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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS DE
Saccharomyces cerevisiae EM GEL DE ALGINATO DE CÁLCIO
NO PROCESSO DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
MESTRANDO: Eng.Químico Márcio de Andrade Batista
ORIENTADOR: Prof. PhD. Luís Cláudio Oliveira Lopes
Co-Orientador: Prof. Dr. Eloízio Júlio Ribeiro
UBERLÂNDIA – MG
AGOSTO – 2005
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS DE Saccharomyces cerevisiae EM GEL DE ALGINATO DE CÁLCIO NO PROCESSO DE
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
Márcio de Andrade Batista
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre emEngenharia Química, Área de concentração emDesenvolvimento de Processos Químicos.
Uberlândia2005
FICHA CATALOGRÁFICA
Elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação
B333e Batista, Márcio de Andrade, 1974- Estudo da imobilização de células de Saccharomyces cerevisiae em gel de alginato de cálcio no processo de fermentação alcoólica / Márcio de An- drade Batista. - Uberlândia, 2005. 114f. : il. Orientador: Luís Cláudio Oliveira Lopes. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Uberlândia, Progra- ma de Pós-Graduação em Engenharia Química. Inclui bibliografia. 1. Álcool - Teses. 2. Fermentação - Teses. I. Lopes, Luís Cláudio Oli-veira. II. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Gradua-ção em Engenharia Química. III. Título.
CDU: 662.754
AGRADECIMENTOS
A realização de uma dissertação de mestrado constitui-se uma tarefa de tal magnitude, que se torna impossível realizá-la sem a ajuda de outras pessoas e gostaria de certificar que as mesmas soubessem de meu apreço.
Agradeço ao Deus Jeová, que em sua onisciência, onipotência e onipresença tem guiado meus caminhos;
Aos meus irmãos Mauri Andrade, Maurílio Andrade e Maércio Andradepela ajuda econômica nos “duros” anos de graduação e que sem eles, esse mestrado não seria possível;
A mimha irmã Márcia Andrade pelo apóio constante e por acreditar em meu trabalho;
Ao hialotecnista Gentil pela confecção das “células” usadas nos ensaios experimentais;
Ao Prof. Dr. Luís Cláudio, que com paciência mostrou como as equações diferenciais podem ser “poderosas” na solução de problemas de Engenharia;
Ao Prof. Dr. Eloízio, Prof. Dr. Damasceno, Prof. Dr. Marcos Barroso, Prof. Dr. Adilson, Prof. Dr. Moilton e Prof. Dr. Sílvio Silvério da Silva. Professores que não só compreendem a ciência, mas também são capazes de explicá-la;
A técnica química Roberta, pela vidraria utilizada;
Ao Doutorando Cláudio “Mezenga” pelo treinamento no software Global Lab .
À empresa Torre - Materiais para panificação, pela doação do fermento utilizado nos ensaios fermentativos;
À Capes, pelo apoio financeiro;
A todos aqueles que embora não citados, contribuíram de maneira direta ou indireta nesse trabalho.
Recebam meus melhores agradecimentos.
“Se ensinarmos a todo mundo, inclusive a estudantes de segundo grau, os hábitos do pensamento cético, eles provavelmente não vão restringir o seu ceticismo aos UFOS, aos comerciais de aspirina e as mentes canalizadas de 35 mil anos de idade.Talvez comecem a fazer perguntas incômodas sobre as instituições econômicas, sociais, políticas ou religiosas.Talvez desafiem as opiniões de quem está no poder. Então o que aconteceria conosco?”
Carl Sagan
“Não devemos acreditar nos muitos que dizem que só as pessoas livres devem ser educadas, deveríamos antes acreditar nos filósofos que dizem que apenas as pessoas educadas são livres.”
Epicteto, Filósofo e ex-escravo romano.
“Sucesso: 1% inspiração e 99% transpiração.”
Thomas Edison (1847-1931)
“Ubi dubiun ibi libertas”
Provérbio latino
i
CONTEÚDO
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................... iiiLISTA DE TABELAS........................................................................................................ viLISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................... viiLISTA DE SIMBOLOS..................................................................................................... viiiRESUMO........................................................................................................................... xABSTRACT....................................................................................................................... xi
CAPÍTULO 01 - INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVAS.................................................. 1
1.1- O etanol e seu potencial de utilização........................................................................ 11.2- Bioprocessos conduzidos em células imobilizadas..................................................... 41.3- Objetivos...................................................................................................................... 71.4- Estrutura da dissertação............................................................................................... 7
CAPÍTULO 02 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................... 9
2.1- Introdução.................................................................................................................... 92.1.1- Microganismo: Saccharomyces cerevisiae.................................................... 92.1.2 - Cinética de fermentação................................................................................ 12
2.2 - Meios de cultura......................................................................................................... 142.2.1- Aspectos de assepsia e desinfecção............................................................... 15
2.3 - Rendimentos em processos fermentativos................................................................. 162.4 - Fluxograma simplificado do processo de produção de etanol.................................... 172.5 - Descrição ilustrativa do processo industrial de produção de etanol........................... 182.6 - Imobilização celular................................................................................................... 182.7 - Coeficiente de partição............................................................................................... 212.8 - Projeto de experimentos............................................................................................. 24
2.8.1- Aplicação da função desirability em bioprocessos....................................... 262.9- Modelagem e simulação.............................................................................................. 29
CAPÍTULO 03 - MATERIAIS E MÉTODOS................................................................... 32
3.1- Microrganismo e preparo do inóculo........................................................................... 323.2- Técnicas utilizadas nos ensaios................................................................................... 33
3.2.1- Métodos analíticos........................................................................................ 333.2.2- Procedimentos experimentais........................................................................ 34
3.3- Planejamento de experimentos.................................................................................... 373.3.1- Planejamento varredura................................................................................. 373.3.2- Planejamento tipo fatorial composto central................................................. 393.3.3- Investigação da função desirability em bioprocessos................................... 40
CAPÍTULO 04 - RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................ 42
4.1-Avaliação dos diferentes tipos de fermento biológico.................................................. 424.2-Avaliação das distribuições dos diâmetros dos pellets obtidos.................................... 424.3-Avaliação do planejamento fatorial completo dois níveis do tipo 23.......................... 444.4-Planejamento do tipo 24................................................................................................ 484.5-Planejamento composto central do tipo 34-1................................................................. 544.6-Aspectos introdutórios para a modelagem do Fermentador......................................... 65
CAPÍTULO 05-CONCLUSÕES........................................................................................ 75
ii
CAPÍTULO 06-SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS.................................... 78
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................ 79
APÊNDICES....................................................................................................................... 84
Apêndice A - Curvas de Calibração........................................................................ 85Apêndice B - Resultados dos Ensaios de Fermentação Realizados........................ 86
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 01- Representação da síntese bioquímica do microrganismo Escherichia coli para a conversão de glicose a etanol................................................................................... 4
Figura 02- Fluxograma simplificado para a produção de etanol com
levedura imobilizada........................................................................................................... 6
Figura 03- Representação esquemática das estruturas tipicas
da levedura Saccharomyces cerevisiae............................................................................... 10
Figura 04- Microfotografia com as diversas fases de crescimento
da levedura Saccharomyces cerevisiae............................................................................... 10
Figura 05- Representação das diversas fases de crescimento
da levedura Saccharomyces cerevisiae............................................................................... 11
Figura 06- Etapas de redução da glicose a etanol............................................................... 14
Figura 07- Fermentação contaminada com cultura de lactobacilos e formação de espuma................................................................................................................................ 16
Figura 08- Fluxograma simplificado do processo de produção
de etanol.............................................................................................................................. 17
Figura 09- Métodos de imobilização celular....................................................................... 20
Figura 10- Características e tipos de suporte, utilizados nas diversas técnicas de imobilização........................................................................................................................ 21
Figura 11- Métodos básicos de imobilização.................................................................... 21
Figura 12- Representação esquemática do pellet com a entrada do substrato e saída do produto................................................................................................................................ 23
Figura 13- Reator utilizado nos ensaios fermentativos....................................................... 35
Figura 14- Equipamento utilizado na imobilização e confecção dos pellets...................... 36
Figura 15- Amostra representativa dos pellets de alginato de cálcio obtidos e o padrão de medida (diâmetro externo de15mm) usado no software Global Lab®........................... 37
Figura 16-“Ponteiras” usadas para obtenção dos pellets de diferentes diâmetros e padrão de medida (diâmetro externo de15mm).............................................................................. 37
Figura 17- Processamento de imagens dos pellets: (a) imagem processada; (b) determinação dos diâmetros de cada partícula; (c) avaliação do número de partículas para determinação do raio médio do conjunto de partículas............................................... 37
Figura 18- Diagrama de dispersão dos pontos do planejamento gerado............................ 38
iv
Figura 19- Perfis de concentração de etanol, glicose e células livres para o fermento
tipo A................................................................................................................................... 43
Figura 20- Perfis de concentração de etanol, glicose e células livres para o fermento
tipo B .................................................................................................................................. 43
Figura 21- Representação dos efeitos para o planejamento 23............................................ 46
Figura 22- Gráfico das médias marginais obtidas no planejamento 23............................... 46
Figura 23- Diagrama de Pareto das variáveis mais significativas, com nível de confiança de 95% ............................................................................................................... 47
Figura 24- Superfícies de resposta de obtidas no planejamento de varredura.................... 48
Figura 25- Análise de Pareto para a fração 24 do planejamento composto central com limite de confiança de 90%................................................................................................. 50
Figura 26- Perfis para valores preditos e desirability para o planejamento 24................... 51
Figura 27- Distribuição dos resíduos em função dos valores normais para o planejamento 24................................................................................................................... 52
Figura 28- Distribuição dos resíduos em função valor predito para o planejmento 24....... 53
Figura 29- Médias marginais para o panejamento 24 com nível de confiança de 90%....... 53
Figura 30- Resíduos para o planejamento 34-1 com nível de significância de 90%............. 54
Figura 31- Distribuição do valor predito versus valor observado para o planejamento
34-1....................................................................................................................................... 56
Figura 32- Análise de Pareto para o planejamento 34-1 com limite de confiança de 90%. Efeitos dos fatores: Lineares(L), Quadráticos (Q)……………………………………….. 56
Figura 33- Perfis para valores preditos otimizados e desirability para o planejamento
34-1 (desirability global igual a 1)....................................................................................... 57
Figura 34- Curvas de nível para desirability do planejamento 34-1: Valores ótimos com ajuste spline......................................................................................................................... 58
Figura 35- Região de máximo rendimento como função das concentrações de cloreto de cálcio e alginato de sódio no planejamento 34-1.................................................................. 59
Figura 36- Cinética e produtividade de fermentação do melhor ensaio obtido................... 62
Figura 37- Relação percentual entre concentração de células livres e células imobilizadas........................................................................................................................ 63
Figura 38- Partículas de alginato de cálcio com células imobilizadas: (a) Pellet do tipo A; (b) Pellet do tipo B............................................................................ 64
v
Figura 39- Comportamento estacionário de uma partícula com 5 pontos de colocação
internos, polinômio de Jacobi com 1, 1 , Sh=100, 2,0 e =[1(+), 10(x), 100( )].................................................................................................................................
2
67
Figura 40- Comportamento estacionário de uma partícula com 5 pontos de colocação
internos, polinômio de Jacobi com 1, 1 . Sh=100, 2,0 , =100 e =[0(+), 10(x), 25( ),100( )].........................................................................................
2
2 68
Figura 41- Comportamento estacionário de uma partícula com inibição pelo produto de forma não competitiva utilizando 5 pontos de colocação internos, polinômios de Jacobi
com 1, 1 , 2,0 , Sh=100, =100 e 23 =[0(+), 10(x),
25( ),100( )]...................................................................................................................... 71
vi
LISTAS DE TABELAS
Tabela 01- Propriedades termodinâmicas da gasolina e do etanol..................................... 2
Tabela 02- Rendimento ótimo de fermentação de leveduras em condições
anaeróbicas.......................................................................................................................... 13
Tabela 03- Composição do meio de cultura semi- sintético............................................... 15
Tabela 04- Produtos da fermentação alcoólica, em g/100g de glicose metabolizada, para diferentes rendimentos fermentativos em células livres............................................. 16Tabela 05- Classificação dos modelos cinéticos................................................................. 29
Tabela 06- Modelos cinéticos sem inibição........................................................................ 30
Tabela 07- Modelos cinéticos com inibição pelo substrato................................................ 30
Tabela 08- Modelos cinéticos com inibição pelo produto.................................................. 31
Tabela 09- Lista de Reagentes e Materiais utilizados nos ensaios de fermentação............ 32
Tabela 10- Composição do meio de cultura sintético........................................................ 33
Tabela 11- Fatores e níveis do planejamento fatorial tipo varredura................................. 39
Tabela 12- Matriz do planejamento experimental fatorial completo 23 com fatores e níveis codificados............................................................................................................... 39
Tabela 13- Fatores e níveis do planejamento composto central......................................... 40
Tabela 14- Matriz do planejamento experimental fatorial composto central 34-1
contendo fatores e níveis codificados................................................................................ 41Tabela 15- Avaliação estatística entre os fermentos biológicos disponíveis no mercado............................................................................................................................... 42Tabela 16- Raios médios para partículas confeccionadas nas 5 faixas analisadas com o software de processamento de imagens.............................................................................. 44Tabela 17- Planejamento 23 e a resposta obtida nos ensaios............................................ 45
Tabela 18 -Planejamento 24 e a resposta obtida nos ensaios............................................ 50
Tabela 19- Planejamento 34-1 e a resposta obtida nos ensaios.......................................... 54
Tabela 20- Propriedades físicas e aparentes do alginato de cálcio..................................... 61
Tabela 21- Características aparentes das partículas investigadas....................................... 64
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
RSM Response Surface Methodology-
AIE Agência Internacional de Energia
RMI Instituto Rocky Mountain
EUA Estados Unidos da América
RON Research Octane Number
MON Motor Octane Number
Co Company
SINAFERM Simpósio Nacional de Bioprocessos
SHEB Simpósio Nacional de Hidrólise Enzimática de Biomassas
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídio
TQM Total Quality Managemente
JIT Just in Time,
PCC Planejamento composto central
ISO International Organization for Standardization
HPLC Comatografia Líquida de Alta Resolução
viii
LISTA DE SÍMBOLOS
S Concentração de substrato S0 Concentração de substrato inicial P Concentração de produto X Concentração celular CO2 Dióxido de carbono Mg+2 Íon magnésio H2O Água(NH4)2SO4 Sulfato de amônio KH2PO4 Dihidrogenofosfato de potássio Na2HPO4 Monohidrogenofosfato de sódio MgSO4.7H2O Sulfato de Magnésio heptahidratado Al(NO3)3 Nitrato de alumínio
PiK Coeficiente de partição da espécie química i
iGC Concentração da espécie química i no interior da matriz
iFC Concentração da espécie química i no interior do fluido adjacente(r0) Taxa de reação por unidade de volume da partícula Cs Gradiente de concentração de substrato na superfície da partícula CSb Concentração de substrato na fase bulk Cx Concentração celular CS Concentração de substrato na superfície da partícula De Coeficiente de difusão efetivo K2 Parâmetro da equação de Monod Km Parâmetro da equação de Monod
X Valor médio Desvio padrão
T Valor desejado (L) Limite inferior (U) Limite superior S’, t’ Parâmetros que definem a variação da taxa de desejabilidade nm Nanômetrorpm Rotações por minuto
Coeficiente de rotabilidade
SR Taxa de transformação do substrato por unidade de volume na partícula
r Posição radial no pellet
R Raio do pellet (Superfície da partícula)kL Constantes de inibição (Monod)D Coeficiente de difusividade
2 Módulo de Thiele
2 Parâmetro de inibição
pD Difusividade do etanol na partícula
efR Taxa efetiva de crescimento celular no exterior da partícula Concentração inicial de células livres
ix
Cgf Concentração de glicose no fluido Ccd Concentração de células CL Concentração celular no leito Kp, Km , n Constantes de processo mef Concentração de etanol no interior da partícula V Volume do reator
max Velocidade específica máxima
efm.
Quantidade de etanol gerada no interior da partícula
gfm.
Quantidade de glicose consumida no interior da partícula
Lk Coeficientes de transferência de massa nas vizinhanças externas à partícula ' Proporcionalidade
x
RESUMO
Este trabalho tem como objetivo central o oferecimento de uma contribuição para o
desenvolvimento de tecnologias alternativas na produção de etanol pela via biotecnológica.
Nessa direção, apresenta-se um estudo sobre as condições para a imobilização da levedura
Saccharomyces cerevisiae em alginato de cálcio e abordam-se aspectos de estabilidade de
pellets em um bioreator agitado a fim de investigar fatores importantes na operação de
biorreatores com células imobilizadas.
A metodologia da superfície de resposta (RSM), usando um projeto estatístico de
varredura e um planejamento composto central, aliada a função desirability, foram usados
para avaliar a eficiência das partículas na fermentação alcoólica e otimizar as condições de
imobilização. Utilizou-se um bioreator do tipo batelada com agitação mecânica e capacidade
volumétrica de 2 litros com controle de temperatura para o acompanhamento da concentração
celular livre e imobilizada, concentração de etanol e de glicose em intervalos de 2 horas
durante todo o ensaio.
Os resultados para a faixa experimental explorada indicam que o procedimento
sugerido leva a partículas suficientemente robustas no que diz respeito à imobilização. O
tratamento das partículas com Al(NO3)3 resultou em pellets com satisfatória estabilidade
mecânica e ótima atividade metabólica para a produção de etanol, atingindo valores de
conversão de até 94% do rendimento Pasteur.
Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, Fermentação, Etanol, Imobilização.
xi
ABSTRACT
This work aims to offer a contribution for the development of an economic technology
for ethanol production by the biotechnological approach. In this direction, it investigates the
conditions for Saccharomyces cerevisiae cells immobilization in calcium alginate and
addresses the operational stability aspects of a stirred batch bioreactor in order to deal with
important factors in the immobilized cell bioreactor operation.
A Response Surface Methodology (RSM), using a statistical screening design and a
central composite design, allied with a desirability function analysis, were used to evaluate the
fermentation efficiency of the pellets and to optimize the cells immobilization conditions. A 2
liters stirred batch bioreactor with temperature control was used to monitor the free and
immobilized cell concentrations, ethanol and glucose concentrations were sampled at each 2
hours during the duration of the fermentation process.
The results in the explored experimental range indicate that the proposed methodology
leads up to a sufficiently robust immobilization procedure. The pellets treated with Al(NO3)3
presented a great deal of stability and metabolic activity for ethanol production, reaching
conversion of up to 94% of the Pasteur yield.
Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Fermentation, Ethanol, Immobilization.
CAPÍTULO 01 – INTRODUÇÃO
1.1-O etanol e seu potencial de utilização
Nas últimas décadas o etanol tem ocupado um lugar de destaque e de grande
importância tecnológica, firmando-se como um produto estratégico economicamente. Tem
alto valor estratégico devido à proposta promissora como combustível alternativo ao petróleo,
que segundo estudiosos tem um tempo de vida estimado em 50 anos. Outro aspecto a ser
destacado é sua utilização como intermediário na síntese de biodiesel, durante a etapa de
transesterificação. Biodiesel é um combustível biodegradável derivado de fontes renováveis
como óleos vegetais (mamona, dendê, girassol e babaçu) e gorduras animais, que pela ação de
um catalisador, reagem com o etanol. Tecnicamente o biodiesel substitui total ou parcialmente
o diesel de petróleo em motores ciclodiesel de caminhões, tratores e automóveis e também é
indicado para a geração de energia. Pode ser utilizado puro ou misturado ao diesel tradicional
em diversas proporções. A mistura de 2% de biodiesel ao diesel de petróleo é chamada de B2
e assim sucessivamente, até o biodiesel puro, denominado B100.
Segundo a Agência Internacional de Energia (AIE), o mercado de biocombustíveis
dominará 30% do mercado mundial em 2020. Este setor tem crescido 20% ao ano, apontando
o Brasil como um dos potenciais produtores de energia alternativa ao petróleo para as
próximas décadas.
O mercado de biocombustíveis representa apenas 2% do mercado global e o comércio
internacional soma R$5 bilhões/ano. Neste contexto, o Brasil exportou 2 bilhões de litros de
etanol e o consumo interno foi de 15 bilhões de litros, mostrando assim que existe ainda um
grande mercado a ser explorado e desenvolvido.
O programa brasileiro Proálcool, segundo o Ministério da Ciência e Tecnologia, o
programa foi uma resposta à crise do petróleo na década de 80 e uma alternativa para o
controle flutuante dos preços do açúcar no mercado internacional e colocou o Brasil como o
maior produtor de mundial de etanol por via biotecnológica em 1980 e conforme relata
GOLDEMBERG et al.,(1994), as propriedades do etanol como combustível levaram as
empresas automobilísticas, ao desenvolvimento de motores a álcool e também motores de
mistura álcool/gasolina para os sistemas carburados e atualmente para todos os motores com
sistema de injeção eletrônica.
Na década de 80, 90% dos motores dos carros eram a álcool e o custo de produção do
barril de etanol atingiu valores de cerca de 100 dólares. Investimentos significativos estão
2
sendo realizados na modernização de tecnologias de produção mais eficientes, atraindo a
atenção de investidores estrangeiros que importam o etanol brasileiro para diversas aplicações
industriais, entre elas a sua utilização na indústria de bebidas e como aditivo à gasolina.
Segundo GOLDEMBERG (1994), o etanol é um excelente combustível automotivo,
apresenta índice de octanagem superior ao da gasolina e tem uma pressão de vapor inferior,
resultando em menores emissões evaporativas. Isso o torna atrativo ambientalmente, tendo em
vista o protocolo de Kyoto e o compromisso firmado pelos países mais industrializados com a
United Nations Framework Climate Change Convention, onde os mesmos se comprometem
a reduzir suas emissões de CO2 na atmosfera.
De acordo com o Instituto Rocky Mountain (RMI , 2005), o etanol é uma das únicas
fontes alternativas de energia que podem competir de maneira equiparada ao petroleo, ainda
que o mesmo fosse vendido a menos da metade do preço atual e segundo o mesmo instituto, a
economia gerada nos EUA, na identificação de um substituto para o petroleo seria da ordem
de U$70 bilhoes / ano, alem de reduzir as emissões de carbono do pais em 26%.
Na Tabela 1 tem-se a comparação entre as propriedades termodinâmicas do etanol e da
gasolina.
Tabela 1- Propriedades termodinâmicas da gasolina e do etanol (GOLDEMBERG,1994)
Propriedades Físicas Gasolina Etanol
Calor específico 34900 kJ/kg 26700 kJ/kg
Número de octano (RON/MON)* 91/80 109/98
Calor latente de vaporização 376 a 502 903
Temperatura de ignição 220 oC 420 oC
Razão estequiométrica - Ar / Combustível 14,5 9 * RON –Research Octane Number MON-Motor Octane Number
Outra possibilidade para o uso de etanol é a sua utilização como intermediário na
produção de hidrogênio para células combustíveis para automóveis e como fonte de energia
elétrica para processos (SILVA , 2003). O uso do etanol como intermediário pode viabilizar a
aplicação do hidrogênio como combustível (SCHMIDT, 2004) e ainda apresentar vantagens
ambientais, pois o hidrogênio não emite nenhum tipo de poluição ou gases que contribuam
para o efeito estufa.
Processos para a produção de etanol a partir de cana-de-açúcar são bem documentados
e discutidos na literatura. Nos Estados Unidos e Europa, o etanol é obtido a partir de milho e
outros amiláceos que podem servir como fonte de matéria-prima barata e renovável (LIMA ,
3
2002), mas do ponto de vista econômico, o produto americano custa até três vezes mais que o
etanol brasileiro, embora seja beneficiado por subsídios do governo americano para se tornar
competitivo.
Atualmente existem tecnologias disponíveis para a conversão de materiais
lignocelulósicos em etanol, mas DORRY (2001) afirma que embora cientificamente possível,
esta técnica ainda é inviável economicamente, devido a dificuldade de ruptura do complexo
lignina-hemicelulose-celulose (CARVALHO, 2000).
Estudos para se obter um fungo (gênero Trichoderma) para a obtenção de etanol a
partir da glicose resultante da degradação da celulose estão em desenvolvimento (DORRY et
al., 2001).
Com o desenvolvimento da biotecnologia e da genética, varias técnicas de
manipulação gênica tem tentado desenvolver microrganismos que sejam capazes de fermentar
uma ampla gama de açúcares. A Escherichia coli é capaz de fermentar uma grande gama de
açúcares, mas gera produtos de pouco valor agregado, o que a princípio desestimula o seu
uso, devido ao aspecto econômico (LIMA, 2002).
INGRAN et al. (1991), citado por LIMA (2002), afirmam que foram obtidos
recombinantes de Escherichia coli que possuem o gene pdc e adh de Zymomonas mobilis,
(que é um microrganismo referenciado na literatura para produção de etanol) permitindo que
o metabolismo do piruvato durante a fermentação seja desviado da síntese de uma mistura de
ácidos orgânicos para a produção de etanol com eficiência de conversão superior a 95% do
rendimento teórico máximo.
Na Figura 1, apresenta-se a representação da síntese bioquímica da Escherichia coli
para conversão de glicose a etanol, mostrando como a Escherichia Coli pode sintetizar as
unidades estruturais bioquímicas para a formação das proteínas, polissacarídeos, lipídeos e
ácidos nucléicos, bem como todas as estruturas celulares, quando cultivadas em meio
contendo glicose, sulfato de amônio e outros sais inorgânicos, conforme citado por
PELCZAR et al. (2004).
As leveduras foram os primeiros organismos encontrados capazes de crescer na
ausência de oxigênio e segundo TAKAHASHI et al. (2002), a levedura Saccharomyces
cerevisiae é o microrganismo mais freqüentemente utilizado na produção de etanol, embora
não seja capaz de fermentar pentoses.
4
Figura 1 - Representação da síntese bioquímica do microrganismo Escherichia coli para a conversão de glicose a etanol (PELCZAR et al., 2004).
1.2 - Bioprocessos conduzidos com células imobilizadas
Tão importante quanto à escolha do microrganismo adequado para a fermentação é a
escolha do processo para a condução do bioprocesso. A literatura tem registrado inúmeros
modelos de bioreatores para a produção biotecnológica de etanol e atualmente o uso de
células livres é o método mais empregado.
Segundo FREEMAN e LILY (1998), citados por CARVALHO (2000), a imobilização
de células viáveis apresenta grande potencial para aplicações em conversões ou sínteses que
envolvam sistemas multienzimáticos complexos, nos quais a presença de passos que requerem
provisão de energia ou uso de cofatores seja comum, uma vez que a regeneração desses
compostos ocorre de forma natural.
Um inconveniente dos processos tradicionais é a necessidade de se inocular um
número elevado de células, assim a imobilização pode-se mostrar uma alternativa eficiente
para esse problema. CASSIOLA (2001), afirma que Saccharomyces cerevisiae imobilizada
em crisotila (resíduo da indústria de cerâmica) mostrou ser um excelente biocatalisador no
processo de produção de etanol, aumentando o rendimento do processo em cerca de 26 % em
relação ao sistema com células livres. BRODELIUS e VANDAMME (1987), citados por
CARVALHO (2000), destacam que a condução de bioprocessos com o emprego de células
imobilizadas tem vantagens em relação aos processos fermentativos tradicionais, como a
utilização de altas densidades celulares por unidade de volume do reator, e como destacam
5
CASSIOLA (2001) e VASCONCELOS (1998) resulta em maior produtividade e rendimento
fermentativo.
A bibliografia especializada tem citado o uso de reatores para a produção de etanol e
os mais diversos rendimentos foram obtidos usando-se diferentes suportes como, por
exemplo, a crisotila, géis (como o alginato de cálcio) e o próprio bagaço de cana.
VASCONCELOS (1998) propôs o uso de reatores batelada simples e reator contínuo
para a fermentação alcoólica com leveduras imobilizadas em colmos de cana-de-açúcar e
obteve eficiência fermentativa de 86,40% no processo contínuo e FREGONESI (1998)
destaca que a utilização de sistemas contínuos, empregando-se reatores tubulares, pode
reduzir seu custo de produção, com um rendimento superior em relação ao sistema de células
livres.
RIGO (2001) conduziu fermentações alcoólicas em sistema batelada com células
imobilizadas em crisotila e teve aumento de até 27% na velocidade inicial de conversão de
açúcares a etanol e nas fermentações contínuas, com a presença de crisotila em seu leito,
ocorreu aumento da produção de etanol nas diversas taxas de diluição investigadas.
WENDHAUSEN JUNIOR (1998), utilizando sistemas em regime batelada e contínuo,
conduzidos com células imobilizadas em crisotila, afirmou que obteve de (25 a 30)% de
produção de etanol em relação ao sistema de células livres e o sistema operacional mostrou
estabilidade em relação à produtividade e estrutura do recheio.
No Japão, pelo menos um processo que utiliza levedura imobilizada em gel alginato de
cálcio em reatores de leito fluidizado, foi desenvolvido em escala piloto pela Kyowa Hakko
Kogyo Co. (BORZANI et al., 2001) e (FERREIRA, 1986). Seu fluxograma simplificado é
apresentado na Figura 2. Os autores afirmam que a planta produzindo 12 m3/dia operou por 6
meses sem perda da estabilidade. A produtividade do sistema foi de 20g de etanol/L.h com
uma concentração de etanol no caldo fermentado de 68 g/L e rendimento da fermentação de
aproximadamente 95% do valor teórico. Os resultados indicam que os valores de
produtividade em etanol e de rendimento da fermentação são superiores aos processos de
produção de etanol operando em batelada (Melle-Boinot).
6
Figura 2 – Fluxograma simplificado para a produção de etanol com levedura imobilizada(BORZANI et al., 2001).
WENDHAUSEN JUNIOR (1998) afirmou que os biocatalisadores apresentam como
vantagens à não geração de resíduos de alta toxidade, sendo portanto, ecologicamente corretos
e principalmente, atuam sob condições “suaves”, operando com pH entre 4 e 8, com
temperaturas entre 200C e 400C e na condição de pressão ambiente.
Embora a imobilização de células viáveis seja uma metodologia recomendada em
processos biotecnológicos para o aumento nas taxas de produtividade de produtos de
interesse, o método de imobilização deve ser suficientemente ameno para preservar a
atividade e viabilidade celular (BATISTA et al., 1999).
ALVA (1997) destacou o estresse do microambiente sobre a atividade enzimática da
levedura e afirma que as barreiras difusionais impostas pela matriz sólida e a condição de
empacotamento das células são os principais responsáveis pelas mudanças metabólicas.
A literatura especializada tem citado que o aprisionamento de microrganismos por um
gel é a técnica de imobilização mais utilizada. Dentre os principais estão o alginato de cálcio e
k-carragenana. Outra técnica consiste uma adsorção celular no próprio bagaço de cana-de-
açúcar.
A proposta deste trabalho teve como objetivo apresentar uma contribuição para o
desenvolvimento de metodologias para processos fermentativos, bem como a escolha de um
suporte que alie compatibilidade biológica, resistência mecânica e difusão. A vantagem
principal de investigar a fermentação com a utilização de células imobilizadas deve-se ao fato
de que naqueles sistemas, as células estão fisicamente aprisionadas dentro de uma matriz e
7
assim possuem melhor retenção e uma grande área superfícial para uma operação eficiente. A
imobilização de células permite o reuso de biomassa, melhora a estabilidade e diminui a
contaminação do produto. Entretanto, os bioreatores operando com células imobilizadas em
que as partículas não são fixas apresentam um grau mais elevado de dificuldade no projeto e
operação, principalmente devido à necessidade de agitação mecânica, a prevenção de
sedimentação ou quebra da partícula, e do necessário cuidado na operação para que os danos
nas partículas sejam minimizados.
Existe assim a necessidade de estudos que justifiquem a escolha adequada de suportes
para imobilização e o desenvolvimento de modelos teóricos que possibilitem a simulação
computacional e otimização de processos biotecnológicos.
1.3 – OBJETIVOS
Os objetivos principais desse trabalho podem ser divididos em :
GERAL:
Estudar a imobilização de células de Saccharomyces cerevisiae em gel alginato de cálcio no
processo de fermentação alcoólica.
ESPECÍFICOS:
Verificar as condições de imobilização de células Saccharomyces cerevisiae em suporte de
gel de alginato de cálcio usando técnicas estatísticas;
Propor um modelo matemático que considere os pellets em um bioreator de mistura;
Analisar o comportamento do reator bioquímico operando em batelada e com células
imobilizadas para obtenção de etanol;
Avaliar a produção de etanol com a melhor condição de imobilização definida através de
planejamentos fatoriais.
1.4 – ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO
Essa dissertação foi dividida em 06 capítulos, além das referências bibliograficas,
com a estrutura apresentada a seguir. No Capítulo 01 apresenta-se uma abordagem sobre a
importância dos estudos de imobilização celular para a produção de etanol e as principais
realizações de diversos pesquisadores na área.
8
O Capítulo 02 apresenta uma revisão da literatura sobre os diversos microrganismos
estudados para a produção de etanol, os processos pertinentes e ilustra os aspectos principais
do processo com um fluxograma de uma unidade produtora de etanol e açúcar.
O Capítulo 03 aborda as principais técnicas e metodologias desenvolvidas na
realização da dissertação, apresenta a utilização do software Global Lab® no tratamento de
imagens de pellets para a discriminação de tamanhos necessária ao planejamento
experimental proposto.
O Capítulo 04 apresenta os resultados e as discussões deste trabalho. As conclusões
são apresentadas no Capítulo 05 e sugestões para trabalhos futuros, como por exemplo, o
desenvolvimento de reatores para operação contínua, são propostas no Capítulo 06. O
Apêndice B apresenta as Tabelas (B1 até B25) com os resultados experimentais obtidos nos
experimentos realizados e o Apêndice A as curvas de calibração utilizadas durante os ensaios
fermentativos.
Alguns resultados desse trabalho foram publicados em congressos científicos. Citam-
se: (a) SINAFERM-2005 (XV Simpósio Nacional de Bioprocessos, Recife, Pernambuco),
título do trabalho Study of an immobilized cell bioreactor for alcohol production e (b) SHEB-
2005 (Simpósio Nacional de Hidrólise Enzimática de Biomassas, Maringá, Paraná), título do
trabalho: Avaliação das Condições de Confecção de Pellets de Alginato para a Imobilização
de Leveduras em Processos Biotecnológicos.
9
CAPÍTULO 02 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- Introdução
Esse capítulo apresenta uma revisão dos aspectos centrais da utilização da levedura
Saccharomyces cerevisiae na produção de etanol. A produção de etanol pela via química não
é discutida nessa dissertação. É de interesse nessa revisão, a apresentação do estado da arte da
produção de etanol pela via biotecnológica. Para fins de clareza, define-se processo
biotecnológico como aquele que objetiva a utilização de sistemas celulares para obtenção de
produtos ou desenvolvimento de processos industriais (BORZANI et al., 2001).
Os processos biotecnológicos possuem origem bastante antiga, entretanto, nas últimas
décadas têm despontado como área estratégica por muitos países, incluindo o Brasil. Essa
grande importância estratégica tem despertado e catalisado o crescimento de várias
possibilidades de aplicação.
2.1.1 - Microrganismo: Saccharomyces cerevisiae
De maneira geral, leveduras são fungos unicelulares pertencentes a um grande grupo
heterogêneo de organismos eucarióticos. A levedura Saccharomyces cerevisiae é tipicamente
gemulante e suas cepas são utilizadas no processo de fermentação para produção de bebidas
alcoólicas e combustíveis como o etanol, são em geral de forma elipsoidal, com dimensões
características de 6 a 8 de comprimento por 5m m de largura (PELCZAR et al., 2004).
Na Figura 03 tem-se a representação esquemática das estruturas típicas da levedura
Saccharomyces cerevisiae e suas principais organelas. Reproduzem-se assexuadamente por
brotamento e durante o processo, o núcleo divide-se por “estrangulamento” onde uma parte
dele entra no broto juntamente com outras organelas. A conexão citoplasmática é lacrada pela
confecção de novo material de parede celular.
As Figuras 4 e 5, mostram como é o desenvolvimento e reprodução da célula livre da
levedura Saccharomyces cerevisiae e assim pode-se fazer uma suposição do que acontece no
interior do microambiente.
10
Figura 03 – Representação esquemática das estruturas típicas da leveduraSaccharomyces cerevisiae.
Figura 04 – Microfotografia com as diversas fases de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae (PELCZAR et al., 2004).
Das Figuras 04 e 05 observa-se que tanto o estado vegetativo haplóide como os
20 m
Saccharomyces cerevisiaecom células vegetativas (1)
Ascósporos comarranjo tetraédrico
Saccharomyces cerevisiae comcélulas em brotamento (2)
11
diplóides podem estar presentes. A cariogamia precede um estágio de multiplicação
vegetativa diplóide e a meiose precede um estágio de multiplicação vegetativa haplóide com
formação de ascósporos.
Figura 05 – Representação das diversas fases de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae (PELCZAR et al., 2004).
Em termos de atividade biológica de microrganismos, VALLERO (1999), utilizando
células livres e imobilizadas em reator anaeróbio, constatou que as células aderidas aos
Ascósporos com arranjo tetraédrico (3)
Saccharomyces cerevisiae comcélulas em brotamento (2) Saccharomyces cerevisiae
com células vegetativas (1)
Plasmogamia
12
diversos suportes utilizados tiveram menor atividade biológica que as células livres, embora
essa diferença não fosse significativa. Nesse mesmo trabalho, o autor afirma que tanto a
porosidade como a espessura do biofilme influenciaram na velocidade global de consumo de
substrato.
ALCAZAR (2000), estudando a atividade da levedura Saccharomyces cerevisiae sob
diferentes condições de estresse e o efeito do aprisionamento em gel alginato de cálcio, relata
que, além de exibirem maiores teores de glicogênio, as células imobilizadas apresentam uma
menor sensibilidade tanto ao estresse salino quanto ao estresse alcoólico durante a
fermentação, pois a matriz de alginato no sistema de fermentação contribui na tolerância ao
etanol.
MARQUES (2001), utilizando uma cultura mista de microrganismo Saccharomyces
cerevisiae e Zymomonas mobilis imobilizadas em siltito, destaca que a levedura
Saccharomyces cerevisiae apresentou melhor aderência e fixação ao suporte, resultando em
melhores desempenhos na fermentação contínua e em batelada.
De acordo com MARCONDES (2002), quando os nutrientes são deficientes, as
leveduras entram em meiose para formarem esporos haplóides, os quais germinam quando as
condições tornam-se mais favoráveis. Ainda de acordo com esse autor, para um processo
fermentativo recomenda-se que as leveduras sejam selecionadas conforme os seguintes
critérios:
Fermentação altamente produtiva;
Alto rendimento em etanol;
Tolerância ao etanol;
Ótima tolerância a baixo pH;
Alta tolerância na faixa de temperatura do processo;
Alta tolerância a contaminação.
A utilização dos critérios propostos por MARCONDES (2002) permite destacar as
leveduras Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces fragilis como as mais adequadas para
utilização, sendo que a levedura Saccharomyces cerevisiae ocupa lugar de maior atratividade.
2.1.2- Cinética de fermentação
A reação de produção do etanol é bem documentada na literatura e é expressa como:
13
célulasGlicose S + Nutrientes Etanol P + Células X +Produtos
e apresenta um taxa de conversão teórica de glicose em etanol, segundo MAIORELLA
(1994), expressa por:
1,0g de Glicose 0,511g de Etanol
A princípio, a estequiometria da reação mostra que toda a glicose é consumida e é
convertida em etanol, com rendimento teórico de 0,511g de etanol para cada 1g de glicose.
No entanto, conforme relatam LIMA (2002) e MARCONDES (2002), ocorrem, durante a
síntese, reações secundárias, resultando na redução do rendimento teórico, conhecido com
rendimento Pasteur, que demonstra que no processo, o rendimento máximo real é de 95%. Em
laboratório, o rendimento obtido é de 64,33L de etanol / 100 kg de sacarose e não é atingido
nas destilarias industriais. Obviamente o controle de temperatura e demais condições de
processo são mais facilmente controladas em laboratório do que em escala industrial. Em
destilarias que operam bem tecnicamente e em adequadas condições de funcionamento tem-se
obtido cerca de 61 L de etanol/100 kg de sacarose em um processo bem conduzido.
Na Tabela 02, pode-se verificar quais são os subprodutos gerados durante a fermentação.
Tabela 02 - Rendimento ótimo de fermentação de leveduras em condições anaeróbicas, (LIMA, 2002) e (MARCONDES, 2002)
Produtos Massa (g) de Produto /100 g de Glicose
Etanol 48,4Dióxido de carbono 46,6Glicerol 3,3Ácido succínico 0,6Massa de células 1,2
A bioconversão da glicose em etanol é representada pela Figura 06, conforme citado
por PELCZAR et al. (2004). A glicose é convertida em piruvato pela glicólise, e o piruvato é
convertido em etanol e CO2 em um processo com duas etapas. Na primeira etapa o piruvato
sofre a descarboxilação em uma reação irreversível catalisada pelo piruvato descarboxilase.
Essa reação é uma descarboxilação simples e não envolve a oxidação do piruvato. A enzima
piruvato descarboxilase requer Mg+2 e tem uma coenzima firmemente ligada, a tiamina
pirofosfato, que segundo RAHN (1952), citado por MARCONDES et al. (2002), age
14
aumentando a tolerância da levedura ao etanol. Na segunda etapa, por ação da enzima álcool
desidrogenase, o acetaldeído é reduzido a etanol, com o NADH derivado da atividade da
enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase fornecendo o poder redutor. Assim, em vez de
lactato, os produtos finais da fermentação alcoólica são o etanol e o CO2, (LEHNINGER et
al., 2002).
Destaca-se ainda que a levedura Saccharomyces cerevisiae é um aeróbio facultativo,
ou seja, em aerobiose, parte da glicose é transformada em biomassa, CO2 e H2O e em
anaerobiose, a maior parte é convertida em etanol e CO2, processo esse chamado de
fermentação.
Figura 06 – Etapas de redução da glicose a etanol (PELCZAR et al., 2004).
2.2- Meios de cultura
A preparação de meio de cultura semi-sintético visa identificar e selecionar os mais
importantes nutrientes de forma a se estabelecer um processo fermentativo adequado.
FERREIRA (1998), simulando a fermentação alcoólica usando glicose com fonte de carbono,
recomenda a seguinte composição, citada na Tabela 03.
15
Tabela 03 – Composição do meio de cultura semi-sintético (FERREIRA,1998)
Nutrição mineral Concentração em (g/L)
(NH4)2SO4 1,2KH2PO4 2,4Na2HPO4 1,2Glicose variável*MgSO4.H2O 0,3Extrato de levedura 3,0*conforme planejamento experimental.
2.2.1-Aspectos de assepsia e desinfecção
Contaminação biológica e efeitos de infecções podem ser observados em praticamente
todos os processos biotecnológicos. Em geral, os processos contínuos apresentam uma
dificuldade extra, pois é difícil localizar a fonte de contaminação e quando isso acontece todo
o sistema fica comprometido.
GAVA (2004) afirma que o pH relativamente baixo (2 - 4,5) do meio de fermentação
inibe a ação de microrganismos contaminantes e ERGUN(2000) afirma que o pH ideal para a
fermentação alcoólica é de 4,5.
A Figura 07 apresenta uma fermentação tipicamente contaminada com lactobacilos,
onde se pode observar a formação de espuma nos frascos indicados com setas. Ressalta-se
ainda que essa espuma exerce uma influência significativa na homogeneização do meio de
cultura e ainda exige a presença de antiespumantes.
ANGELIS et al. (2001) destacam que a presença de bactérias floculantes, como o
Lactobacillus fermentun, pode causar o assentamento de células de levedura no fundo das
dornas e perdas de células nas centrífugas, já que essas bactérias são contaminantes triviais
das fermentações alcoólicas industriais e conseqüentemente levam a uma diminuição do
rendimento e produtividade do etanol. Outro aspecto importante desse trabalho, é que, na
faixa de pH entre 2 e 5, a floculação é próxima de zero, quando a concentração de
Lactobacillus fermentun foi de 1,38g/L para cada 65,4 g/L de Saccharomyces cerevisiae.
16
Figura 07 - Fermentação contaminada com cultura de lactobacilos e formação de espuma (FERMENTEC, 2005).
2.3- Rendimentos de processos fermentativos
Sabe-se que parte do açúcar presente no meio fermentativo é consumido pela levedura
para sua manutenção, reprodução e às vezes quando o ambiente fermentativo torna-se
agressivo, a mesma consome o substrato de maneira acentuada, não para geração de produtos,
mas sim para sua proteção e manutenção.
A literatura tem avaliado que 5% do açúcar do meio fermentativo é metabolizado para
gerar subprodutos, diminuindo, conseqüentemente, o rendimento da fermentação. Na Tabela
04 apresenta-se os diversos rendimentos encontrados na literatura, bem como os produtos
obtidos durante a fermentação alcoólica.
Tabela 04 - Produtos da fermentação alcoólica, em g/100g de glicose metabolizada, para diferentes rendimentos fermentativos em células livres (BORZANI et al., 2001)
Produto de fermentação
Pasteur95%
JACKMAN (1987) (90-95)%
BASSO et al., (1996) (85-92)%
Etanol 48,5 45 - 49 43 – 47 CO2 46,4 43 – 47 41 – 45 Glicerol 3,3 2 – 5 3 – 6 Ácido succínico 0,6 0,5 – 1,5 0,3 – 1,2 Ácido acético ––– 0 – 1,4 0,1 – 0,7 Óleo fúsel ––– 0,2 – 0,6 –––Butilenoglicol ––– 0,2 – 0,6 –––Biomassa(massa seca) ––– 0,7 – 1,7 1 - 2
17
Segundo STUPIELLO (1984), até 1975, o processo fermentativo tinha
aproximadamente 63% de taxa de conversão para 100 g de açúcar total. Com a incorporação
de leveduras selecionadas, melhor qualidade do mosto, controle da nutrição e de temperatura
do processo, as fermentações em batelada ganharam produtividades fermentativas, chegando
a ciclos completos de 5 a 8 horas e com rendimentos fermentativos de até 92%.
2.4 - Fluxograma simplificado do processo de produção de etanol
A Figura 08 apresenta um fluxograma simplificado para a produção de etanol,
representando apenas as etapas envolvidas no processo fermentativo. É importante ressaltar
que existem vários tipos de usinas e destilarias, destacando as seguintes categorias:
Usinas autônomas: processam a cana-de-açúcar para a produção de vários
tipos de açúcar;
Destilarias autônomas: processam a cana-de-açúcar para a produção de álcool
(hidratado ou anidro);
Destilarias anexas: são unidades próximas as usinas de açúcar que são
capazes de produzir açúcar e álcool hidratado ou anidro.
Figura 08 – Fluxograma simplificado para a produção de etanol (UDOP, 2005).
18
2.5- Descrição ilustrativa do processo industrial de produção de etanol
Os procedimentos básicos de um processo industrial específico para produção de
etanol podem ser descritos pelas seguintes etapas: limpeza da carga de cana-de-açúcar; corte e
desfibrilamento (preparação para a extração do caldo); separação do caldo e bagaço. Esse
caldo que é chamado de caldo misto, é enviado aos aquecedores e depois para um decantador,
onde são separadas as impurezas, obtendo-se o caldo clarificado.
Após resfriamento do caldo clarificado em um trocador de calor, envia-se o mesmo
para o processo fermentativo, onde é adicionada a cultura de leveduras.
A suspensão (caldo + levedura) é incubada em dornas de fermentação por até 8 horas,
obtendo-se um produto intermediário chamado vinho. Após essa etapa, o vinho é
centrifugado, separando-se as leveduras, que são denominadas de leite de levedura, que será
usado em novas fermentações.
O produto centrifugado é chamado de vinho delevedurado (contém até 8% de álcool) e
o etanol (produto final) é separado deste por destilação. Para cada 1L de etanol processado
são gerados 13L de vinhaça e esta é enviada para tratamento para se minimizar impactos
ambientais. Após o término da destilação, obtem-se o álcool hidratado, que é armazenado em
tanques e posteriormente distribuído.
2.6- Imobilização celular
De modo geral, a imobilização celular consiste em “aprisionar” um microrganismo em
determinada matriz chamada suporte (bagaço de cana-de-açúcar, géis como o alginato e
pectina, siltito e crisotila, que é um resíduo da indústria produtora de cerâmica).
Em processos biotecnológicos, a imobilização celular tem-se mostrado uma técnica
promissora, pois permite a operação de fermentação em condições de alta densidade celular,
além de evitar o washout de células durante operações com altas vazões de alimentação e
possibilitar a reutilização das células em sistemas em batelada e contínuo. Em processos de
produção de etanol, por exemplo, existe a possibilidade de ganhos, evitando-se a etapa de
centrifugação e conseqüentemente a economia de energia.
Segundo CARVALHO (2000), a utilização da técnica tem sido recomendada uma vez
que possibilita a obtenção de elevadas concentrações celulares por unidade de volume do
reator, maximiza a fração de meio fermentativo descarregada ao final de cada batelada,
facilita a reutilização dos biocatalisadores, minimiza tempos “mortos” e custos de separação e
confere maior estabilidade às células.
19
O aprisionamento em gel de alginato de cálcio é a técnica mais amplamente utilizada
para a imobilização de células viáveis. O alginato é um polissacarídeo presente em todas as
“algas marrons”, embora poucas espécies sejam comercialmente importantes (CARVALHO,
2000). A gelificação do alginato ocorre rapidamente na presença de íons cálcio sem alterações
drásticas de temperatura, pH e pressão osmótica, o que permite preservar a atividade e a
viabilidade dos microrganismos imobilizados. Além disso, o alginato é um material barato e
facilmente encontrado (BATISTA et al., 1999).
ORIVE et al. (2002) afirmam que a pureza do alginato também é um fator de
biocompatibilidade de microesferas e tem uma influência direta no processo fermentativo.
Outro fator importante que viabiliza a utilização da técnica de imobilização em alginato é a
possibilidade do preparo de grandes quantidades de pellets de maneira fácil e relativamente
rápida.
WENDHAUSEN JUNIOR (1998) apresenta como vantagens do uso de células
imobilizadas:
Processamento através de regime multienzimático;
Maior densidade celular por volume de reator;
Facilidade de separação do meio reacional;
Possibilidade de operar em sistema contínuo com maior controle sobre a
permanência das células dentro do reator;
Utilização de altas taxas de diluição sem possibilidade de eluição do
biocatalisador;
Redução da fase de adaptação do microrganismo (fase lag);
Maior conversão;
Menor inibição pelos produtos formados;
Menor tempo reacional;
Controle do crescimento da biomassa.
COX e NELSON (2002) destacam a importância de sistemas imobilizados e suas
vantagens, como por exemplo, a possibilidade de percolamento de um leito fixo com o meio
fermentativo e a coleta do produto de interesse no efluente.
WENDHAUSEN JUNIOR (1998) descreve os mais diversos métodos de imobilização
de biocatalisadores que tem sido relatados na literatura, e encontram-se destacados na Figura
09.
20
ADSORÇÃO LIGAÇÃO IÔNICA LIGAÇÃO COVALENTE
LIGAÇÃO A SUPORTE SÓLIDO
LIGAÇÃO COVALENTE
RETICULAÇÃO
GEL MICROCÁPSULAS FIBRA
APRISIONAMENTO
FORMAS DE IMOBILIZAÇÃO
Figura 9 - Métodos de imobilização celular (WENDHAUSEN JUNIOR, 1998).
O mais popular método de aprisionamento é o que utiliza matrizes de gel, sendo que
os géis de cálcio são os mais utilizados devido a sua resistência ao ataque por microrganismos
ou enzimas. Um aspecto negativo do método de aprisionamento deve-se as limitações
difusionais do substrato e produto na matriz de gel, que necessitam de estudos mais
detalhados para aperfeiçoamento da metodologia de imobilização celular.
Segundo MATTIASSON (1982), citado por WENDHAUSEN JUNIOR (1998), o
método de reticulação ou ligação cruzada baseia-se na ligação covalente entre moléculas do
biocatalisador, criando aglomerados, através de um agente ligante, como por exemplo,
glutaraldeído. Os microrganismos têm uma tendência natural de aderência sobre superfícies
sólidas, e esse, é o principio da imobilização por adsorção.
FERREIRA (1986) afirma que os problemas mais evidentes relacionados à utilização
da técnica de imobilização de leveduras em gel são:
Vida útil do conjunto suporte / levedura;
Retirada do CO2 produzido na fermentação alcoólica;
Retirada de energia do sistema.
CARVALHO (2000), estudando a imobilização de Candida guilliermondii FTI 20037
em gel de alginato de sódio, verificou que as variações nos parâmetros de imobilização
exerceram influências sobre a estabilidade química do suporte e sobre a capacidade
fermentativa das células imobilizadas, mostrando que estudos no sentido de desenvolver
metodologias e planejamento para técnica de imobilização devem ser estimulados e
desenvolvidos.
Nas Figuras 10 e 11, pode-se observar os tipos de forças de atração e as diversas
formas de imobilização.
21
Forças eletrostáticas Reagente Bifuncional Membrana com microporos
Matriz porosa Fase líquida Canal insolúvel
Figura 10- Características e tipos de suporte utilizados nas diversas técnicas de imobilização,(KOURKOUTAS et al., 2003).
Adsorção em uma superfície Ligação eletrostática em
uma superfície
Ligação covalente em uma superfície
Aprisionamento em matrizporosa
Floculação natural ou agregação
Floculação artificial ou Ligação cruzada
MicroencapsulaçãoMicroencapsulação
interfacial
Contenção entre membrana com microporos
Figura 11- Métodos básicos de imobilização (KOURKOUTAS et al., 2003).
2.7- Coeficiente de partição
A estrutura cinética em uma reação envolvendo células imobilizadas em suportes
inertes pode ser atribuída em parte a mudanças nas concentrações das espécies químicas e a
efeitos locais devido ao efeito de partição e efeito difusional, onde a partição está ligada ao
equilíbrio de fases entre a partícula de gel e o fluido que a envolve. E o efeito difusional está
22
relacionado à resistência a transferência de massa das espécies químicas que difundem no gel,
segundo YAMANÉ et al. (1981), citados por FERREIRA (1986) e GUBULIN (1986).
O efeito de partição aparece devido a uma distribuição desigual da concentração de
solutos na superfície de contato entre a matriz e o fluido adjacente, em geral expresso por uma
constante de equilíbrio definida como coeficiente de partição, Kp, (FERREIRA,1986).
Em equilíbrio termodinâmico tem-se que:
iGPi
iF
CK
C(1)
onde:
PiK ..............Coeficiente de partição da espécie química i;
iGC .............Concentração da espécie química i no interior da matriz;
iFC .............Concentração da espécie química i no interior do fluido adjacente
(solução externa á partícula gelatinosa).
INCROPERA (2002) afirma que para mecanismos de difusão dos líquidos em sólidos
não existem teorias gerais disponíveis e apenas resultados limitados são encontrados na
literatura.
De acordo com a lei da conservação de massa, a taxa na qual a massa de uma
determinada espécie entra em um volume de controle menos a taxa na qual a massa da espécie
deixa o volume de controle deve ser igual a taxa na qual a massa da espécie é armazenada no
mesmo volume de controle.
Tomando um pellet como volume de controle, de acordo com a Figura 12, tem-se que
o balanço de massa correspondente à entrada de substrato A é dado pela Equação 2:
23
Figura 12- Representação esquemática do pellet com a entrada do substrato e saída do
produto.
A, entra A, gerado A, sai A, armazenadoFluxo de Massa Fluxo de Massa -Fluxo de Massa Fluxo de MassadMA
dt
(2)
Para o caso de coordenadas esféricas tem-se que:
2 *2 2 2 2
1 1 1 sinr sin r sin
A A AAB AB AB A
Ax x xD r D D N
r r r t
C
(3)
HANDRIKOVÁ (1996), utilizando alginato de cálcio como suporte, propôs o modelo
descrito pela Equação 4 para coeficiente de difusão efetivo, baseado na cinética de Monod. O
modelo proposto baseia-se na dependência entre a taxa de reação por unidade de volume da
partícula (r0), em regime isotérmico e a partícula homogênea:
03 e s
r R
D dCr
R dr(4)
O gradiente de concentração de substrato Cs na superfície da partícula é obtido
resolvendo-se a equação reação-difusão abaixo:
24
2
22
2 0S S Se X
m S
d C dC CD K C
dr r dr K C (5)
Com suas condições de contorno:
0 0S
S s
dCr
drr R C C b
(6)
CSb ---- Concentração de substrato na fase bulkCx ---- Concentração celularCS ---- Concentração de substrato na superfície da partícula De ---- Coeficiente de difusão efetivo K2 ---- Parâmetro da equação de Monod Km ---- Parâmetro da equação de Monod
Resolvendo-se as Equações (5-6) tem-se o modelo para o cálculo do coeficiente de
difusão efetivo em alginato de cálcio, Equação 7 (HANDRIKOVÁ, 1996):
0S Sb S P
P P
V dC V dCr
V dt V dtb (7)
HANDRIKOVÁ (1996) afirma que na concentração de 100mM de glicose, a 300C e
utilizando um reator batelada o De (coeficiente de difusão efetivo) é de 2,9.10-10 m2s-1.
2.8- Projeto de experimentos
A ferramenta estatística de planejamento de experimentos e superfícies de resposta,
RSM (Response Surface Methodology), não é nova, ela foi proposta por Box nos anos de
1950 e apresenta as mais diversas possibilidades de aplicações, como por exemplo, a redução
do teor de oxigênio dissolvido em cervejas e otimização de processos de fermentação.
Com o desenvolvimento da tecnologia e novas propostas para as ferramentas da
qualidade como TQM (Total Quality Managemente) e JIT (Just in Time), a técnica de
planejamento de experimentos ganhou destaque com a implementação da metodologia Six-
Sigma, que é mais uma filosofia de trabalho do que uma simples técnica matemática. Segundo
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essa metodologia, todos os processos operando no “estado” Six-Sigma geram apenas 3,4
defeitos por milhão de ensaios (NETO, 2001).
Em geral, o planejamento composto central (PCC) deve ser utilizado quando se deseja
verificar a existência de uma curvatura da função objetivo, ou seja, quando se deseja verificar
a existência de termos não lineares no modelo de regressão. Esse tipo de planejamento
consiste de uma parte referente ao planejamento fatorial 2k, com nF corridas, 2k corridas
axiais ou estrela e nC corridas centrais (CALLADO et al., 2001).
Quatro diferentes modelos podem ser testados seqüencialmente no planejamento
composto central:
Somente termos lineares dos efeitos principais;
Termos lineares e quadráticos dos efeitos principais;
Termos lineares dos efeitos principais e interações de segunda ordem;
Termos lineares e quadráticos dos efeitos principais e interações de segunda ordem.
A técnica de planejamento visa mostrar como os fatores (variáveis envolvidas no
processo) podem influenciar determinada resposta, como por exemplo, a produtividade. A
função que descreve essa influência é chamada de superfície de resposta (NETO et al., 2001).
Segundo MONTGOMERY e CALLADO (2001), quando as variáveis criticas não são
conhecidas é necessário aplicar um experimento varredura (o screen experiment), que visa
exatamente determinar quais são as variáveis mais importantes e que resultam em um melhor
desempenho do processo.
O planejamento, nesse aspecto, tem se apresentado como uma poderosa ferramenta de
análise, possibilitando o conhecimento do “melhor” caminho a ser investigado durante a
realização dos ensaios, para se evitar o estudo de “regiões” que não são relevantes na
investigação pretendida.
Como em procedimentos experimentais nem sempre é possível realizar a repetição de
ensaios, devido ao fator custo operacional e tempo, necessita-se do desenvolvimento de
ferramentas estatísticas de reconhecimento de anomalias nos resultados. O teste de Grubbs,
reconhecido pela International Organization for Standardization (ISO), é uma dessas
ferramentas. Ele admite a distribuição normal e compara a norma, medida em desvio padrão,
do valor duvidoso em relação à média do conjunto de valores. Assim, o valor duvidoso é
incluído no cálculo da média e do desvio padrão (NETO et al., 2001).
A expressão para o cálculo do teste é dada pela Equação 8, onde Xa é o valor anômalo
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do ensaio , X o valor médio dos ensaios e o desvio padrão. Se o valor do teste for maior
que o limite crítico tabelado, então o valor duvidoso é considerado anômalo.
(8)aX XG
Segundo NETO et al. (2001), uma das vantagens dos planejamentos compostos
centrais é que, por serem formados com três partes distintas, pode-se construí-los
seqüencialmente, conforme a necessidade. Se a análise estiver acontecendo em uma região da
superfície de resposta em que a curvatura não é importante, então não se precisa de um
modelo quadrático, e pode-se ter uma análise significativa com apenas a parte fatorial do
planejamento, com a qual pode-se ajustar um modelo linear e em seguida deslocar-se para a
região de interesse da superfície de resposta. Usando-se os ensaios dos pontos centrais pode-
se testar a significância da curvatura e se esta se mostrar significativa, pode-se completar o
planejamento com os pontos axiais.
2.8.1- Aplicação da função desirability em bioprocessos
A quantidade de fatores envolvidos no desempenho de bioprocessos e os respectivos
efeitos da interação entre os mesmos, tornam a análise e a otimização de processos um
procedimento complexo. Quando o número de fatores significativos em um processo é igual
ou superior a três não é mais possível a sobreposição das curvas de nível para todas as
respostas estudadas afim de se visualizar a região de ótimo e mesmo quando, apenas dois
fatores são significativos, a otimização simultânea de todos os fatores só é possível se a região
tida como ótima dos níveis dos dois fatores for a mesma para todas as respostas estudadas. É
evidente que a medida que o número de fatores aumenta, a análise torna-se ainda mais difícil
de ser realizada.
Segundo NETO (2001), um problema de otimização com várias respostas Y1 , Y2 ,..,
Yn , para o qual existe um modelo baseado no mesmo conjunto de fatores codificados X1 , X2
,..., Xn, consiste em identificar os níveis dos fatores que produzirão o conjunto de respostas
mais adequadas. Dessa forma, se o número de fatores significativos Xi gerar um modelo
ajustado, e ainda, se o número de respostas Yi não for superior a 2, pode-se sobrepor as
superfícies de resposta e localizar a região de ótimo por inspeção visual. A otimização de uma
27
resposta poderá ser realizada por técnicas de programação matemática se as demais respostas
estiverem sujeitas a determinadas restrições impostas para cada processo específico.
Para que todos os fatores operem simultaneamente em seus níveis otimizados, pode-se
aplicar a metodologia de otimização simultânea proposta por DERRINGER et al. (1980). A
metodologia consiste em transformar cada resposta Yi em uma função, que se define função
de desejabilidade (desirability) di , com valores restritos ao intervalo [0,1], conforme:
di = 1 A resposta Yi está no seu valor desejável;
i0,80 d < 1 A resposta Yi está excelente;
i0,63 d < 0,80 A resposta Yi está adequada;
i0,40 d < 0,63 A resposta Yi está aceitável, mas pobre;
i0,30 d < 0,40 A resposta Yi está no limite de aceitabilidade;
i0 d < 0,30 A resposta Yi está fora da faixa adequada;
As funções de desejabilidade para todas as respostas são combinadas em uma função
chamada desejabilidade global (D), que é a média geométrica das m desejabilidades
individuais e é dada pela Equação (1) (STEUER, 1999).
1 2 . . . .mmD d d d (9)
A otimização simultânea das várias respostas se reduz a maximização da
desejabilidade global (D). Dessa maneira, a otimização está condicionada em se determinar
quais são os di que levam ao D global máximo. Dessa forma, todas as vezes em que um valor
de di estiver fora da faixa adequada, a desejabilidade global será anulada, independentemente
dos valores das demais respostas.
De acordo com MONTGOMERY e CALLADO (2001), as funções individuais de
desejabilidade são estruturadas como:
Maximização: para que um valor desejado ótimo T seja máximo para uma resposta Y,
tem-se uma função desejabilidade definida conforme a Equação (10), onde L é o
menor valor aceitável para a resposta.