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Estudio del posible poder beneficioso

del yogur pasteurizado

Informe Final

18-01-2007

Rev. 00

Estudio del posible poder beneficioso del yogur pasteurizado Asociación para la investigación microbiológica (APIMC)

15 de Julio de 2006 Página 2 de 25

Ya en 1900, el inmunólogo Ilya Metchnikoff, centró sus estudios en demostrar que el

consumo de yogur era el responsable de la longevidad de los búlgaros. El interés que estos compuestos despertaron por su posible poder beneficioso se perdió con la aparición de los antibióticos. Sin embargo, ha sido la utilización de potentes antibióticos con su acción colateral sobre la flora saprofita intestinal, la que ha revitalizado el interés inicial que estos derivados de la leche suscitaron a comienzos del siglo XX. (1).

Hacia los años 70 se volvió sobre esta idea y se estudió el posible efecto beneficioso tanto de las sustancias prebióticas, ingredientes no digeribles que afectan beneficiosamente al huésped por una estimulación selectiva del crecimiento de un limitado grupo de bacterias del colon (2) como de los probióticos, microorganismos vivos, que usados en forma de suplementos nutricionales se considera que ejercen un efecto positivo en la salud, más allá de los efectos nutricionales clásicos (1).

El derivado lácteo más consumido entre la población es el yogur, del que existen en

el mercado dos preparaciones diferentes: el clásico con bacterias vivas, cuyos efectos beneficiosos teóricamente se derivarían por una parte de la acción de dichas bacterias ácido lácticas (Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophylus) sobre la leche al transformarla en yogur (producción de lactasa y generación de ácido láctico principalmente) y por otra a la posible acción beneficiosa que producen estas bacterias vivas al establecerse en la flora intestinal. En el otro tipo de yogur, pasteurizado tras la fermentación, sus efectos beneficiosos teóricamente se derivarían de forma exclusiva de la ingestión de los productos de fermentación de las bacterias sobre la leche.

Por último son muchos los efectos que se han atribuido al consumo de yogur en

general debido a la conexión nutricional con el sistema inmune (3).

Teniendo en cuenta todo lo anterior y con objeto de determinar si los efectos beneficiosos del yogur son dependientes de la viabilidad de las bacterias lácticas y por tanto, exclusivos de los yogures frescos o bien se deben sólo a la transformación bioquímica de la leche por las bacterias, en cuyo caso ambos tipos de preparados tendrían la misma acción, hemos planteado el siguiente estudio: evaluar en una población de individuos sanos, si tras el consumo de yogur fresco comparativamente con la ingestión de yogur pasteurizado, se producen diferencias en cuanto a:



1.- Intolerancia a la lactosa. Las posibles diferencias en la prueba de intolerancia a la lactosa podrían relacionarse con el consumo de yogures frescos por la capacidad de S. thermophylus de producir lactasa.

2.- Confort gastrointestinal. Si se producen diferencias entre el bienestar gastrointestinal de los consumidores de las dos presentaciones de yogur, podrían ser evidenciadas mediante una encuesta de satisfacción gastrointestinal. 3.- Parámetros del sistema inmunitario. Si el consumo de yogures frescos en comparación con el consumo de pasteurizados, produjera una variación de los parámetros estudiados para evaluar la inmunidad general, esta podría ser evidenciada en el laboratorio mediante la cuantificación de anticuerpos (inmunoglobulinas), así como el número de leucocitos, neutrófilos, linfocitos, y por las subpoblaciones linfocitarias de células T, CD3, CD4 y CD8.

4.- Variaciones en la flora intestinal. Si las bacterias ácido lácticas propias del yogur (Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophylus) fueran capaces de sobrevivir y establecerse en el intestino, éstas deberían ser detectadas en las heces de los voluntarios tras ingerir yogur fresco durante un periodo en este ensayo.

DESCRIPCION DEL ENSAYO Se realizó un ensayo ciego y controlado sobre una población de individuos sanos, que no declararon sufrir molestias intestinales en las encuestas realizadas ni presentaron alteraciones de los parámetros bioquímicos estudiados al inicio del ensayo. La muestra poblacional estuvo formada por 80 voluntarios previamente informados del ensayo e instruidos en cuanto a las pautas a seguir para las determinaciones de los parámetros de estudio y en cuanto al seguimiento de una dieta con ausencia de lácteos fermentados antes de comenzar el ensayo y durante los períodos de descanso. Los ochenta participantes fueron distribuidos en tres grupos: dos grupos de treinta voluntarios cada uno que se someterían a un ensayo cruzado alimentándose con tres yogures diarios del tipo frescos o pasteurizados y un tercer grupo control formado por veinte voluntarios que no consumieron yogures.



Durante 30 días el grupo 1, en adelante F-P, consumió 3 yogures frescos (F) al día, descansó por un periodo de 15 días (tiempo de lavado) y de nuevo durante 30 días consumió 3 yogures pasteurizados (P) diarios. Grupo 1: (F-P)

Ingesta de yogures frescos (F) descanso ingesta de yogures pasteurizados (P)

Día 0 día 30 día 45 día 75

En paralelo, el grupo 2 (P-F) inició el ensayo ingiriendo yogures pasteurizados (P) durante treinta días y posteriormente yogures frescos (F) durante otros treinta tras un periodo de descanso de quince días.

Grupo 2: (P-F)

Yogures pasteurizados (P) descanso ingesta de yogures frescos (F)

Día 0 día 30 día 45 día 75

El grupo control no consumió ningún tipo de yogures durante los setenta y cinco días que duró el ensayo.

El Grupo Leche Pascual suministraba los dos tipos de yogures utilizando envases idénticos salvo un código impreso como M1Y que identificaba a los yogures frescos (que denominaremos F) o B3P que identificaba a los yogures pasteurizado (que denominaremos P). Los voluntarios no conocieron la clase de yogur que consumían. Todos los envases se mantuvieron en frío a lo largo del estudio para evitar desenmascarar el ensayo. Sistemáticamente y en cada lote de yogures se comprobaba la carga bacteriana. El número aproximado de Lactobacillus y Streptococcus en los yogures frescos era de 107 UFC/g de



yogur de cada uno de los dos tipos de bacterias, lo que hace un total de 1250 millones de bacterias de cada especie en cada yogur fresco. Igualmente se comprobaba que no se detectaban bacterias vivas en los yogures pasteurizados.

Parámetros estudiados:

• Intolerancia a la lactosa (IL) detectada por la prueba de malabsorción de la lactosa.

• Confort gastrointestinal (CG) mediante un cuestionario.

• Parámetros inmunológicos (I) mediante el estudio de inmunoglobulinas y celularidad.

• Presencia de bacterias del yogur (L. bulgaricus y S. thermophylus) y de su ADN en las heces (BH).

Tabla 1 Determinaciones realizadas en los diferentes grupos a lo largo del estudio.

El primero y el último día del estudio, a todos los participantes (Grupos 1, 2 y control) se les realizó una encuesta para valorar el grado de confort gastrointestinal, la prueba de malabsorción de lactosa y un análisis bioquímico de sangre y microbiológico de heces para conocer su estado inicial y final. Al finalizar el primer periodo de tratamiento, el día 30, a los voluntarios de los grupos 1 (F-P) y 2 (P-F) se les repitieron las determinaciones bioquímicas y microbiológicas, se les encuestó de nuevo para conocer el confort gastrointestinal y solo a aquellos que mostraron indicios de malabsorción el primer día del estudio se les repitió la prueba de de intolerancia a la lactosa (IL*). Los voluntarios de los grupos 1 y 2, permanecieron 15 días sin ingerir yogures ni otros lácteos y al finalizar dicho periodo de lavado se les repitieron los análisis anteriormente mencionados.

Día 1 Día 30 Día 31 al día 45

Día 46 Día 75

Grupo 1 (F-P)

IL, CG, I, BH

IL*, CG, I, BH

IL*, CG, I, BH

IL, CG, I, BH

Grupo 2 (P-F)

IL, CG, I, BH

IL*, CG, I, BH

IL*, CG, I, BH IL, CG,

I, BH

Grupo Control

IL, CG, I, BH

--

Periodo de lavado de 15 días

IL, CG, I, BH



Metodología

Intolerancia a la lactosa.

Se utilizó una prueba de aliento, análisis sencillo y no invasivo que permite cuantificar

la cantidad de hidrógeno en el aire espirado tras la ingestión de lactosa. Se midió con un equipo Bedfon EC60 Gastrolyzer, Breath H2 Monitor.

A todos los voluntarios en ayunas, fuera del periodo de sueño y sin haber fumado ni

realizado ejercicios bruscos se les determina la prueba basal de hidrógeno espirado. Posteriormente se les administra un preparado con 25 gramos de lactosa disuelto en agua y tras la ingesta se les realizan mediciones cada 30 minutos durante tres horas. El ensayo se consideró positivo cuando se obtuvieron incrementos superiores a 20 ppm de H2 espirado con relación al resultado basal. La prueba fue repetida a todos los participantes el último día (día 75). Aquellos individuos que presentaron indicios de intolerancia a la lactosa fueron sometidos de nuevo a la prueba los periodos intermedios (días 30 y 46).

Confort gastrointestinal.

Mediante un cuestionario compuesto por diez preguntas que admite una puntuación 1 al 5 cada una de ellas (anexo 1, página 25), se evaluó el bienestar gastrointestinal de los participantes. La puntuación más alta corresponde al mayor bienestar gastrointestinal.

Parámetros del sistema inmunitario.

Se cuantificaron los parámetros inmunológicos de todos los voluntarios en ayunas

mediante la determinación de IgA, IgG, IgM, leucocitos, neutrófilos, linfocitos totales, linfocitos CD3+, CD4+ y CD8 .

Las inmunoglobulinas (IgG, IgA, e IgM) fueron determinadas por una técnica de

nefelometría, que mide la velocidad de incremento de la dispersión de la luz producida por las partículas suspendidas en la solución, resultante de los complejos formados durante una reacción antígeno-anticuerpo. El nefelómetro utilizado fue un Beckman Coulter Immage (Immunochemistry system).

Los leucocitos (linfocitos y neutrofilos) fueron cuantificados por un contador

hematimétrico (Coulter). Las subpoblaciones linfocitarias fueron evaluadas por citometría de flujo (FacScalibur, Becton Dickinson), utilizando anticuerpos frente a CD3, CD4 y CD8 marcados con diferentes fluoróforos (FITC, PE, PerCP, APC), en sangre total y lisando los hematíes al tiempo que se fijan los anticuerpos. Las células se lavan con solución salina



tamponada del citómetro (FACS Flow) y se analizaron los porcentajes de subpoblaciones linfocitarias.

Presencia de bacterias vivas del yogur en las heces.

Métodos microbiológicos tradicionales.

Se procesaron en total 280 muestras de heces (120 de cada uno de los grupos estudiados y 40 del grupo control). A los participantes de los grupos 1 y 2 se les tomaron muestras los días 1 (comienzo del estudio) 30, tras la finalización de la primera toma de yogures, 46, tras el periodo de lavado y 75, tras el segundo periodo de ingesta de yogures. Al grupo control solo se le tomaron muestras al comienzo del estudio (día 1) y al final del mismo (día 75), tabla 2. La pérdida de muestras fue de 4 en cada uno de los grupos 1 y 2 y de 3 en el grupo control.

Día1 Día 30 Día 46 Día 75 Total

Grupo1 (F-P)

Toma heces (30muestras)

Toma heces (30 muestras)



120

Grupo 2 (P-F)





120

Grupo control Toma heces (20 muestras)


40

280

Tabla 2. Esquema de recogida de heces

Antes de comenzar el estudio, se determinó el límite de detección de la técnica de

cultivo a utilizar añadiendo concentraciones conocidas de S. thermophilus y de L. delbrueckii . Para cada una de las bacterias por separado se procedió de la siguiente forma: a 500 µl de una suspensión de heces de personas sanas se le añadió 500 µl de un inóculo con 106 ufc/ml. A partir de ella se realizaron diluciones seriadas en base diez hasta llegar a la dilución menor que permitía el recuento en placa. El límite de detección estimado fue 102 ufc/ml (100 bacterias/placa en la dilución 10-2).



Las heces, recogidas en frascos estériles, se procesaron de la siguiente forma: 1 gramo de muestra se suspende en 10ml de solución salina y, tras obtener una suspensión completa, se centrifuga a baja velocidad durante 4-5 minutos después de lo cual, se toman 100µl del sobrenadante y se realizan diluciones seriadas en base diez hasta la dilución 10-5

cultivándose 100µl de cada una de las diluciones 10-3, 10-4 y 10-5 en los medios MRS y M17

(4, 5). El primero, para el aislamiento de lactobacillus, fue incubado en anaerobiosis 48-72 horas y el segundo, para el aislamiento de estreptococos, se incubó el mismo tiempo en

aerobiosis. Las muestras que no mostraron crecimiento a la mayor concentración (10-3), se

estudiaron también en concentraciones superiores (diluciones de 10-2 y 10-1)

Se procedió de la siguiente forma con los cultivos bacterianos: MRS: se realizaron tinciones de gram a cada una de las colonias aisladas que

presentaban morfología diferente. Los bacilos gram positivos (BGP) se sembraron en el medio LAMVAB para diferenciar los lactobacillus por su resistencia a vancomicina y su acidofilia (4,5). Posteriormente, para la determinación de la especie, se estudió su utilización de azúcares mediante el sistema api 50 CH siguiendo normas del FIL. (8) M17: se procedió de la misma forma y a toda colonia con morfología de estreptococo

(coco gram positivo en cadenas) se le realizo una identificación bioquímica siguiendo normas del FIL (8).Todos los estreptococos que cumplían los criterios de S. thermophylus por ese método se identificaron posteriormente mediante el sistema api20 Strept.

Métodos microbiológicos moleculares.

Para el análisis molecular del ADN extraído de las heces, se tomaron 0.5 g de heces frescas de cada voluntario siendo resuspendidas en solución salina y centrifugadas a baja velocidad. Se tomaron 200 µl de la fase superior que fueron procesados utilizando el kit para extracción de ADN de heces QIAamp de QiaGen. Cantidades idénticas de todas las muestras se transfirieron a membranas de Nylon Hybond N+ para ser hidridadas con sondas específicas que permitan la detección de L. delbrueckii y S. thermophilus. Como sondas se utilizaron fragmentos de PCR marcados con digoxigenina. Para la detección de L. delbrueckii y S. thermophilus se usó un fragmento de 715 pb del gen add y un fragmento de 968 pb del gen lacZ respectivamente. La amplificación y el marcaje de las sondas se realizó con los primers y las condiciones de PCR descritas:



Primers y condiciones de PCR para L. delbrueckii: F: 5´-AATTCCGTCAACTCCTCATC-3´ R: 5´-TGATCCGCTGCTTCATTTCA-3´

10 CICLOS: 20 s a94º C, 75 s a 65º C y 40 s a 72º C 35 CICLOS: 20 s a 94º C, 50 s a 55º C y 30 s a 72º C ELONGACIÓN FINAL: 3 min a 72º C Primers y condiciones de PCR para S. thermophilus: F: 5´-CACTATGCTCAGAATACA - 3´ R: 5´ -CGAACAGCATTGATGTTA – 3´ 35 CICLOS: 20 s a 94º C, 60 s a 58ºC y 30 s a 72º C ELONGACIÓN FINAL: 3 min a 72º C

En las membranas de hibridación se incluyeron controles positivos ADN extraído bien de cultivos puros de ambas bacterias, directamente de yogur, de mezclas de bacterias/heces y de yogur/heces.

Para la hibridación se utilizó el kit de Roche Dig Easy. Las condiciones de hibridación fueron de alta estringencia para evitar aparición de falsos positivos. Se realizaron dos lavados de 5 minutos con 2x SSC y 0.1% SDS a temperatura ambiente y dos lavados de 15 minutos con 0.5x SSC y 0.1% SDS a 68º C. La detección de la hibridación se realizó usando anticuerpos anti-digoxigenina y el sustrato quimioluminiscente CSPD ambos de la casa comercial Roche. Con objeto de evitar el arrastre de señales positivas obtenidas cuando se realizan hibridaciones consecutivas sobre la misma membrana, se utilizaron membranas independientes para S. thermophilus y L. bulgaricus.



Análisis estadístico.

Para conocer cómo se afectan los parámetros utilizados correspondientes a las muestras de los distintos grupos en los días 0, 30, 45 y 75, se utilizó el ANOVA de un factor. Este procedimiento es una extensión de la prueba t de Student para dos muestras (paramétrica). Para poder utilizar el Anova de un factor se requiere normalidad en los datos de la muestra (que se contrasta mediante Shapiro-Wilks) e igualdad de varianzas (que se comprueba mediante el test de Levene). La comparación de muestras sin normalidad en los datos se realizó aplicando el test de Kruskall-Wallis.

Para comparar sólo dos muestras cuyos datos cumplen la normalidad, se utilizó la t de

Student. En el caso de que las dos muestras comparadas no cumplieran la hipótesis de normalidad se recurrió a una prueba no paramétrica; la U de Mann-Whitney.



RESULTADOS

Intolerancia a la lactosa

La ingesta continuada de ambos tipos de yogures F y P no provocó en ninguno de los voluntarios un efecto de malabsorción de lactosa.

No hubo diferencias significativas entre los resultados obtenidos en los grupos de

voluntarios F-P, P-F tanto cuando se realizaron en condiciones basales como tras el consumo de yogures, con independencia del tipo de yogur ingerido. Tampoco se apreciaron diferencias al compararse éstos con el grupo control.

Nº de individuos con

incrementos de H2 > 20ppm Día 1 Día 30 Día 46

Día 75

Grupo 1 (F-P)

1 1 1

1

Grupo 2 (P-F)

0 0 0

0

Grupo control

2 - -

2

Sólo tres voluntarios participantes en el estudio presentaron síntomas de malabsorción de lactosa, uno de ellos perteneciente al grupo 1 y dos del grupo control. El único voluntario identificado como malabsorbedor de lactosa, incluido en el grupo de consumidores de yogures, no mostró variaciones de los resultados a lo largo del estudio ni manifestó molestias intestinales según se desprende de su encuesta de confort gastrointestinal.

Confort gastrointestinal.

No se detectaron variaciones en el bienestar gastrointestinal de los voluntarios

después de la ingestión de yogures con independencia del tipo de yogur consumido. Tampoco se encontraron diferencias al compararse con el grupo control (tablas 3-5).

Un primer análisis de ésta variable solo mostró diferencias entre las muestras tomadas el día 46 y 75 del Grupo 2 (P-F). Analizadas las comparaciones múltiples en este grupo se



concluyó que los niveles de confort gastrointestinal no variaban significativamente en relación al tipo de yogur ingerido (el nivel de significación siempre fue mayor de 0.05).

Tabla 3. Análisis de los datos del Grupo de Control.

Tabla 4. Análisis de los datos del Grupo 1 (F-P).

Tabla 5. Análisis de los datos del Grupo 2 (P-F).



Parámetros del sistema inmunitario.

Los parámetros inmunológicos valorados no registraron variaciones tras el consumo de yogures frescos o pasteurizados en ninguno de los dos grupos.

Los resultados de los análisis estadísticos de los datos de IgA, IgG, IgM, CD3, CD4 CD8,

Leucocitos, neutrófilos y linfocitos de los grupos control, 1 y 2 se muestran en las tablas 6-12.

No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las muestras de los días 0,

30, 46 y 75 para ninguna de las variables inmunológicas ni dentro de cada grupo ni cuando

se comparaban entre ellos (Grupo1 F-P Vs Grupo 2 P-F ).

Tabla 6. Grupo de Control. Análisis de los datos de CD3, CD4, IgG, Leucocitos,

Segmentados.



Tabla 7. Grupo de Control. Análisis de los datos de IgA, IgM, CD8 y linfocitos.

Test de Tukey

IgM CD3 CD4 CD8 Leucocitos IgG Mentados Linfocitos

0,867 0,703 0,954 0,951 0,933 0,849 0,886 0,648

Tabla 8. Grupo 1 (F-P). Análisis de los datos de, IgM, CD3, CD4, CD8, Leucocitos, IgG,

Segmentados y linfocitos.

Tabla 9. Grupo 1 (F-P). Análisis de los datos IgA



Tabla 10. Grupo 2 (P-F). Análisis de los datos de de CD3, IgA, IgG, IgM, Leucocitos,

Segmentados y linfocitos.

Tabla 11. Grupo 2 (P-F). Análisis de los datos de CD4 y CD8

Presencia de bacterias del yogur en las heces.

Métodos microbiológicos tradicionales.

MRS. Se utilizó este medio para el aislamiento de lactobacillus por dos motivos: por

una parte, siguiendo normas del FIL y por otra basados en un estudio de Hartemink y cols (6) en el que evalúan tres diferentes medios de cultivo selectivos utilizados con esta finalidad, MRS, Rogosa y LAMVAB, demostrando que el medio MRS permitía el aislamiento de un mayor número de lactobacillus que los otros dos. Sin embargo, también detectaban que su selectividad era menor que la de los otros dos medios pues crecían otros bacilos gram positivos no lactobacillus, levaduras y estreptococos. Al ser el medio LAMVAB altamente selectivo para lactobacillus, según sus autores, lo utilizamos en un segundo tiempo para diferenciar este género dentro de los BGP.

La selectividad de este medio se basa en dos hechos: por una parte, su concentración

en vancomicina que inhibe la mayoría de la flora gram positiva ( tanto cocos como bacilos) y a la que los lactobacillus aislados del tracto intestinal humano son intrínsecamente resistentes (7), y por otra, su pH ácido que inhibe el crecimiento de la mayoría de los bacilos gram negativos tanto aerobios como anaerobios y en el que estas bacterias son capaces de crecer dando lugar a la formación de colonias verdes o azuladas, debido a la captación del verde bromocresol del medio.

En las 280 muestras estudiadas se aislaron un total de 222 bacilos gram positivos

(BGP) en el medio MRS, de los cuales 111 se identificaron como lactobacillus por su crecimiento en LAMVAB. También evidenciamos la escasa selectividad del medio MRS pues



permitió en nuestro estudio el crecimiento además de otros BGP no lactobacillus, la de estreptococos y levaduras. Sin embargo, al inhibir el crecimiento de enterobacterias y bacteroides, la disminución del número total de bacterias, facilita el recuento y la individualización de las mismas.

Al final de los cuatro periodos de ingesta de yogures se observó un incremento de

BGP y lactobacillus spp tanto en el grupo 1 como en el grupo 2. El grupo control que no ingirió ningún tipo de yogures, no mostró variaciones. En la tabla se expresa el número de lactobacillus spp aislados en relación al número de personas en las que se aísla (tabla 12).

Comparando en ambos grupos de voluntarios las variaciones en el número de

lactobacillus aislados y el número de personas en las que se aislaron, se observa que no hay diferencia en el aumento registrado durante los respectivos periodos de ingesta de uno u otro tipo de yogur (días 1-30 del grupo 1 versus días 46 -75 del grupo 2 y viceversa). Sí se observa un incremento final en ambos grupos de voluntarios, mientras que el grupo control permanece igual.

Lactobacillus/ nº personas

Día 1 Día 30 Día 46

Día 75 Total

Grupo 1 (F-P)

7/6 19/8 6/5

26/19 58/38

Grupo 2 (P-F)

6/5 11/6 6/5

19/9 42/25

Grupo control

5/5 - -

6/5 11/10

Total Lactobacillus/ nº personas 111/73

Tabla 12. Aislamiento de Lactobacillus/ número de personas en los grupos estudiados



Se identificaron trece especies diferentes de lactobacillus mediante la galería de identificación api 50HC leído automáticamente mediante el programa de ordenador APILAB (bio-Merieux, France) aceptando una concordancia igual o superior al 90%, siendo L. rhamnosus el más frecuente, seguido de L. acidophilus (tabla 13). Esto concuerda con lo encontrado por otros autores (9).

Especies de lactobacillus y nº de aislamientos

L. rhamnosus 26

L. acidophilus 22

L. paracasei 18

L. brevis 14

L. plantarum 10

L. pentosum 5

L. fermentum 2

L. salivarius 5

L. bulgaricus 2

L. curvatus 2

L. lactis 2

L. collinoides 2

L. buchneri 1

Tabla 13. Frecuencia de las especies de Lactobacillus encontradas.



Tabla 14. Evolución de las especies de Lactobacillus en tres voluntarios de cada grupo de

ingesta a lo largo del tiempo.

L. delbrueckii spp. bulgaricus se aisló solo en dos voluntarios correspondiendo cada uno a uno de los grupos 1 y 2. En ambos casos se aisló en una sola muestra por persona:

• 1 caso en la cuarta muestra del grupo 1 (45 días después de terminar la ingesta de yogures frescos) ,

• 1 caso en la cuarta muestra del grupo 2 (al terminar el periodo de ingesta de yogures frescos).

• Ningún caso en el grupo control. Las distintas especies bacterianas se aislaron de manera aleatoria en las diferentes muestras de los voluntarios estudiados encontrando una gran variación entre especies y personas en las que se aisla cada una de ellas, incluso en una misma persona a lo largo del tiempo (10). En la tabla 14 se expone la evolución a lo largo del periodo estudiado de tres voluntarios pertenecientes al grupo 1 (F/P) y otros tres del grupo 2 (P/F).

voluntario Día 1 Día 30 Día 46 Día 75

1 voluntario (F-P)

negativa L.plantarum

L.pentosus

L.rhamnosus

L.collinoides

negativa L. pentosus

1 voluntario (F-P)

negativa L.paracasei

L.rhamnosus

L.salivarius

L.pentosus

L.buchneri

negativa L.paracasei

GRUPO 1 (F-P)

1 voluntario (F-P)

L.rhamnosus negativa L.rhamnosus L.rhamnosus

L.bulgaricus

1 voluntario (P-F)

negativa negativa L.rhamnosus L.plantarum

L.brevis

1 voluntario (P-F)

L.acidophilus negativa negativa L.rhamnosus

GRUPO 2 (P-F)

1 voluntario (P-F)

negativa L.paracasei negativa L.bulgaricus



Estreptococos (Cocos gram positivos) Se cultivaron un total de 296 aislamientos de

estreptococos. Veintitrés de ellos cumplían los requisitos FIL para ser identificados como S. thermophylus. Ante la posibilidad de que en las heces humanas se encuentren algunas especies de estreptococos que sin ser S.thermophylus den las mismas reacciones bioquímicas en las pruebas preliminares, se llevó a cabo una identificación más exhaustiva de estos 23 estreptococos realizando una determinación de fermentación de azúcares mediante una galería api 20 Strept. Ninguno se identificó como S. thermophylus. La mayoría de ellos pertenecía al grupo D. En la tabla 15 se expresa la escasa variación en el número de estreptococos aislados a lo largo del estudio en los diferentes grupos.

Estreptococos Día 1 Día 30 Día 45

Día 75 Total

Grupo 1 (F-P)

39 33 36 32 104

Grupo 2 (P-F)

35 25 27 30 97

Grupo control

31 - -

28 59

Total 296

Tabla 15.- Estreptococos aislados en los diferentes grupos y tomas

Métodos microbiológicos moleculares.

Se procedió a la extracción de ADN de heces de todos los voluntarios del ensayo. En total se han procesaron 280 muestras. La calidad y cantidad de todos los ADNs ha sido evaluada mediante electroforesis, permitiendo hacer una estimación adecuada del estado del ADN, de su integridad y tamaño antes de proceder a la hibridación.

En paralelo fue purificado ADN tanto de los yogures (fresco y pasteurizado) como de

las cepas tipo de L. bulgaricus y S. thermophilus. Estos últimos ADNs fueron igualmente evaluados y utilizados como molde para la obtención de sondas. Para la preparación de las sondas se utilizaron los cebadores y ciclos de amplificación por PCR descritos anteriormente.



Se valoraron dos sistemas de revelado de la hibridación con objeto de utilizar el método más sensible; precipitación de sustrato y quimioluminiscencia. Tras experimentos preliminares se escogió el segundo método.

De igual modo se realizaron experimentos preliminares de hibridación aplicando

distintas cantidades de ADN con objeto de estimar la cantidad que se podía aplicar en las membranas sin que resultase saturante y evitando así la aparición de falsos positivos.

Del total de 280 muestras se obtuvieron 9 muestras de heces con hibridación positivas

para L. bulgaricus y 1 para S. thermophilus. Una muestra resultó positiva para ambas cepas. Las señales positivas correspondieron sólo a heces de individuos del grupo 1 tanto al concluir el periodo de consumo de yogur fresco (día 30) como tras el periodo de lavado (día 45), siendo en todos ellos negativas en el control del día 75. Las señales se detectaron de manera aleatoria en las diferentes muestras estudiadas. No hubo señales positivas en ninguna de las muestras de heces de individuos de los grupos 2 y control (Figura 1). Los datos obtenidos apoyan estudios previos que indican la escasa capacidad de las bacterias del yogur para sobrevivir al tránsito gástrico y colonizar el intestino.

Se detecta ADN compatible con bacterias lácticas en un porcentaje bajo de la

población estudiada (12.5%), valores ligeramente superiores a los obtenidos en otro estudio (11) tras 15 días de ingesta (10.5%). Este incremento no es lo suficientemente significativo para apoyar o al menos indicar presencia mantenida de las bacterias lácticas en el colon de los individuos estudiados.

Comparando los resultados obtenidos con técnicas moleculares y con métodos de cultivo, se observa que no existe correlación entre el aislamiento de bacterias L. bulgaricus o S. thermophylus y la detección de su ADN. Esto pone de manifiesto que esta técnica molecular solo permite la detección de los ADNs dichas bacterias, no pudiendo ser interpretados sus resultados como viabilidad celular o establecimiento de estos microorganismos en el colon.



Figura 1. Detección de ADN de bacterias lácticas mediante hibridación

P: Pasterurizado, F: Fresco, L/H: L. bulgaricus/heces, L: L. bulgaricus, S/H: S. thermophilus/heces, S: S. thermophilus,

C: Control, M1: Muestra día 0, M2: muestra día 30; M3: Muestra día 45; M4: muestra día 75.

Grupo 2

Grupo 1

Grupo

Control

Detección ADN Lactobacillus Detección ADN Streptococcus

M4 M4



CONCLUSIONES

La ingesta continuada de tres yogures diarios frescos (F) y pasteurizados (P) no provocó en ninguno de los grupos de voluntarios un efecto de malabsorción de lactosa ni afectó al bienestar gastrointestinal de los participantes. No existe una influencia del consumo de yogures, frescos o pasteurizados, en los parámetros inmunológicos estudiados de los voluntarios al no haber encontrado diferencias en los parámetros inmunológicos que lo cuantifican en este estudio (IgA, IgG, IgM, Linfocitos CD3, CD4,CD8, Linfocitos totales y Neutrófilos). Los resultados obtenidos utilizando métodos tradicionales de cultivo ponen de manifiesto que no se aisló Streptococcus thermophilus en las heces de ningún voluntario de los grupos 1 y 2, que ingirieron yogures durante o después del periodo de estudio. Se aisló L actobacillus delbrueckii spp bulgaricus solo en las heces de dos voluntarios correspondientes uno a cada uno de los grupos 1 (F-P) y grupo 2 (P-F) y en el último día del estudio. En el primer caso podría deberse a una colonización antigua, detectada solo 45 días después de la finalización del consumo de yogur fresco. En el segundo caso sería una colonización recién adquirida al finalizar el consumo del yogur fresco.

Estos aislamientos no pueden diferenciar entre una colonización transitoria y un establecimiento permanente de L.delbrueckii spp bulgaricus como integrante de la flora intestinal en estas personas. Los resultados obtenidos utilizando métodos moleculares de detección indican que las bacterias utilizadas para la fabricación de yogur no sobreviven al tránsito gástrico ya que en un 87.5% de la población analizada no se detectan restos de ADNs de las mismas. Este porcentaje podría ser aún más elevado en la población general que ingiere yogures pero en menor cantidad que los participantes del estudio.



Los restos de ADN detectados en estas personas probablemente no correspondan a bacterias vivas pues estos datos no se corresponden con los obtenidos en los cultivos bacterianos llevados a cabo en paralelo. Nuestros resultados no cuestionan que el yogur es un producto sano y saludable pero no corroboran el efecto salutífero atribuido al yogur fresco como fuente de bacterias responsables del mismo. Más aún, los valores de los parámetros analizados obtenidos para los grupos que ingieren yogur, independientemente del tipo, son similares a los que presentan los individuos del grupo control.



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Anexo I: Rev. 01 9/09/2005 CUESTIONARIO DE CALIDAD DE VIDA GASTROINTESTINAL

Código:

Dia del estudio:

1. Durante las 2 últimas semanas ¿Ha sentido sensación de plenitud abdominal (o de tripa llena)?

1. Todo el tiempo 2. Casi todo el tiempo 3. algunas veces 4. raramente 5. nunca.

2. Durante las 2 últimas semanas ¿ha sentido escape de ventosidades?


3. Durante las 2 últimas semanas ¿ha sentido fuertes eructos?


4. Durante las 2 últimas semanas ¿ha sentido ruidos llamativos en el estómago o la tripa?


5. Durante las 2 últimas semanas ¿ha sentido la necesidad de defecar con mucha frecuencia?


6. Durante las 2 últimas semanas, ¿ha sentido la necesidad de tener que defecar con urgencia?


7. Durante las 2 últimas semanas, ¿ha tenido diarrea?


8. Durante las 2 últimas semanas, ¿ha tenido estreñimiento?


9. Durante las 2 últimas semanas, ¿ha tenido problemas para contener las heces?


10. Durante las 2 últimas semanas, ¿ha podido realizar sus actividades cotidianas (estudios, trabajo, labores

domésticas)?

1. Nunca 2. raramente 3. algunas veces 4. Casi todo el tiempo. 5. Todo el tiempo .

Puntuación total …………………………………….

estudio del posible poder beneficioso del yogur pasteurizado · del yogur pasteurizado informe...

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