etude structurale du système de sécrétion de type iv chez brucella suis
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Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella
suis
Les bactéries Gram négatives possèdent plusieurs systèmes pour transférer le matériel génétique.
L’un de ces mécanismes est le système de conjugaison.
Ce mécanisme a été détourné par différentes bactéries pour d’autres transferts de macromolécules que
celui de matériel génétique = système de sécrétion de type IV
Echantillon des systèmes de sécrétion de type IV
(Covacci et al, 1999)
Schéma hypothétique du système de sécrétion de type IV chez Agrobacterium tumefaciens
IM
OM
PP
ext.
CP
B 7
B9
B 7
B9
SS
S
S
B4NTPB6
D4B3
NTP
B8 B11
NTP
B5 B5
B10
B2
Les composants du système de sécrétion sont codés par un opéron nommé virB
(Covacci et al, 1999)
B1
La bactérie d ’intérêt dans ce travail est Brucella suis.
- Coccobacille Gram-négatif - Zoonose affectant quelquefois l ’homme. - Pathogène intracellulaire - Famille des -2 Protéobactériacées comme Agrobacterium tumefaciens
Cette bactérie se développe, in vitro, dans les cellules HeLa et dans les macrophages, grâce à une déviation de la voie classique d’endocytose.
Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp
endocytose
Dégradation enzymatique
Interaction
phagosomeEndosome précoce
Endosome tardif
Lysosome
Brucella
Interaction
Autophagosome
Vacuole de réplication
Reticulum endoplasmiqueIntervention du
système de type IV
Les ORFs de ces deux opérons partagent un pourcentage d ’identité moyen de 26% (19,5 à 31 %)
(O ’Callaghan et al, 1999)
Objectif de ce travail :
Utilisation d ’une approche bioinformatique en vue de voir si on peut appliquer le schéma du système de sécrétion de type IV d’Agrobacterium tumefaciens à Brucella suis.
Les étapes suivies :
1) Collecter des informations au départ des séquences protéiques : - les localisations cellulaires - les motifs - les structures secondaires et tertiaires 2) Analyse plus approfondie de composants pour lesquels nous aurons pu proposer une fonction
La méthodologie :
1) Recherche d’homologues (Blast)
- Banque non redondante - Banque de structures (PDB)- Banque d’ESTs humaines
Les composants des systèmes de type IVLa relation structure/fonctionInteraction avec l’hôte
2) Prédiction de localisation sub-cellulaire (PSORT)
- 4 localisations- Ne prédit pas encore la sécrétion- Prédictions fiables (cas-tests)- Localise une peu trop souvent en membrane interne
La méthodologie (suite) :
4) Prédiction de structures secondaires (PHD)
- Localisation des structures secondaires- Prédiction d’hélices transmembranaires- Prédiction des résidus enfouis et exposés- Validation des localisations sub-cellulaires
3) Détection de motifs
a) Caractérisation d’une famille protéique (Blocks)b) Recherche de motifs fonctionnels (Prosite)
La méthodologie (fin) :
5) Prédiction de structures tertiaires (3D-PSSM, Ucla-Doe)
- Similarité de repliement protéique Relation structure / fonction
Résultats du débroussaillage du système de sécrétion de type IV chez B. suis
IM
OM
PP
ext.
CP
B 7
B9
B 7
B9
S
S
SS
B4NTP
B6
D4B3
NTP
B8 B11
NTP
B5 B5
B10
B2
Agrobacterium tumefaciensBrucella
suis
IM
OM
PP
ext.
CP
B 7
B9
B 7
B9
B4NTP
B6B3 B8 B11
NTP
B5 B5
B10
B2
orf12 ?
B1
- 8 protéines du système de sécrétion de type IV d’A. tumefaciens peuvent être transposées à B. suis.- Des fonctions ont pu être proposées ou renforcées pour deux composants du système : VirB1 et VirB5.
Conclusions du débroussaillage :
La protéine VirB1 et son homologie avec les lysozymes
La fonction proposée, dans la littérature, pour VirB1 est la
dégradation du peptidoglycane qui est aussi une des fonctions que remplissent les lysozymes.
Les topologies de VirB1 et du lysozyme sont comparables
C N
C
N
Lysozyme VirB1
Lysozyme complexé avec du NAG
La protéine VirB5 et son homologie avec la MAP1A (Microtubule Associated
Protein 1A)
VirB5 ne partage pas le motif de liaison aux microtubules.
Domaines identifiés sur la MAP1A (2805 aa)(ProDom)
PD000002
(K/R)(K/R)(D/E)Motif de liaison aux
microtubules
Ce qui s ’aligneÀ VirB5
N C
Ce bloc PD000002 est conservé par beaucoup d’autres familles protéiques. Il s ’agit en fait d’un
coiled coil
Voici un échantillon des protéines quipartagent ce motif coiled coil:
Protéines liant l’ADN :- protéines activatrices- élément de dimérisation de facteurs de transcription
Famille des v-SNARE et t-SNARE
Intéressant
Protéines fibreuses
Apolipoprotéines
Schéma d’interaction entre v-SNARE et t-SNARE
Membrane vacuolaire
Membrane organiteRE, Golgi
Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp
endocytose
Dégradation enzymatique
Interaction
phagosomeEndosome précoce
Endosome tardif
Lysosome
Brucella
Interaction
Autophagosome
Vacuole de réplication
Reticulum endoplasmiqueIntervention du
système de type IV
Conclusions :
- Nous avons pu transposer 8 composants du système de sécrétion de type IV d’A. tumefaciens à B. suis.- VirB1 dégraderait le peptidoglycane- VirB5 est le candidat préférentiel pour le détournement du trafic intracellulaire- Discussion sur la méthode employée
Perspectives :
- Validation de la fonction enzymatique de VirB1 en mutant les résidus conservés dans le site actif d’un lysozyme (mutagenèse dirigée)- Validation de la fonction de VirB5 par différentes manipulations (co-immunoprécipitation, …).- Analyse approfondie d’autres composants du complexe.