aksinya :
1.Sitotoksin, membunuh sel inang atau mempengaruhi fungsi sel.
2.Neurotoksin, terlibat dalam transmisi normal impuls saraf.
3.Enterotoksin, mempengaruhi sel – sel pada saluran pecernaan.
![Page 6: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/6.jpg)
• Daya racun eksotoksin dpat diinaktivasi dengan pemanasan atau paparan formaldehid, iodin atau bahan kimiawi lain.
• Eksotoksin yang di inaktivasi tidak dapat lagi menyebabkan penyakit, namun tetap dapat menginduki pembentukan antitoksin.
• Eksotoksin yang di inaktivasi disebut toksoid.
![Page 7: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/7.jpg)
ENDOTOKSIN• Endotoksin dihasilkan oleh bakteri gram
negatif patogen ataupun nonpatogen selama masa pertumbuhannya atau pada saat sel lisis.
• Toksin ini merupakan bagian dari membran luar bakteri gram negatif yang tersusun atas lapisan lipopolisakarida (LPS).
• Endotoksin bersifat tahan panas, merupakan antigen lemah, dan tidak dapat di ubah menjadi toksoid.
![Page 8: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/8.jpg)
ENDOTOKSIN• Meskipun seluruh bakteri gram negatif memiliki LPS
pada dinding selnya, LPS tidak bersifat toksik hingga dilepaskan dari membran luar dinding sel.
• Pada sat bakteri gram negatif mati, disintegrasi dinding selnya mengakibatkan pelepasan toksin LPS.
• Pelepasan endotoksin dalam sistem peredaran darah dapat menyebabkan syok akibat penurunan tekanan darah dan kegagalan fungsi banyak organ.
• Semua endotoksin bersifat pirogen, tetapi tidak semua senyawa pirogen itu merupakan endotoksin.
![Page 9: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/9.jpg)
Efek Endotoksin Bagi Tubuh
• demam• aktivasi sistem sitokin• rusaknya sel-sel endotelial• permeabilitas pembuluh darah
berubah sehingga menyebabkan turunnya tekanan darah
![Page 10: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/10.jpg)
Perbedaan endotoksin dan eksotoksin
CIRI KHAS ENDOTOKSIN EKSOTOKSIN
Komposisi kimiawi Bagian lipid (lipid A) pada LPS membran luar
Protein
Sumber Dinding sel bakteri gram negatif, dihasilkan pada saat kematian sel atau otolisis bakteri
Mayoritas pada bakteri gram positif, di produksi selama pertumbuhan sel, pada beberapa kasus di produksi setelah lisis atau kematian sel
Farmakologi (efek pada inang)
Tidak spesifik Pada jaringan tertentu
Ketahanan terhadap panas
Tahan panas (heat – stable), pada suhu 121° C selama 1 jam
Tidak tahan panas (heat – labile), inaktif pada suhu 60 – 80° C, kecuali toksi Staphlococcus
![Page 11: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/11.jpg)
Imunologi Tidak mudah dinetralisasi oleh antitoksin sehingga toksoid yang efektif tidak dapat dibuat sebagai imunisasi terhadap toksin
Dapat di ubah menjadi toksoid sebagai imunitas terhadap toksin, di netralisasi oleh antitoksin
Dosis letal Besar Kecil
Toksisitas Rendah tinggi
Penyebab demam Ya tidak
Contoh penyakit Demam tifoid, ISK, meningitis
Gas gangren, tetanus,botulisme, difteri
Perbedaan endotoksin dan eksotoksin
![Page 12: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/12.jpg)
LAL-(Limulus amebocytelysate)Test
• The Limulus amebocytelysate (LAL) test adalah uji in vitro untuk deteksi dan analisis kuantitatif endotoksin bakteri.
• Metode analisis LAL yang dilakukan mencakup teknik gel-clot dan turbidimetri kinetik dan kromogenik (kolorimetri).
![Page 13: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/13.jpg)
• Lisat diperoleh dari amubosit kepiting landam kuda (Limulus polyphemus).
• 1956: Penggunaan LAL untuk deteksi endotoksin berawal dari pengamatan Bang bahwa infeksi bakteri gram negatif pada Limulus polyphemus menyebabkan koagulasi intravaskular yang parah.
• 1964: Levin and Bang kemudian menunjukkan bahwa penggumpalan itu merupakan hasil reaksi antara endotoksin dan protein yang dapat menggumpal dalam amubosit.
• Solum (1970, 1973) dan Young (1972), melakukan pemurnian dan karaterisasi protein yang dapat bergumpal dari reaksi LAL dan menunjukkan bahwa reaksi dengan endotoksin merupakan reaksi enzimatik.
![Page 14: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/14.jpg)
Limulus polyphemus(horseshoe crab)
![Page 15: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/15.jpg)
Cara Memperoleh Lysate
• Untuk memperoleh LAL, horseshoe crabs yang berukuran besar ditangkap, cek kesehatannya, lalu darahnya diambil dengan menggunakan jarum suntik. Darah kepiting ini lalu disentrifuga untuk memisahkan amoebocytes dari plasma cairnya.
• Amoebocyte lalu difreeze-dried dan diproses untuk digunakan.
![Page 16: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/16.jpg)
Metode LAL yang direkomendasi oleh FDA –USA
• Metode Gel-Clot : prinsip bahwa LAL menggumpal dengan adanya endotoksin
• Metode kinetik turbidimetri: menggunakan kecepatan pembentukan gel untuk menentukan kandungan endotoksin
• Metode Kromogenik: menggunakan substrat kromogenik sintetik, dengan adanya LAL dan endotoksin, menghasilkan warna kuning dan secara linier ekuivalen dengan konsentrasi endotoksin yang ada
![Page 17: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/17.jpg)
Prinsip LAL Test• Uji LAL memanfaatkan dasar respon imun dari kepiting landam kuda
terhadap invasi bakteri gram negatif.
• Bahan-bahan yang terkandung dalam amubosit kepiting landam kuda terdiri dari berbagai protein, faktor, kofaktor dan ion-ion yang berinteraksi menyebabkan koagulasi.
• EndotoksinGram negatif mengkatalisis aktivasi proenzim dalam lisat amubosit Limulus. Kecepatan awal aktivasi ditentukan oleh konsentrasi endotoksin.
• Selanjutnya enzim yang diaktivasi (enzimkoagulase) menghidrolisis ikatan spesifik dalam suatu protein penggumpal(koagulogen) yang juga terdapat pada lisat amubosit Limulus menghasilkan koagulin.
• Sekali terhidrolisis, koagulin yang dihasilkan bergabung dengan sendirinya dan membentuk suatu gumpalan/bekuan seperti gel.
![Page 18: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/18.jpg)
Penetapan Batas Endotoksin
• 1983 : FDA menentukan batas endotoksin berdasarkan dosis maksimum sediaan obat untuk manusia atau kelinci
• Dan penyesuaian batas endotoksin untuk semua obat (kecuali intratekal) dari2,5 EU kg-1 sampai 5,0 EU kg-1
• EU = Endotoxin Unit
• Batas deteksi untuk beberapa produk diperoleh dari monografi USP atau EP. Kalau tidak dinyatakan dalam farmakope, batas endotoksin harus dihitung dari dosis maksimum manusia
![Page 19: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/19.jpg)
EL = K/M
• EL = endotoksin limit
• K = konstanta = 5 EU atau IU per kg berat badan
• M = dosis maksimum untuk manusia
per kg per jam.
![Page 20: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/20.jpg)
Batas Endotoksin Dan Volume Per Jam
• Harus diperhatikan bahwa batas endotoksin dinyatakan per jam. Oleh karena itu konsentrasi yang dibolehkan untuk endotoksin per mililiter injeksi beragam tergantung pada volume pemberian dalam satu jam.
• Suatu dosis tunggal injeksi 1 ml secara teoritis mengandung 349 EU per ml dan masih diijinkan pada uji endotoksin bakteri, sedangkan infus dengan volume 1 L harus mengandung kurang dari 0,349 EU per ml.
![Page 21: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/21.jpg)
Contoh Perhitungan
Potensi injeksi insulin 100 unit per ml, dosis maksimum 2 unit per kg dan sensitivitas lisat 0,125 unit/ml, makaC = 100 unit per mlK = 0,5 EU per kg λ = 0,125 unit per mlM = 2 unit per kg
MVD = 100 x 5 = 1 : 2000 0,125 x 2
• Nilai MVD dapat diperoleh dari MVC
• MVD = potensi sediaan/MVC
![Page 22: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/22.jpg)
LAL Test Untuk Alat Kesehatan
• Kadar endotoksin pada alat kesehatan diperoleh dengan prosedur ekstraksi, yaitu dengan cara merendam sejumlah alat pada cairan pengekstraksi biasanya pereaksi air LAL. Nilai batas 20 EU per alat dinyatakan dalam addendum USP 1997, jadi batas maksimum konsentrasi endotoksin yang diijinkan dalam cairan hasil ekstraksi (ERL) dihitung dengan rumus:
• ERL = K x N/V
K = 20 EUN = jumlah alatV = total volume larutan ekstraksi
![Page 23: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/23.jpg)
Kelebihan LAL-Test
• Limulus amebocyte lysate (LAL) test adalah metode alternatif terhadap rabbit pyrogen test yang difokuskan pada deteksi senyawa pirogen dalam produk, untuk menghindari penggunaan hewan dalam percobaan
• Metode lebih akurat
![Page 24: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/24.jpg)
Metode Gel-Clot
• Pada metode ini, hasil akhir dapat dideteksi berupa spot pada slide, atau microplate
• Perlu pembanding, berupa control standard endotoxin (CSE)
• Peralatan gelas yang digunakan harus di“de-pirogenasi”
![Page 25: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/25.jpg)
Prinsip Uji Dan Prosedur
• 100 ul CSE dimasukkan ke dalam tabung gelas depirogen (positive control)
• LAL reagent water (negative control)
• Sampel jumlah sama
• + 100 ullysate
• Inkubasi 37°C di atas penangas air selama 1 jam
• Tabung lalu dibalik perlahan (180°) untuk melihat solid clot yang terjadi
![Page 26: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/26.jpg)
Hal Yang Harus Diperhatikan Dalam Metode Gel-Clot
• Untuk membuat alat-alat depirogen: pemanasan pada 180°C, selama 4 jam atau 250°C selama 30 menit
• Teknik pengerjaan pada saat membalik tabung kira-kira selama 2 detik
• pH sampel 7,0 –8,0. Jika diperlukan pH diatur menggunakan asam atau basa depirogen
![Page 27: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/27.jpg)
Sensitivitas Lisat Pada Gel-Clot
• Diperlukan untuk menentukan konsentrasi minimum endotoksin yang menyebabkan terjadinya gel
• Satuan dinyatakan dalam EU atau IU
• Dibuat 1 seri pengenceran endotoksin (dalamEU/mL) dan percobaan dilakukan rangkap 4 (quadruplicate)
• Titik akhir pengenceran (end-point dilution) ditentukan pada pengenceran terakhir yang masih memberikan reaksi positif
![Page 28: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/28.jpg)
Metode Kromogenik
• Metode kromogenik merupakan metode LAL test yang paling banyak digunakan saat ini karena lebih mudah dan murah
• Sesuai untuk jumlah produk yang diuji tidak banyak dan tidak sering (infrequent)
• Digunakan untuk uji sampel serum pada uji klinis
![Page 29: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/29.jpg)
Prinsip Uji Dan Prosedur
• Endotoksin akan mengkatalisis aktivasi suatu proenzim
• Enzim yang teraktivasiakan mengkatalisis terpecahnya PNA dari substrat Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-PNA
• PNA yang dilepaskan diukur secara spektrofotometri pada 405 nm
• Nilai absorbans sebanding dengan jumlah endotoksin, dibandingkan terhadap endotoksin standard menggunakan kurva standard
![Page 30: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/30.jpg)
Penemuan Baru• Alternatif terhadap LAL saat ini telah berhasil
diteliti di India dan China, yaitu pereaksi TAL, atau Tachypleus amoebocyte lysate, fungsinya mirip dengan LAL, juga untuk deteksi gram-negative bacteria.
• Ilmuwan di Singapur tengah meneliti cloning gen pendeteksi toxin dalam darah horseshoe crab. Jika gen tersebut dapat dikloning, derivat LAL dapat dibuat tanpa harus menggunakan horseshoe crabs untuk ekstraksi darahnya.
![Page 31: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/31.jpg)
Perhitungan MVD Dan MVC• MVD = Maximum Valid Dilution (pengenceran
maksimum)
• MVC = Minimum Valid Concentration (konsentrasi minimum)
• MVD dan MVC adalah perhitungan yang menunjukkan seberapa banyak pengenceran yang harus dilakukan untuk mengatasi kemungkinan interferensi, sebelum efek pengenceran melampaui kemampuan uji LAL yang digunakan untuk mendeteksi endotoksin dalam sediaan asli
![Page 32: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/32.jpg)
Penggunaan Istilah MVD Dan MVC
• MVD biasanya digunakan untuk sediaan yang berbentuk cairan dimana pemberian dinyatakan dalam per mililiter Contoh: dosis tunggal injeksi 2 ml dan batas endotoksin dinyatakan dalam EU per mililiter
• MVC biasanya digunakan untuk sediaan dengan batas endotoksin dinyatakan dengan EU per mg dan dosis dinyatakan dengan mg/ kg bb
• Penentuan MVD dan MVC tergantung pada sensitivitas lisat yang digunakan (λ)
• Semakin sensitif lisat atau metoda, semakin tinggi MVD
atau semakin rendah MVC
![Page 33: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/33.jpg)
Perhitungan MVD
MVD = C x K
λx M
• C = konsentrasi obat• K = konstanta = 0,5 EU per kg • M = dosis maksimum manusia
![Page 34: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/34.jpg)
PerhitunganMVC
MVC = λM
K
• λ = sensitifitas dari lisat yaitu nilai terkecil dari standar untuk pengujian kuantitatif
• K = konstanta = 0,5 EU per kg
• M = dosis maksimum manusia
![Page 35: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/35.jpg)
• Pyro artinya keadaan atau bentuk yang berhubungan dengan panas / api. Gen artinya membentuk atau menghasilkan, jadi pyrogen artinya sesuatu yang dapat menghasilkan panas / demam.
![Page 36: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/36.jpg)
• Pirogen adalah hasil dari mikroorganisme berupa kompleks lipo polisakarida protein lipid yang mengandung gugusan radikal nitrogen dan fosfor, merupakan endotoksin dari bakter gram negative dan jika di suntikkan ke dalam tubuh manusia dan hewan dalam dosis tertentu akan menyebabkan demam.
Pirogen
![Page 37: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/37.jpg)
• Pirogen berasal dari macam – macam sumber, sehingga susunan kimiawinya berbeda – beda dan menyebabkan aktivitasnya berbeda misal sifat farmakologis, stabilitas dan daya keracunannya.
• Gejala umum yang timbul dengan adanya pirogen adalah demam setelah beberapa saat penyuntikan, reaksi yang jelas akan terlihat setelah 45 menit sampai 8 jam penyuntikan.
![Page 38: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/38.jpg)
Sumber pirogen
• Air air yang sudah di simpan • Peralatan • Solute atau zat terlarut • Proses produksi • Udara kotor
![Page 39: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/39.jpg)
Sifat – sifat pirogen kelarutan : larut dalam air, alkohol, tidak
larut dalam pelarut organik lain ukuran : 1 – 50 mµ stabilitas : dalam keadaan kering dan
terlarut stabiltasnya t, termostabil, dalam larutan sukar dihilangkan dengan pemanasan , dalam keadaan kering pirogen dapat dihilangkan dengan pemanasan tinggi dan waktu lama tinggi
berat molekul : 15.000 – 4.000.000
![Page 40: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/40.jpg)
Cara – cara pembebasan pirogen
A. Penyulingan : - penyulingan biasa - penyulingan khusus
B. Pemanasan : - dalam larutan - dalam keadaan kering
C. Penyerapanpirogen diserapa dengan secara kimia / fisika dengan adsorben
D.Depirogenase E. Radiasi sinar gammaF. Getaran ultrasonik
![Page 41: endotoksin dan pirogen](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022061316/55b1449fbb61eb04568b465c/html5/thumbnails/41.jpg)
DAFTAR PUSTAKA
• Anonim,1995.Farmakope Indonesia edisi IV. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.Jakarta
• Anonim,1997.Farmakope Indonesia edisi III. Departemen Kesehatan Republik Indonesia.Jakarta
• T.Pratiwi Sylvia,2008,Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta
• http://download.fa.itb.ac.id/filenya/Handout%20Kukah/mikrobiologi%20Analisis%20%28FK3207%29/Uji%20ENDOTOKSIN.pdf