estudio biodirigido de un extracto alcohólico de frutos de sechium edule (jacq.) swartz

8/12/2019 Estudio Biodirigido de Un Extracto Alcohlico de Frutos de Sechium Edule (Jacq.) Swartz

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Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal

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M. Elena Monroy-Vzquez, Marcos Soto-Hernndez, Jorge Cadena-Iiguez, Edelmiro Santiago-Osorio, Lucerodel Mar Ruiz-Posadas, Hortensia Rosas-Acevedo

ESTUDIO BIODIRIGIDO DE UN EXTRACTO ALCOHLICO DE FRUTOS DE Sechium edule (Jacq.) Swartz

Agrociencia, vol. 43, nm. 8, noviembre-diciembre, 2009, pp. 777-790,

Colegio de Postgraduados

Mxico

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Agrociencia,

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ESTUDIO BIODIRIGIDO DE UN EXTRACTO ALCOHLICO

DE FRUTOS DE Sechium edule (Jacq.) Swartz

BIO-GUIDED STUDY OF AN ALCOHOLIC EXTRACT OFSechium edule (Jacq.) Swartz FRUITS

M. Elena Monroy-Vzquez1,2, Marcos Soto-Hernndez1,2*, Jorge Cadena-Iiguez2,3, Edelmiro Santiago-Osorio2,4,

Lucero del Mar Ruiz-Posadas1,2,Hortensia Rosas-Acevedo5

* Autor responsable vAuthor for correspondence.Recibido: Junio, 2008. Aprobado: Agosto, 2009.Publicado como ARTCULO en Agrociencia 43: 777-790. 2009.

RESUMEN

Sechium edule (chayote) es una especie neotropical con

amplia variacin biolgica en forma, color y sabor de

los frutos, los cuales han sido utilizados como fuente de

alimento y medicina. En esta investigacin se usaron frutos

de S. edule var. nigrum spinosumpara evaluar la actividad

antiproliferativa y citotxica en dos lneas tumorales (L-929

y HeLa); adems, de aislar y caracterizar los componentes demayor actividad a partir de un extracto alcohlico. El extracto

se fraccion por cromatografa en columna, los ensayos

biolgicos se realizaron con el extracto y las fracciones

principales evaluando seis concentraciones (0, 0.047, 0.23,

0.47, 1.18, 2.37 mgmL-1). De cuatro fracciones aisladas, tres

tuvieron actividad antiproliferativa y citotxica de tipo dosis

dependiente. El anlisis por resonancia magntica nuclear de

hidrgeno y cromatografa de gases acoplada a espectrometra

de masas, revel como componentes mayoritarios de la

fraccin ms activa a steres de tipo metlico de cido

hexadecanoico, etlico del cido hexadecanoico, metlico del

cido 10-octadecenoico, metlico del cido octadecanoico,octlico del cido octadecenoico y metlico del cido 9-oxo-

nonanoico, ampliando con ello la gama de especies vegetales

con posibilidad de detener la proliferacin de clulas

cancergenas.

Palabras clave: Cncer, chayote, fracciones, cidos grasos,

Cucurbitaceae

1Botnica. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230. Montecillo, Estado deMxico. 2Interdisciplinary Research Group of Sechium edule in Mxico (GISeM), AgustnMelgar 10. 56153. Texcoco, Estado de Mxico. ([email protected]). 3Campus San LuisPotos. Colegio de Postgraduados. 78600. Iturbide No. 73, Salinas de Hidalgo, San LuisPotos. 4Facultad de Estudios Superiores de Zaragoza. Universidad Nacional Autnoma

de Mxico (UNAM). 09230. Avenida Guelatao 66, Iztapalapa, Mxico D.F. 5Instituto deQumica. Universidad Nacional Autnoma de Mxico (UNAM). 0450. Ciudad Universitaria,Circuito Exterior, Mxico, D.F.

ABSTRACT

Sechium edule (chayote) is a Neotropic species with wid

biologic variation of form, color, and fruits flavor fruits

which has been utilized as source of food and medicine. In

this research, fruits of S. edule var. nigrum spinosum wer

used in order to assess antiproliferative and cytotoxic activit

in two tumoral lines (L-929 and HeLa), besides for isolatin

and characterizing the components of most importanactivity starting from an alcoholic extract. e extract wa

fractionated by column chromatography; the bioassays wer

carried out using the extract and the main fractions assessin

six concentrations (0, 0.047, 0.23, 0.47, 1.18, 2.37 mg mL-1)

ree out of four isolated fractions had antiproliferative an

cytotoxic dose-dependent activity. e analysis by hydrogen

nuclear magnetic resonance and gas chromatography

coupled to mass spectrometry, revealed esters of: methyl o

hexadecanoic acid, ethyl of hexadecanoic acid, methyl o

10-octadecenoic acid, methyl of octadecenoic acid, octyl o

octadecenoic acid, and methyl of 9-oxononanoic methyl aci

as the principal components of the most active fraction, thuextending the range of vegetal species with the possibility o

blocking proliferation of carcinogenic cells.

Key words: Cancer, chayote, fractions, fatty acids, Cucurbitaceae

INTRODUCTION

Natural products coming from plants arvalued by man as source of active principlefor medicinal use (Farnsworth et al.,1992)due to their chemical constituents, generally secondary


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AGROCIENCIA, 16 de noviembre - 31 de diciembre, 2009

VOLUMEN 43, NMERO 8778

INTRODUCCIN

Los productos naturales provenientes deplantas son valorados por el hombre comofuente de principios activos para usomedicinal (Farnsworth et al., 1992) debido a susconstituyentes qumicos, generalmente metabolitossecundarios (Bye et al., 1992), que en la naturalezafuncionan como defensa qumica contra herbvoros.La complejidad estructural de estos metabolitospuede determinar su actividad biolgica; por loque representan un recurso para el desarrollo denuevos frmacos (Hostettmann et al., 1995). La

bsqueda de medicamentos naturales surge por elincremento en la frecuencia de padecimientos comoel cncer. ste se ha extendidos en el panoramaepidemiolgico mundial desde finales del siglo XX,con un registro de 22 millones de casos. En Mxico,el cncer ocupa desde 1990 el segundo lugar comocausa de muerte (INEGI, 2007); causando en el ao2001, la prdida de 33.5 aos potenciales de vida(RHNM, 2001). En trminos de tratamiento delcncer, existen serias limitaciones debido a la falta deselectividad de los agentes quimioteraputicos y a laresistencia desarrollada por algunas clulas cancerosasa dichos productos (Setzer y Setzer, 2003); por ello,los compuestos obtenidos mediante la extraccinfitoqumica, cobran relevancia como nuevos recursospara tratamientos alternativos y la farmacutica(Mans et al., 2000).

Sechium edule (Cucurbitaceae), comnmentellamado chayote, es una especie neotropical(Newstrom, 1991), estudiada desde el punto de vistataxonmico, ecolgico, nutrimental, agronmico,fisiolgico, qumico y gentico (Lira-Saade yCaballero, 2002; Modgil et al., 2004; Cadena-iguez,2005). El chayote se emplea en la medicina tradicionalcomo diurtico, cardiovascular, antiinflamatorio,

contra calcificaciones renales y arteriosclerosis(Jensen y Lai, 1986). Contiene alcaloides nofenlicos, saponinas, esteroles, triterpenos (Salama etal.,1986) y flavonoides glicosilados (Siciliano et al.,2004). Se le atribuyen propiedades antiinflamatorias(Salama et al., 1987); antihipertensivas (Gordon etal., 2000); antimicrobianas (Ordoez et al., 2003)y antioxidantes (Ordoez et al., 2006), validadascon estudios farmacolgicos. Una caractersticaimportante de S. edule, es su variacin biolgica,observada principalmente en la forma, color y sabor

metabolites (Bye et al.,1992) that in nature function

as chemical defense against herbivores. e structuracomplexity of these metabolites may determine theibiologic activity; therefore they represent a resourcfor the development of new drugs (Hostettmannet al., 1995). e search for natural medicamentarises by the growing frequency of suffering fromdiseases such as cancer. is has spread worldwidon the epidemiological scene since the end of th20th century, with a record of 22 million cases. InMxico, since 1990 cancer has occupied the secondplace as cause of mortality (INEGI, 2007) leading tothe loss of 33.5 potential years of life in the year 200(RHNM, 2001). In terms of cancer treatment, therare serious limitations due to the lack of selectivityof chemotherapeutic agents and to the resistancdeveloped by some cancerous cells to such product(Setzer and Setzer, 2003); therefore, the compoundobtained by means of phytochemical extractionbecome important as new resources for alternativtreatments and pharmaceutics (Mans et al.,2000).

Sechium edule (Cucurbitaceae), usually calledchayote, is a Neotropic species (Newstrom, 1991)studied from the taxonomic, ecological, nutritionalagronomic, physiological, chemical, and genetic poinof view (Lira-Saade and Caballero, 2002; Modgil eal.,2004; Cadena-Iiguez, 2005). Chayote is used intraditional medicine as diuretic, cardiovascular, antiinflammatory cure, against renal calcification, andarteriosclerosis (Jensen and Lai, 1986). It containnonphenolic alkaloids, saponins, sterols, triterpene(Salama et al., 1986), and glycoside flavonoid(Siciliano et al.,2004). Anti-inflammatory (Salamet al., 1987), antihypertensive (Gordon et al2000), antimicrobial (Ordoez et al., 2003), andantioxidant properties (Ordoez et al., 2006) arattributed to chayote, validated by pharmacologicastudies. An important characteristic of S. edule is it

biologic variation, mainly observed in form, colorand flavor of the fruits, the latter attributed to thvariation in tetracyclic triterpene concentrationsuch as cucurbitacins (Cadena-Iiguez et al., 2007a)Starting from the aforementioned and based on thfact that these metabolites have potential activity aantineoplasic agents(Anonymous, 1996), besides thsearch of new uses for this species, Cadena-Iigue(2005) and Cadena-Iiguez et al.(2006) assessedalcoholic fruit extracts of eight varieties in thtumoral lines P-388 and L-929 (monocytic leukemi


4/1577MONROY-VZQUEZ et al.

ESTUDIO BIODIRIGIDO DE UN EXTRACTO ALCOHLICO DE FRUTOS DE Sechium edule(Jacq.) Swar

de los frutos, atribuido ste ltimo a la variacin

en la concentracin de triterpenos tetraciclicos,tales como las cucurbitacinas (Cadena-iguez etal., 2007a). Partiendo de lo anterior y con base enque estos metabolitos tienen actividad potencialcomo agente antineoplsico (Annimo, 1996),adems de la bsqueda de nuevos usos para estaespecie, Cadena-Iiguez (2005) y Cadena-Iiguezet al. (2006), evaluaron los extractos alcohlicos defrutos de ocho variedades en las lneas tumoralesP-388 y L-929 (leucemia monoctica y fibrosarcomade pulmn respectivamente), de los cuales S. edulevar. nigrum spinosum, mostr la mayor actividadantiproliferativa, sin embargo, no se identificaron losmetabolitos contenidos en el extracto responsables dedicha accin. Con base en lo anterior, en el presentetrabajo se planteo la hiptesis bajo un enfoquebioprospectivo que S. edule var. nigrum spinosumtiene actividad antineoplsica por contener en sucomposicin bioqumica metabolitos del grupo delos triterpenos tetraciclicos; por tal motivo, se evaluun extracto alcohlico de frutos de dicha variedad,con el fin de determinar su actividad en dos lneastumorales, adems de identificar los principalesmetabolitos responsables de la misma, de tal formaque lo anterior permita enriquecer el valor de uso de

este recurso fitogentico Mesoamericano como unalimento funcional.

MATERIALESYMTODOS

Material vegetal, extraccin y aislamiento

Se utilizaron frutos de Sechium edule (Jacq.) Sw., var.nigrum

spinosum, procedentes del Banco Nacional de Germoplasma de

S. edule en Mxico. Esta variedad se desarrolla bajo condiciones

de cultivo, en altitudes que oscilan entre los 800 a 2500 m, con

requerimientos de alta humedad ambiental (80-85 %), suelos

cidos a ligeramente cidos (4.5 a 6.5 de pH), bien drenados y ricosen humus (Flores, 1989; Cadena, et al., 2001), con precipitacin

media anual de 1500 a 2000 mm., fotoperiodo de hasta 12 h luz

para inicio de floracin y temperaturas de 20 a 25 C; es muy

susceptible a la sequa, heladas que generalmente ocasionan

muerte de la planta (Cadena et al., 2001). El ejemplar herborizado

se deposit en el Herbario Ortorio del Colegio de Postgraduados,

Montecillos, Texcoco, Mxico, con la accesin No. 300-2005.

A diferencia del resto de las variedades tanto cultivadas

como en condiciones de traspatio, n. spinosum, presenta en la

composicin de sus frutos hasta diez veces ms contenido de

and lung fibrosarcoma, respectively), of which

S. edule var. nigrum spinosum showed the highesantiproliferative activity; however, the metabolitecontained in the extract which produced this effectwere not identified. Based on the aforesaid, in thpresent study the hypothesis was exposed under bioprospective approach that S. edule var. nigrumspinosum has antineoplasic activity because ocontaining metabolites of the tetracyclic triterpengroup in its biochemical composition; therefore, analcoholic fruit extract of this variety was assessedwith the purpose to determine its activity in twtumoral lines, besides identifying the principametabolites responsible for this activity, so that thaforementioned allows enriching the value of thiMiddle American phytogenetic resource using it afunctional food.

MATERIALSANDMETHODS

Vegetal Material, Extraction and Isolation

Sechium edule (Jacq.)Sw., var.nigrum spinosumfrom the Banc

Nacional de Germoplasma de S. edulein Mxico was used. i

variety is developed under crop conditions at altitudes betwee

800 and 2500 m, with requirements of high environmenta

humidity (80-85 %), acid and slightly acid soils (4.5 to 6.5 pH)well-drained and rich in humus (Flores, 1989; Cadena et al

2001). With annual mean precipitation of 1500 to 2000 mm

photoperiod of up to 12 h light for the beginning of flowering

and temperatures of 20 to 25 C, it is highly susceptible to drough

and frosts that generally cause plant mortality (Cadena et al

2001). e herbaceous specimen was deposited in the Herbari

Ortorio of the Colegio de Postgraduados, Montecillo, Texcoco

Mexico, with accession No.300-2005.

Unlike the rest of the varieties, cultivated as well as unde

backyard conditions, n. spinosumhas in its fruit composition u

to ten times as much tetracyclic triterpene content as the varietie

of yellow fruits like a. levis and a. dulcis; and presumably thtype of metabolites with respect to the varieties of green fruit

like nigrum levis, virens levis, nigrum xalapensis show highe

antiproliferative activity in the preliminary assays (Cadena

Iiguez, 2005; Cadena-Iiguez et al., 2005). e fruits were use

when reaching horticultural maturity at 182 days after anthes

(Aunget al.,1996; Cadena-Iiguez et al.,2007b), chopped i

small pieces, dried for three days at 50 C up to 10% humidity

and macerated for standardizing at 2 mm particle size (no.1

mesh). Subsequently, a discontinuous extraction was mad

submerging the macerated fruit in methanol (99.8 %, certifie


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triterpenos tetraciclicos que las variedades de frutos amarillos,

tales como albus minor, a. levis y a. dulcis, y presumiblementeel tipo de metabolitos respecto a las variedades de fruto color

verde como nigrum levis, virens levis , nigrum xalapensis, muestran

mayor actividad antiproliferativa en los ensayos preliminares

(Cadena-Iiguez, 2005: Cadena-Iiguez et al., 2005). Los frutos

se usaron cuando alcanzaron su madurez hortcola a los 182

das despus de antesis (Aung et al., 1996; Cadena-Iiguez et

al., 2007b), cortados en trozos pequeos, secados por tres das

a 50 C, hasta 10 % de humedad y macerados para estandarizar

a tamao de partcula de 2mm (malla No. 10). Posteriormente,

se realiz una extraccin discontinua al sumergir el macerado

en metanol (99.8 %, ACS certificado, Merck) por 48 horas a

temperatura ambiente (20 C2). El extracto alcohlico se filtr

con papel en 12 ocasiones, renovando el disolvente, hasta que

el macerado no produjo filtrados con color; posteriormente,

se evapor el disolvente a presin reducida (Rotavapor Bchi,

R-114, Suiza) a 45 C, hasta obtener un extracto crudo sin

disolvente orgnico (Kuklinski, 2000), el cual fue evaluado en un

primer bioensayo. Posteriormente, a partir de 20 g de extracto, se

realiz el fraccionamiento por cromatografa en columna (CC),

empacada con gel de slice 60 (Merck, D. F. Mxico), con fase

mvil de hexano-acetato de etilo (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 1:1) y acetato

de etilo-metanol (10:0, 9:1, 8:2). Se recolectaron fracciones de

100 mL cada una; stas se monitorearon por cromatografa en

capa fina, empleando como adsorbente gel de slice (60 GF254

,

Merck, Mxico) con fase mvil acetato de etilo-metanol (8:2).Las cromatoplacas se observaron con luz UV a 254 y 365 nm

(Cole-Parmer 9818, Chicago) y se revelaron con un agente

cromognico de anisaldehdo-cido actico glacial-metanol-cido

sulfrico (0.05, 1.0, 8.5 y 0.5 mL, respectivamente) calentando

a 110 C por 5 min, lo que permiti reunir las fracciones por

su identidad cromatogrfica. La seleccin de las fracciones

para la segunda fase de ensayos biolgicos, se realiz con base

en la coloracin de las marcas rojo violeta y caf marrn de la

cromatoplaca relacionadas con compuestos triterpnicos (Che et

al., 1985; Afifi et al., 1999).

Evaluacin de la actividad antiproliferativa

La evaluacin de la accin antineoplsica se realiz a travs

de la medicin de la actividad antiproliferativa y el ndice de

citotoxicidad. La primera se define biolgicamente, como la

reduccin en nmero de la multiplicacin celular, mientras que

la citotoxicidad se refiere a la cualidad de ser txico a clulas

provocando su destruccin (National Cancer Institute, 2009).

Los bioensayos se realizaron empleando las lneas celulares

tumorales L-929 (fibrosarcoma de pulmn de ratn) y HeLa

(cncer crvico-uterino humano). Las lneas se mantuvieron

ACS, Merck) for 48 h at environmental temperature (20 C2

e alcoholic extract was filtered through filter paper 12 timechanging the solvent until the crushed fruit produced filtrate

without coloring, later on, the solvent evaporated at reduce

pressure (Rotavapor Bchi, R-114, Switzerland) at 45 C, unt

obtaining a raw extract without organic solvent (Kuklinsk

2000), which was assessed in a first bioassay. Subsequently

starting from 20 g of extract, fractionation by colum

chromatography (CC) was carried out, packed with silica gel 6

(Merck, D.F. Mxico) with hexane-ethyl acetate as mobile phas

(10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 1:1), and ethyl acetate-methanol(10:0, 9:1

8:2). Fractions of 100mL each were collected and monitored b

thin-layer chromatography, employing silica gel as absorben

(60 GF254

, Merck, Mexico) with ethyl acetate-methanol (8:2

as mobile phase. Chromatoplateswere observed under UV ligh

at 254 and 365 nm (Cole-Parmer 9818, Chicago) and reveale

using a chromogenic agent of acetic anisaldehyde-acetic acid

methanol-sulfuric acid (0.05, 1.0, 8.5, and 0.5 mL, respectively

heating to 110 C for 5 min, which allowed joining the fraction

by their chromatographic identity. e selection of fractions fo

the second phase of bioassays was made, based on the coloring o

violet red and coffee brown marks of the chromatoplate related

to triterpenoid compounds (Che et al.,1985; Afifi et al.,1999)

Assessment of Antiproliferative Activity

Evaluation of antineoplasic action was carried out througmeasuring of antiproliferative activity and the cytotoxicity index

e former is biologically defined as reduction in number o

cell multiplication, whereas cytotoxicity refers to the qualit

of being toxic for cells provoking their destruction (Nationa

Cancer Institute, 2009). Bioassays were conducted employin

the tumoral cell lines L-929 (rat lung fibrosarcome) and HeL

(human uterine cervical cancer). e lines were kept as crop

in monolayerin IMDM (Iscoves Modified Dulbecos Medium

Invitrogen, U.S.A.) supplemented with 10 % deactivated SFB

(bovine fetal serum) (Gibco BRL, U.S.A.) at 37 C at 5 % CO

atmosphere and 95 % humidity in incubator (scientific erm

Form, Marietta, U.S.A.), at density of 1106

cells mL-1

. alcoholic extract, as well as the fractions (71.2 mg of each) wer

solubilized in 40 mL absolute ethanol and 960 mL phosphat

buffer solution (PBS: sodium chloride (8 g), potassium chlorid

(0.2 g), monobasic potassium phosphate (0.2 g), dibasic sodium

phosphate (2.16 g), 7.2 7.4 pH (SIGMA, CHEM, St. Louis

U.S.A.). e mixture was centrifuged at 500 g during 5 mi

(Hermle-Labortechnik, Germany). Supernatants were filtered i

order to obtain a stock of 14.24 mg per every 600 mL of PBS

this was diluted to concentrations of 0, 0.047, 0.23, 0.47, 1.18

2.37 mg mL-1. L-929 and HeLa lines were re-sown in plate




como cultivos en monocapa, en IMDM (Iscoves Modificed

Dulbecos Mdium, Invitrogen, USA) suplementado con 10 %de SFB (suero fetal bovino) desactivado (Gibco BRL, USA), a

37 C en una atmsfera al 5 % de CO2y 95 % de humedad

en incubadora (ermo Forma cientfica, Marietta, USA), a una

densidad de 1106 clulasmL-1. Tanto el extracto alcohlico

como las fracciones (71.2 mg de cada una) se solubilizaron en 40

mL de etanol absoluto y 960mL de solucin amortiguadora de

fosfatos (PBS: cloruro de sodio (8 g), cloruro de potasio (0.2 g), fosfato de

potasio monobsico (0.2 g), fosfato de sodio dibsico (2.16 g), pH 7.2-

7.4 (SIGMA, CHEM, St. Louis, USA). La mezcla se centrifug

a 500 g durante 5 min (Hermle-Labortechnik, Alemania). Los

sobrenadantes se filtraron para obtener un stock de 14.24 mg

por cada 600mL de PBS; ste se diluy a concentraciones de 0,

0.047, 0.23, 0.47, 1.18, 2.37 mgmL-1. Las lneas L-929 y HeLa

se resembraron en placas de 96 pozos a una densidad de 2104

clulasmL-1de medio de cultivo, adicionando el extracto o las

fracciones en las concentraciones indicadas y se co-cultivaron por

72 h. Posteriormente, las clulas adheridas al pozo se fijaron con

glutaraldehido al 1 % durante una hora, despus se adicion la

solucin de cristal violeta (Sigma, St. Louis Missouri, USA) para

colorear el ncleo celular (Kueng et al., 1989), como mtodo

indirecto para cuantificar el nmero celular (Gillies et al., 1986);

las placas se agitaron por 10 min (Labnet International Inc.

Woodbridge, USA) y se retir el exceso de colorante con agua

destilada. En seguida se agregaron 50mLpozo-1de cido actico

al 10 %, agitndolo durante 20 min para solubilizar el colorante.La densidad ptica de las clulas fue evaluada a 570 nm en un

espectrofotmetro de placas (Spectra Tecan Image, Austria). Los

bioensayos se realizaron en dos ocasiones, con tres repeticiones.

Evaluacin de la citotoxicidad

Los sobrenadantes de los ensayos de proliferacin celular

se emplearon para evaluar la presencia de la enzima lactato

deshidrogenasa (LDH), encontrada en el citoplasma celular

(Tejin et al., 2006). La enzima LDH es empleada para

cuantificar el dao a la membrana celular mediante la liberacin

del lactato de deshidrogensa en el sobrenadante (Fischer etal., 2002). La actividad de LDH es medido por una prueba

enzimtica para lo cual, primero el NAD+es reducido a NADH/

H+ por tanto el LDH catalizado es convertido a lactato de

piruvato. En la segunda etapa de catlisis se transfieren H/H+

y se convierte en sal de tetrazolio que es reducida a formazan

que puede ser identificada colorimtricamente (Abe y Matsuki

et al., 2000). Los sobrenadantes se co-cultivaron a temperatura

ambiente (222 C) por 30 min con el kit de deteccin de

LDH (RocheMR, Mxico). Para determinar el porcentaje de

citotoxicidad se requiere de un control positivo el cual permite

of 96 wells at 2104 cells mL-1 of culture medium density

adding extract or fractions in the indicated concentrations anco-cultivating them for 72 hours. Subsequently, the cells adhere

to the well were fixed with 1% glutaraldehyde during one hour

afterwards the violet glass solution (Sigma, St. Louis Missour

USA) was added in order to color the cell nucleus (Kueng e

al., 1989) as an indirect method for quantifying cell numbe

(Gillies et al.,1986); the plates were shaken for 10 min (Labne

International I1nc. Woolbridge, USA) and the excess of colo

was removed with distilled water. Next, 50 mL well-1of aceti

acid at 10 % were added shaking during 20 min in order t

solubilize the color.Optical cell density was assessed at 570 nm

using a plate spectrophotometer (Spectra Tecan Image, Austria)

e bioassays were carried out on two occasions with thre

replications.

Cytotoxicity Assessment

Supernatants of cell proliferation assays were utilized t

evaluate the presence of lactate dehydrogenase enzyme (LDH

found in cell cytoplasm (Tejin et al.,2006). e LDH enzym

is utilized to quantify damage to cell membrane by release o

dehydrogenase lactate in the supernatant (Fischer et al.,2002

LDH activity is measured by enzymatic test for which first NAD

is reduced to NADH/H+, therefore the catalyzed LDH is turne

to pyruvate lactate.In the second phase of catalysis, H/H+ ar

transferred and turned into tetrazolium salt, which is reduceto formazan which may be identified colorimetrically (Ab

and Matsuki et al., 2000). e supernatants were co-cultivate

at environmental temperature (222 C) for 30 min with th

LDH detection kit (RocheMR, Mexico). In order to determin

cytotoxicity percentage a positive control is required, whic

allows obtaining absolute cell toxicity; to this purpose, 30 mi

before concluding culturingtime, a Triton X-100 solution at 2 %

(Sigma,USA) with culture medium, in relation 1:1, was added

the culturing time having passed, cytotoxicity was assessed, usin

the Cytotoxicity Detection (LHD) kit (Roche, Diagnostics

Germany).e tests were read at optical density of 490 nm on

a plate reader(Image, Tecan-Spectra, Austria). ree controls peassay were established: one in depth with 200 mL well-1of 10 %

SFB medium, the negative one with 100m L medium in 100m

of cells; and the positive one with 100 mL of cells and 100m

of Triton X-100 (Sigma, USA) at 2 % culture medium. In orde

to determine cytotoxicity percentage absorbance readings wer

utilized; the difference between the value of negative contro

and the value obtained experimentally was divided between

the difference of positive and negative control. e resultin

quotient was multiplied by 100. In order to eliminate the effec

of absorbance of the culture medium, the mean value of th


7/15



obtener la toxicidad celular absoluta; para ello, 30 min antes de

concluir el tiempo de cultivo se adicion una solucin de TritnX-100 al 2 % (Sigma, USA) con medio de cultivo, en relacin

1:1; transcurrido el tiempo de cultivo se evalu la citotoxicidad

con el kit Cytotoxicity Detection (LDH) (Roche, Diagnostics,

Germany). Las muestras fueron ledas a una densidad ptica de

490 nm en un lector de placas (Image, TECAN-SPECTRA,

Austria). Por cada ensayo se establecieron tres controles: el

de fondo con 200 mLpozo-1 de medio al 10 % de SFB;

el negativo con 100 mL de medio en 100 mL de clulas; y

el positivo con 100 mL de clulas y 100 mL de Triton X-100

(Sigma, USA) al 2 % de medio de cultivo. Para determinar

el porcentaje de citotoxicidad, se emplearon las lecturas de

absorbancia; la diferencia entre el valor del control negativo y

el valor experimental obtenido se dividi entre la diferencia del

control positivo y el negativo. El cociente resultante se multiplic

por 100. Para eliminar el efecto de la absorbancia del medio de

cultivo, se rest el valor promedio del control de fondo a los

valores experimentales, el control positivo y el negativo (Mora-

Garca et al., 2006).

Identificacin de las fracciones

activas y anlisis estadstico

Las fracciones activas fueron sometidas al anlisis de

resonancia magntica nuclear de hidrgeno (1H NMR) a 200

MHz y a cromatografa de gases acoplada a espectrometra demasas (CG-MS) usando un espectrmetro JMS-AX 505HA

(JEOL) acoplado al cromatgrafo GC Hewlett Packard 5890

series II, equipado con una columna capilar (25 m 20 mm i.

d.0.33mm de espesor), con fenil-metil polisiloxano como fase

estacionaria. La columna se mantuvo a 100 C por un min y luego

se calent a 260 C a 10 C por min. La temperatura del inyector

fue de 250 C y se oper en modo Split en una relacin 70:1. El

anlisis de las masas separadas se hizo por impacto electrnico

de 69.9 eV con la fuente de ionizacin a 230 C. El anlisis

estadstico fue realizado considerando los valores de absorbancia

(570 nm) obtenidos en los ensayos de proliferacin, como forma

indirecta de cuantificar el nmero celular de cada cultivo. Dichosvalores fueron sometidos a un anlisis de varianza, con un nivel

de significancia de a0.05,a0.01 y prueba de Tukey. Se emple

el software SAS, versin 9.0 (SAS Institute Inc., USA), teniendo

como variables al extracto, las fracciones y las concentraciones.

RESULTADOSYDISCUSIN

La primera fase de bioensayos se realiz conel extracto crudo y se observ que las actividadesantiproliferativa y citotxica fueron de tipo dosisdependiente. La inhibicin de la proliferacin

control in depth was subtracted from the experimental values

the positive and the negative control (Mora-Garca et al., 2006)

Identification of Active Fractions and Statistical Analysis

e active fractions were submitted to analysis of hydroge

nuclear magnetic resonance (1H NMR) at 200 MHz and to ga

chromatography coupled to mass spectrometry (CG-MS) usin

a JMS-AX 505HA (JEOL) spectrometer connected with a GC

Hewlett Packard 5890 chromatograph series II, equipped with

capillary column(25 m 20 mm i. d. 0.33mm thickness

with phenyl-methyl polysiloxane asstationary phase. e colum

was kept at 100 C for 1 min and then heated to 260 C at 10 C

per min. e injector temperature was 250 C and operated i

the way ofSplitin a 70:1relation.Masses analysiswas made b

electronic impact of 69.9 eV with ionization source at 230 C

e statistical analysis was conducted considering the absorbanc

values (570 nm) obtained in proliferation assays, as an indirec

way of quantifying the cell number of each culture. ese value

were submitted to analysis of variance with significance leve

a0.05, a0.01, and Tukey test. SAS software version 9.0 (SA

Institute Inc., USA) was employed, taking the fractions an

concentrations as extract variables.

RESULTSANDDISCUSSION

e first phase of bioassays was carried out usinraw extract, and it was observed that antiproliferativand cytotoxic activities were of dose-dependentype. Inhibition of cell proliferation was highein L-929 than in HeLa starting from intermediatdoses, recording inhibiting mean concentration(IC

50) of 1.54 and 1.82 mg mL-1, respectively

in other words, the amount of extract (inhibitinagent), needed to inhibit the biological process ocell proliferation to 50 %. Related to cytotoxic meanconcentration (CC

50) or effective maximum mean

concentration (EC50

), values of 2.22 and 2.68 mg

mL-1

for L-929 and HeLa, respectively (Figur1), and in both cases, dose-response curves werrecorded. It has been demonstrated that raw extractof species like Syzygium samarangense (Blume) andPolyalthia longifolia (Sonn.) w., are cytotoxic oncancer lines of human colon (SW-480 and SW-620with IC

50of 35mM and 6.1mg mL-1, respectively

(Simirgiotis et al., 2008; Verma et al., 2008); as welTerminalia catappa L., and Pinus massoinana Lambprevented lung (A549) and breast cancer (MCF-and HELF) proliferation in concentrations of 10and 500mg mL-1, respectively (Chu et al., 2007; Y




celular fue mayor en L-929 que en HeLa desde

dosis intermedias, registrando una concentracininhibitoria media (IC50

) de 1.54 y 1.82 mgmL-1respectivamente, es decir, cunto extracto (agenteinhibidor) fue necesario para inhibir el procesobiolgico de proliferacin celular al 50 %. Enrelacin a la concentracin citotxica media (CC

50),

o concentracin media mxima efectiva (EC50), seregistraron valores de 2.22 y 2.68 mgmL-1 paraL-929 y HeLa, respectivamente (Figura 1), y enambos caso, se registraron curvas dosis respuesta. Seha demostrado que extractos crudos de especies comoSyzygium samarangense(Blume) y Polyalthia longifolia(Sonn.) w., son citotxicas sobre lneas de cncerde colon humano (SW-480 y SW-620), con IC

50de

35mM y 6.1mgmL-1, respectivamente (Simirgiotiset al., 2008; Verma et al., 2008); tambin TerminaliacatappaL., y Pinus massoinanaLamb., inhibieron laproliferacin de cncer de pulmn (A549) y pecho(MCF-7 y HELF) en concentraciones de 100 y500 mgmL-1 respectivamente (Chu et al., 2007;Yu et al., 2008). Aun cuando las concentracionesevaluadas del extracto crudo de S. edule var.nigrumspinosumfueron mayores a las referidas, los resultadospermiten establecer en principio la potencialidaddel extracto crudo como agente antineoplsico. A

este respecto, Wu et al. (1998) demostraron que laprotena sechiumina de S. edule, inhibi la sntesisprotica en clulas HeLa y concluyeron que sta

Figura 1. Efecto del extracto alcohlico (crudo) de frutos de S. edulevar.nigrum spinosumsobre las lneas tumorales L-929 HeLa. A: efecto antiproliferativo, B: efecto citotxico. Los valores son producto de dos bioensayos con tres repeticionepor tratamiento, las lneas sobre las barras indican la desviacin estndar.

Figure 1. Effect of alcoholic extract (raw) of S. edulevar. nigrum spinosumon L-929 and HeLa tumoral lines. A: antiproliferativeffect, B: cytotoxic effect. e values are the product of two bioassays with three replications per treatment; the lineabove the bars indicate standard deviation.

120

100

80

60

40

20

00 0.047 0.23 0.47 1.18 2.37

Proliferacin(%)

L-929HeLa

Concentracin (mg m L-1)

100

80

60

40

20

00 0.23 0.47 1.18 2.37

Proliferacin(%)

L-929HeLa


A B

et al., 2008). Even though the evaluated raw extrac

concentrations of S. edulevar. nigrum spinosumwerhigher than those referred to, the results in principlallow establishing the potential of raw extract aantineoplasic agent. Regarding this, Wu et al.(1998proved that sechiumine protein of S. eduleinhibitedproteinaceous synthesis in HeLa cells and concludethat it may be used in the preparation ofimmunotoxinwith chemotherapeutic potential. Cadena-Iiguez eal.(2007b) reported antiproliferative activity of rawextracts of eight fruits of S. edulevarieties in P-38and L-929. erefore, it is expected that S. edulvar. nigrum spinosum alcoholic extract may containmetabolites, able to impede the carcinogenesiprocess, fractioning of raw extract being needed.

Based on CC50

, four main fractions were obtainedused to direct the second phase of bioassays. e firsfraction 5-7 (215 mg) was of liquid oily consistenceyellow colored, obtained from hexane-ethyl acetatsystem (9:1). e second fraction 18-20 (35.4 mgwas sticky, of coffee-brown color, from ethyl hexaneethyl acetate system (8:2); fraction 35 (18 mg) osticky consistence showed light yellow color, waobtained from ethyl acetate-methanol (9:1), andfraction 39 (24 mg) was from ethyl acetate -methanosystem (8.2). e bioassay results of antiproliferativ

activity showed dose-dependent inhibiting effecfor fractions 5-7, 18-20, and 39, on which the bioguided study was based. Fraction 35 did not presen


9/15



puede emplearse en la preparacin de inmunotoxinas

con potencial quimioteraputico. Cadena-Iiguez etal. (2007b) reportaron la actividad antiproliferativade extractos crudos de frutos de ocho variedadesde S. edule en P-388 y L-929. Por ello, se esperaque el extracto alcohlico de S. edule var. nigrumspinosum, contenga metabolitos capaces de inhibirel proceso de carcinognesis, haciendo necesario elfraccionamiento del extracto crudo.

Con base en la CC50, se obtuvieron cuatrofracciones principales con las cuales se dirigi lasegunda fase de ensayos biolgicos. La primerafraccin 5-7 (215 mg), fue de consistencia lquidaoleosa color amarillo obtenida en sistema hexano-acetato de etilo (9:1). La segunda fraccin 18-20(35.4 mg) de consistencia pegajosa, color caf marrna partir del sistema hexano-acetato de etilo (8:2), lafraccin 35 (18 mg), de consistencia pegajosa, coloramarillo claro obtenida con el sistema acetato deetilo-metanol (9:1), y la fraccin 39 (24 mg) delsistema acetato de etilo-metanol (8:2). Los resultadosde los bioensayos de la actividad antiproliferativa,mostraron un efecto inhibitorio de tipo dosisdependiente para las fracciones 5-7, 18-20 y 39, conlas cuales se sigui el estudio biodirigido. La fraccin35 no mostr actividad alguna y fue eliminada. La

fraccin 5-7 tuvo el mayor efecto antiproliferativoen ambas lneas, desde dosis intermedias (0.23y 0.47 mgmL-1) para L-929 y desde dosis bajas(0.047 mgmL-1) para HeLa, lo cual permite sugerirespecificidad sobre esta ltima. Respecto a la fraccin18-20, el mayor efecto se dio en la concentracin msalta (2.37 mgmL-1) sobre L-929 y en HeLa en dosisintermedias (0.23, 0.47 y 1.18 mgmL-1) (Figura 2).

Los valores medios de esta fraccin fueronsignificativamente diferentes en HeLa, lo quepermite sugerir mayor especificidad para la misma,segn la dosis. La fraccin 39 mostr efecto

significativo en la dosis ms alta (2.37 mgmL-

1) enambas lneas. El Cuadro 1muestra la comparacinde medias de los valores de absorbancia, indicandodiferencias significativas entre las concentraciones;sin embargo, los valores ms altos en todos los casoscorrespondieron biolgicamente a los valores demenor actividad antiproliferativa, ya que a menorabsorbancia del sobrenadante de clulas tumorales,menor proliferacin de stas.

El anlisis de varianza (ANOVA), mostrdiferencia significativa a una a=0.05 y altamentesignificativa con a=0.01 para las fuentes de

any activity and was eliminated. Fraction 5-7 had

the highest antiproliferative effect on both linefrom intermediate doses (0.23 and 0.47 mg mL-1

for L-929 and from low doses (0.047 mg mL-1) foHeLa, which suggests specificity with respect to thlatter. Regarding fraction 18-20, the greatest effecwas reached in the highest concentration (2.37 mmL-1) on L-929 and HeLa in intermediate dose(0.23, 0.47, and 1.18 mg mL-1) (Figure 2)

e mean values of this fraction were significantldifferent in HeLa, which suggests its higher specificitaccording to the dose. Fraction 39 showed considerableffect in the highest dose (2.37 mg mL-1) on bothlines. e Table 1 presents comparison of means oabsorbency values, indicating significant differenceamong the concentrations; the highest values in althe cases, however, corresponded, biologically, to thvalues of lower antiproliferative activity, since thlower the absorbency of supernatant of tumoral cellsthe lower their proliferation.

e variance analysis (ANOVA) showed significandifference toa=0.05 and highly significant differencwith respect toa=0.01 for sources of variation (linefraction and concentration) as well as for interactionline-fraction and fraction-concentration, from whicit can be deduced that the response of antiproliferativ

activity on tumoral lines is strongly affected by thfraction and its concentration.

Since fraction 5-7 was the one of highesantiproliferative effect on both lines, the studywas directed to the structural elucidation of itcomponents. e 1H MNR spectrum demonstratedthat this fraction refers to a mixture of compoundwhose structural base is the aliphatic chainSubsequent chromatographic fractioning permittedisolation and identification of the principacomponents, which were: methyl ester of 9-oxononanoic acid, methyl ester of hexadecanoic acid

ethyl ester of hexadecanoic acid, methyl ester o10-octadecenoic acid, methyl ester of octadecanoiacid, and octyl ester of octadecenoic acid (Table 2)At separating these compounds from the mixturby CG (Figure 3), these structures were confirmedthrough fragmentation pattern analysis of theirmasspectra.

e constituents of fraction 5-7 corresponded tofatty acid esters; it is known, that high concentrationof these metabolites cause cell mortality by apoptosisand when the concentrations increase, cells diby necrosis due to inhibition of DNA synthesi




variacin (lnea, fraccin y concentracin) as comopara las interacciones lnea-fraccin y fraccin-concentracin, de lo cual se desprende que larespuesta de la actividad antiproliferativa sobre laslneas tumorales, est fuertemente afectada por lafraccin y la concentracin de sta.

Figura 2.Actividad antiproliferativa de tres fracciones del extracto alcohlico (crudo) de frutos de S. edulevar.nigrum spinosumA: lnea tumoral L-929, B: lnea tumoral HeLa. Los valores son producto de dos bioensayos con tres repeticiones potratamiento. Las lneas sobre las barras indican la desviacin estndar.

Figure 2. Antiproliferative activity of three fractions of alcoholic extract (raw) of S. edulevar. nigrum spinosumfruits. A: L-92tumoral line, B: HeLa tumoral line. e values are the product of two bioassays with three replications per treatmentthe lines above the bars indicate standard deviation.

Cuadro 1. Efecto del extracto alcohlico y tres fracciones qumicas de frutos de S. edule var. nigrum spinosum, sobre lproliferacin de L-929 y HeLa. Valores promedio de densidad ptica de los cultivos expresados en absorbancia, dobioensayos con tres repeticiones por tratamiento.

Table 1. Effect of alcoholic extract and three chemical fractions of S. edulevar. nigrum spinosumfruits on proliferation of L-92and HeLa. Mean values of culture optical density expressed in absorbance, two bioassays with three replications petreatment.

Concentracin (mgmL-1)

0 0.047 0.23 0.47 1.18 2.36

L-929 Absorbancia (570 nm)

Extracto 1.02 a 1.80 ab 0.71 ab 0.56 abc 0.51 bcd 0.23 defgh5-7 0.266 cdefg 0.251 cdefgh 0.141 efgh 0.100 efgh 0.100 efgh 0.106 efgh18-20 0.101 efgh 0.081 fgh 0.070 gh 0.063 gh 0.064 gh 0.061 h39 0.325 cde 0.316 cde 0.304 cdef 0.305 cdef 0.309 cdef 0.224 defghHeLa

Extracto 1.37 a 1.16 ab 1.03 bc 0.98 bc 0.89 c 0.52 d5-7 0.309 de 0.074 gh 0.066 gh 0.077 gh 0.072 gh 0.069 gh18-20 0.108 fgh 0.079 gh 0.068 gh 0.056 h 0.055 h 0.082 gh39 0.242 ef 0.243 ef 0.190 efg 0.163 efgh 0.152 efgh 0.149e fgh

Fibrosarcoma de pulmn de ratn vRat lung fibrosarcome. Medias con distinta letra entre tratamientos por lnea tumoral son estadsticamente diferentes (Tukey, p0.05) vMeans with differenletter among treatments per tumoral line are statistical ly different (Tukey p0.05).Cncer crvico uterino humano vHuman cervical cancer.

120

100

80

60

40

20

00 0.047 0.23 0.47 1.18 2.37

Proliferacin(%)

Fr. 5-7


100

80

60

40

20

00 0.23 0.47 1.18 2.37

Proliferacin(%)


120 Fr. 5-7Fr. 18-20Fr. 39

Fr. 18-20 Fr. 39

A B

(Kharroubi et al.,2004; Benzaria et al., 2007; Takearaet al., 2007). De Lima et al. (2006) proved thathese compounds increase the loss of cell membranintegrity and DNA fragmentation in macrophagesFurthermore, they may cause mitochondriadepolarization in leukemic lines (Otton and Curi


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Dado que la fraccin 5-7 fue la de mayor efecto

antiproliferativo en ambas lneas, el estudio se dirigia la elucidacin estructural de sus componentes.El espectro 1H MNR mostr que dicha fraccinest referida a una mezcla de compuestos cuya baseestructural es la cadena aliftica. El fraccionamientocromatogrfico posterior permiti el aislamientoe identificacin de los componentes mayoritarios,los cuales fueron: esteres del tipo metlico del cido9-oxo-nonanoico, metlico del cido hexadecanoico,etlico del cido hexadecanoco, metlico del cido10-octadecenoico, metlico del cido octadecanoicoy octlico del cido octadecenoico (Cuadro 2).Estos compuestos al separarse de la mezcla por CG(Figura 3), por medio del anlisis del patrn defragmentacin de sus espectros de masas confirmarondichas estructuras.

Los constituyentes de la fraccin 5-7correspondieron a esteres de cidos grasos; se sabeque altas concentraciones de estos metabolitoscausan muerte celular por apoptosis, y cuando lasconcentraciones se incrementan, la muerte celularocurre por necrosis debido a inhibicin de sntesisde ADN (Kharroubi et al., 2004; Benzaria et al.,2007; Takeara et al., 2007). De Lima et al. (2006)

O

O O

O

O

Cuadro 2. Componentes mayoritarios de la fraccin 5-7 del extracto alcohlico de frutos de S. edule var. nigrum spinosumidentificados por cromatografa de gases y espectrometra de masas.

Table 2. Principal components of fraction 5-7 of alcoholic fruit extract of S. edule var. nigrum spinosum identified by gachromatography and mass spectrometry.

Compuesto {M}+ Frmula Rt(min) Estructura qumica

Ester metlico del cido 9-oxo-nonanoico 186 C10

H18

O3

17.49

Ester metlico del cido hexadecanoico 270 C17

H34

O2

24.82

Ester etlico del cido hexadecanoico 284 C18H36O2 25.66

Ester metlico del cido 10-octadecenoico 296 C19

H36

O2

27.01

Ester metlico del cido octadecanoico 298 C19

H38

O2

27.28

Ester octlico del cido octadecanoico 396 C26

H52

O2

33.47

Tiempo de retencin en minutos en el cromatgrafo de gases vTime retention in gas chromatograph in minutes. Peso molecular gmol-1 determinados de CG-SM vMolecular gmol-1weight of CG-SM.

O

O

OO

O

O

O

O

2005). Several authors have demonstrated that som

fatty acids, mainly unsaturated ones, are toxic fovarious human tumoral cell lines, such as prostatcancer (Pandalai et al., 1996), breast and bladde(Davies et al., 1999), lung cancer (Schonberg andSkorpen, 1997), and leukemia (Siddiqui et al., 2001Lima et al.,2002; Pompeia et al.,2002). Related tsaturate fatty acids, toxicity for tumoral cells has beenreported (Ostrander et a.,2001; Mu et al., 2001; DSousa Andrade et al., 2005). Ohashi et al. (2003demonstrated that C18 fatty acids at 10 mg mL-

concentration inhibited cell proliferation by 99.4 %of rat lung cancer cell lines. Recently, Yoo et al.(2007recorded that palmitic (Z)-9-octadecenoic andoctadecenoic fatty acids have apoptotic propertiein colon tumoral lines, due to damage in DNA andcaspasa-3 activation.

Conventionally, antineoplasic activity of mancucurbitaceae has been attributed to the presence ocucurbitacins (Dantas et al.,2006; Cadena-Iiguez eal.,2007b; Li et al., 2007; Chen et al.,2008; Wanet al., 2008). However, with the results of the presenstudy it is proved that also the esters of saturatfatty acids of S. edule fruits have suchactivity; thiextends the range of sources of chemical principle




demostraron que dichos compuestos incrementanla prdida de integridad de la membrana celular yla fragmentacin de ADN en macrfagos. Adems,pueden causar despolarizacin mitocondrial enlneas leucmicas (Otton y Curi, 2005). Diversos

autores han comprobado que algunos cidos grasos,principalmente los insaturados, son txicos paravarias lneas celulares tumorales humanas comocncer de prstata (Pandalai et al., 1996), pecho yvejiga (Davies et al., 1999), pulmn (Schonberg ySkorpen, 1997) y leucemia (Siddiqui et al., 2001;Lima et al., 2002; Pompeia et al., 2002). Conrelacin a los cidos grasos saturados, se ha reportadotoxicidad para clulas tumorales (Ostrander et al.,2001; Mu et al., 2001; De Sousa Andrade et al.,2005). Ohashi et al. (2003) demostraron que loscidos grasos C18 a una concentracin de 10 gmL-1inhibieron la proliferacin celular en un 99.4 % delneas celulares cancergenas de rata. RecientementeYoo et al. (2007), registraron que los cidos grasospalmtico (Z)-9-octadecenoico y octadecenoicotienen propiedades apoptticas en lneas tumoralesde colon debido a dao en el AND y activacin dela caspasa-3.

De manera convencional la actividadantineoplsica de muchas cucurbitceas, ha sidoatribuida a la presencia de cucurbitacinas (Dantas etal., 2006; Cadena-Iiguez et al., 2007b; Li et al., 2007;Chen et al., 2008; Wang et al., 2008). Sin embargo,

Figura 3.Cromatograma de gases dla fraccin 5-7 del extracto alcohlicde frutos de S. edule var. nigrumspinosum: Ester (1) metlico del cid9-oxo-nonanoico (2) metlico decido hexadecanoico (3) etlico decido hexadecanoico (4) metlico decido 10-octadecenoico (5) metlicdel cido octadecanoico (6) octlicdel cido octadecanoico.Figure 3. Gas chromatogram ofraction 5-7 of alcoholic fruit extracof S. edulevar. nigrum spinosum: (1methyl ester of 9-oxo nonanoic aci(2) methyl ester of hexadecanoic aci(3) ethyl ester of hexadecanoic aci(4) methyl ester of 10-octadecenoiacid (5)methyl ester of octadecanoiacid (6) octyl ester of octadecanoiacid.

150 000 000

140 000 000130 000 000

120 000 000

110 000 000

100 000 000

90 000 000

80 000 000

70 000 000

60 000 000

50 000 000

40 000 000

30 000 000

20 000 00010 000 000

TICScan

Min.

1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400

153

168

608

16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

2600

1

2

3

4 5

6

for their potential use as antineoplasic agentswhich in principle allow suggesting new researchlines. It is important to point out that Mxico ithe second exporter of chayote worldwide, and thanigrum spinosum is the second variety in economi

importance as high-valley crop within the MiddlAmerican zone of Mxico (Cadena et al., 2001Bancomext, 2004). Chayote being an importanfood resource in rural zones, under backyardconditions, and considering the promising resultdescribed in previous paragraphs, its re-valuationas a functional food with higher benefits than thstrictly nutritious ones, may be suggested. Eventhough in the present study there is no referencto the continuance of antiproliferative activity aftecooking the fruits, which is the common way of theiintake (Lira-Saade, 1996), recent laboratory result(unpublished) indicate that the metabolites involvedin these properties do not lose their antiproliferativand cytotoxic effectiveness in vitro.

CONCLUSIONS

e alcoholic extract of Sechium edulefruits varnigrum spinosum presented antiproliferative andcytotoxicactivity of dose-dependent type on L-929and HeLa cell lines, showing greater specificity fothe latter in high doses. ree of the four mainfractions of the extract had antiproliferative activit


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con los resultados del presente estudio se demuestra

que tambin los esteres de cidos grasos saturados defrutos de S. edule, tienen dicha actividad; estoamplala gama de fuentes de principios qumicos para supotencial uso como agentes antineoplsicos, loscuales en principio permiten sugerir nuevas lneas deinvestigacin. Es relevante apuntar que Mxico es elsegundo exportador mundial de chayote y que nigrumspinosum es la segunda variedad en importanciaeconmica como cultivo en zonas de valles altosdentro de la zona Mesoamericana de Mxico(Cadena et al., 2001; Bancomext, 2004), lo cualaunado a que es un recurso alimentario importanteen reas rurales bajo condiciones de traspatio y alos resultados prometedores descritos en prrafosanteriores, se puede sugerir su revalorizacin comoun alimento funcional con mayores beneficios que elestrictamente nutritivo. Aun cuando en el presentetrabajo no se hace referencia a la permanencia de laactividad antiproliferativa despus de la coccin delos frutos, que es la forma comn de su ingesta (Lira-Saade, 1996), resultados recientes de laboratorio (nopublicados) indican que los metabolitos involucradosen estas propiedades, no pierden su efectividadantiproliferativa y citotxica in vitro.

CONCLUSIONES

El extracto alcohlico de frutos de Sechiumedule var. nigrum spinosum, present actividadantiproliferativa y citotxica de tipo dosisdependiente sobre las lneas celulares L-929 y HeLa,mostrando mayor especificidad para sta ltima endosis altas. De las cuatro fracciones principales delextracto, tres mostraron actividad antiproliferativaen ambas lneas, siendo la 5-7 la de mayor actividady especificidad sobre HeLa desde dosis bajas.Los componentes qumicos de la fraccin 5-7

correspondieron al grupo de esteres de cidos grasossaturados. Estadsticamente, cinco de siete fuentesde variacin involucradas en el presente estudiofueron altamente significativas, atribuible a que larespuesta de la actividad inhibitoria sobre las lneastumorales est fuertemente influida por la fraccinqumica y la concentracin de sta. El contenidode cidos grasos saturados en los frutos comestiblesde S. edule var. nigrum spinosum, ampla la gamade metabolitos y fuentes de especies vegetales conactividad antineoplsica y su revalorizacin como unalimento funcional.

in both lines, 5-7 presenting the highest activity an

specificity on HeLa from low doses. e chemicacomponents of fraction 5-7 corresponded to thgroup of saturate fatty acid esters. Statistically, fivof seven sources of variation involved in the presenstudy were highly significant, attributable to the facthat the response of inhibiting activity on tumoralines is strongly influenced by the chemical fractionand its concentration. e content of saturate fattyacids in edible fruits of S. edule var. nigrum spinosumextends the range of metabolites and sources ovegetal species with antineoplasic activity and itrevaluation as functional food.

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