UNIVERSITATEA ,,LUCIAN BLAGA,DIN SIBIU FACULTATEA DE TIINE AGRICOLE,INDUSTRIE ALIMENTAR I PROTECIA MEDIULUI

ENZIME PROTEOLITICE DE ORIGINE VEGETAL: PAPAINA

COORDONATOR: Prof.Univ.Dr.Ing.Neli DARIE

MASTERAND: Anul I M.P.M.A

-SIBIU 2011ABSTRACT

Papain is a proteolytic enzyme that is obtained from the latex tree melon, prezetandu to form a homogeneous electrophoretic protein. Papain molecule consists of a polypeptide chain composed of 212 amino acid residues with three disulphides bridges and free sulfhydryl group. She has the ability to synthesize amino acid derivatives anilidele stereospecific for separating racemic mixtures of derivatives. It is used to break ties for tough meat, covered in dust being marketed for tenderizing carnii.It is sold in tablet form for improving digestion digestive problems giving good results in treating cellulite.

PAPAINA

Aceast enzim proteolitic se obine n cantiti apreciabile din latexul arborelui de pepene (Carica papaja).Enzima se gsete n toate prile plantei (excepie fac numai rdcinile) dar cea mai mare cantitate se obine din fructele arborelui de pepene,de unde se elibereaz prin simpla crestare.Latexul de Carica papaja conine trei enzime proteolitice diferite: papaina,chimopapaina i peptidaza A.

Papaina se obine n stare cristalizat din latexul uscat (1 g de papain cristalizat din 180 g latex uscat) i se prezint sub forma unei proteine omogene electroforetic,cu un pH 9 i o mas molecular de 20 700.Preparatele cristalizate de papain au o activitate catalitic sczut i activarea lor are loc numai n prezena unor ageni reductori : glutation redus,cistein,borohidrur de sodiu,acid tioglicolic,ptiocrezol sau a unor compui capabili s lege ionii metalelor: 2,3-dimercaptopropanol,cistein,versen i altele.Enzima este inhibat reversibil de peroxidul de hidrogen i ireversibil de iod,iodacetat i iodacetamid,p-cloromercuribenzoatul de sodiu i bromacetat. Glazer i Smith studiind formele active i inactive ale papainei au ajuns la concluzia c enzima posed o singur grupare SH liber dei n molecul sunt prezeni opt atomi de sulf.Gruparea sulfhidril a papainei active,dup Glazer i Smith poate trece ntr-o form disulfuric de tipul Protein S S R cu inactivarea concomitent a enzimei. Klein i Kirsch ,Sluyterman au demonstrat experimental c papaina inactiv reprezint o disulfur protein-cistein,iar activarea enzimei de KCN pune ntotdeauna n

libertate acid 2 iminotiazolidin 4 carbonic ,ca urmare a unei ciclizri a tiocianatalaninei care se formeaz n reacia dintre KCN i restul de cistein neproteic din preparatul de papain.Oxigenul atmosferic poate cataliza reacia invers de adiie a gruprii SH la papaina activ i de inactivare a preparatului.Dup Klein i Kirsch mecanismul activrii preparatelor de papain cu activitate enzimatic sczut ar decurge dup schema redat n figura 1. COO PAPAINA S S CH2 CN + KCN NH3+ - tiocianatalanin OOC PAPAINA SH + N C S CH2 CH+

H3N

H N

H

C+

S

NH CH2 CH COO

Acid 2 iminotiazolidin 4 carbonic Fig.1.Mecanismul activrii preparatelor de papain (dup Klein i Kirsch) Molecula de papain const dintr-un lan polipeptidic format din 212 resturi de aminoacizi,cu trei puni disulfurice i o grupare sulfhidril liber (fig.2).Structura are dimensiunile 5 x 3,7 x 3,7 nm i poate fi considerat ca o protein ,,binuclear fiind alctuit din doi centri hidrofobi.Cele dou pri ale moleculei conin aproximativ acelai numr de resturi de aminoacizi,catena polipetidic ncrucindu-se n dreptul restului aminoacidului din poziia 111.Molecula papainei conine patru regiuni cu structur de

- helix.Prima secven cu structur helicoidal ncepe cu restul celui de-al 24 lea aminoacid i se termin n dreptul celui de-al 43 lea aminoacid.Al dilea helix se gsete situat n regiunea resturilor de aminoacizi din poziiile 50 85,legndu-se de primul helix prin intermediul resturilor de Glu 50 i Arg 35.Un al treilea helix (69 78) format din numai trei ture de spir completeaz primul centru hidrofob.Partea a doua a moleculei de papain cuprinde resturile aminoacizilor din poziiile 111 212.Catena polipeptidic este hidrifil pn la restul aminoacidului 117,de unde ncepe un helix scurt (116 126),care pe o latur este hidrofob,constituind nucleul celei de a doua pri a moleculei.Dup acest helix,catena polipeptidic continu nepliat pn la restul de aminoacid din poziia 160.Resturile aminoacizilor 164 173 formeaz o structur de tip ,alctuit din dou catene antiparalele intern hidrofob i extern hidrofil.Structura formeaz un fel de sept,un adevrat perete al centrului hidrofob. H2N Ile Pro Glu Tyr Val Asp Trp Arg Gln Lys Ala Val Thr Pro Val 1 20 35 50 65 85 100 115 130 145 165 180 195 Pro Val Lys Asn COOH 200 185 205 150 170 135 155 175 190 120 140 160 105 125 70 90 110 55 75 95 40 60 80 5 25 45 10 30 15 Lys Asn Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Val Val Thr Ile Glu Gly Ile Ile Lys Ile Arg Thr Gly Asn Leu Asn Gln Tyr Ser Glu Gln Glu Leu Leu Asp Cys Asp Arg Arg Ser Tyr Gly Cys Asn Gly Gly Tyr Pro Trp Ser Ala Leu Gln Leu Val Ala Gln Tyr Gly Ile His Tyr Arg Asn Thr Pro Tyr Tyr Glu Gly Val Gln Arg Tyr Cys Arg Ser Arg Glu Lys Gly Pro Tyr Ala Ala Lys Thr Asp Gly Val Arg Gln Val Gln Pro Tyr Asn Gln Gly Ala Leu Leu Tyr Ser Ile Ala Asn Gln Pro Val Ser Val Val Leu Gln Ala Ala Gly Lys Asp Phe Gln Leu Tyr Arg Gly Gly Ile Phe Val Gly Pro Cys Gly Asn Lys Val Asp His Ala Val Ala Ala Val Gly Tyr Asn Pro Gly Tyr Ile Leu Ile Lys Asn Ser Trp Gly Thr Gly Trp Gly Glu Asn Gly Tyr Ile Arg Ile Lys Arg Gly Thr Gly Asn Ser Tyr Gly Val Cys Gly Leu Tyr Thr Ser Ser Phe Tyr

210

212

Fig.2.Secvena primar de aminoacizi a papainei,izolat din Carica papaja ntre cei doi centri hidrofobi ai moleculei de papain,se formeaz,datorit structurilor secundare,o cavitate n care se gsete centrul catalitic activ al enzimei constituit din restul de Cys 25.Molecula de papain posed trei puni disulfurice: una situat ntre resturile aminoacizilor 56 95 i orientat ,,spre dreapta i dou situate ntre resturile aminoacizilor 22 63 i 153 200 orientate ,,spre stnga. Drenth i Colab au artat c structura papainei rmne nemodificat n urma dizolvrii n medii apoase.Densitile optice rotatorii,la 220 nm,sunt aceleai n ap i alcool ceea ce indic acelai procent (22%) de structur helicoidal a enzimei att n stare cristalizat ct i n soluie. n figura 3 sunt redate gruprile care,probabil,ndeplinesc un rol activ n procesul catalizei enzimatice.n scindarea substratului intervin gruparea sulfhidril liber a restului de Cys 25 i gruparea imidazol a restului de His 159.Gruparea imidazol se leag prin intermediul unei puni de hidrogen cu gruparea carbonil a funciei amidice a restului de Asn 175.Studiile ntreprinse cu diferii efectori,precum i cu reactivi bifuncionali de tipul 1,3 dibromacetonei,care realizeaz alchilarea moleculei de papain,au demonstrat c n centrul activ al enzimei se gsesc ntr-adevr resturile Cys 25 i His 159 ntre care distana n molecula nativ nu este mai mare de 0,5 nm i este meninut mai degrab prin interaciuni tip Van der Waals,dect de eventualele legturi de hidrogen. Situsul activ al papainei prezint cteva particulariti. Berger i Colab,au efectuat studii de specificitate,utiliznd diferite peptide sintetice corelnd vitezele de reacie cu mrimea fragmentului peptidic pn la punctul unde are loc hidroliza legturii.Astfel,sa demonstrat c situsul activ al papainei se poate combina cu apte resturi de aminoacid considerndu-se a fi format din subsitusuri..Fiecare subsitus poate fi considerat ca o microregiune de pe suprafaa enzimei care este capabil s interacioneze cu restul unui singur aminoacid din structura substratului.n figura 4 sunt prezentate schematic subsitusurile centrului catalitic activ al papainei.n complexul enzim substrat care se formeaz n cursul hidrolizei legtura peptidic care urmeaz a fi hidrolizat ocup ntotdeauna aceeai poziie,resturile de aminoacizi ocupnd poziii adiacente n subsitusurile localizate la dreapta i la stnga acesteia.Experimental s-a demonstrat c dimensiunile centrului activ al papainei sunt de aproximativ 2,5 nm,cnd restul unui aminoacid se consider c ocup 0,35 nm. Elaborarea unui model structural pentru molecula de papain trebuie s in seama,n primul rnd,de faptul c legtura peptidic care urmeaz s fie hidrolizat,este necesar s fie situat n aa fel n spaiu nct s poat reaciona att cu restul de His 159,la nivelul oxigenului gruprii carbonil peptidice ct i cu azotul imidazolic protonat i cu gruparea SH hiperactiv a restului de Cys 25. Asn 175 C NH2

O

H

H C N Cis 25 SH 0,84 nm

N C O

H

His 159 O (-) O 0,75 nm

0,675 nm C Asp 158

Fig.3.Resturile aminoacizilor care intr n constituia situsului activ al papainei: Cys 25, His 159,Asp 158,Asn 175. p4 p3 p2 p1 p'1 p'2 p'3 s4 s3 s2 s1 s'1 s'2 s'3 H2N - COOH

PAPAINA Fig.4.Reprezentarea schematic a celor apte subsitusuri care alctuiesc centrul activ al papainei. Acionnd asupra substratului,papaina formeaz compui intermediari de tipul acil enzim,care pot fi izolai din mediul de reacie ceea ce a permis formularea a dou ipoteze privind mecanismul ei de aciune. Sluyterman i Wolthers au propus un mecanism de reacie (fi.g.5).n cazul etapei de acilare,reacia are loc de la stnga spre dreapta,iar n cazul dezacilrii apa nlocuiete gruparea care este scindat i reacia decurge n sens invers.Legtura carbonil a substratului este polarizat de sarcina pozitiva a gruprii imidazol,ceea ce permite atomului de sulf s formeze o legtur de tip covalent cu carbonul gruprii carbonil.Protonul lui este transferat oxigenului gruprii alcool.

+

NH

NH

NH +

N H O

N | H+ -

N | H

R C OCH3

O | RC OCH3 | H

O

OH H

R C O CH3 | | S H

SH

| + S

Fig.5.Mecanismul reaciei enzimatice catalizate de papain (dup Sluyterman i Wolthers) Dependena de pH a KM enzimei pentru esterul etilic al N benzoil L argininei,care este hidrolizat sub aciunea papainei,indic rolul unei grupri ionizate cu un pK 9.Aceasta ar putea fi gruparea sulfhidril care ionizeaz la acest pH.Reaciile de acilare i dezacilare nu au loc cu histidin neprotonat,pentru o cataliz acid ca cea postulat de Sluyterman i Wolthers fiind necaesar prezena unui ion imidazolium.Studii pe modele moleculare au demonstrat c restul His 159 are o valoare pK mult crescut,rezultat care poate fi atribuit influenei pe care o exercit gruparea carboxil a restului de Asp 158 situat n imediata vecintate a gruprii imidazol sau legturi de hidrogen stabilit ntre oxigenul Asn -175 i N 3 a restului His 159,consolidat de mediul hidrofob. Lowe i Williams presupun c ntre restul de Cis 25 i His 159,n enzima activ se formeaz o legtur de hidrogen,i n timpul hidrolizei substratului un proton al nucleului imidazolic este cedat azotului amidic al moleculei substratului,avnd loc un atac nucleofil al carbonului carbonilic (fig.6).

R

O

C S H S H X

R S C OX

N

NH

NH

HN

+

NH

O R SC O Y H N NH HN + NH N NH R S C OY S H RC Y

S H

N

NH

Fig.6.Mecanismul reaciei enzimatice de papain (dup Lowe i Williams) Papaina este o enzim proteolitic cu o larg specificitate de substrat deoarece catalizeaz hidroliza proteinelor native i denaturate,peptidelor rezultate dup aciunea tripsinei i chimotripsinei,substratelor sintetice de cele mai diferite structuri,hidroliznd orice fel de legtur peptidic,indiferent de natura aminoacizilor care particip la formarea acesteia.Papaina hidrolizeaz i substratele sintetice specifice pentru pepsin: carbobenzoxi L glutamil L tirozina,pentru chimotripsin: acetilLtirozinamida i pentru leucinaminopeptidaz i carboxipeptidaz.Specificitatea de aciune a papainei este n funcie de masa molecular a substratului asupra cruia acioneaz i viteza hidrolizei depinde de natura resturilor de aminoacizi care se gsesc de-o parte i de alta a legturii peptidice ce urmeaz a fi hidrolizat.Viteza reaciei enzimatice este,de asemenea,funcie i de starea

conformaional a molecului substratului.n sprijinul acestei afirmaii sunt datele experimentale care demonstreaz c proteinele denaturate sunt mult mai rapid hidrolizate dect cele native i c enzima hidrolizeaz acidul poli L glutamic cu o vitez mare la pH 4 6,situaie n care 40 60 % din gruprile carboxil ale acestui polimer se gsesc n stare disociat. Papaina este o enzim care are i aciune transferazic sau transpeptidazic,precum i transesterazic,utiliznd n calitate de acceptori diferite peptide,aminoacizii i derivaii lor,hidroxilamina etc.Activitatea transpeptidazic a papainei este mai mare atunci cnd n calitate de acceptor servesc peptidele.Reaciile de transfer pot fi redate schematic astfel: CH2 O CO NH CH2 CO NH2 + H2N CH2 COOH carbobenzoxiglicinamida glicina

CH2 O CO NH CH2 CO NH CH2 COOH + NH3 carbobenzoxiglicilglicina H3C CH2 O CO NH CH2 CO NH2 + CH CH2 CH CONHCH2 COOH H3C L leucilglicina CH2 O CO NH CH2 CO NH CH CONHCH2COOH+NH3 carbobenzoxiglicil L tizilglicina CH2 CH CH3 Aceste reacii joac,dup opinia lui Behrens i Bergmann,un rol important n aciunea proteolitic a papainei,deoarece unele substrate sintetice de tipul acetil L fenilalanilglicinei pot media hidroliza compuilor de tipul glicil L leucinei,monoanilidei acidului glutamic,glicinanilidei care n condiii obinuite de reacie nu sunt scindate: CH3 NH2

CH2 CH3 CO NH CH CO NH CH2 COOH + H2N CH2 CO NH acetil L fenilalanilglicina CH2 CH3 CO NH CH CO NH CH2 CO NH CH2 CO NH acetil L fenilalanilglicilanilida CH2 glicinanilida

CH3 CO NH CH NH CH2 CO NH CH2 COOH + H2N acetil L fenilalanilglicilicina CH2 CH3 CO NH CH CO NH CH2 COOH + H2N CH2 COOH acetil L fenilalanilglicina glicina Behrens i Bergmann denumesc aceste substane care mediaz aciunea catalitic a papainei asupra substratelor nehidrolizabile n condiii normale ,,cosubstrate i presupun c printre produsele hidrolizei proteinelor de ctre papain se gsesc n mod normal asemenea cosubstrate.Papaina,ca de altfel alte enzime proteolitice de origine vegetal (ficina,bromelaina,chimopapaina) posed ns i capacitatea de a sintetiza stereospecific anilide ale derivailor aminoacizilor,proprietate utilizat pentru separarea amestecurilor racemice ale aminoacizilor: anilidele L aminoacizilor sunt insolubile i precipit din soluie,n timp ce anilidele R CO NH 2 CH R' + 2 COOH NH2 2H2O amestec racemic (DL) n industria alimentar,papaina este folosit la ruperea fibrelor dure de carne i este utilizat de mii de ani n America de Sud. Este inclus drept component n prafurile comercializate pentru frgezirea crnii. Enzima din papain este de asemenea comercializat sub form de tablete ca un remediu pentru probleme digestive i n mod deosebit pentru pre-digestia crnii nc nainte de a ajunge n intestin. Papaina acioneaz ca un supliment ideal pentru perioadele de dup mese, papaina mbuntete n mod natural digestia i combate neplcerile cauzate de un regim alimentar inadecvat (balonri, jen gastric, senztie de "prea-plin etc.). Papaina este folositoare n curele de slbire i a dat rezultate bune n tratarea celulitei. anilin L derivat D - derivat CO NH CH R ' CO NH + CO NH CH R CO NH R R D aminoacizilor rmn n soluie.Reacia de sintez a anilidelor aminoacizilor decurge,n principiu,dup ecuaia general: anilina

REZUMAT

n urma acestui studiu mi-am propus sa identific,sa ncadrez i s caracterizez papina. Papaina este o enzim proteolitic care se obine din latexul arborelui de pepene,furniznd cea mai mare cantitate de enzim n fructe i se prezint sub forma unei proteine omogene electroforetic cu pH 9.Totodat papaina se obine n stare cristalizat din latexul uscat.

n urma studiilor efectuate de ctre mai muli cercettori s-a ajuns la concluzia c papaina posed o singur grupare SH liber format din opt atomi de sulf prezeni n molecul. Papaina catalizeaz hidroliza proteinelor native i denaturate,peptidelor rezultate dup aciunea tripsinei i chimotripsinei,hidroliznd orice fel de legtur peptidic. Este o enzim care are aciune transferazic sau transpeptidazic i transesterazic. Papaina este folosit la ruperea fibrelor dure de carne,fiind inclus n prafurile comercializate pentru frgezirea crnii.Totodat este comercializat sub form de tablete pentru probleme digestive mbuntind digestia dnd rezultate bune n tratarea celulitei.

CONCLUZII

n urma studiului efectuat am ajuns la concluzia ca papaina (enzim proteolotic de origine vegetal) se extrage n cantitate mai mare din fruct i este utilizat la frgezirea crnii,n problemele de digestie i balonare,ct i n tratarea celulitei.

BIBLIOGRAFIE

1.I. F. DUMITRU,Dana IORDCHESCU. Introducere n enzimologie. Editura Medical, Bucureti,1981. 2. www.google.ro/imagini