1

Enzyme and cofactor

ดร.พริมา พิริยางกูรhttp://cyberlab.lh1.ku.ac.th/

Enzyme and cofactor

วัตถุประสงค เพื่อทราบถึงคุณสมบัติและการทํางานของ

เอนไซม ตลอดจนรายละเอียดที่เกี่ยวของและจลนศาสตรของเอนไซม

Enzyme and cofactor1. ชีวเคมี. โดยคณาจารยภาควิชาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร

มหาวิทยาลัยมหิดล 25422. ชีวเคมี . โดยดาวัลย ฉิมภู สํานักพิมพแหงจุฬาลงกรณ

มหาวิทยาลัย 25483. E-Biochem. โดยอุษณีย วินิจเขตคํานวณ คณะแพทยศาสตร

มหาวิทยาลัยเชียงใหม 25484. Biochemistry (2ndedition). Mathews and van Holde.

1996

Enzyme and cofactor(4 ช่ัวโมง)

1. บทนําและคุณสมบัติ2. การเรียกช่ือและการแบงกลุมของเอนไซม3. หลักการทํางานของเอนไซม4. ปจจัยท่ีมีผลตอการทํางานของเอนไซม5. จลนศาสตรของเอนไซม

Enzyme and cofactor(ตอ)

6. การยับย้ังเอนไซม7. เอนไซมแอลโลสเตอริคและไอโซไซม8. โคแฟคเตอรและโคเอนไซม9. ประโยชนของเอนไซม

ตัวเรงปฏิกิริยา (Catalyst)

สารที่ เพิ่มอัตราหรือความเ ร็วของป ฏิ กิ ริ ย า ท า ง เ ค มี โ ด ย ที่ ตั ว เ อ ง ไ มเปลี่ยนแปลงเมื่อปฏิกิริยาสิ้นสุด

2

EnzymeDefinition:

ตัวเรงปฏิกิริยาจําเพาะซ่ึงจําเปนในการควบคุมปฏิกิริยาทางชีวเคมีที่สําคัญใหมีอัตราเร็วที่เหมาะสมภายใตสภาวะแวดลอมทางสรีระของสิ่งมีชีวิต โดยที่ตัวเองไปเปลี่ยนแปลง

Biological Catalyst/Biocatalyst

Thermodynamics

G = H – T S

G = Gibbs free energy changeH = Enthalpy (พลังงานภายใน)S = Entropy (ความไรระเบียบ)T = Absolute temperature

Thermodynamics

A B

G = GB – GA

G : ผลตางพลังงานอิสระกิบสG : พลังงานอิสระ

Thermodynamics

G

- 0 +

=

Spontaneous Rx ChemicalEquilibrium

+ Energy

A B

ThermodynamicsG° : ผลตางของพลังงานอิสระมาตราฐาน( G ของปฏิกิริยาในสภาพมาตรฐาน)

Standard state:ปฏิกิริยาที่ 25°C ความดัน 1 บรรยากาศและ

ความเขมขนของตัวทําปฏิกิริยาอยางละ 1 M

ThermodynamicsG = G° + RT ln[B]/[A]

At equilibrium ( G = 0)0 = G° + RT ln[B]eq/[A]eqG° = - RT ln[B]eq/[A]eq

= - RT lnKeq

Keq = Equilibrium Constant

3

Transition state

www.uic.edu/

EA = Activation Energy, ∆G = ผลตางของพลังงานอิสระมาตราฐาน

Transition state

www.pickens.k12.sc.us

Transition state

reactants

products

energy

Intermediate – formed between

enzyme and reactant

molecules

Uncatalysedreaction

Enzyme-catalysed reaction

Reaction profiles: uncatalysed and enzyme-catalysed

Course of reaction

exergonicreaction

www.chemsoc.org

การทํางานของเอนไซม• เรงปฏิกิริยาไดเสร็จสิ้นโดยที่ตัวเองไมเปลี่ยนแปลง• เอนไซมเขารวมในปฏิกิริยาโดยตรง เกิด ES complex(Transition state)

• ณ บริเวณเรงจะเกิดการเรงปฏิกิริยาดวยกลไกตาง ๆ ตามชนิดของเอนไซม (เรงการสรางหรือทําลายพันธะโควาเลนต รวมทั้งเพิ่มความใกลชิดและความเขมขนของสารที่ทําปฏิกิริยา ทําใหปฏิกิริยาเกิดไดงายขึ้น)

หลักการทํางานของเอนไซม

• Induced fit hypothesis (Koshland, 1958)

• Lock and key hypothesis (Fischer, 1894)

www.steve.gb.com

Induced fit hypothesis

www.pickens.k12.sc.us/

4

คุณสมบัติเอนไซม1. โปรตีนกอนกลม

(globular protein)

2. เปนตัวเรงทางชีวภาพ (Biocatalyst)3. ความจําเพาะเจาะจง (Specificity)

คุณสมบัตเิอนไซม1. โปรตีนกอนกลม (globular protein)

Active form

Inactive form

pH, T

pH, T

Active form

http://www.geocities.com/

Ribozymeribonucleic acid enzyme/RNA enzyme

เรงการตัดแตง (cleavage) ตัวเอง หรือตัดแตง RNA

ชนิดอื่น ๆ

เรงปฏิกิริยาการโยกยายหมูอะมิโน

(aminotransferase) ของไรโบโซม (ribosome)

มีมี enzyme enzyme อ่ืนอีกไหมที่อ่ืนอีกไหมที่ไมไดเปนไมไดเปน Protein Protein enzyme enzyme ????????

คุณสมบัตเิอนไซม2. เปนตวัเรงทางชีวภาพ (Biocatalyst)

Activation state/ Transition state

Activation state/ Transition state

http://en.wikipedia.org/

5

คุณสมบัตเิอนไซม3. ความจําเพาะเจาะจง (Specificity)

–ซับสเตรท (Substrate)

Lactate Pyruvate–Reaction

–Stereochemical (D-/L-form)

Lactate dehydrogenase

Active site

www.phschool.com

การตั้งชื่อของเอนไซม1. ช่ือแบบทั่วไป (Common name)

ปฏิกิริยาที่เรงและลงทายดวย -ase

2. ช่ือตามระบบ EC (Enzyme commission)

ตัวแรกบอก class name (ชนิดของปฏิกิริยา)ตัวสองบอก subclass (รายละเอียดของปฏิกิริยา)ตัวสามบอก functional grตัวสี่บอกลําดับของเอนไซม

International ClassificationAccording to International Enzyme

Commission (EC)EC 1: Oxidoreductases

EC 2: TransferasesEC 3: Hydrolases

EC 4: Lyases or synthase

EC 5: IsomerasesEC 6: Ligases or synthetases

http://dbs.umt.edu

1. Oxidoreductases (oxidation-reduction Rx)

2. Transferases (transfer of a group from onemolecule to another)

Oxidized form Reduced form

6

3. Hydrolases (cleavage of a bond by water)

4. Lyases (addition/removal of a double bond)

5. Isomerases (intramolecular rearrangement)

6. Ligases (joining of substrates using ATP)

ตัวอยางการตั้งชื่อของเอนไซมATP + creatin

ADP + phosphocreatine

Common name : kinaseตามระบบ EC : E.C. 2.7.3.2(2: transferase, 7: phosphoryl, nitrogenous gr, creatinkinase)

enzyme

ปจจัยที่มีผลตอการทํางานของเอนไซม1. อุณหภูมิ (Temperature)

2. pH

3. ความเขมขนของซับสเตรท

(Concentration of substrate)

4. ความเขมขนของเอนไซม (Concentration of enzyme)

ปจจัยที่มีผลตอการทํางานของเอนไซม1. อุณหภูมิ

http://www.chemsoc.org

7

1. อุณหภูมิ

www.uic.edu

ปจจัยที่มีผลตอการทํางานของเอนไซม2. pH

http://www.chemsoc.org

5-9

pH เพิ่มขึน้- COOH กลายเปน - COO-

pH ลดลง- NH2 กลายเปน - NH3

+

2. pH

www.uic.edu

ปจจัยที่มีผลตอการทํางานของเอนไซม3. Concentration of substrate

www.steve.gb.com

V 0

(Vmax)

Km = Vmax/2

Vmax =ความเขมขน (อิ่มตัว) ของ substrate ท่ีทําใหมีอัตราเร็วสูงสุด

ปจจัยที่มีผลตอการทํางานของเอนไซม4. Concentration of enzyme

(ที่ความเขมขนอ่ิมตัวของ substrate)

http://www.chemsoc.org

V0 α [E]

Enzyme Activity : Unit (U)คือ ปริมาณ (µmole or µg) ของสับสเตรทที่

เปล่ียนแปลงโดยปฏิกิริยาเฉพาะของเอ็นไซมจํานวนหนึ่งภายในหนึ่งหนวยเวลา (min or sec)

Ex: 1 U = 1 µg substrate/min

Enzyme Activity Unit

8

Enzyme Activity Unit• 1 หนวยสากล (International unit, I.U.)

ปริมาณเอนไซมท่ีสามารถเปลี่ยนใหซับสเตรท 1 µmole ไปเปนผลิตผลในเวลา 1 นาที ท่ี 25°C

• 1 หนวยคาทาล (katal)ปริมาณเอนไซมท่ีสามารถเรงใหซับสเตรท 1 mole

เปล่ียนเปนผลิตผล 1 mole ในเวลา 1 วินาที

Enzyme Specific Activity

จํานวนหนวยการทํางานของเอนไซม (enzyme activity unit) ตอมิลลิกรัมโปรตีน

บงบอกความบริสุทธิ์ของเอนไซมปริมาณโปรตีนนอย activity สูง แสดงวา enzyme น้ีมีความบริสุทธิ์มาก

Turn Over Number, kcat

จํ า น วน โ ม เ ล กุ ล ข อ ง สั บ ส เ ต รทที่ ถู กเปลี่ยนเปนผลิตผลโดยเอนไซม 1 โมเลกุลในเวลา 1 นาที

บงบอกประสิทธิภาพของเอนไซม

จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme Kinetics)การศึกษาอัตราเร็วของปฏิกิริยาและการ

เปลี่ยนแปลงอัตราเร็วของปฏิกิริยาเมื่อมีปจจัยบางอยางเปลี่ยนแปลงไป

ชวยใหเขาใจกลไกการทํางานของเอนไซมนั้นไดดีย่ิงข้ึน

จลนศาสตรของเอนไซม

www.steve.gb.com

จลนศาสตรของเอนไซมReaction Velocity = จํานวนของผลิตผลตอเวลา

Initial Velocity (V0)

http://dbs.umt.edu

The initial velocity can measured from the slope at the beginning of a reaction progress curve.

9

จลนศาสตรของเอนไซม

www.steve.gb.com

Hyperbolar curveFirst-order kinetics = rate depend on conc. of one substrate.Zero-order kinetics = rate does not depend on conc. of substrate.

Michaelis-Menten equation

V0 = initial velocityVmax = maximum velocity[S] = concentration of substrateKM = Vmax/2

= Michaelis-Menten constant

0

http://dbs.umt.edu

Michaelis-Menten equation

www.steve.gb.com

Lineweaver-Burkจากสมการ Michaelis-Menten:

กลับเศษเปนสวน

0

0

Lineweaver-Burk

www.steve.gb.com

Y = aX + b

EadieEadie--HofsteeHofstee• จากสมการ Michaelis-Menten:

• กลับเศษเปนสวน:

• คูณดวย Vmax

0

0

10

Eadie-Hofstee

• คูณดวย V0

• จัดเรียงสมการ

Eadie-Hofstee

www.science.siu.edu

Kinetic parameters:• Km (a constant):

[S] at ½Vmax (mol L−1)

Km ต่ํา เอนไซมจับกับ substrate ไดดี

• Vmax (not a constant): depend on mass of enzyme

(mol L−1 s−1 or mol s−1)

Km : Hexokinase- Glucose 0.5 mM

- Fructose 3 mM

Which one is better???

Kinetic parameters:

Kinetic parameters:• The specific activity:

จํานวนหนวยการทํางานของเอนไซมตอมิลลิกรัมโปรตีนspecific activity บริสุทธิ์สูง

• The turnover number (kcat):จํานวนโมเลกุลของซับสเตรทที่ถูกเปล่ียนเปนผลิตผลโดย

เอนไซม 1 โมเลกุลภายในเวลา 1 นาที kcat สูง เอนไซมมีประสิทธิภาพดี

Kinetic parameters

A good enzyme,

Km low

Vmax

turnover numberhigh

11

การยับย้ังเอนไซม (Enzyme Inhibition)

การยับยั้งเอนไซม การลดความสามารถหรือลดการทํางานของเอนไซม

โดยใชสารยับยั้งสารยับยั้ง (Inhibitor)

สารที่ทําใหเอนไซมเปลี่ยนโครงรูปหรือทําใหบริเวณเรงเกิดความผิดปกติ

การยับยั้งเอนไซมมี 2 แบบ1. การยับย้ังแบบทวนกลับได

(Reversible inhibition)

2. การยับย้ังแบบถาวร (Irreversible inhibition)

1. การยับย้ังเอนไซมแบบทวนกลับได

1.1 การยับยั้งแบบแขงขัน (Competitive inhibition)

1.2 การยับยั้งแบบไมแขงขัน (non-competitive inhibition)

http://people.uis.edu/

1. การยับย้ังเอนไซมแบบทวนกลับได 1.1 การยับย้ังแบบแขงขัน

www.biochem.arizona.edu

1.1 การยับยั้งแบบแขงขัน• substrate analogues• จับแบบสามารถผันกลับไดท่ี active site• Km เพิ่ม• เชน Krebs cycle: malonate inhibits

succinate dehydrogenase

Succinic acid Malonic acid.

1.1 การยับยั้งแบบแขงขัน

www.biochem.arizona.edu

12

1.2 การยับยั้งแบบไมแขงขัน (non-competitive inhibition)

• ตัวยับยั้งชนิดนี้ไมมีลักษณะเหมือนซับสเตรท • เขาไปจับที่บริเวณอื่นบนโมเลกุลของเอนไซมที่ไมใชบริเวณเรงแต

ทําใหบริเวณเรงเปลี่ยนไปจึงทํางานไดนอยลง (EI, ESI)• แมเพ่ิมปริมาณซับสเตรทก็ยังคงมีการยับยั้งอยู • คา Vmax เปลี่ยนแปลงแต Km คงที่

non-competitive inhibition

www.biochem.arizona.edu

2. การยับย้ังแบบถาวร (Irreversible inhibition)

• ตัวยับยั้งจะจับกับเอนไซมที ่active site ดวยพันธะโควาเลนต • เชน ยาฆาแมลง (Parathion) ยับยั้ง Acetylcholinesterase

Cyanide (CN-) จับเอนไซมที่ไออนโลหะ (Fe, Zn, Cu)

Penicillin ยับยั้งเอนไซมที่ใชในการสังเคราะหผนังเซลลของแบคทีเรีย

2. การยับยั้งแบบถาวร (Irreversible inhibition)

ไดไอโซโพรพิลฟอสโฟฟลูออริเดต ยับย้ังเอนไซมที่มีเซรีนเปนหนวยจําเปนตอการทํางาน เชน ไคโมทริปซิน (Chymotrypsin) ทริปซิน (Trypsin) เอสเทอเรส (Esterase)

Enz-CH2OH + Enz-CH2O + HF

Diisopropylphosphofluoridate

(DIPF)

เอนไซมแอลโลสเตอริค (Allosteric enzyme)

• ประกอบดวยหลายหนวยยอย (≥ 2 subunits)

• มี catalytic site สําหรับจับกับ substrate• มี regulatory site สําหรับจับกับตัวแปลง (modifiers/effecters) เชน inhibitor activator

เอนไซมแอลโลสเตอริค (Allosteric enzyme)

• Cooperativity• โครงสรางจตุรภูมิจะอยูในสภาพสมดุลระหวางโครงสรางที่ตึงเครียด

(tense, T) และสภาพที่ผอนคลาย (relax,R) โดย R จะมี affinity ตอซับสเตรทสูงกวา T

• Sigmoid Curve ไมใช hyperbolar

เปนเอนไซมท่ีสําคญัในการควบคุมเมแทบอลิซึม (Regulatory enzyme)

13

Cooperativity

www.steve.gb.com

Cooperativity

www.steve.gb.com

เอนไซมแอลโลสเตอริค (Allosteric enzyme)

www.steve.gb.comSigmoid Curve

phosphofructokinase (PFK)

citrate

AMP

ไอโซไซม (Isozyme)

เอนไซมท่ีทําหนาท่ีเรงปฏิกิริยาเดียวกันแตมีโครงสรางตางกัน และสามารถแยกออกจากกันไดโดยวิ ธี อิ เ ล็กโทรโฟรีซีส (Electrophoresis)

เชน LDH (Lactate dehydrogenase)

LDH มี 4 subunits

5 isoform (H4, H3M, H2M2, HM3, M4)H4 หัวใจ เปล่ียน lactate เปน pyruvate ในเนื้อเยื่อท่ีมี O2

M4 กลามเนื้อ เปล่ียน pyruvate เปน lactate ในเนื้อเยื่อท่ีขาด O2

ไอโซไซม (Isozyme) เอนไซมHoloenzyme =

Apoenzyme + Cofactor

โคแฟคเตอร (Cofactor)เปนสารโมเลกุลขนาดเล็กมีสวนรวมในการทําปฏิกิริยาชวยการทํางานของเอนไซมในการเรงปฏิกิริยา ทางเคมี

14

โคแฟคเตอร (Cofactor):1. ไอออนโลหะ (Metal ions)

ไมถูกเปลี่ยนแปลงไปในปฏิกิริยา ชวยให ES cpx คงตัวมากข้ึน เชน

Zn2 CarboxypeptidaseMg2+ Phosphatase, KinaseK+ Pyruvate kinase

2.Prosthetic group3. โคเอนไซม (Coenzyme)

2. Prosthetic group• จับดวยพันธะโควาเลนท • ถาแยกออกจากโมเลกุลเอนไซมจะทําใหเอนไซมเสียสภาพ

Haem

www.steve.gb.com

ใน haemoglobin,cytochromes

3. โค เอนไซม (Coenzyme)• สารประกอบอินทรีย

ซ่ึงมักเปนอนุพันธของวิตามินที่ละลายน้ําหรือมวีิตามินเปนสวนประกอบ อาจเปลี่ยนแปลงโครงสรางไดระหวางที่เกิดปฏิกิริยาแตมักจะกลับสูสภาพเดิมได

• ทําหนาที่โยกยายหมูเคมี อะตอมหรืออิเลคตรอนโดยการทําปฏิกิริยากับซับสเตรทเอง

ดังนั้นโครงสรางอาจเปลี่ยนแปลงไดระหวางที่เกิดปฏิกิริยาแตจะเปลี่ยนกลับสูสภาพเดิมได

• จับแบบหลวมทําใหแยกโคเอนไซมออกได แตจะทําใหเอนไซมขาดความสามารถในการเรงปฏิกิริยา

Vitamin

วิตามิน คือ อินทรียท่ีรางกายตองการปริมาณเล็กนอย

ไมใหพลังงาน ไมไดเปนสวนประกอบของรางกายแตจําเปนในการควบคุมปฏิกิรยิาเคมีท่ีเกิดข้ึนในรางกาย รางกายสังเคราะหข้ึนเองไมไดหรือไดแตไมเพียงพอตองไดรับจากอาหาร

ประเภทของโคเอนไซมแบงตามหมูเคมีที่เกี่ยวของในการเคลื่อนยาย ได 2 ประเภท1. เคลื่อนยายอะตอมไฮโดรเจน

Oxidoreductaseไดแก FAD, FMN, NAD+, NADP+, Lipoic acid,

2. เคลื่อนยายหมูสารเกือบทุกชนิดยกเวนไฮโดรเจน Transferaseไดแก Coenzyme A, Thiamine pyrophosphate , Pyridoxal phosphate, Tetrahydrofolic acid, Biotin, Lipoic acid

โคเอนไซม

CO2transferBiotinBiotin (B7)

Methyl group transferTetrahydrofolic acidFolic acid

TransaminationPyridoxal phosphatePyridoxine (B6)

Ketoaciddecarboxylation

Thiamine pyrophosphateThiamine (B1)

Acyl transferCoenzyme A (CoA)Pantothenic acid (B3)

Acyl + H transferLipoic acidLipoic acid

H transfer (oxidoreduction)NAD+, NADP+,Nicotinic acid (B5)

H transfer (oxidoreduction)FAD, FMNRiboflavin (B2)

Metabolic FunctionsCoenzymesVitamins

15

FAD

http://www.uky.edu/

Riboflavin (B2) = prosthetic gr

Flavin adenine dinucleotide

Adenine

sugar

FADFlavin adenine dinucleotide

Oxidized flavoprotein Reduced flavoprotein

FMNFlavin mononucleotide

www.biopsicologia.net

FMN

FAD

Riboflavin

Nicotinic acid (vitamin B5)

Nicotinamide Niacin (Nicotinic acid)

NAD+ = Nicotinamide adenine dinucleotideNADP+ = Nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate

NAD+ and NADP+

http://fig.cox.miami.edu

Reactive gr.

R

= H (NAD+)

= -P=O (NADP+)

O-

O-

Lipoic acid

16

Coenzyme A

http://library.med.utah.eduwww.homepages.hetnet.nl

B3

Adenine

Ribose 3 P

Reactive gr.

Pantothenic acid

Thiamine (B1)

Thiamine Thiamine Pyrophosphate (TPP)

วงแหวนไทอาโซลThiazole ring

วงแหวนไพริมิดีนPyrimidine ring

C

Thiamine (B1)

www.rpi.edu

Reactive carbon

Pyridoxal phosphate (B6)

Pyridoxine Pyridoxal Pyridoxamine

Pyridoxal Phosphate (PLP)

Reactive gr.

Folic acid

Folate (F)

(FH2) (THF, FH4)

8 7

65

Biotin (B7)

Biotin (Carboxylate)

Biotin

+ CO2

อิมมิดาโซล (imidazole ring)

ไทโอฟน (Thiophene ring)biotin-avedin cpx รางกายไมสามารถดูดซึมได

17

Biotin (B7)

The biotinyllysine (biocytin) cpx

from apoenzyme

Biotin (B7)

PyruvateCarboxy-biotinyl cpx

Pyruvate carboxylase

Holoenzyme

www.worthington-biochem.com

-Metalloenzyme-Ion activator

ประโยชนของเอนไซม1. ใชในการตรวจวินิฉัยในหองปฏิบติการ เชน การวิเคราะห

ยูเรียไนโตรเจนในเลือดโดยอาศัยเอนไซม urease และ glutamate dehydrogenase (GDH)

Urea + H2O ammonia + CO2

Ammonia + α ketoglutarate + NADH (340 nm)

glutamate + H2O + NAD+

2. ใชเปนตัวบงชี้โรค เชน creatine phosphokinase(PK) ในเลือดระดับสูง บงชี้วาเปนโรคกลามเนื้อหัวใจตาย

3. ใชเปนยารักษาโรค เชน protease เปนยาลดอาการอักเสบบวมเนื่องจากชวยยอยสลายไฟบรินไปบริโนเจนและโปรตีนบริเวณที่มีอาการอักเสบติดเชื้อ

4. ใชในอุสาหกรรม เชน lipase ในผงซักฟอก Naringinase เพ่ือลดสารขมในน้ําผลไม

ประโยชนของเอนไซม

The end