evaluación de la concentración del contaminante emergente
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Evaluación de la concentración del contaminante emergente
Triclosán en el Bagre rayado del Magdalena Pseudoplatystoma
magdaleniatum, y los posibles efectos sobre su capacidad
reproductiva
Autor(es)
Natalia Inés Zapata García
Universidad de Antioquia
Facultad de Ingeniería
Medellín, Colombia
2021
Evaluación de la concentración del contaminante emergente Triclosán en el Bagre rayado
del Magdalena Pseudoplatystoma magdaleniatum, y los posibles efectos sobre su capacidad
reproductiva
Natalia Inés Zapata García
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ingeniería Ambiental
Asesor
Gustavo Antonio Peñuela Mesa
Ph.D Química Ambiental
Línea de Investigación:
Ecotoxicología Ambiental – Contaminantes Emergentes
Grupo de Investigación:
Diagnostico y Control de la Contaminación – GDCON -
Universidad de Antioquia
Facultad de Ingeniería
Medellín, Colombia
2021
1
CONTENIDO
RESUMEN.......................................................................................................................... 10
AGRADECIMIENTOS....................................................................................................... 13
CAPITULO 1.................................................................................................................................. 14
1. Generalidades ..................................................................................................................... 14
1.1 Planteamiento del Problema y Pregunta de investigación. .............................................. 17
1.2 Objetivos ......................................................................................................................... 19
1.3 Marco Teórico ................................................................................................................. 20
1.4 Características Generales del Bagre Rayado del Magdalena. ......................................... 20
Clasificación taxonómica del Bagre Rayado ....................................................................... 22
1.5 Normatividad de Pesca .................................................................................................... 24
1.6 Estado de la Pesca en los ríos Magdalena y Cauca .......................................................... 25
1.7 Calidad del Agua Superficial en Colombia ..................................................................... 26
1.8 Afectaciones medioambientales y sociales de las hidroeléctricas ................................... 28
1.9 Bioacumulación .............................................................................................................. 28
1.10 Contaminantes Emergentes ......................................................................................... 30
1.11 Disruptores Endocrinos o EDC ................................................................................... 31
1.12 Fuentes de EDC en el ambiente .................................................................................. 32
1.13 Triclosán (TCS) .......................................................................................................... 33
CAPITULO 2 ................................................................................................................................. 39
2. Concentración De Triclosán En Agua De Los Ríos Magdalena Y Cauca
………………………………………………………………………………………………………….39
2.1 Metodología .................................................................................................................... 40
2.2 Reactivos, solventes y materiales .................................................................................... 43
2.3 Extracción y Limpieza .................................................................................................... 44
2.4 Resultados y Discusiones ................................................................................................ 45
2.5 Análisis estadístico de las variables fisicoquímicas......................................................... 46
Homogeneidad de varianzas ................................................................................................ 46
Normalidad de las variables ................................................................................................ 47
2.6 Parámetros fisicoquímicos del agua en los ríos Magdalena y Cauca. .............................. 47
2.7 Análisis de las variables fisicoquímicas por punto de muestreo. ..................................... 48
Cuenca del Magdalena ........................................................................................................ 48
2
Municipio de Barrancabermeja ........................................................................................... 48
Municipio de la Dorada ....................................................................................................... 49
Municipio de Puerto Berrío ................................................................................................. 49
Corregimiento de Puerto Serviez ......................................................................................... 49
Municipio de Puerto Triunfo ............................................................................................... 50
Cuenca del Río Cauca ......................................................................................................... 50
Municipio de La Apartada ................................................................................................... 50
Municipio de Ayapel ........................................................................................................... 50
Municipio de Caucasia ........................................................................................................ 50
Municipio de Cáceres .......................................................................................................... 51
Municipio de Nechí ............................................................................................................. 51
2.8 Análisis de las variables fisicoquímicas con respecto a la cuenca y puntos de muestreo.51
Temperatura. ....................................................................................................................... 51
pH........................................................................................................................................ 52
Oxígeno Disuelto ................................................................................................................ 53
Conductividad ..................................................................................................................... 54
Conclusiones ....................................................................................................................... 58
CAPITULO 3 ................................................................................................................................. 59
3. Concentración de Triclosán en el músculo de bagre rayado del Magdalena (Pseudoplatystoma
magdaleniatum) en el río Magdalena y Cauca. ...............................................................................
3.1 Validación del método para la determinación de TCS en músculo de bagre Rayado. ..... 60
3.2 Materiales y Métodos ...................................................................................................... 61
Condiciones para la preparación de la muestra .................................................................... 61
Manejo de campo. ............................................................................................................... 61
Transporte y conservación. .................................................................................................. 61
Condiciones de laboratorio. ................................................................................................. 61
Para la preparación - fileteado, desuello/molienda .............................................................. 62
Envasado. ............................................................................................................................ 62
Congelación. ....................................................................................................................... 62
3.3 Tratamiento y Análisis de las muestras. ........................................................................ 62
3.4 Preparación de la muestra .............................................................................................. 63
3.5 Reactivos, solventes y materiales .................................................................................. 63
3.6 Condiciones Cromatográficas ......................................................................................... 64
3
3.7 Proceso de Validación del Método. ................................................................................. 64
Linealidad............................................................................................................................ 65
Límites de detección y cuantificación ................................................................................. 65
Selectividad y Efecto matricial ............................................................................................ 66
Veracidad ............................................................................................................................ 66
Precisión (repetibilidad) ...................................................................................................... 66
Estabilidad ........................................................................................................................... 67
3.8 Monitoreo en matrices ambientales ................................................................................. 67
3.9 Resultados y Discusiones ................................................................................................ 67
Linealidad............................................................................................................................ 67
Límite de cuantificación ...................................................................................................... 71
Selectividad y efecto matriz ................................................................................................ 72
Veracidad ............................................................................................................................ 72
Repetibilidad ....................................................................................................................... 72
Estabilidad ........................................................................................................................... 74
3.10 Prueba del método validado en muestras ambientales ................................................ 74
3.11 Conclusiones ............................................................................................................... 77
CAPITULO 4 ................................................................................................................................. 78
4. Evaluación de la calidad seminal de bagre rayado Pseudoplatystoma magdaleniatum expuesto
a Triclosán. .................................................................................................................................. 78
4.1 ............................................................................................................................................ 78
4.2 Metodología .................................................................................................................... 78
Material biológico ............................................................................................................... 78
4.3 Manejo y tratamientos ..................................................................................................... 80
4.4 Colecta y análisis de semen ............................................................................................. 80
4.5 Movilidad total y tipos de movilidad............................................................................... 81
4.6 Progresividad, velocidad e índices espermáticos. ............................................................ 82
Tiempo de activación. ......................................................................................................... 82
Concentración espermática. ................................................................................................. 82
4.7 Consideraciones éticas y experimentación con especímenes........................................... 82
4.8 Análisis estadístico .......................................................................................................... 83
4.9 Resultados y Discusiones ................................................................................................ 83
4.10 Evaluación microscópica. ........................................................................................... 83
4
4.11 Movilidad total y Velocidad Espérmica ...................................................................... 84
4.12 Velocidad y Progresividad Espermática ..................................................................... 85
Velocidad Curvilínea (VCL) ............................................................................................... 87
Velocidad de la trayectoria promedio (VAP) ...................................................................... 88
Velocidad Lineal o rectilínea (VSL) .................................................................................... 88
Índice de rectitud (STR) ...................................................................................................... 88
Índice de Linealidad o LIN.................................................................................................. 88
Índice de Oscilación (WOB) ............................................................................................... 89
Frecuencia de Batida (BCF) ................................................................................................ 89
4.13 Conclusiones ............................................................................................................... 92
CAPITULO 5 ................................................................................................................................. 93
5. Cuantificación de Vitelogenina en plasma del bagre rayado del Magdalena
(Pseudoplatystoma magdaleniatum) después de ser expuesto a Triclosán .................................. 93
5.1 Materiales y Métodos ...................................................................................................... 96
Animales de Experimentación. ............................................................................................ 96
5.2 Colecta y Análisis de Plasma para medición de Vtg ....................................................... 96
5.3 Análisis Estadístico ......................................................................................................... 97
5.4 Resultados ...................................................................................................................... 97
Concentración de Vtg en las muestras de plasma de P. magdaleniatum. ............................. 97
Análisis estadístico por medio de la prueba ANOVA y Levene’s ..................................... 100
Comparación de dos muestras – tiempo cero y tiempo final ............................................. 101
Prueba de Kolmogorov-Smirnov ....................................................................................... 102
5.5 Discusiones ................................................................................................................... 103
5.6 Conclusiones ................................................................................................................. 104
CAPITULO 6 ............................................................................................................................... 105
6. Determinación de pérdida del potencial de membrana y daño de ADN del bagre rayado
Pseudoplatystoma magdaleniatum expuesto a Triclosán. .......................................................... 105
6.1 Materiales y Métodos .................................................................................................... 105
Animales de Experimentación. .......................................................................................... 105
Colecta y Análisis de Plasma ............................................................................................ 105
6.2 Análisis mediante citometría de flujo ............................................................................ 105
6.3 Análisis estadístico ........................................................................................................ 106
5
6.4 Resultados y Discusión ................................................................................................. 106
6.5 Conclusiones. ................................................................................................................ 111
PRODUCTOS ASOCIADOS ...................................................................................................... 112
7. Publicaciones Científicas ................................................................................................... 112
7.1 Participación en Congresos: .......................................................................................... 112
7.2 Socialización de Resultados .......................................................................................... 112
REFERENCIAS ........................................................................................................................... 113
6
INDICE DE FOTOS
Foto 1. Ejemplar de Experimentación (Cinpic, marzo 2020) .............................................. 22
Foto 2. Ejemplares de Puerto Triunfo. Hembra izquierda, macho derecha. ........................ 23
Foto 3. Toma de medidas in situ – pH, Conductividad eléctrica, Oxígeno Disuelto,
Temperatura del Agua – (Puerto Serviez) ............................................................................ 43
Foto 4. Toma de muestras de agua superficial en el Río Magdalena – Puerto Serviez ....... 43
Foto 5. Preparación de muestras en cavas con hielo para su preservación .......................... 43
Foto 6. Proceso de Extracción de los contaminantes por PSE ............................................. 44
Foto 7. Viales ámbar con extractos finales para lectura en UPLC-MS-MS ........................ 44
Foto 8. revisión de condiciones organolépticas para el procesamiento de la muestra ......... 62
Foto 9. Molienda del músculo para ser almacenado en bolsas sellables y tubos Falcón de
50ml. ..................................................................................................................................... 62
Foto 10. Muestras procesadas y rotuladas para conservación en freezer a -18°C ............... 62
Foto 11. Estanques en Geomembrana Circulares y aireación asistida para la
experimentación con bagres ................................................................................................. 79
Foto 12. Instalaciones del Centro de Investigación Piscícola – Universidad de Córdoba-
CINPIC ................................................................................................................................. 80
Foto 13- Estanques de experimentación rectangulares -CINPIC ......................................... 80
Foto 14. Masaje craneocaudal para extracción de esperma ................................................. 81
Foto 15. Microscopio óptico de contraste de fase y el programa SCA® utilizados en las
instalaciones del CINPIC...................................................................................................... 81
Foto 16. Cámara de conteo Makler ...................................................................................... 81
Foto 17. Extracción de sangre en vena caudal con aguja Vacutainer .................................. 96
Foto 18. Tubos EDTA con muestras de sangre para análisis ............................................... 96
Foto 19. Muestra de plasma en tubos de microcentrífuga ................................................... 97
Foto 20. Siembra de muestras en Kit ELISA ....................................................................... 97
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Afinidad de las sustancias a bioacumulación según su valor de KOW ................... 30
Tabla 2. información Espectral- Propiedades del TCS.(PubChem, 2020) .......................... 33
Tabla 3. Producción Global de Triclosán por región (EPA-Denmark, 2016) ..................... 36
Tabla 4. Campañas y sitios de muestreo .............................................................................. 42
7
Tabla 5. Análisis Estadístico de las Variables continuas de temperatura, pH, Conductividad
eléctrica y Oxígeno Disuelto Vs Cuenca, Puntos de muestreo y temporada Climática ....... 47
Tabla 6. Resultados de las variables fisicoquímicas analizadas .......................................... 56
Tabla 7. Condiciones usadas de los compuestos en el UPLC/MS/MS................................ 64
Tabla 8. Resultados R2, tests Shapiro-Wilk, Durbin-Watson y Breusch-Pagan .................. 69
Tabla 9. Límites de cuantificación para cada compuesto .................................................... 71
Tabla 10. Resultados t-Student, F- Snedecor y Grubbs para Ibuprofeno, Diclofenaco y
Triclosán ............................................................................................................................... 72
Tabla 11. Porcentajes de recuperación y RSD..................................................................... 72
Tabla 12. Resultados a tres niveles de concentración por analista ...................................... 73
Tabla 13. Concentraciones de Triclosán en las muestras de peces recolectadas en río Cauca
y Magdalena. ........................................................................................................................ 76
Tabla 14. Volumen, concentración espermática y tiempos de activación de bagre rayado P.
magdaleniatum a tres concentraciones de Triclosán. ........................................................... 84
Tabla 15. Resultados de movilidad total, tipos de movilidad y progresividad total para
peces expuestos a 25 y 50 μg/L de TCS ............................................................................... 85
Tabla 16. Resultados de progresividad total para peces expuestos a 25 y 50 μg/L de TCS 87
Tabla 17. Motilidad espérmica evaluados para las muestras de P. magdaleniatum expuesto
a 25 y 50 μg/L de TCS. ......................................................................................................... 90
Tabla 18. Concentración de Vtg en P. magdaleniatum, tiempo cero de exposición. .......... 98
Tabla 19. Concentración de Vtg después de 9 meses de exposición a 25 y 50 µg/L TCS. . 99
Tabla 20. Prueba estadística Levene´s- y ANOVA para los tratamientos (0, 50 y 25 μgTCS
/L) ....................................................................................................................................... 100
Tabla 21. Resumen estadístico comparación de dos muestras - Tiempo cero y tiempo final
de Vtg después de ser expuesto a dos concentraciones de TCS ......................................... 101
Tabla 22. Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨM) en sangre expuesto a dos
concentraciones de TCS ..................................................................................................... 107
Tabla 23. Viabilidad celular y respuesta autoinmune por la exposición a TCS. ............... 110
ÍNDICE DE FIGURAS
8
Figura 1. Holotipo, Pseudoplatystoma magdaleniatum, escala 15 cm, LE de 421.5 mm,
CAS 19165.(Buitrago-Suárez, U.A & Burr, 2007) ---------------------------------------------- 21
Figura 2. Desembarcos en puertos comerciales de Bagre Rayado en la Cuenca Magdalena-
Cauca (Fundación Humedales, 2014) -------------------------------------------------------------- 25
Figura 3. Estado de la calidad del agua superficial en la región andina ---------------------- 27
Figura 4. Principales rutas de absorción y eliminación de sustancias químicas en
peces.(Arnot & Gobas, 2006) ----------------------------------------------------------------------- 29
Figura 5. Fuentes de EDC en aguas ambientales y exposición humana (Caballero-Gallardo
et al., 2016) -------------------------------------------------------------------------------------------- 33
Figura 6. Sitios de muestreo en el río Magdalena y Cauca – Colombia. --------------------- 41
Figura 7. Concentraciones de Triclosán en los Ríos Magdalena y Cauca por Época
Climática ----------------------------------------------------------------------------------------------- 46
Figura 8. Variación de la temperatura por cuenca (cuenca 1-Magdalena; Cuenca 2- Cauca)
Y por puntos de muestreo.--------------------------------------------------------------------------- 52
Figura 9. Variación del pH por cuenca (cuenca 1-Magdalena; Cuenca 2- Cauca) Y puntos
de muestreo. ------------------------------------------------------------------------------------------- 53
Figura 10. Variación del Oxígeno Disuelto por cuenca (cuenca 1-Magdalena; Cuenca 2-
Cauca) Y puntos de muestreo. ---------------------------------------------------------------------- 54
Figura 11. Variación de Conductividad eléctrica por cuenca (cuenca 1-Magdalena; Cuenca
2- Cauca) Y puntos de muestreo. ------------------------------------------------------------------- 55
Figura 12. (a) Curva de Calibración para Triclosán, (b) Curva de Calibración Ibuprofeno
(c) Curva de Calibración Diclofenaco ------------------------------------------------------------- 68
Figura 13. Cromatograma Transición del Triclosán 288.9˃37 y 288.9˃35 ------------------ 70
Figura 14. Cromatograma Muestra Positiva ----------------------------------------------------- 70
Figura 15. Cromatograma Blanco ----------------------------------------------------------------- 71
Figura 16. Resultados de la Concentración de Triclosán en muestras de bagre rayado y
temporada climática. --------------------------------------------------------------------------------- 75
Figura 17. Porcentaje de movilidad total de los espermatozoides de bagre rayado --------- 85
Figura 18. . Resultados de progresividad espermática a 3 niveles de concentración (0-
control, 25 μgTCS/L y 50 μgTCS/L --------------------------------------------------------------- 86
9
Figura 19. Interpolación de datos con la curva de absorbancia obtenida por regresión
lineal- Kit ELISA. Tiempo cero. ------------------------------------------------------------------- 98
Figura 20. Interpolación de datos con la curva de absorbancia obtenida por regresión
lineal- Kit ELISA, tiempo final (9 meses de exposición a 25 y 50 µg/L TCS) -------------- 99
Figura 21. Concentración de Vitelogenina tiempo cero y tiempo final. --------------------- 100
Figura 22. Diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher para los 3 niveles de
concentración de TCS ------------------------------------------------------------------------------- 102
Figura 23. Gráfico de Cuartiles para tiempo cero y tiempo final de la concentración de Vtg
en peces expuesto a dos concentraciones de TCS (25 y 50µg/L). ---------------------------- 102
Figura 24. Análisis representativo por citometría de flujo de viabilidad de células
expuestos a 3 tratamientos (0, 25 y 50 µg/L TCS) ---------------------------------------------- 108
Figura 25. Representación del análisis por citometría de flujo del daño al ADN después de
ser expuestos. ---------------------------------------------------------------------------------------- 110
10
RESUMEN
Entre los diversos componentes de los Productos de Cuidado Personal o PPCP, los agentes
antimicrobianos como el Triclosán o TCS están presentes en los vertimientos a través de su amplio
uso como geles, champús, jabones, desodorantes, lociones, cremas solares, cosméticos, pastas de
dientes, perfumes, repelentes de mosquitos, entre otros. El Triclosán es considerado un disruptor
endocrino con posibles efectos tóxicos en la reproducción y otros sistemas intervenidos por
hormonas, actuando en la actividad biológica del hombre y los animales (Bester, 2005; Gao et al.,
2015; Lee et al., 2012; Lindström et al., 2002; Nishi et al., 2008; Sanz, 2017).
El Triclosán es un contaminante emergente catalogado como una de las sustancias más
frecuentemente detectada en el ambiente (agua, suelo) y en los organismos vivos. En la última década,
estudios han demostrado su toxicidad en organismos acuáticos, su bioacumulación y los efectos sobre
el comportamiento, desarrollo y reproducción de peces (Dar et al., 2020; Hemalatha et al., 2019;
Stenzel et al., 2019; Tabares et al., 2005).
Recientes reportes revelan su potencial efecto nocivo sobre los seres vivos y a pesar de que aún existe
mucha discusión sobre este aspecto, es necesario tener resultados contundentes acerca de su real
peligro, por lo que es necesario llevar a cabo estudios sobre su acumulación y efectos disruptivos en
los peces, principalmente del bagre rayado del magdalena que es una especie emblemática de los ríos
de Colombia, migratoria y en estado crítico de conservación, por lo que en el presente documento se
registran los resultados obtenidos luego de llevar a cabo una propuesta de investigación que pretende
cuantificar la concentración de Triclosán en el músculo del bagre rayado y en el agua de los ríos
Magdalena y Cauca en cinco puntos de muestreo a la orilla de ambos ríos y determinar si el Triclosán
afecta la capacidad reproductiva del bagre, aumento de la Vitelogenina (Vtg) en machos y daño
celular luego de ser expuestos a dos concentraciones de Triclosán (25 µg/L y 50 µg/L TCS) durante
nueve meses.
Para facilitar la lectura del trabajo de investigación, este se encuentra dividido en seis capítulos en los
cuales se busca desarrollar las preguntas que motivaron la realización de esta investigación,
desarrollando metodologías y presentando los resultados más relevantes que permitan integrar y
entender los efectos del Triclosán sobre el bagre rayado del Magdalena.
En el primer capítulo se pretende introducir al lector en los conceptos generales de la investigación,
para que se puedan desarrollar las preguntas de investigación y fundamenten teóricamente los
siguientes capítulos. En el capítulo dos, se determinó la concentración de Triclosán en el agua del río
Magdalena y Cauca, con el método de Extracción en Fase Solida o SPE siguiendo las
recomendaciones de la EPA 1694: Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water y
cuantificación por UPLC-MS-MS. Se analizaron en total de 150 muestras de agua donde se detectó
11
la presencia de TCS por encima de 0.5 µg/L en aguas río Magdalena, en todos los puntos de muestreo
seleccionados en la temporada de lluvias del año 2018 y Seca del año 2019; para el río Cauca se
detectó TCS en la época de lluvias del año 2019 en tres puntos de muestreo (Nechí, Guarumo y la
Apartada).
En el capítulo tres, se determinó la cuantificación de Triclosán en el músculo del bagre rayado, para
ello se desarrolló un método analítico simple, rápido y sensible para la extracción y cuantificación del
Triclosán en el músculo del bagre rayado. El método de extracción utilizado para músculo del bagre,
fue el QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged & Safe) y la cuantificación fue realizada
por la UPLC-MS. El método fue validado de acuerdo con los requisitos de rendimiento del Apéndice
F de la AOAC. Los resultados mostraron que el método es preciso y reproducible, El valor del Límite
de Cuantificación o LOQ en el tejido de los peces fue de 20 µg/kg-peso húmedo(dw). Los valores de
desviación estándar relativa o RSD para la repetibilidad y la precisión intermedia fueron < 20,3%. La
linealidad tiene coeficientes de correlación (r) superiores a 0,99 para el rango de 20- 400 µg/kg. Se obtuvieron
recuperaciones de 63-112% para el Triclosán. Luego de realizar el proceso de análisis de las muestras de músculo
del pez bagre rayado, se detectó el contaminante Triclosán en concentraciones de hasta 54,67 µg/kg dw, es
importante resaltar que esta es la primera investigación de este tipo realizada en peces de agua dulce en Colombia.
En el capítulo cuatro, se realiza la evaluación de la calidad seminal del bagre rayado, luego de ser expuesto a tres
concentraciones de Triclosán (0 (control), 25 y 50 μg /L), donde se determinó que el Triclosán afecta la
movilidad y progresividad de los espermatozoides siendo inferiores al 50% y aumentando los
espermatozoides no progresivos (superior al 50%), los parámetros cinéticos de los espermatozoides
también se vieron afectados por la exposición a este contaminante.
En el capítulo cinco se cuantifica la concentración de Vitelogenina en los machos de bagre rayado,
pues en los peces, los principales componentes del huevo, como la Vitelogenina (Vtg) y las proteínas
de la cáscara del huevo o proteína de la zona radiada (Zrp), son sintetizados en el hígado de las
hembras bajo regulación endocrina y transportados a la sangre para ser tomados posteriormente por
el oocito. Tanto machos como hembras tienen receptores hepáticos para estrógenos, pero solo el
hígado de los peces hembras están expuestos normalmente a los estrógenos. Por lo tanto, la
producción de estas proteínas en peces macho o peces inmaduros proporciona un indicador útil para
detectar la presencia de disrupción endocrina con actividad estrogénica(Taborda & Rodríguez, 2010).
Debido a que el TCS es estructuralmente similar a los estrógenos naturales, se desarrolla la hipótesis
de que el TCS puede inducir la producción de Vtg en el bagre Rayado, determinándose que la
concentración de Vtg encontrada en los machos de bagre rayado, indica que los peces ya tienen
previamente una condición de disrupción desde su ambiente natural y que los tratamientos a los que
fueron sometidos no afectaron su condición preexistente, sino que se mantuvieron en el tiempo.
12
El capítulo seis se determinó la pérdida del potencial de membrana (ΔψM) y daño en el ADN del
bagre rayado luego de su exposición al Triclosán, la viabilidad celular permaneció cercana al 100%
para todos los tratamientos. La determinación del potencial de la membrana mitocondrial sirve como
un medio para proporcionar evaluación cuantitativa más inmediata del riesgo potencial a exposiciones
ambientales de contaminantes. Por lo tanto, el ΔψM podría funcionar como un nuevo biomarcador y
podría ser utilizado en programas de biomonitoreo. En este estudio, la integridad del ADN no se vio
afectada por la exposición a TCS (p <0,05) y se evidencia un leve incremento en las células 4n o con
fragmentación de ADN en el tratamiento de 50 µg/L TCS, también se evidencia el incremento de
leucocitos, que es un indicador de la respuesta inmune a los tóxicos, efecto de productos
químicos.(Paul et al., 2019)
Palabras clave: Triclosán, disruptor endocrino, Bagre Rayado, Río Magdalena, Río Cauca,
Pseudoplatystoma, daño mitocondrial, ADN, Vitelogenina en peces, calidad seminal
13
AGRADECIMIENTOS
Quiero agradecer a todas aquellas personas que contribuyeron al desarrollo, planeación y realización
de esta investigación, que me brindaron siempre su apoyo, sonrisas, recomendación y motivación
para seguir adelante y conseguir culminar este sueño.
Al Dr, Gustavo Peñuela, por abrirme las puertas del grupo GDCON, por su tiempo, confianza, guía
y consejo durante todo este tiempo.
A mi familia, mi esposo y mi hija, por la paciencia, amor, comprensión y apoyo incondicional.
A Sara Gallego y Silvia Cacua por ser excelentes compañeras de viaje y por tener siempre una sonrisa
y una mano extendía cada vez que la necesitaba.
A todos mis compañeros y amigos del grupo GDCON que me guiaron, apoyaron y aconsejaron
durante todo este tiempo y a todos los que me apoyaron en la realización de diferentes análisis.
Al profesor Néstor Aguirre Profesor Investigador grupo GEOLIMNA
A la Estación Piscícola San José del Nus de la Universidad de Antioquia, Don Otoniel, Camilo, Laura,
Juan Carlos y Juan David, por toda su ayuda, amistad y calidad humana conque siempre nos recibían.
Al profesor Víctor Atencio coordinador del Centro de Investigación Piscícola CINPIC de la
Universidad de Córdoba y todo su equipo técnico y estudiantes por su gran colaboración en el
desarrollo de este trabajo, su calidez, amabilidad y acogida.
El profesor Mauricio Rojas coordinador del grupo de Inmunología Celular e Inmunogénica (GICG)
de la Universidad de Antioquia
La profesora Beatriz Peña del Grupo de Reproducción de la Universidad de Antioquia
Al señor Robinson Bergara, pescador de Puerto Berrío, por su gran colaboración en las faenas de
pesca y consecución de los peces que requerimos para esta investigación.
14
CAPITULO 1. Generalidades
El término de contaminantes emergentes (CE) generalmente se utiliza para referirse a compuestos de
distinto origen y naturaleza química, cuya presencia en el medio ambiente no se considera
significativa en términos de distribución y/o concentración, por lo que pasan inadvertidos; no
obstante, ahora están siendo detectados y tienen el potencial de acarrear un impacto ecológico, así
como efectos adversos sobre la salud. Estos causan efectos negativos a los organismos acuáticos,
debido a que continuamente ingresan a los recursos hídricos (Janet Gil et al., 2012; López-Doval et
al., 2019).
La contaminación ambiental por productos químicos peligrosos, como productos farmacéuticos y de
cuidado personal (PPCP), han sido de gran preocupación en la última década, debido a que estos
compuestos tienen un alto contenido de actividad biológica (Nishi et al., 2008; Park et al., 2017).
Estas sustancias son móviles, persistentes y bioacumulables en la vida silvestre y tejido humano, lo
que plantea una serie de preguntas sobre la seguridad de los ciudadanos. Los Contaminantes que
resultan de productos farmacéuticos y de cuidado personal no están regulados o están en proceso de
regulación, y poseen potentes propiedades disruptivas endocrinas (Tijani et al., 2016).
Entre los diversos componentes de los Productos de Cuidado Personal o PPCP, los agentes
antimicrobianos como el Triclosán son importantes debido a su eficacia como bactericida contra
Gram positivos y bacterias, estando presentes en los vertimientos a través de su uso como geles,
champús, jabones, desodorantes, lociones, cremas solares, cosméticos, pastas de dientes, perfumes,
repelentes de mosquitos, entre otros (Bester, 2005; Gao et al., 2015; Lee et al., 2012; Lindström et
al., 2002; Nishi et al., 2008; Sanz, 2017).Una diferencia importante con otro tipo de productos
farmacéuticos y de uso personal, es que, al aplicarse externamente, no hay cambios metabólicos
previos a su liberación al medio, es decir, en las aguas residuales se puede encontrar el compuesto
original (Pal et al., 2014; Sanz, 2017).
El Triclosán (TCS) es considerado un disruptor endocrino o EDC con posibles efectos tóxicos en la
reproducción y otros sistemas intervenidos por hormonas, actuando en la actividad biológica. El TCS
puede degradarse a productos como metiltriclosán [MeTCS, 5-cloro-2- (2,4-di-clorofenoxi) anisol)],
que es más persistente, lipofílico, bioacumulativo y estable que TCS (Dar et al., 2020; Hemalatha et
al., 2019; Lindström et al., 2002; López-Doval et al., 2019). Más allá de sus efectos en animales, el
TCS es altamente tóxico para las bacterias y pueden bioacumularse en biopelículas (López-Doval et
al., 2019; Reichert et al., 2019). Por ser lipofílico (coeficiente de partición octanol-agua log Kow =
4.8), presenta bioacumulación en los organismos. Se ha observado que causa efectos tóxicos sobre el
comportamiento, desarrollo y reproducción de peces (Bedoux et al., 2012; Dar et al., 2020; Elodie et
15
al., 2017; Escarrone et al., 2016; Falisse et al., 2018; Guruge et al., 2019; Nag et al., 2018; Paul et al.,
2019; Tabares et al., 2005).
Se ha demostrado que el TCS puede elevar significativamente la Vitelogenina (Vtg) y expresión de
ARNm del macho maduro del pez mosquito occidental (gambusia) y a la carpa amarilla (Cyprinus
carpio), lo que sugiere que TCS tiene el potencial de actuar como EDC (Dar et al., 2020; Huang et
al., 2014; F. Wang et al., 2019), también se estudió su efecto endocrino en moluscos (Tran et al.,
2019) en la inducción a fecundidad reducida y estrés oxidativo con transcripción a la regulación de
genes mediados por el estrés oxidativo con activación del sistema antioxidante en el copépodo T.
japonicus (Park et al., 2017). El TCS aumento la actividad de colinesterasa entre embriones de pez
cebra, que es biomarcador asociado con el desarrollo nervioso y muscular (F. Wang et al., 2019). Se
demostró su potencial para ingresar y bioacumularse en la cadena alimentaria a partir de agua,
alimentos y sedimentos, causar la disminución en el contenido de proteínas, glutatión redox
(GSH/GSSG) y actividad de acetilcolinesterasa (AChE) y en el contenido de ácidos orgánicos
(fumarato, malato, succinato y citrato) de los embriones de cuatro especies de peces alimenticios
Cyprinus carpio , Ctenopharyngodon idella , Labeorohita y Cirrhinus mrigala (Dar et al., 2020); se
demostró que el TCS es acumulado en el hígado del guppy Poecilia vivípara (Escarrone et al., 2016);
El TCS induce apoptosis en las células neuronales (Szychowski et al., 2016) y el MTCS puede inducir
a la apoptosis mitocondrial en Células HepG2 (X. Li et al., 2019).
Los hábitos de alimentación de los peces son uno de los factores básicos que determinan el ingreso
del TCS para su posterior bioacumulación, y por eso la importancia de la relación depredador-presa
y dinámica trófica de la materia orgánica. Las distribuciones específicas de los EDC en peces a
diferentes niveles tróficos en mares, lagunas y ríos han sido reportados (Escarrone et al., 2016; Fan
et al., 2019; Olaniyan et al., 2016). Sin embargo, la presencia de EDC en peces que habitan en grandes
ríos y exhiben comportamientos complejos de alimentación como es el caso del bagre rayado del
Magdalena han sido menos reportados, especialmente para ríos tropicales y subtropicales con alta
biodiversidad (Fan et al., 2019). La mayoría de los estudios se realizan en laboratorio con peces
pequeños de fácil manejo y rápido crecimiento.
El Bagre rayado del Magdalena, Pseudoplatystoma magdaleniatum es una especie de bagre
perteneciente a la familia Pimelodidae, en peligro crítico de extinción y es posible que una de las
razones de su disminución en la última década, se deba al contacto con los EDC presentes en el agua,
que influyen en la capacidad reproductiva y enzimática del mismo, adicionalmente debido a la buena
calidad de su carne y que es una especie migratoria, hacen que sea bastante vulnerable a la sobrepesca
y que por medio de su consumo, pueda estar afectando la salud humana (Mojica et al., 2012).
16
En cuanto a estudios relacionados con afectación a la salud humana se ha evidenciado que El TCS se
ha detectado en varias muestras biológicas, como la leche humana, la sangre y la orina, entre las
cuales la detección en la orina se ha utilizado con frecuencia en la evaluación de la exposición
humana.(C. F. Wang & Tian, 2015) El primer informe sobre la exposición a los TCS provino de la
detección en la leche humana en el año 2002. Se analizaron cinco muestras de leche humana
seleccionadas al azar en Suecia. En tres muestras se encontraron niveles elevados de TCS (LQO de
20 mg/kg de peso de lípidos), siendo el más alto de 300 mg/kg de peso de lípidos (Sandborgh-Englund
et al., 2006) La presencia de TCS en la leche humana produjo preocupación por la seguridad de los
recién nacidos y los lactantes, así como por la posible toxicidad para la reproducción.
Aunque el TCS puede producir efectos tóxicos en los mamíferos, los estudios existentes no
demuestran efectos tóxicos similares en el cuerpo humano, las pruebas realizadas, son limitadas y
contradictorias (Zang et al., 2019).
En la actualidad se utilizan métodos in vitro e in vivo que apoyan la conclusión de que el TCS es un
disruptor endocrino reproductivo con efectos estrogénicos y se han propuesto como mecanismos de
la acción disruptor la alteración del metabolismo hormonal, el desplazamiento de las hormonas de los
receptores y la alteración de la actividad de las enzimas esteroidogénicas. (C. F. Wang & Tian, 2015).
Las pruebas actuales sobre los efectos de alteración endocrina del TCS se ajustan al patrón típico de
las primeras pruebas de investigación sobre toxicidad de los EDC(World Health Organization, 2012),
lo que indica la necesidad de más estudios epidemiológicos en el futuro. Por otra parte, teniendo en
cuenta que la exposición estimada al TCS en humanos es de 0,13 mg/kg/día(Rotroff et al., 2010), que
es mucho menor que en los estudios de animales existentes (1-300 mg/kg/día), requiere de la
investigación in vivo de dosis más bajas a largo plazo para modelar y comprender mejor los efectos
potenciales de la exposición en la vida real en humanos. Es por lo anterior, que estudios in vivo, como
los desarrollados en este trabajo de investigación, son importantes como evidencia de los efectos a
largo plazo y posibles afectaciones a la salud humana.
En Colombia han sido pocos los reportes de monitoreo de TCS o EDC en matrices ambientales,
Martínez et al, realizaron el monitoreo de TCS y 4n-nonilfenol en un embalse que suministra de agua
potable a una ciudad principal de Colombia (Martinez & Peñuela, 2013) Bedoya- Ríos et al,
informaron la presencia de EDC en humedales, de los cuales se incluyeron productos farmacéuticos
como ftalatos, compuestos organofosforados, carbamazepina (CBZ), Triclosán (TCS) y
primidona(PRI) en las aguas residuales (Bedoya-Ríos et al., 2018); Botero et al, analizaron la
presencia de 20 productos farmacéuticos en aguas residuales de dos ciudades principales de Colombia
encontrando presencia de estos en concentraciones mayores de 1µg/L , (Botero-Coy et al., 2018);
Pemberthy et al, informa sobre la presencia de Triclosán, Ibuprofeno y Diclofenaco en aguas y peces
17
del Golfo de Urabá-Caribe Colombiano, encontrando presencia de estos tres contaminantes en el agua
y no en el músculo de los peces estudiados (Pemberthy M et al., 2020).
Dado el creciente riesgo de los EDC en los cuerpos de agua y el aumento de los datos de toxicidad,
se debería desarrollar un criterio de calidad del agua de los EDC y realizar una evaluación del riesgo
ecológico para determinar límites máximos y garantizar la supervivencia de las especies y del ser
humano.
Planteamiento del Problema y Pregunta de investigación.
Colombia como uno de los países con mayor biodiversidad en el mundo, posee un alto potencial para
el comercio de bienes y servicios provenientes de la vida silvestre a partir de estrategias de
aprovechamiento sostenible. La vertiente del Caribe es la más importante, pues agrupa el mayor
porcentaje de la actividad económica, social e industrial del país; esta vertiente está compuesta por
las cuencas de los ríos Magdalena, la cual atraviesa el país de sur a norte, ocupando una superficie de
257.000 km2 y en ella habita el 80% de la población del país y la del Río Cauca, con una extensión
de 14.000 km2, siendo esta cuenca una de las más fértiles de Colombia con actividades ganaderas y
agroindustriales (MADS, 2012).
El registro más reciente para la fauna íctica dulceacuícola señala la presencia de 1435 especies en
Colombia (MADS, 2012; Maldonado-Ocampo et al., 2008) cifra que, junto con las estimadas para
especies marinas, 1100 en el Caribe y unas 1000 para el Pacífico, señalaría que la diversidad de peces
del país es muy elevada. Se ha estimado que solo en especies de agua dulce, Colombia puede tener
unas 3000, lo cual situaría al país como segundo después de Brasil en riqueza íctica (Maldonado-
Ocampo et al., 2008). En un primer esfuerzo por evaluar el grado de amenaza de extinción de la
ictiofauna dulceacuícola de Colombia, se reconocieron para el comienzo del siglo XXI un total de 43
especies, cifra que aumentó a 84 para el año 2012 (Mojica et al., 2012). De acuerdo con el Tomo II
del “Informe nacional sobre el estado de la biodiversidad, publicado por el Instituto de Investigación
de Recursos Biológicos “Alexander von Humboldt”, se consideran como principales causas directas
de la pérdida de la biodiversidad en Colombia, la transformación y fragmentación de hábitats, la
introducción y trasplante de especies, la sobreexplotación de recursos biológicos, la contaminación y
el cambio climático global, y como causas indirectas: la expansión de la frontera agrícola, el
desconocimiento del potencial estratégico de la biodiversidad y los cultivos ilícitos (MADS, 2012).
El bagre rayado del Magdalena Pseudoplatystoma magdaleniatum, es un bagre de agua dulce de
hábitos bentopelágicos, endémico de los ríos Magdalena y Cauca del territorio colombiano. Se trata
de un depredador situado en la cima de la cadena trófica y como tal, podría constituir un buen
integrador de la información ecológica.
18
La especie es conocida como bagre rayado o pintadillo, constituye una de las especies de mayor
importancia económica en esta región, debido principalmente a su gran tamaño, alcanza a crecer hasta
1.40m de longitud y por la buena calidad de su carne. Presenta una tasa de crecimiento relativamente
lenta y es una especie migratoria, condiciones que hacen que sea bastante vulnerable a la pesca
(Hernández, 2008).
El contaminante emergente Triclosán (TCS) es un disruptor endocrino o EDC con posibles efectos
tóxicos en la reproducción y otros sistemas intervenidos por hormonas, actuando en la actividad
biológica, la exposición al TCS en el uso de productos personales es relativamente corta. Tras su
eliminación, el TCS se envía a las plantas de tratamiento de aguas residuales municipales, donde, su
eliminación es parcial o se adhiere a otras matrices como en los lodos (Amariei et al., 2017; Bedoux
et al., 2012; Bester, 2005).Esto plantea un posible peligro ambiental y ecológico, particularmente para
los sistemas acuáticos, debido a que se puede adherir a otras matrices en ambientes acuáticos, lo que
potencialmente pone en peligro a los organismos acuáticos y puede conducir a una mayor
bioacumulación (PubChem, 2020).
Los peces actúan como medios no polares que pueden adsorber productos orgánicos hidrofóbicos
dentro de la columna de agua. Desde los pájaros hasta los humanos consumen pescado, esto hace que
los peces sean buenos biomonitores para xenobióticos contaminantes pues la ingestión de alimentos
contaminados con productos químicos persistentes y lipofílicos pueden provocar la acumulación de
estos productos en humanos (Ojemaye & Petrik, 2019).
Los hábitos de alimentación de los peces son uno de los factores básicos que determinan el ingreso
del TCS para su posterior bioacumulación, los residuos de contaminantes en las diferentes especies
de peces están influenciadas por los hábitos alimenticios y el consumo de alimentos (Escarrone et al.,
2016; Fan et al., 2019; Olaniyan et al., 2016). Por lo anterior, se evidencia la necesidad de realizar
una investigación sobre los posibles efectos del TCS en la capacidad reproductiva de los peces,
especialmente del bagre rayado, especie endémica y en estado crítico de conservación, para
determinar si la presencia de este compuesto podría amenazar el desarrollo y continuidad de su ciclo
de vida, contribuyendo a la disminución de su población. En el presente trabajo, se plantean las
siguientes preguntas tratando de enmarcar la problemática actual de la especie y sus amenazas ¿Hay
presencia del contaminante emergente Triclosán en las aguas del río Magdalena y Cauca? ¿Hay
presencia del contaminante Triclosán en músculo del pez bagre rayado del Magdalena? ¿Puede el
Triclosán influir en la capacidad reproductora del bagre rayado de Magdalena? ¿Puede el Triclosán
alterar funciones como producción de Vitelogenina, daño celular o disminución en la calidad
seminal?
19
Objetivos
General:
Evaluar la concentración del contaminante emergente Triclosán en Bagre rayado del Magdalena
(Pseudoplatystoma magdaleniatum) y los efectos sobre su capacidad reproductiva.
Específicos:
• Determinar la concentración del Triclosán en el agua a lo largo de varios puntos del río
Magdalena
• Determinar la concentración de Triclosán en individuos capturados de bagre rayado del
Magdalena (Pseudoplatystoma magdaleniatum) en el río Magdalena.
• Evaluar la calidad seminal del bagre rayado del Magdalena (Pseudoplatystoma
magdaleniatum) expuesto a Triclosán.
• Cuantificar los niveles de Vitelogenina en bagre rayado del Magdalena (Pseudoplatystoma
magdaleniatum) expuesto a Triclosán.
• Determinar si la exposición a Triclosán causa daño celular en el bagre rayado del Magdalena
20
Marco Teórico
A continuación, se presenta de manera general algunas características y conceptos importantes para
entender e ilustrar sobre la importancia del trabajo de investigación; en la primera parte, se describirá
la especie con la cual se desarrolló este trabajo, que es el bagre rayado del magdalena
Pseudoplatystoma magdaleniatum, su distribución, características más relevantes de la especie,
amenazas, estado actual de la población, normatividad pesquera y estado actual en los ríos Magdalena
y Cauca.
Después de conocer sobre el estado general de la especie, se hace una introducción al estado de la
calidad el agua de los ríos Magdalena y Cauca, para poder dar una explicación a las posibles fuentes
de contaminación y factores de riesgo de las poblaciones biológicas, especialmente del bagre rayado.
Luego se mencionan las fuentes de contaminación y problemática ambiental de los ríos Magdalena y
Cauca, se desarrollan concetos teóricos sobre procesos de bioacumulación, contaminantes
emergentes, disruptores endocrinos y el Triclosán, con el fin de que al final del capítulo uno, se tengan
las herramientas teóricas, para interpretar los concetos y efectos del Triclosán en el bagre rayado del
magdalena, los tratamientos realizados y los resultados obtenidos desarrollados en los capítulos
siguientes.
Características Generales del Bagre Rayado del Magdalena.
El bagre rayado del Magdalena, Pseudoplatystoma magdaleniatum, antes conocido como
Pseudoplatystoma fasciatum, fue reconocido científicamente con este nombre, gracias a la
descripción y diferenciación de los demás bagres que se hace en (Buitrago-Suárez, U.A & Burr,
2007). Donde realizaron un estudio taxonómico de las especies pertenecientes a este género y
determinaron que los individuos que se encuentran distribuidos en la cuenca Magdalénica incluyendo
el río Cauca pertenecen a esta nueva especie, la cual es considerada endémica para la
cuenca.(Buitrago-Suárez, U.A & Burr, 2007; Hernández, 2008).
El Pseudoplatystoma magdaleniatum se reconoce por características tales como: cuerpo alargado y
delgado, cabeza grande con margen anterior redondeada, medianamente deprimida, ojos pequeños en
posición dorsal, extremo de la boca semicircular; mandíbula superior más larga que la inferior; dientes
pequeños localizados en bandas sobre las maxilas y en parches sobre el vómer y palatino; fontanela
no alcanza proceso occipital y no presenta hendiduras profundas en ese proceso. Color gris oscuro en
el dorso y blanco en la vientre, con presencia de bandas oscuras transversales, con variación en el
patrón de estas franjas (Buitrago-Suárez, U.A & Burr, 2007).
21
Además esta especie presenta rayos en los lóbulos dorsal y ventral de la aleta caudal con surcos
fusionados o no separados como en otras especies de Pseudoplatystoma; barras rectas, anchas, y
oscuras verticales en los costados, sin bucles en la nuca y las áreas asociadas, regiones dorsal y ventral
de la aleta pectoral pálidos, sin puntos o manchas; aleta dorsal con pocas o ninguna mancha (a veces
5 puntos); 43 vértebras; aleta adiposa con 6 o 7 manchas grandes, áreas que rodean a los rayos de la
aleta dorsal procurrente sin manchas. Piel sin escamas, fosas nasales anteriores cortas. Cuerpo con
pigmentación oscura en los lados dorsal y lateral sin clara delimitación entre las zonas claras y
oscuras. Las barras oscuras se extienden más allá de la línea lateral con barras pálidas. Región
posterior de la aleta dorsal con algunas barras oscuras mediana (Buitrago-Suárez, U.A & Burr,
2007).ver Figura 1.
Figura 1. Holotipo, Pseudoplatystoma magdaleniatum, escala 15 cm, LE de 421.5 mm, CAS
19165.(Buitrago-Suárez, U.A & Burr, 2007)
El bagre rayado, es una de las especies de mayor importancia económica en las cuencas de los ríos
Magdalena y Cauca, debido principalmente a su gran tamaño y a la buena calidad de su carne (Lasso
et al., 2011; Mojica et al., 2012). Presenta una tasa de crecimiento relativamente lenta y es una especie
migratoria, condiciones que hacen que sea bastante vulnerable a la pesca. En el acuerdo 16 de 1997
se estableció una veda temporal para la pesca, modificada por el acuerdo 242 de 1996 y el acuerdo
09 de 1996 que establece que la veda en la cuenca del Magdalena se lleve a cabo del 1 al 30 de mayo
y de 15 de septiembre al 15 de octubre de cada año protegiendo de esta manera a la especie durante
la época que ha sido determinada como la época de reproducción. Vive en los cauces de los grandes
ríos de la cuenca el Magdalena y en sus planicies de inundación. Paradójicamente y a pesar de que
fue una de las especies importantes en las pesquerías del Magdalena, prácticamente se desconoce su
biología (Maldonado-Ocampo et al., 2005; Mojica et al.,2012).
El bagre rayado es un pez carnívoro que se alimenta principalmente de peces y camarones en algunas
ocasiones. Los insectos son importantes en la alimentación de ejemplares menores de 10 centímetros;
se alimenta de peces pequeños, prefiriendo los de forma fusiforme principalmente de las familias
Characidae y Curimatidae, el material vegetal aparece en forma muy ocasional en su dieta. Los
camarones son importantes para su dieta hasta que alcanzan los 50 centímetros de longitud y el bagre
adulto prefiere presas de tamaño mayores a 10 centímetros (Rojas Muñoz, 2014).
22
Es considerada una especie sombrilla, debido a su posición en la cadena alimenticia de predador de
último nivel, se convierte en eslabón clave para mantener el equilibrio ecológico del ecosistema. En
este mismo sentido, en el libro rojo de especies dulceacuícolas de Colombia se encuentra declarado
en categoría de peligro crítico (Mojica et al.,2012), debido principalmente a la contaminación de las
aguas y el mal manejo de los recursos pesqueros.
Clasificación taxonómica del Bagre Rayado
Nombre
común
Bagre rayado, bagre, pintadillo.
Foto 1. Ejemplar de Experimentación (Cinpic, marzo 2020)
Taxonomía
Reino: Animalia
Phylum: Cordata
Subphylum: Vertebrata
Superclase: Gnathostomata
Clase: Actinopterygii
Superorden: Ostariophysi
Orden: Siluriformes
Familia: Pimelodidae
Género: Pseudoplatystoma
Especie: Pseudoplatystoma magdaleniatum
Nombre
científico
Pseudoplatystoma magdaleniatum
Categoría En peligro de extinción. En peligro (EN A1d, A2d); para cuenca del río
Magdalena (CR A1d).
Característica
Bagre emblemático del Magdalena, es la especie de mayor tamaño en la
cuenca, alcanza a crecer hasta 1,5 m de longitud.
Considerada como P. fasciatum en la edición del 2002, posteriormente fue
descrita como nueva especie restringida exclusivamente a la cuenca del
Magdalena. Se distingue de sus congéneres por su proceso occipital largo, que
alcanza a unirse con las placas predorsales y por la presencia de una fontanela
larga en la región media del cráneo. Su cuerpo es alargado con la cabeza grande
y deprimida, con ojos pequeños en posición dorsal. Coloración con fondo gris
oscuro en el dorso y blanco en el vientre, cruzado por una serie variable de
bandas oscuras transversales.
23
Foto 2. Ejemplares de Puerto Triunfo. Hembra izquierda, macho derecha.
Distribución
geográfica
Endémica de Colombia, en la cuenca del Magdalena
Subcuencas: Magdalena, Cauca y San Jorge.
Fuente:(Mojica, J. I.; Usma, J. S.; Lasso, C.A; Álvarez-León, 2012)
La disminución en más de un 90% de las capturas en los últimos 30 años junto con un aumento del
volumen de aprovechamiento de ejemplares jóvenes con tallas pequeñas, son indicadores básicos del
grave estado de la población de bagre rayado en la cuenca Magdalena. El 85% de los ejemplares
observados estuvieron por debajo de la talla mínima legal (80 cm). En la cuenca media del río
Magdalena, el 60% de lo capturado se encontró por debajo de la talla legal y la Fundación Humedales
en el bajo Magdalena, menciona que solamente el 2% de las capturas poseen tallas superiores a la
mínima legal (Mojica et al.,2012).
Su alta demanda, sumado a la contaminación de los cuerpos de agua, las barreras en los canales de
migración y la perdida de las ciénagas por la disminución del agua que impiden el crecimiento de
maleza, siendo ésta el hábitat para su óptimo desarrollo y crecimiento, son algunas de las causas de
su disminución. Esta especie endémica, desempeña un papel fundamental al controlar otras especies
que pueden convertirse en plagas (AUNAP, 2018).
El bagre rayado migra en la época denominada por los pescadores como "subienda", desplazándose
desde las ciénagas localizadas en las zonas medias y bajas de las cuencas, hacia las partes altas de los
ríos donde se reproduce; durante esta migración sus gónadas terminan de madurar. Otro aspecto de
la migración ocurre en la "bajanza" cuando los peces adultos con poco peso, regresan de sus zonas de
desove, río arriba, hacia las ciénagas y lagunas (Cortés, 2003).
24
La especie presenta una estrategia reproductiva estacional y cíclica, sin cuidado parental, y alta
fecundidad. Los bagres son especies dioicas con fecundación cruzada —gonocóricas—(Jiménez-
Segura, 2009; Vazzoler, 1996a). A este tipo de estrategia de vida se le denomina r-estacional (especies
altamente móviles, ciclos de vida prolongados, alta fecundidad, una o dos reproducciones anuales y
generalmente ajustados con los periodos hidrológicos y baja inversión energética en tamaño de
ovocito y en cuidado de la prole) (Jiménez-Segura, 2009).
Los machos alcanzan la madurez sexual a los 65 cm LE y las hembras a los 89 cm (Hernández, 2008;
Lasso et al., 2011; Nathan & Scobell, 2012; Pineda, 2007).Los juveniles permanecen durante los
meses de máxima inundación en las ciénagas de la cuenca media y baja, donde se alimentan de otros
peces e insectos (Cortés, 2003).
Normatividad de Pesca
A través de la Resolución 430 de 1982 (que modificó la Resolución 25 de 1971) se estableció la talla
mínima del bagre en 80 cm LE en la cuenca de los ríos Magdalena y Cauca. El Acuerdo 09 del 1996
estableció nuevas fechas de veda en la cuenca del Magdalena, del 1 a 30 de mayo y del 15 de
septiembre al 15 de octubre de cada año.
El acuerdo 08 de 2008 del ICA establece los métodos y artes de pesca que deben ser usados en la
ciénaga de Zapatosa (Cesar-Magdalena). En 2012 se da la categoría de Estado Crítico de conservación
o en peligro de extinción. En peligro (EN A1d, A2d); para cuenca del río Magdalena (CR A1d). En
Peligro Crítico CR (A1d) libro rojo de los peces dulceacuícolas de Colombia.
A través de la Resolución 1912 de 2017 “Por la cual se establece el listado de las especies silvestres
amenazadas de la diversidad biológica colombiana continental y marino costera que se encuentran
en el territorio nacional, y se dictan otras disposiciones" el Ministerio de Medio Ambiente categoriza
nuevamente el bagre rayado del Magdalena como especie en peligro crítico (CR) y lo define como
“Aquellas que están enfrentando un riesgo de extinción extremadamente alto en estado de vida
silvestre”.
Como medidas de conservación propuestas se recomiendan acciones urgentes de manejo y
conservación de la especie que involucren cumplimiento de vedas y regulación de la
comercialización. También el fomento a la investigación científica de la biología de la especie, con
estudios a largo plazo que consideren además la evaluación y seguimiento de los “stocks” de pesca,
patrones migratorios y estructuras poblacionales con marcadores moleculares.
25
Estado de la Pesca en los ríos Magdalena y Cauca
En países como Colombia, con extrema diferencia social, cultural y económica, temas como
biodiversidad, conservación y manejo, tienen una amplia aceptación. Tomó más de 20 años para que
la idea de preservación generará aceptación y una vez alcanzado, surgió la idea de sostenibilidad que
de alguna manera va en la dirección opuesta (Galvis & Mojica, 2007).
En la parte baja de la cuenca del Magdalena existe un exceso de pescadores y ante la ausencia de
alternativas laborales para la población, se presenta una sobrepesca desproporcionada (Galvis &
Mojica, 2007) El censo de pescadores de la parte baja de la cuenca realizado por Cormagdalena en el
2007, reportó 25000 pescadores y la Fundación Humedales (2010) registró para el sector de la Isla de
Mompox 2400 pescadores.
En las lagunas de las tierras bajas, la sobrepesca es continúa debido a un exceso de pescadores y una
falta total de oportunidades de trabajo. El período de pesca más intenso es durante el período de
desove aguas arriba con la migración de la mayoría de las especies de peces al comienzo del período
seco que precede a la Pascua. El 60% de las capturas se extrae en esta época del año.
Los impactos negativos en el río han ocasionado la disminución poblacional de P. magdaleniatum,
visualizada a través de la reducción exponencial del aporte (toneladas) en la producción total de la
pesca y la reducción en las tallas medias de captura de la especie (Galvis and Mojica, 2007). De las
2.500 toneladas que se extraían en 1992, se reportan en el año 2013 menos de 1600 toneladas (Figura
2¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.), situación ocasionada por la sobrepesca y el
deterioro ambiental evidente que sufren hábitats en la cuenca del río Magdalena (Fundación
Humedales, 2014).
Figura 2. Desembarcos en puertos comerciales de Bagre Rayado en la Cuenca Magdalena-Cauca
(tomado de Fundación Humedales, 2014)
26
La vulnerabilidad observada del bagre es un indicador del decline del servicio de aprovisionamiento.
La desaparición del bagre implicaría: la alteración de la estructura íctica de los niveles tróficos
inferiores, la pérdida de biodiversidad en la cuenca y la disminución del bienestar de las comunidades
pesqueras ribereñas.
Para el manejo sostenible de P. magdaleniatum y los servicios que provee, se requiere de información
basada en los hechos reales que permita tomar decisiones informadas, esto implica la actualización
de la reglamentación pesquera asociada a la ordenación del bagre. La reglamentación para la pesca
del bagre del río Magdalena es insuficiente y en la realidad no garantiza el manejo sostenible de la
especie. La necesidad de información para la toma de decisiones y su control práctico en los mercados
nacionales implica la realización de un mayor número de estudios (Chaves Aguilar, 2017).
P. magdaleniatum reúne características que le permiten ser una especie sombrilla (especie que al ser
protegida permite de forma indirecta la protección de otras especies) debido a su factible manejo y
recuperación, incidencia en la protección indirecta de otras especies y sus hábitats. La conservación
del bagre ofrece la oportunidad de minimizar los costos de inversión teniendo en cuenta su valor
ecosistémico y el alto interés que despierta y es de carácter: científico (declarada en peligro crítico),
cultural y económico para la sociedad colombiana (Chaves Aguilar, 2017).
Calidad del Agua Superficial en Colombia
La región andina, comprende diez departamentos del centro y nororiente del país (Norte de Santander,
Santander, Boyacá, Cundinamarca, Antioquia, Caldas, Risaralda, Quindío, Tolima y Huila), lo
integran numerosos municipios con población mayor de 100.000 habitantes donde se concentra
aproximadamente el 36 % de la población colombiana. En esta región ejercen la función de autoridad
ambiental 15 Corporaciones Autónomas y las autoridades urbanas del Valle de Aburra (AMVA),
Bogotá (SDA) y Bucaramanga (AMB); además de Cormagdalena que tiene parte de su jurisdicción,
extendida sobre los municipios rivereños del río Magdalena, donde se superpone su función ambiental
a la de las respectivas corporaciones (Contraloría General de la República de Colombia, 2018).
Por tratarse de la zona más poblada y económicamente más activa del país, la principal problemática
ambiental deriva de la aglomeración urbana y se manifiesta en contaminación hídrica. La
construcción de Plantas de Tratamiento de Aguas Residuales (PTAR) en las ciudades que están
ubicadas en la región Andina, así como su correcto funcionamiento, que permita que el efluente de
estas cumpla la normatividad de vertimientos vigente, son actividades que, junto con otras, van en la
vía de obtener la mejor calidad del agua superficial posible en los centros urbanos. Para la vigencia
2018 se tiene que la gestión en PTARs, permisos de vertimientos, referentes de norma y resultados
de calidad del agua vertida, en las ciudades con población de 100.000 habitantes es muy deficiente,
27
lo que no permite pensar que el indicador de calidad del agua superficial haya mejorado, desde el año
2013 hasta la fecha (Contraloría General de la República de Colombia, 2018).
La mayoría de los municipios de Colombia no cuentan con un sistema de tratamiento de aguas
residuales PTAR eficiente o simplemente no tienen, tal y como lo informa la Contraloría General de
la Nación en el informe del estado de los recursos naturales del año 2018 en su numeral 5.1.2 Estado
de la Calidad del Agua Superficial, donde después de recoger la información de las 13 autoridades
ambientales que tienen jurisdicción en la región andina, se concluyó que solo el 63% de la los
municipios (337) tienen una PTAR y de las cuales solo el 51% (172) se amparan a la Norma de
Vertimientos (Resolución 631 de 2015) y de estas solo 17% (58) cumplen con los estándares de
vertimientos (Contraloría General de la República de Colombia, 2018) ver Figura 3.
Figura 3. Estado de la calidad del agua superficial en la Región Andina
Los ríos Magdalena y Cauca son los principales ríos de Colombia que atraviesan el país de sur a norte
y en los cuales un gran porcentaje de las actividades productivas para la economía regional y nacional
como la industria azucarera, los cultivos de café, actividades agropecuarias, así como actividades
mineras e hidroeléctricas, se desarrollan en esta área y cerca de 26 millones de personas se asientan
en este territorio (Pérez-Valbuena et al.,2015).
Los municipios seleccionados dentro de este estudio son poblaciones entre los 15 y 50 mil habitantes
exceptuando Barrancabermeja con 210.729 habitantes, la mayor parte de su población está asentada
en la zona urbana y su actividad económica principal es la agricultura, pesca y ganadería.
La Cobertura de alcantarillado de estos municipios es deficiente, en la mayoría solo hay cobertura en
un sector del centro urbano y se están mejorando y ampliando las PTAR existentes, se están
realizando la formulación de Planes Maestros de Acueducto y Alcantarillado (PMAA), la separación
630
337
172
58
28
de redes de alcantarillado en redes de aguas residuales y de aguas lluvias, así como la formulación de
Planes de Saneamiento y Manejo de Vertimientos (PSMV). Sin embargo, la mayoría de las aguas
residuales de los municipios rivereños vienten directamente por caños, quebradas y canales a los ríos
Magdalena y Cauca.
Afectaciones medioambientales y sociales de las hidroeléctricas
Las afectaciones medio ambientales y sociales, ocasionadas por la construcción de hidroeléctricas en
el país, especialmente en la zona Andina, se refieren a afectaciones al sostenimiento ecosistémico y
de los recursos naturales que ponen en riesgo el sustento de la población circundante, gran demanda
de recurso hídrico afectando la fauna por la intervención en su hábitat, debido a la fragmentación del
ecosistema. Lo anterior ha generado pérdida de la cobertura vegetal por la remoción de grandes áreas
de bosques, causando deforestación por la obligada tala de árboles que impiden el ciclo de los
ecosistemas, lo que se traduce en deterioro y menoscabo de los bienes y servicios ambientales
ocasionando desmejora de la calidad de vida de las comunidades allí asentadas, cambios morfológicos
del cauce de los ríos intervenidos y degradación de sus lechos, alterando la cantidad y calidad de las
aguas de los mismos, modificaciones desmedidas en zonas de valle, laderas y montañas intervenidas,
alterando el paisaje y la calidad de vida y bienestar de las comunidades y de la sociedad en general.
Fragmentación de ecosistemas, interrupción de corredores biológicos que conforman los ríos
intervenidos frente a la fauna que por allí transita hacia las serranías y demás zonas propias de su
hábitat.(Contraloría General de la República de Colombia, 2018).
La contingencia presentada con la hidroeléctrica Hidroituango, en el río Cauca, que viene generando
una problemática ambiental desde la emergencia ocurrida en abril y mayo de 2018 se evidenció la
desestimación del plan de contingencia, para esta clase de megaproyectos, por los permanentes
riesgos y los impactos tanto a las poblaciones y a los elementos ambientales y naturales afectados. La
modificación del régimen hidrológico y el impacto sobre las poblaciones de peces migradores, como
bocachicos y bagres, al modificarse las condiciones de volumen y temporalidad de las aguas, así como
el impedimento al acceso de los peces a zonas de reproducción aguas arriba de los reservorios, son
los principales impactos a nivel regional, en especial en aquellos embalses construidos a altitudes
menores a 700 msnm, altitud límite de distribución de las especies migradoras en la cuenca
Magdalena-Cauca (Valderrama, 2015).
Bioacumulación
La bioacumulación es un proceso en el cual una sustancia química es absorbida por un organismo por
todas las rutas de exposición como ocurre en el medio ambiente natural, es decir, fuentes de medio
29
ambiente dietético y ambiental. La bioacumulación es el resultado neto de procesos competitivos de
absorción química en el organismo en la superficie respiratoria y de la dieta y eliminación química
del organismo incluyendo intercambio respiratorio, digestión fecal, biotransformación metabólica del
compuesto original y dilución por crecimiento (Arnot & Gobas, 2006). En la Figura 4 se resumen
las principales vías de absorción y eliminación de sustancias químicas en peces de agua dulce.
Los peces, como consumidores a altos niveles tróficos, acumulan contaminantes de múltiples
maneras, la absorción en la dieta y las branquias se consideran importantes vías de acumulación. Por
lo tanto, utilizando los peces se podría indicar no solo los efectos directos de los contaminantes en el
medio ambiente en la biota (p. ej., bioconcentración) sino también lo indirecto como transmisión
trófica (p. ej., biomagnificación). Los hábitos de alimentación de los peces son los factores básicos
que determinan enlaces depredador-presa y dinámica trófica de materia orgánica que permiten
distinguir las vías de transmisión de productos químicos entre los alimentos (Arnot & Gobas, 2006).
Figura 4. Principales rutas de absorción y eliminación de sustancias químicas en peces.(Arnot &
Gobas, 2006)
El potencial de bioconcentración y bioacumulación de los productos químicos orgánicos a menudo
se compara con el coeficiente de reparto octanol-agua (KOW).
El valor de KOW de una sustancia está relacionado con su capacidad de adsorción o su potencial de
bioconcentración en tejidos grasos. Un valor bajo de KOW indica la probable movilidad y transporte
de ese material por su buena solubilidad, y fácil metabolización y biodegradación, es decir, hay que
esperar una escasa bioacumulación. Por el contrario, un valor alto de KOW indica posible absorción
en tejidos grasos, suelo y sedimentos. Por lo tanto, es probable la bioconcentración o bioacumulación.
Su escasa movilidad favorece la toxicidad de estas sustancias.
Las dos propiedades fisicoquímicas KOW y la solubilidad acuosa (SW) son inversamente relacionado
y la incertidumbre de los valores medidos y estimados de KOW generalmente aumenta para productos
químicos hidrofóbicos, es decir, valores de log KOW mayores que 5.
En la tabla siguiente se observa la afinidad de una sustancia por los tejidos grasos (abundantes en
animales) en función del valor del logaritmo del coeficiente de reparto octanol-agua. Así este valor
Captación branquial k1
Absorción
dietética; kD
Eliminación de branquias k2
Biotransformación Metabólica kM
Crecimiento
'dilución'; kg
Digestión fecal; kE
30
es una medida de la bioconcentración de esa sustancia en organismos acuáticos.
Tabla 1. Afinidad de las sustancias a bioacumulación según su valor de KOW
Valor de log KOW Afinidad por los
tejidos grasos animales
> de 5 Muy alta
3,5 a 5 Alta
3 a 3,5 Media
1 a 3 Baja
< de 1 Muy baja
Contaminantes Emergentes
El término de contaminantes emergentes (CE) generalmente se utiliza para referirse a compuestos de
distinto origen y naturaleza química, cuya presencia en el medio ambiente no se considera
significativa en términos de distribución y/o concentración, por lo que pasan inadvertidos; no
obstante, ahora están siendo detectados y tienen el potencial de acarrear un impacto ecológico, así
como efectos adversos sobre la salud. La característica de estos grupos de contaminantes es que no
necesitan estar constantemente en el ambiente para causar efectos negativos, puesto que sus altas
tasas de transformación/remoción se pueden compensar por su introducción continua en el ambiente
(Janet Gil et al., 2012; López-Doval et al., 2019).
Los CE comprenden una amplia gama de compuestos químicos, productos farmacéuticos, productos
de cuidado personal, agentes tensoactivos, plastificantes y aditivos industriales, que no están incluidos
en el monitoreo actual de programas de tratamiento de aguas; también incluyen la síntesis de nuevos
compuestos químicos o cambios en el uso y disposición de los productos químicos ya existentes de
los cuales existe una limitada información disponible sobre el efecto que puede causar en la salud
humana y en la ecología (Janet Gil et al., 2012).
De las diferentes clases que existen dentro de los CE, es de interés para esta investigación los que
están categorizados como productos de cuidado personal o PPCP, estos son producidos para uso
directo sobre el cuerpo humano. En general estos productos están dirigidos a alterar el olor, el aspecto,
el tacto, y no deben mostrar actividad bioquímica significativa. Muchos de estos productos son usados
como ingredientes activos o preservativos en cosméticos, productos de baño o fragancias y en
ocasiones estas sustancias son usadas en cantidades mayores a las recomendadas. Los PPCP que
hacen parte de los contaminantes emergentes son: perfumes, fragancias, agentes de protección solar,
Benzofenonas, repelentes de insectos entre otros (Janet Gil et al., 2012).
31
Una de las principales razones de la disminución de la biodiversidad que afecta los organismos de
agua dulce es la contaminación orgánica e inorgánica. Estos contaminantes generalmente están
presentes en mezclas complejas e interactúan con estresores físicos, químicos o biológicos,
potencialmente modificando el efecto toxicológico, Por lo tanto, una evaluación realista del riesgo de
contaminación requiere una comprensión de los efectos combinados de diferentes contaminantes en
los organismos (López-Doval et al., 2019).
Disruptores Endocrinos o EDC
La Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. (EPA) define un EDC como un agente exógeno que
interfiere con la síntesis, secreción, transporte, unión, acción o eliminación de hormonas naturales en
el cuerpo que son responsables del mantenimiento de la homeostasis, la reproducción, el desarrollo
y/o comportamiento (USEPA, 1997).
Los EDC son sustancias químicas capaces de alterar el equilibrio hormonal y la regulación del
desarrollo embrionario y, por tanto, con capacidad de provocar efectos adversos sobre la salud de un
organismo o de su progenie (Romano Mozo, 2013). Los EDC abarcan una variedad de clases
químicas, incluidas las hormonas naturales y sintéticas, componentes vegetales, pesticidas,
compuestos utilizados en la industria del plástico y en productos de consumo. Algunos son
persistentes, pueden ser transportados largas distancias a través de las fronteras nacionales, y han sido
encontrado en prácticamente todas las regiones del mundo. (Ipcs et al., 2002).
Los sistemas endocrinos del cuerpo juegan un papel esencial y dominante en la regulación a corto y
a largo plazo de los procesos metabólicos. Los procesos nutricionales, conductuales y reproductivos
son regulados por sistemas endocrinos, al igual que el crecimiento (incluido el crecimiento del hueso/
remodelación), intestino, cardiovascular y función renal y respuestas a todas las formas de estrés.
Trastornos de cualquiera de los sistemas endocrinos, que involucran tanto la hormona hiperactiva
como la secreción hipoactiva, son resultado inevitable de enfermedad, y sus efectos pueden
extenderse a muchos órganos y funciones diferentes a menudo son debilitantes o que amenaza la vida
del organismo. Visto desde esta perspectiva general, la amenaza a partir de productos químicos
ambientales con actividad endocrina (ya sea agonista o antagonista) es potencialmente grave. Sin
embargo, el hecho de que los humanos y la vida silvestre están expuestos a tales productos químicos
no necesariamente significa que manifieste una alteración clínicamente relevante. Muchas de estas
respuestas depende del nivel y duración de la exposición y en el momento de la exposición (Ipcs et
al., 2002).
Desafortunadamente, muchos de los estudios epidemiológicos o de vida silvestre no tienen buenos
resultados por lo que el impacto de los EDC en la vida silvestre y la salud humana no es claro, lo que
32
limita la capacidad de realizar conclusiones de ellos. Este problema es especialmente frecuente para
aquellos EDC que se degradan rápidamente en el medio ambiente o en el cuerpo humano. Esto
significa que la exposición que pudo haber causado un resultado adverso (p. ej., un déficit
reproductivo) no es detectable en el momento en que las manifestaciones clínicas se hacen evidentes.
Por esta razón, la mayoría de los EDC en los que se basa para extraer causa y efecto las relaciones
son aquellas que son biológica y ecológicamente persistentes (p. ej., PCB, DDT y dioxinas). Algunos
de estos son conocidos por poner en peligro la salud humana y los ecosistemas, y han sido el sujeto
de convenciones globales (Ipcs et al., 2002).
La mayoría de los EDC son lipofílicos (log Kow > 4), pueden acumularse en los peces por ingestión
y absorción por la piel e incluso biomagnificarse a lo largo de las cadenas alimentarias (Campbell et
al., 2006; Fan et al., 2019; Zang et al., 2019). Por lo tanto, los peces ribereños, especialmente aquellas
especies bentónicas, expuestas a agua intersticial y sedimento, pueden estar en riesgo de absorción
de EDCs.
Fuentes de EDC en el ambiente
Las fuentes reales son descargas aguas arriba a las instalaciones de tratamiento, que contienen
hormonas naturales y estrógenos farmacéuticos excretados por humanos e inodoros en el hogar, PPCP
excretados o lavado del cuerpo, material vegetal, artículos tratados con retardantes de fuego, otros
productos de limpieza para el hogar y pesticidas. Las PTAR también podrían recibir efluentes de
industrias, que contienen EDCs. Sin embargo, la escorrentía de los campos agrícolas y operaciones
de alimentación de ganado y tierras mejoradas con biosólidos o estiércol también contribuyen como
fuentes no puntuales para EDC en el medio acuático. Además, existe el potencial por la escorrentía
agrícola que contiene pesticidas y fertilizantes que podrían contener tensioactivos estrogénicos. Otras
fuentes potenciales incluyen servicios privados, flujos de aguas pluviales no tratadas y escorrentía
urbana, efluentes industriales, lixiviados de vertederos y despojos atmosféricos. La exposición
humana puede ocurrir por ingestión de alimentos, polvo y agua, inhalación de gases y partículas en
el aire y contacto con la piel. Un diagrama que muestra el destino ambiental y la exposición humana
de estos contaminantes se resume a continuación en la Figura 5 .
33
Figura 5. Fuentes de EDC en aguas ambientales y exposición humana (Caballero-Gallardo et al.,
2016)
Triclosán (TCS)
El Triclosán (2,4,40-tricloro-20-hidroxidifenil éter) es un agente antibacteriano y antifúngico. Es
ampliamente utilizado como agente conservante y antimicrobiano en productos para el cuidado
personal como jabones, cremas para la piel, pasta de dientes y desodorantes, así como en artículos
para el hogar como tablas de cortar de plástico, equipos deportivos y zapatos. En la Tabla 2 se puede
observar la información química del TCS.
Tabla 2. información Espectral- Propiedades del TCS.(PubChem, 2020)
34
Apariencia Polvo cristalino blanco a blanquecino
Olor Ligero olor aromático
Punto Ebullición 120 ° C (se descompone 280 a 290 °C)
Punto de fusión 55-57 ° C
Solubilidad - En agua, 10 mg L a 20 °C
- Fácilmente soluble en soluciones alcalinas y
muchos solventes orgánicos; soluble en
metanol, alcohol, acetona
Presión de Vapor 4.6X10-6 mm Hg a 20 ° C (est)
Coeficiente de partición octanol /
agua
4.76 (LogP)
Estabilidad / Vida útil Estable bajo las condiciones de almacenamiento
recomendadas.
pKa 7,9
Índice de retención de Kovats Semi-estándar no polar: 2114
Estructura C12H7Cl3O2
CAS 3380-34-5
GC-MS
Número NIST 250165
Picos totales 100
m / z pico superior 290
m / z 2do más alto 288
m / z 3er más alto 218
35
El TCS es un EDC con posibles efectos en la reproducción y otros sistemas intervenidos por
hormonas, actuando en la actividad biológica, puede degradarse a productos como metil Triclosán
[MeTCS, 5-cloro-2- (2,4-di-clorofenoxi) anisol)], que es más persistente, lipofílico, bioacumulativo
y estable que el TCS (Dar et al., 2020; Lindström et al., 2002; López-Doval et al., 2019). Por ser
lipofílico (coeficiente de partición octanol-agua log Kow = 4.8), muestra bioacumulación en los
organismos. Se ha observado que causa efectos tóxicos sobre el comportamiento, desarrollo y
reproducción de peces (Dar et al., 2020; Tabares et al., 2005).
El Triclosán (TCS) es un contaminante emergente catalogado como una de las sustancias más
frecuentemente detectada en el ambiente (agua, suelo) y en los organismos vivos (Dar et al., 2020;
Stenzel et al., 2019; F. Wang et al., 2019). En la última década, estudios han demostrado su toxicidad
en organismos acuáticos, su bioacumulación y los efectos sobre el comportamiento, desarrollo y
reproducción de peces (Dar et al., 2020; Hemalatha et al., 2019; Stenzel et al., 2019; Tabares et al.,
2005). Se ha detectado efectos neuroendocrino en la corvina atlántica (Argyrosomus regius) expuesto
a Triclosán durante 10 días en su dieta (Hedrick-Hopper et al., 2015) en pez cebra (Danio rerio) se
ha observado alteración de la metilación del ADN durante el desarrollo embrionario (Falisse et al.,
2018); asi como una supervivencia reducida y desarrollo larval retardado (Stenzel et al., 2019).
Es posible que la exposición a TCS durante etapas críticas de desarrollo, puedan causar cambios que
resulten en el deterioro reproductivo de los peces, pues el TCS tiene el potencial de alterar las vías
hormonales importantes en la metamorfosis y reproducción de estos. En machos de Gambusia affinis,
expuestos a TCS mostraron una reducción significativa de espermatozoides y aumento de
Vitelogenina, lo que indica que el TCS actúa como contaminante disruptor endocrino (EDC) (Rauty
& Angus, 2010). Evaluar las posibles consecuencias de los EDC durante los períodos críticos de
desarrollo son casi imposibles de abordar en poblaciones de peces silvestres (Stenzel et al., 2019);
Los estudios indican que el TCS interfiere con la absorción de yoduro (Wu et al.,2016) así como con
el eje tiroideo debido a su similitud con hormonas tiroideas naturales (Dar et al.,2020). Debido a su
extenso uso, el TCS es uno de los compuestos detectados con más frecuencia en los efluentes de las
aguas residuales en USA, Canadá, Europa, Australia y Japón (Sanz 2017; Siddique et al.,2016) En
España, un estudio reciente detectó su presencia en los ríos Segura y Vinalopó, en Alicante ( Varo et
al.,2016;Sanz 2017). En Latinoamérica la mayoría de los estudios de contaminantes emergentes se
han realizado en Brasil (53%) y México (15%). Los Contaminantes más estudiados en la literatura
son los productos farmacéuticos, seguidos por productos de cuidado personal.
En 2016, la producción y consumo de TCS se estimó en 850 toneladas en Europa, y 4760 toneladas
a escala mundial. (Maulvault et al., 2019). El mercado de estos productos se ha incrementado
exponencialmente.
36
Se estima que el consumo anual de TCS puede exceder 300 toneladas en los Estados Unidos
alcanzando hasta 350 toneladas en Europa. Los datos más recientes demuestran que el consumo
global de TCS equivale a 4760 toneladas en 2015 (EPA-Denmark, 2016). Debido a su uso
generalizado durante décadas, el TCS se ha convertido en uno de los compuestos más ampliamente
detectados en las aguas residuales en todo el mundo, siendo eliminado solo parcialmente durante el
tratamiento de aguas (Montagnini et al., 2018).
El uso de Triclosán ha sido prohibido para algunas aplicaciones, pero la sustancia está aprobada como
conservante en productos cosméticos seleccionados. Se utiliza en productos como pasta de dientes,
jabón de manos, jabones corporales, geles de ducha, polvos para la cara y corrector de imperfecciones,
productos para limpiar las uñas de las manos y los pies antes de la aplicación de uñas artificiales,
desodorantes (sin spray) a concentraciones de hasta 0.3%, y enjuague bucal a una concentración de
hasta 0.2% (EPA-Denmark, 2016).
El consumo global y producción de Triclosán, ha ido disminuyendo con los años (Tabla 3). El
consumo en la UE en 2015 es equivalente al 62% del de 2011. El consumo de Triclosán en la UE es
aproximadamente el 20% del Triclosán global.
Tabla 3. Producción Global de Triclosán por región (EPA-Denmark, 2016)
Producción
país/región
Toneladas
2011
Toneladas
2012
Toneladas
2013
Toneladas
2014
Toneladas
2015
Unión Europea 1.348 1.212 1.077 944 841
India 1.226 1.159 1.098 1.009 921
China 2.188 2.055 1.932 1.782 1.638
Otros 1.819 1.717 1.618 1.495 1.361
Total (global) 6.581 6.143 5.725 5.230 4.760
Según la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), en la actualidad, no hay evidencia
de que el TCS en los productos de cuidado personal proporcione un beneficio adicional a la salud
más allá de su efecto antigingivitis en la pasta de dientes. La FDA no recomienda cambiar a los
consumidores el uso de los productos regulares como jabón líquido por los que contienen TCS debido
a la evidencia insuficiente de su seguridad. Los estudios de la Agencia de Protección Ambiental
(EPA) encontraron que el TCS es un antibacteriano efectivo para uso medicinal, pero no para uso
regular, es por eso que la seguridad de TCS está siendo revisada actualmente por la FDA y Health
Canadá (Tato et al., 2018).
37
En cuanto a la normativa de uso y regulación de Triclosán, en septiembre de 2016 la Administración
de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA), prohíbe la comercialización de jabones
antibacteriales de venta libre que contienen diecinueve (19) ingredientes, incluyendo Triclosán y
triclocarbán, debido a que el sector industrial no pudo demostrar que su uso a largo plazo fuera más
seguro y eficaz que el uso del jabón tradicional para la prevención y propagación de ciertas
enfermedades, pero que podrían representar un riesgo para la salud por la resistencia bacteriana. En
octubre de ese mismo año, las autoridades sanitarias de los países miembros de la Comunidad Andina
inician consultas para evaluar el uso de los ingredientes Triclosán y triclocarbán, por indicios o
pruebas científicas sobre su posible afectación a la salud. Las consideraciones tenidas en cuenta hasta
el momento en la construcción de la resolución incluyen:
• Los productos cosméticos sólo pueden incorporar en sus formulaciones, los ingredientes
referidos en los listados internacionales estipulados por la Decisión 777 de 2012, Artículo 1,
a saber: la lista de aditivos de colores permitidos por la FDA, los listados de ingredientes de
The Personal Care Products Council y de Cosmetics Europe – The Personal Care Association
y las Directivas de la Unión Europea
• A pesar de la prohibición establecida en USA por la FDA, el Triclosán y el triclocarbán, no
han sido prohibidos en la Unión Europea, donde pueden ser utilizados en cantidades y casos
específicos, así:
1. Triclosán: puede ser utilizado como preservante en una concentración máxima del
0,3% para dentífricos, pastillas de jabón, jabones líquidos y geles de ducha,
desodorantes (no en aerosol), polvos faciales y cremas correctoras y productos para
limpiar las uñas de manos y pies antes de colocar uñas artificiales; y con una
concentración máxima del 0,2% para enjuagues bucales (Reglamento UE 358 del 09
de abril de 2014, que modifica el Reglamento CE 1223 del 30 de noviembre de 2009
en sus Anexos II y V)
2. Triclocarbán: puede ser utilizado como preservante con una concentración máxima
del 0,2%. También, permite un manejo de una concentración mayor, y sólo hasta el
1,5%, cuando el producto cosmético que lo contiene se retira con agua. (Reglamento
CE 1223 del 30 de noviembre de 2009). En las condiciones de uso establecidas por
la Unión Europea, el triclocarbán inhibe primariamente el crecimiento de bacterias
gram-positivas, pero también de bacterias gram-negativas, lo que permite proteger la
formulación cosmética de una contaminación microbiana.
Finalmente, en octubre de 2017 se emite la Resolución 1953 de la secretaria general de la Comunidad
Andina donde “se restringe y prohíbe el uso de ingredientes utilizados en jabones cosméticos para
38
el aseo e higiene corporal que tengan acción antibacterial o microbiana”. Por lo anterior el Triclosán
sigue siendo utilizado en productos de cuidado personal, solo que restringido a la concentración
permitida por la FDA enumerados anteriormente.
Sin embargo, debido a que no hay información concluyente sobre la cantidad mínima que causa daños
en los organismos y su sistema hormonal, no se encuentra normativa ambiental ni estándares de
vertimiento, lo que no permite que haya un seguimiento o evaluación del riego ambiental de los
mismos.
39
CAPITULO 2
Concentración de Triclosán en agua de los ríos Magdalena y Cauca
La cuenca Magdalena y Cauca constituye el eje principal de desarrollo social del país, permitiendo
satisfacer las necesidades de más del 80% de la población colombiana y aportando el 85% del PIB,
ya que es una fuente de recursos explotados por múltiples actividades económicas como: la
producción de energía –hidroeléctricas--, la explotación pesquera-agropecuaria, la extracción de
petróleo o minera, como vía del transporte naviero y como abastecedor hídrico de más del 80% de
las cabeceras municipales (Galvis & Mojica, 2007).
El desarrollo social ha permitido el aumento del tamaño poblacional humano, que se ha concentrado
en centros urbanos, sumado al alza en la demanda de recursos que incluyen al bagre. Sin embargo,
este desarrollo no ha sido sostenible y ha generado impactos negativos sobre los recursos naturales,
la tierra y el medio ambiente (Angel Restrepo, 2005).
La principal fuente de contaminantes en la cuenca del Magdalena, son las aguas residuales de las
principales ciudades como Bogotá, Cali y Medellín con más de 12 millones de personas. Los efectos
de los productos químicos agrícolas también son importantes, particularmente en el Alto Magdalena
y el Valle del Cauca, que son las principales zonas agrícolas del país. Los efectos de los contaminantes
en los peces de la cuenca no han sido evaluados con precisión (Galvis & Mojica, 2007).
En Colombia se han realizado varios estudios desde la década de los setenta tendientes a conocer la
concentración de sustancias químicas en las aguas y sedimentos, luego en los peces y más
recientemente en la vegetación acuática y en poblaciones de pescadores que consumen con frecuencia
el recurso pesquero obtenido en los principales ríos del país. Los estudios pioneros han sido los
realizados por investigadores citados por (Mancera-rodriguez, 2005) son los trabajos sobre residuos
de detergentes no biodegradables en río Bogotá de Vargas y Ramírez (1969), Evaluación de los
residuos de detergentes no biodegradables en Colombia de Galiano-Sedano (1972), Evaluación de la
contaminación industrial del Río Magdalena de Cardeñosa et al. (1973), Contenido de alquil benceno
sulfonado de GalianoSedano (1973), sobre fosfatos y alquil benceno sulfonado de Galiano-Sedano et
al. (1977), contaminación por residuos industriales de Galiano-Sedano (1979) Contaminantes
organoclorados persistentes. Cala (1997), Contaminantes persistentes lipofílicos en peces de agua
dulce de Colombia de Cala y Sodergren (1995, 1999), Contaminación por metales pesados, con
especial atención a los efectos nocivos del mercurio de Cala y Sodergren (1995). Y la problemática
de la presencia de mercurio en peces de los ríos Magdalena y Meta de Cala (2001). Los últimos 10
años, se ha incrementado el número de publicaciones con referencia a la identificación de compuestos
40
exógenos en agua y peces, debido a la mejora en las técnicas de análisis, equipos más sofisticados y
rápidos, reducción en el costo de operación entro otros.
Se ha determinado que existen dificultades para establecer los efectos genotóxicos inducidos en los
peces, debido a la gran variedad de sustancias toxicas que son vertidas a este ecosistema, a la dinámica
ecológica del mismo y a los mecanismos metabólicos de los peces que marcan una diferencia en la
respuesta depurativa ante los agentes contaminantes (Ortegon Torres et al., 2014).
En cuanto e estudios de identificación de Triclosán en fuentes de agua en Colombia, se han
desarrollado investigaciones como la de Martínez et al, donde realizaron el monitoreo de TCS y 4n-
nonilfenol en un embalse que suministra de agua potable a una ciudad principal de Colombia
(Martinez & Peñuela, 2013) Bedoya- Ríos et al, informaron la presencia de EDC en humedales, de
los cuales se incluyeron productos farmacéuticos como ftalatos, compuestos organofosforados,
carbamazepina (CBZ), Triclosán (TCS) y primidona(PRI) en las aguas residuales (Bedoya-Ríos et
al., 2018); Botero et al, analizaron la presencia de 20 productos farmacéuticos en aguas residuales de
dos ciudades principales de Colombia encontrando presencia de estos en concentraciones mayores de
1µg/L , (Botero-Coy et al., 2018); Pemberthy et al, informa sobre la presencia de Triclosán,
Ibuprofeno y Diclofenaco en aguas y peces del Golfo de Urabá-Caribe Colombiano, encontrando
presencia de estos tres contaminantes en el agua y no en el músculo de los peces estudiados
(Pemberthy M et al., 2020).
Metodología
Las muestras de agua fueron tomadas superficialmente por triplicado a orillas de los ríos Magdalena
y Cauca en los diez municipios seleccionados (Figura 6), debido a que son centros poblados
importantes y porque acopia un mayor número de personas, actividades industriales, ganaderas y
comerciales. En el río Magdalena se seleccionaron los siguientes municipios: Puerto Triunfo, Puerto
Berrío, Puerto Serviez, La Dorada y Barrancabermeja; para el río Cauca: Caucasia, Ciénaga de
Ayapel, La Apartada, Guarumo y Nechí. Se realizaron tres campañas de muestreo para la región del
Magdalena y Cauca, entre los años 2017 y 2019 para recolectar las muestras en las estaciones
climáticas de lluvia, seca y de transición (Tabla 4).
41
Figura 6. Sitios de muestreo en el río Magdalena y Cauca – Colombia.
42
Tabla 4. Campañas y sitios de muestreo
Cuenca Sitio de muestreo Campañas por estación climática Coordenadas
Río Cauca Ayapel
Lluvia (29/03/2017 y 22/03/2019)
Transición (29/08/2017 y 07/09/2019)
Seca (12/07/2018 y 13/06/2019)
08° 18'24,9N
075° 06'42.9 W
Apartada-San Jorge 08° 2´44 N
075° 21´27W
Caucasia 07° 58'15 N
075° 11'24 W
Nechí 08°09´73N
074°77´5W
Guarumo-Cáceres 07°50.804 N
075° 12.314 W
Río
Magdalena
Barrancabermeja
Lluvia (29/03/2017 y 9/04/2019)
Transición (7/09/2017 y 25/06/2019)
Seca (12/07/2018 y 20/02/2019)
07°03'35.8 N
073°52'32.6 W
Puerto Berrío 06°29.42 N
074°23.91 W
Puerto Serviez -Nare 06°13'22.0 N
074°33'59.0 W
Puerto Triunfo 05°52'26.2 N
074°38'19.5 W
La Dorada 05°27´.722 N
074°39´.846 W
En cada uno de los sitios de muestreo seleccionados, se tomaron 500ml de agua en un frasco ámbar
de vidrio muflado por triplicado y se midieron en campo el pH, conductividad eléctrica, oxígeno
disuelto y temperatura del agua (Foto 3,Foto 4,Foto 5). También se registraron las condiciones
ambientales durante la toma de la muestra y fueron rotuladas e identificadas con sitio y hora. Las
muestras fueron preservadas en una cava con hielo a una temperatura entre 6°C y 0°C, hasta que
llegaron a las instalaciones del laboratorio ubicado en la Sede Investigaciones Universitarias SIU, de
la Universidad de Antioquia en la ciudad de Medellín. En el laboratorio, las muestras fueron marcadas
y preservadas en cava de refrigeración entre 2 y 6°C.
43
Foto 3. Toma de medidas in situ – pH, Conductividad
eléctrica, Oxígeno Disuelto, Temperatura del Agua –
(Puerto Serviez)
Foto 4. Toma de muestras de agua
superficial en el Río Magdalena –
Puerto Serviez
Foto 5. Preparación de muestras en cavas con hielo para su preservación
Reactivos, solventes y materiales
Los estándares internos utilizados para la identificación y cuantificación fueron: Triclosán 99.7%,
Sigma-Aldrich. Se prepararon soluciones intermedias individuales de los analitos objetivo en MeOH
grado LC/MS (Merck), a una concentración de 1mg/L a 100µg/L, mientras que el nivel de cada
compuesto, las soluciones madre de estándar interno fueron de 1mg/L. Para la validación, calibración
y soluciones estándar de trabajo que contienen todos los compuestos se prepararon en MeOH y agua
tipo I de calidad Milli-Q (conductividad menor a 0.05 μS/cm) a concentraciones de 100 µg/L, 10
µg/L y 1 mg/L. Todas las soluciones se almacenaron en la oscuridad a -20 ° C.
44
Extracción y Limpieza
Para la identificación y cuantificación de Triclosán en agua se realizó de acuerdo con el procedimiento
de la EPA 1694: Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water, con modificaciones,
tomándose 50mL de muestra y se diluyó con agua tipo I hasta completar un volumen 200mL; se
centrifugaron las muestras por 15 min a 3350 rpm, luego fueron filtradas con lana de vidrio y se ajustó
a pH=2 con HCl y se agitaron; se adecuaron los cartuchos SPE HLB (OASIS) al Manifold y se
acondicionó el cartucho con 12 mL de MeOH + 3 mL de H2O; Cuando comenzó al acondicionamiento
no se dejó secar el cartucho, se descartaron los eluentes y se adicionó 3 mL de H2O a pH=2; luego se
hizo pasar la muestra con una velocidad de flujo de 5-10mL/min y cuando terminó de pasar, se lavó
el cartucho con 10 mL de H2O y se dejó secar los cartuchos a vacío x 5 min, luego se eluyeron los
analitos con 6 mL de acetona: MeOH (1:1) y luego con 12 mL de MeOH, después se inició la elución
con vacío y se terminó con gravedad. Se recogió el eluente en un vial de vidrio de 20ml y se concentró
el extracto hasta 1 mL con corriente de nitrógeno de alta pureza, se llevaron los extractos a un volumen
final 5 mL con H2O:MeOH 90:10 en balones volumétricos aforados y se agitaron con vortex para
mezclar. Las partículas visibles presentes en el extracto se filtraron con filtro 0.2 µm y se transfirió 1
mL del extracto al vial ámbar para analizar en el Cromatógrafo líquido (UPLC) acoplado a
espectrometría de masas en tándem (Xevo TQD, Waters) con las siguientes condiciones
cromatográficas: Columna: C18, 2.1 x 100mm, 2.7µm tamaño de partícula, Flujo: 0.3mL/min con un
tiempo de inyección: 7.0 minutos. Temperatura de la columna: 40°C; Temperatura de las muestras
(viales): 15°C; Volumen de inyección: 20μL. Los parámetros del espectrómetro fueron: Source
temperature: 130°C, Desolvation temperature: 350°C, Desolvation Gas Flow: 1000L/hr, Cone Gas
Flow: 100L/hr, Ionización: ESI (-) y ESI (+), Capillary Voltage: 3.5kV. ver Foto 6 y Foto 7.
Foto 6. Proceso de Extracción de los contaminantes por
PSE
Foto 7. Viales ámbar con extractos finales
para lectura en UPLC-MS-MS
El rango de trabajo fue 0.50 μg/L a 10.0 μg/L: se prepararon 7 puntos a concentraciones de 0.50, 1.00,
2.00, 4.00, 6.00, 8.00 y 10.0 µg/L) en H2O:MeOH (90:10) y se utilizó H2O:MeOH (90:10) como
45
blanco. Las muestras fueron cuantificadas mediante la regresión lineal de las curvas de calibración
en el rango de 0.50-10.0 µg/L y límite de cuantificación: LC=0.50µg/L.
La linealidad fue evaluada mediante el análisis de curvas de calibración de estándar externo de
Triclosán. El rango de trabajo fue 5 a 100 μg/L, teniendo en cuenta las diluciones del procedimiento
analítico. Se prepararon 7 niveles de calibración a concentraciones de 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100
µg/L. La veracidad se evaluó con 10 muestras enriquecidas al 30 y 70% o 60 μL y 140 μL de 10 ppm
de Triclosán, mientras que la repetibilidad se determinó con 10 réplicas a tres niveles de concentración
(bajo, medio y alto). Para determinar el límite de cuantificación se analizaron extractos que no
contenían el TCS (blancos), además, fueron utilizados como controles de verificación de
contaminación del sistema durante el proceso.
Los criterios de aceptación se desarrollaron con el método modificado según lo establecido en el
método EPA-1694, las recuperaciones estuvieron en el rango 50-120%, lo que es consistente para la
determinación de PPCP en el medio ambiente y Porcentajes de desviación estándar relativa o (%RSD)
con un valor inferior al 20,3%.
Resultados y Discusiones
Con el método de Extracción en Fase Sólida o SPE siguiendo las recomendaciones de la EPA 1694:
Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water y cuantificación por UPLC-MS-MS se
analizaron en total de 150 muestras de agua. (Figura 7 y Tabla 4). Se detectó la presencia de TCS
por encima de 0.5 µg/L en aguas río Magdalena, en todos los puntos de muestreo seleccionados en la
temporada de lluvias del año 2018 con valores entre 1.44 y 2.93 µg /L, y en la época seca del año
2019 entre 1.34 y 1.64 µg /L. También fue detectado en la época seca del año 2017 en el municipio
de Puerto triunfo con una concentración de 2.50 µg /L. En el agua recolectada del río Cauca se detectó
la presencia de TCS en la época seca del año 2019 en los municipios de la Apartada y Nechí con
valores de 3.46 y 1.83 µg/L, respectivamente, y en la época de Lluvias en los municipios de la
Apartada, Nechí y el Guarumo con concentraciones de 0.94, 1.85 y 2.91 µg/L, respectivamente.
46
Figura 7. Concentraciones de Triclosán en los Ríos Magdalena y Cauca por Época Climática
La presencia de TCS en las muestras de agua recolectadas en los 2 ríos podría ser explicado debido a
las a que la mayoría de los municipios no cuentan con un sistema de tratamiento de aguas residuales
PTAR eficiente o simplemente no tienen (Contraloría General de la República de Colombia, 2018).
A pesar que se ha demostrado, que el TCS es removido en algunas PTAR (Bester 2005; Andrade-
Ribeiro et al.,2006; Janet Gil et al.,2012; Lopes et al.,2012; Pal et al., 2014; Amariei et al.,2017), en
Colombia llega TCS a las fuentes hídricas debido a procesos de escorrentía de zonas agroindustriales
y ganaderas y aguas residuales domesticas no tratadas de los centros urbanos.
Análisis estadístico de las variables fisicoquímicas
Homogeneidad de varianzas
Esta prueba se calcula por el estadístico de Levene para contrastar la igualdad de las varianzas
de grupo; no depende del supuesto de normalidad. Además, por medio de la prueba de
homogeneidad de varianzas se determina la similitud que tiene las variables en los lugares
de muestreo. Se realizó la prueba Levene's para la verificación de varianza (P <0.05) como
método más robusto en cuanto que las desviaciones de la normalidad se basan en las
medianas y no en las medias de los tratamiento.
2,50
1,62
2,93
2,55
1,90
1,441,64
1,341,61 1,47 1,38
3,46
1,83 1,85
2,91
0,94
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
Pu
erto
Tri
un
fo
Pu
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Tri
un
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La D
ora
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La A
par
tad
a
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hi
Nec
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mo
La A
par
tad
a
SECA(2017)
LLUVIA (2018) SECA (2019) SECA (2019) LLUVIA (2019)
Magdalena Magdalena Magdalena Cauca Cauca
[ ]
en
µg/
L
47
Normalidad de las variables
Se realizó la prueba de normalidad de las variables continuas de temperatura, pH, Conductividad
eléctrica y Oxígeno Disuelto, por medio de ANOVA para identificar la diferencia significativa (P
<0.05) entre cuencas, punto de muestreo y temporada climática. Los datos obtenidos se muestran en
la Tabla 5.
Tabla 5. Análisis estadístico de las variables continuas de temperatura, pH, Conductividad eléctrica
y Oxígeno Disuelto Vs Cuenca, puntos de muestreo y temporada climática.
Parámetro Variable Dependiente ANOVA Levene´s
Temperatura Cuenca 0,0002 0,0524
Punto de Muestreo 0,0001 0,2367
Temporada Climática 0,0625 0,9619
pH Cuenca 0,0003 0,5628
Punto de Muestreo 0,0002 0,2957
Temporada Climática 0,6896 0,2707
Conductividad Cuenca 0,0005 0,0151
Punto de Muestreo 0,0001 0,4352
Temporada Climática 0,1453 0,8339
Oxígeno Disuelto Cuenca 0,0024 0,2686
Punto de Muestreo 0,0001 0,0121
Temporada Climática 0,9126 0,0595
Como se puede observar en la tabla anterior, la prueba de ANOVA para todas las variables se
evidencia que existe una diferencia significativa entre las cuencas de los ríos de Magdalena y Cauca
y puntos de muestreo (P <0.05) pero No hay diferencias significativas por temporada climática, lo
que infiere que la temporada climática No afecta las variables de pH, Conductividad eléctrica,
Oxígeno disuelto y Temperatura.
La verificación de la varianza obtenida por la prueba Levene´s (P <0.05), se puede inferir que las
poblaciones son diferentes, no hay homogeneidad de las variables, lo que indica que cada cuenca y
punto de muestreo tiene características específicas que lo hacen diferente de los otros.
Parámetros fisicoquímicos del agua en los ríos Magdalena y Cauca.
Los ríos son sistemas naturales multifuncionales que poseen múltiples redes de drenaje con un
elevado grado heterogeneidad ambiental. Estos sistemas son elementos reguladores de tipo ecológico,
paisajístico y territorial, siendo claves en la dinámica ambiental. A pesar de que Colombia posee un
potencial hídrico tres veces mayor al promedio de los países suramericanos, presenta serios problemas
en la disponibilidad de agua de calidad en muchas regiones; en especial, aquellas zonas más pobladas.
Esto se debe principalmente, a la contaminación, deforestación, erosión, pérdida de capacidad de
48
retención y regulación del recurso hídrico, alterando drásticamente la biodiversidad y los ecosistemas
que regulan directa e indirectamente la oferta hídrica.(Gualdrón, 2016).
Entre las variables fisicoquímicas del agua, se identifican la temperatura, potencial de hidrogeno o
pH, oxígeno disuelto y la conductividad. Estas variables son de gran importancia para los ecosistemas
acuáticos debido a que son indicativos de la composición y dinámica de los agentes contaminantes y
contribuyen en la evaluación de la calidad de agua de los cuerpos loticos.
La temperatura es una de las variables más significativas en los cuerpos de agua, sirviendo de
indicativo de la estabilidad ecológica del sistema. Además, las variaciones de este parámetro generan
un cambio en el ambiente de desarrollo de la fauna y flora presentes en los cuerpos de agua; elevando
el potencial tóxico de ciertas sustancias disueltas en el agua.
El pH es un indicativo del grado de acidez, basicidad y alcalinidad del agua. Además, este parámetro
origina variación en la composición de la fauna y flora de los cuerpos de agua e influye en el grado
de toxicidad de ciertos compuestos, como el amoníaco, metales pesados, hidrógeno sulfurado, entre
otros .
La conductividad indica la presencia de sales ionizadas, como cloruros o iones de sodio, carbonatos,
etc. Además, este parámetro permite relacionar e interpretar resultados con los sólidos disueltos en
las descargas o cuerpos de agua.
El oxígeno disuelto indica la cantidad de oxígeno disuelto disponible en los cuerpos de agua.
Este parámetro da un indicativo de la contaminación del agua y del soporte que está puede
dar para el crecimiento y reproducción animal y vegetal. Generalmente, altos niveles en el
agua indican una alta tasa fotosintética, principalmente de las plantas acuáticas. Factores
como: alta intensidad lumínica, así como mayor turbulencia del cuerpo de agua pueden
aumentar los niveles de oxígeno disuelto.
Análisis de las variables fisicoquímicas por punto de muestreo.
Cuenca del Magdalena
Municipio de Barrancabermeja
Barrancabermeja, es la segunda ciudad del Departamento de Santander, actualmente es un Municipio
de desarrollo Industrial, comercial y urbano, ubicándose como una de las ciudades de mayor
influencia en la generación de actividades productivas en virtud de poseer la mayor Refinería de
Petróleo que se tiene en Colombia, es un puerto natural sobre el curso medio del Río Magdalena,
punto intermedio en el que converge la red férrea, la vía nacional que comunica la capital y el interior
andino con la costa atlántica. La cabecera municipal se localiza sobre la margen del río Magdalena,
49
a una altitud de 75.94 msnm, en las coordenadas 7°3´48” latitud Norte 73° 51´50” longitud Oeste
(Barrancabermeja, 2016).
Los parámetros medidos en campo se mantuvieron constantes, sin variaciones significativas, con un
promedio de temperatura de 29°C, pH de 7.5, Conductividad eléctrica de 185µS/cm y oxígeno
disuelto de 5.6 mg/L. Los valores más significativos se obtuvieron durante la temporada climática
seca en cuanto a valores de Conductividad eléctrica y temperatura (210.9 µS/cm y 29°C).
Municipio de la Dorada
La Dorada es considerado como el segundo municipio ganadero de Colombia, después de Montería,
y la segunda ciudad en importancia del departamento después de su capital Manizales. Se localiza a
5° 27" latitud norte y 74° 40" de longitud, está a 178 metros de altura sobre el nivel del mar, con una
temperatura promedio de 34 °C; ocupa una superficie de 574 km², que corresponden al 6.67 % del
área total del departamento de Caldas (Concejo Municipal- La Dorada, 2016).
No hubo variaciones significativas entre los datos obtenidos de temperatura, conductividad eléctrica,
pH y oxígeno disuelto del agua. Los valores obtenidos para temperatura fueron de 27°C, pH de 7.3,
Conductividad eléctrica de 130µS/cm y oxígeno disuelto de 5.5 mg/L. Los valores más significativos
se obtuvieron durante la temporada climática de transición en cuanto a valores de Conductividad
eléctrica y temperatura (169,4 µS/cm y 28°C).
Municipio de Puerto Berrío
Puerto Berrío es uno de los epicentros del comercio regional y en sitio para el tránsito de carga,
pasajeros y turistas. Es una ciudad intermedia de gran movimiento comercial, y considerada como
la capital del Magdalena Medio. Se ubica al oriente del departamento de Antioquia con coordenadas
Latitud Norte 6º29’35’’ y Longitud Este 74º24’26’’ a 125 msnm y una temperatura promedio de
30°C. (Concejo municipal de Puerto Berrío, 2016).
No hubo una variación significativa entre las temporadas climáticas, los datos más relevantes se
obtuvieron en la temporada de lluvias con un registro de temperatura de 28.4°C, Conductividad
eléctrica de 177.4 µS/cm, pH de 8.03 y Oxígeno disuelto de 6.63 mg/L .
Corregimiento de Puerto Serviez
Ubicado en el departamento de Boyacá, más específicamente en la desembocadura del río Nare, a
orillas del río Magdalena, se desarrollan actividades económicas tal como la ganadería, la pesca y la
agricultura. Este está ubicado cerca al municipio de puerto Boyacá a una Latitud norte: 6°24´83.33”
y Longitud Este: 74°53´52.778” a una altura de 130 msnm y una temperatura promedio de 30°C
(Boyaca, 2016).
50
No hubo una variación significativa entre las temporadas climáticas, los datos más relevantes se
obtuvieron en la temporada de lluvias con un registro de temperatura de 27.3°C, Conductividad
eléctrica de 199.3 µS/cm, pH de 8.07 y Oxígeno disuelto de 6.32 mg/L .
Municipio de Puerto Triunfo
Ubicado en el departamento de Antioquia, a orillas del río Magdalena, Las actividades económicas
de mayor importancia son la agricultura, la ganadería, la minería, el comercio y turismo, se destaca
la explotación de cemento y petróleo. Este está ubicado a una Latitud norte: 05º 52' 15" y Longitud
Este: 74º 38' 44" a una altura de 240 msnm y una temperatura promedio de 28°C.
No hubo una variación significativa entre las temporadas climáticas, los datos más relevantes se
obtuvieron en la temporada Seca con un registro de temperatura de 26.7°C, Conductividad eléctrica
de 114 µS/cm, pH de 7.02 y Oxígeno disuelto de 5.75 mg/L.
Cuenca del Río Cauca
Municipio de La Apartada
La Apartada es un municipio ubicado en el noroccidente del país, entre el departamento de Córdoba
y el departamento de Antioquia. Es atravesado por el río San Jorge con una población de 13.072
habitantes. Este está ubicado a una Latitud norte: 8° 3' 0'' y Longitud Este: 75° 19' 59'' a una altura de
32 msnm y una temperatura promedio de 28°C. (Concejo Municipal- La Apartada, 2016).
No hubo una variación significativa entre las temporadas climáticas, los datos más relevantes se
obtuvieron en la temporada de Transición con un registro de temperatura de 29.3°C, Conductividad
eléctrica de 139.1 µS/cm, pH de 7.14 y Oxígeno disuelto de 5.19 mg/L .
Municipio de Ayapel
Ayapel es un municipio localizado en el extremo oriental del departamento de Córdoba y bañado por
las aguas del río San Jorge y la ciénaga de Ayapel. Las grandes reservas acuíferas convirtieron a
Ayapel en uno de los principales centros comercializadores de pescado en la región, además de la a
agricultura y ganadería como base de la economía municipal. Con una población aproximada de
52.156 habitantes está ubicada a una Latitud norte: 8° 19' 1'' y Longitud Este: 75° 9' 0'' a una altura
sobre del nivel del mar de 25 metros.
No hubo una variación significativa entre las temporadas climáticas, los datos más relevantes se
obtuvieron en la temporada Seca con un registro de temperatura de 30.7°C, Conductividad de 156.6
µS/cm, pH de 7.44 y Oxígeno disuelto de 5.32 mg/L.
Municipio de Caucasia
Caucasia es un municipio colombiano localizado en la subregión del Bajo Cauca del departamento
de Antioquia. Es denominada la Capital del Bajo Cauca por ser el principal centro urbano y comercial
51
de la subregión. La economía local se mueve alrededor de la ganadería, la pesca, la agricultura y la
minería. Cuenta con una población de 90.213 hab y está localizada a Latitud Norte 7° 58′ 59″
Longitud Este 75° 12′ 0” a una altura sobre el nivel del mar de 50 metros (Alcaldia Caucasia 2016).
No hubo una variación significativa entre las temporadas climáticas, los datos más relevantes se
obtuvieron en la temporada de Transición con un registro de temperatura de 29.7°C, Conductividad
eléctrica de 166.7 µS/cm, pH de 7.55 y Oxígeno disuelto de 7.55 mg/L.
Municipio de Cáceres
Cáceres es un municipio localizado en la subregión del Bajo Cauca del departamento de Antioquia.
Limita por el norte con el departamento de Córdoba y el municipio de Caucasia, La economía de
Cáceres se basa en la ganadería, la tala de árboles y la agricultura. Tiene una población de 28.996 hab
y está ubicada Latitud norte 39°28'35.4''y Longitud Este 6°22.334' a un altura de 95m y temperatura
promedio de 28°C (Alcaldía municipal de Cáceres, 2016).
No hubo una variación significativa entre las temporadas climáticas, los datos más relevantes se
obtuvieron en la temporada Seca con un registro de temperatura de 27.2°C, Conductividad eléctrica
de 171.8 µS/cm, pH de 7.8 y Oxígeno disuelto de 7.97 mg/L .
Municipio de Nechí
Nechí es el municipio de menor extensión territorial en el Bajo Cauca antioqueño con una extensión
de 914 Km2, La económica de nechí se basa principalmente en la agricultura, minería, ganadería y
turismo. Tiene una población de 28.561 habitantes y está ubicada a una latitud norte 8° 4′ 59″ y
Longitud Este 74° 46′ 1″ con una temperatura promedio de 29°C y una altura sobre el nivel del mar
de 30m (Alcaldía Municipal de Nechí, 2016).
No hubo una variación significativa entre las temporadas climáticas, los datos más relevantes se
obtuvieron en la temporada Seca con un registro de temperatura de 28.7°C, Conductividad de 173.4
µS/cm, pH de 8.6 y Oxígeno disuelto de 7.3 mg/L .
Análisis de las variables fisicoquímicas con respecto a la cuenca y puntos de muestreo.
Temperatura.
En el análisis general de la variación de la temperatura por cuenca se observa mayor variabilidad en
los rangos de temperatura en la cuenca del río Cauca, donde las mayores temperaturas se registran en
la ciénaga de Ayapel 31.4 °C y Nechí 30.8 °C, las temperaturas se mantuvieron estables en la cuenca
del río Magdalena sobre todo en las estaciones de Barrancabermeja, La Dorada, Puerto Berrío y
Puerto Serviez donde la variación fue mínima durante las diferentes temporadas climáticas. En puerto
52
triunfo, se presentaron las temperaturas más bajas, debido a que tiene una fuerte influencia por los
ríos y quebradas de agua fresca que desembocan al río Magdalena (Figura 8).
Figura 8. Variación de la temperatura por cuenca (cuenca 1-Magdalena; Cuenca 2- Cauca) Y por
puntos de muestreo.
La temperatura presento un valor promedio de 27.3°C para el río Magdalena y 28,6°C en el río Cauca
(Tabla 6) indicando que ambos ríos están dentro de del rango optimo (< 35 °C) establecido para la
biota acuática.
pH
Los valores de mayor variabilidad de pH se presentaron en la cuenca del río Cauca y se ve reflejado
en los datos encontrados en la Ciénaga de Ayapel con un valor mínimo de 6.7 en temporada seca y
máximo de 8.1 en temporada de lluvias, esta variación puede deberse a que es un sistema lentico el
1
2
Gráfico Caja y Bigotes
24 26 28 30 32
Temperatura
Cu
en
ca
Apartada-San Jorge
Ayapel
Barranca
Caucasia
Guarumo-Caceres
La Dorada
Nechi
Puerto Berrio
Puerto Serviz-Nare
Puerto Tiunfo
Gráfico Caja y Bigotes
24 26 28 30 32
Temperatura
Pu
nto
de
mu
es
tre
o
53
cual tiene una fuerte influencia por actividades mineras que se desarrollan en sus alrededores, además
depende los pulsos hidrográficos del río Cauca para su recirculación y renovación (Figura 9).
Figura 9. Variación del pH por cuenca (cuenca 1-Magdalena; Cuenca 2- Cauca) Y puntos de
muestreo.
El pH presentó un valor promedio normal de 7.5 para el río Magdalena y 7.2 para el Cauca (Tabla
6). Estando dentro de los límites permisibles establecidos para la calidad del agua (6.5 – 9). Este
criterio es importante debido a que puede alterar la composición de fauna y flora de los cuerpos de
agua.
Oxígeno Disuelto
Los valores de mayor variabilidad de oxígeno disuelto por cueca fueron muy similares, son presentar
mayores variaciones, sin embargo en la cuenca del río Cauca se observa variaciones de oxígeno
1
2
Gráfico Caja y Bigotes
6,5 6,9 7,3 7,7 8,1
pH
Cu
en
ca
Apartada-San Jorge
Ayapel
Barranca
Caucasia
Guarumo-Caceres
La Dorada
Nechi
Puerto Berrio
Puerto Serviz-Nare
Puerto Tiunfo
Gráfico Caja y Bigotes
6,5 6,9 7,3 7,7 8,1
pH
Pu
nto
de
mu
es
tre
o
54
disuelto más altas que en la del río Magdalena, esto se ve reflejado al observar los puntos de muestreo
de Ayapel, Guarumo y Caucasia se presentaron los valores máximos con un valor máximo de 7.6
mg/L en temporada de Transición y en La Dorada con un valor mínimo de 4.84 mg/L en temporada
de transición y Barrancabermeja con 5,0 mg/L (Figura 10).
Figura 10. Variación del Oxígeno Disuelto por cuenca (cuenca 1-Magdalena; Cuenca 2- Cauca) Y
puntos de muestreo.
El Oxígeno disuelto tuvo un valor promedio de 6.1 para el río Magdalena y 6.7 para el Cauca (Tabla
6). Los cuales corresponden a un nivel medio para el desarrollo de la vida acuática (calidad de agua
para hábitat de peces establece que debe ser mayor a 4 mg/L).
Conductividad
Los valores de mayor variabilidad para Conductividad eléctrica se presentaron la cuenca del río
Magdalena, reflejado en Barrancabermeja con un valor máximo de 210.9µS/cm en temporada de
1
2
Gráfico Caja y Bigotes
4,7 5,7 6,7 7,7 8,7
Oxigeno Disuelto
Cu
en
ca
Apartada-San Jorge
Ayapel
Barranca
Caucasia
Guarumo-Caceres
La Dorada
Nechi
Puerto Berrio
Puerto Serviz-Nare
Puerto Tiunfo
Gráfico Caja y Bigotes
4,7 5,7 6,7 7,7 8,7
Oxigeno Disuelto
Pu
nto
de
mu
es
tre
o
55
Lluvias y Puerto Serviez con 200µS/cm, para la cuenca del río Cauca el valor mínimo se registró en
Ayapel con 33.1µS/cm en la temporada de Transición (Figura 11).
Figura 11. Variación de Conductividad eléctrica por cuenca (cuenca 1-Magdalena; Cuenca 2-
Cauca) Y puntos de muestreo.
La conductividad eléctrica presentó valores promedio de 141,8 μs/cm para el río Magdalena y de
108,1 para el Cauca (Tabla 6). Lo cual permite relacionar la turbiedad y cantidad de solidos
disueltos presente en los ríos.
1
2
Gráfico Caja y Bigotes
0 40 80 120 160 200 240
Conductividad
Cu
en
ca
Apartada-San Jorge
Ayapel
Barranca
Caucasia
Guarumo-Caceres
La Dorada
Nechi
Puerto Berrio
Puerto Serviz-Nare
Puerto Tiunfo
Gráfico Caja y Bigotes
0 40 80 120 160 200 240
Conductividad
Pu
nto
de
mu
es
tre
o
56
Tabla 6. Resultados de las variables fisicoquímicas analizadas
Temperatura pH Conductividad Oxígeno
Disuelto
Magdalena
(1)
Promedio 27,3 7,5 141,8 6,1
Mínimo 24,1 6,5 56,1 4,7
Máximo 29,8 8,1 210,9 7,2
Error
estándar
1,451 0,333 40,224 0,643
Cauca (2) Promedio 28,6 7,2 108,1 6,7
Mínimo 26,4 6,5 33,1 4,9
Máximo 31,4 8,1 173,4 8,3
Error
estándar
1,590 0,454 37,716 0,808
Las diferencias entre las cuencas, podría deberse a que el río Magdalena, principal río de Colombia,
tiene un mayor caudal y aportes de otros tributarios, que permite una autodepuración del sistema,
permitiendo que las variables se mantengan contantes a lo largo de su cauce, mientras que para el río
Cauca, debido a su fuerte intervención por la actividad minera que se desarrolla durante su recorrido,
sus grandes extensiones cenagosas y la intervención por el proyecto de generación de energía Hidro
Ituango, las variables fisicoquímicas mostraron una variabilidad más alta que las del río Magdalena,
además las temperaturas registradas para el río Cauca fueron las más altas durante todo el monitoreo.
Debido que los peces no tienen capacidad propia de regulación de su temperatura corporal y ésta
depende del medio acuático en que viven, la temperatura rige algunos parámetros físicos, químicos y
biológicos, tales como la evaporación y la solubilidad de los gases. Dentro de los biológicos están los
procesos metabólicos como la respiración, nutrición, actividad de las bacterias en la descomposición
de la materia orgánica, entre otros, de ahí la necesidad de conocer y evaluar los cambios de
temperatura del agua (Rojas Bonilla, 2006; Vides, 2013).
La temperatura influye sobre la biología de los peces e invertebrados, condicionando los procesos de
la maduración gonadal, el tiempo de incubación de las ovas, el desarrollo larval, la actividad
metabólica y el ritmo de crecimiento de las larvas, alevinos y adultos. Por lo general las reacciones
químicas y biológicas se duplican cada vez que hay un aumento de 10ºC en la temperatura del agua,
por lo tanto, un organismo acuático consume el doble de oxígeno a 30ºC que a 20ºC. Por lo anterior,
un aumento de temperatura disminuye la concentración de oxígeno, temperaturas altas y pH básico,
favorecen que el amoníaco se encuentre en su forma tóxica, las diferentes especies de peces tienen
sus rangos óptimos de temperatura (Truchas: menores a 18ºC; Carpa: 18-24ºC; Mojarra, Cachama,
Camarón de agua dulce y Bagre: más de 25ºC.), los peces presentan poca tolerancia a los cambios
bruscos de temperatura (Merino et al., 2015; Vides, 2013). Para el bagre rayado el inicio de la
57
reproducción está en estrecha relación con la elevación de la temperatura del agua en el periodo de
verano en un mínimo de 22 ºC (Cortés, 2003).
En cuanto al Oxígeno Disuelto, este corresponde al parámetro más importante en la calidad del agua.
Si hay déficit (˂3,0mg/L) se afecta el crecimiento y la conversión alimenticia de los peces y demás
organismos acuáticos. A mayor temperatura del agua más rápido el proceso de degradación de la
materia orgánica y por consiguiente mayor consumo de oxígeno (Vides, 2013). Los datos obtenidos
de Oxígeno Disuelto, durante el monitoreo de los ríos Magdalena y Cauca, muestran que hay buena
disponibilidad para mantener las poblaciones biológicas, los valores se mantuvieron por encima de
3,0mg/L, obteniéndose los datos más extremos en la Dorada, Barrancabermeja y La Apartada (4,14;
4,72; 4,86 mg/L respectivamente).
El Potencial de Hidrógeno letal para la población de peces, están por debajo de 4 y por encima de 11.
En la mayoría de los casos un rango de pH ente 6,5 y 8,2 es apropiado. Además, cambios bruscos de
pH pueden causar la muerte. Las aguas ácidas irritan las branquias de los peces, las cuales tienden a
cubrirse de moco llegando en algunos casos a la destrucción histológica del epitelio. La
sobresaturación de dióxido de carbono acidifica aún más el agua causando alteraciones de la
osmorregulación y acidificando la sangre.(Rojas Bonilla, 2006). Cachafeiro (1984) señala la
peligrosidad de las aguas ácidas ricas en hierro, al producirse un precipitado de hidróxido férrico en
las branquias de los peces, tornándose estas de un color marrón oscuro y causando la muerte de los
peces por asfixia. pH alcalinos pueden ocasionar lesiones de córnea y cristalino causando ceguera y
también necrosis de las aletas dorsal y caudal en truchas (Rojas Bonilla, 2006).
Los datos de pH obtenidos están en la mayoría de los puntos de muestreo, dentro de los rangos
apropiados para el desarrollo de los peces (6.5 y 8,2) sin embargo en Puerto Triunfo durante la
temporada de lluvias se registró un pH de 6,09, en Ayapel 8,46 en tiempo de lluvia y Nechí 8,61 en
temporada seca.
La conductividad eléctrica se mide con frecuencia en los sistemas acuícolas y se toma como un
indicador del grado de mineralización (concentración iónica total) del agua. Una propiedad coligativa
más importante del agua es el efecto de una mayor conductividad en la presión osmótica. La presión
osmótica de una solución es la cantidad de presión o fuerza necesaria para evitar el flujo de moléculas
de agua a través de una membrana semipermeable. El pez de agua dulce tiende a acumular agua
porque es hipertónico para el medio ambiente, por lo que debe excretar agua y retener iones para
mantener su equilibrio osmótico.
Como se pudo observar en los diferentes puntos de muestreo en los ríos Magdalena y Cauca, los
valores de temperatura, pH, Conductividad Eléctrica y Oxígeno disuelto, están dentro de los rangos
aceptables para la vida y desarrollo de los peces, especialmente del bagre rayado, sin embargo, estas
58
variables si pueden afectar la transformación y remoción de los contaminantes en el agua como el
TCS debido a que las variaciones de pH y temperatura afectan su estructura química favoreciendo su
ionización dando origen a otros compuestos.
En este aspecto, las propiedades de los compuestos como pKa, coeficiente de reparto n-octanol-agua
(log Kow), solubilidad en agua o el coeficiente de adsorción en el suelo (log koc), también pueden
afectar el grado de eliminación del TCS en función del pH. En el caso el TCS tiene un valor
relativamente alto de Kow = 4.8 y un pKa de 7,9 por lo que el pH de las aguas superficiales tiene una
gran influencia sobre su especiación, su destino medioambiental y su comportamiento por lo que
tienden a adsorberse en las partículas en suspensión.
En los puntos de muestreo como Puerto Berrío que presento un pH 8,03 y 7,91( lluvia y transición);
Puerto Serviez pH 8,07; Ayapel pH de 8,46 y 8,13( lluvia y transición) y Nechi 7,98 y 8,61 en
temporada seca, podrían incrementar la cantidad de TCS bioaccesible que estaría determinada por la
solubilidad de éste compuesto en el medio acuoso a causa del pH sobre el de TCS (7,9) (Sandoval,
2016), generarían aumentos en su solubilidad, y biodisponibilidad para los organismos acuáticos, lo
que incrementaría la posibilidad de bioacumularse en los tejidos.
Conclusiones
Todos los puntos de muestreo seleccionados para el río Magdalena registraron presencia del
contaminante TCS en las épocas climáticas de lluvia y Seca con valores entre 1.44 y 2.93µg/L. Para
el río Cauca se registró la mayor concentración de TCS en el agua con un valor de 3.46 µg/L en el
municipio de la Apartada en la temporada climática seca. También fue encontrado en los municipios
de Nechí, Guarumo y la Apartada con concentraciónes de 1.85; 2.91 y 0,94 µg/L de TCS
respectivamente. Las variables fisicoquímicas monitoreadas durante las campañas de muestreo en los
cinco puntos de muestreo seleccionados para los ríos Cauca y Magdalena, mostraron que existen
diferencias significativas entre las cuencas para todas las variables fisicoquímicas, por lo que la
cuenca del Magdalena y Cauca se consideran poblaciones diferentes. No hay diferencias
significativas por temporada climática, lo que infiere que la temporada climática No afecta las
variables de pH, Conductividad eléctrica, Oxígeno disuelto y Temperatura, son las condiciones
particulares de cada punto de muestreo lo que hace que estas variables sean únicas para cada punto
de muestreo. El TCS podría estar más bioaccesible debió la solubilidad de este compuesto en el medio
acuoso a causa del pH sobre el pKa de TCS lo que incrementaría la posibilidad de bioacumularse en
los tejidos.
59
CAPITULO 3
Concentración de Triclosán en el músculo de bagre rayado del Magdalena
(Pseudoplatystoma magdaleniatum) en el río Magdalena y Cauca.
A varios de los fármacos y productos de cuidado personal se les ha comprobado ser disruptores
endocrinos (EDC) en peces y otras especies acuáticas (Helbing et al., 2011). Residuos de estos
medicamentos se han encontrado en peces (Lopes et al., 2012; Zhang et al., 2019) y se ha comprobado
que estos compuestos pueden alojarse en los tejidos animales y luego extenderse a la cadena
alimentaria en una variedad de formas, y finalmente absorbido por los humanos (Ipcs et al., 2002).
Los tejidos de los peces, como el músculo, pueden considerarse como un bioindicador de
contaminación del agua debido a la exposición directa a las aguas residuales y contaminantes
transportados en los ríos (Peña-Herrera et al., 2019a). Los efectos de los EDC a dosis bajas pueden
ser diferentes a los efectos que ocasionan las mismas sustancias a dosis altas (Bern, 2014). También
se ha hecho evidente que los EDC pueden producir una no linealidad de curvas dosis-respuesta tanto
in vitro como in vivo, lo que dificulta su identificación y determinación de sus afectaciones (Barber
et al., 2015; Ipcs et al., 2002; Lamb et al., 2014).
La técnica QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Rafe) es una técnica sencilla,
rápida y confiable para preparación de muestras como alimentos, para extraer analitos como
plaguicidas y micotoxinas (Ramírez Restrepo et al., 2014; Zhang et al., 2019). QUEChERS se basa
en la partición líquido-líquido de los analitos entre agua y acetonitrilo (MeCN) usando sales para
producir el efecto, seguido de una extracción en fase sólida dispersiva (d-SPE). Este procedimiento
ofrece muchas ventajas que incluyen instrumentación básica para la aplicación, pequeñas cantidades
de muestra, rápida extracción y bajo volumen de residuos, lo que resulta en método confiable y
desarrollado en un tiempo eficiente. La técnica de Cromatografía Ultra performance Liquid
Chromatograph acoplado a espectrometría de masas en tándem (UPLC MS/MS) es utilizada para la
identificación y cuantificación de muchos analitos presentes en diferentes matrices, el detector de
espectrómetro de masas en tándem (MS/MS), tiene una sensibilidad muy elevada. Esto permite la
detección y cuantificación de analitos en cantidades a nivel de trazas. Una de las ventajas del equipo
utilizado para este estudio, se refiere a que el detector está conectado a un sistema de UPLC® (Ultra
performance Liquid chromatography) Waters Acquity UPLC H-Class. De este modo, se consigue
aumentar el rendimiento sin comprometer los resultados analíticos.
En la revisión de literatura científica sobre detección de los EDC seleccionados en peces, se ha
encontrado que las técnicas cromatográficas y métodos de extracción son diferentes, debido a su
complejidad y teniendo en cuenta que para cada compuesto deben considerarse sus propiedades
60
químicas para aplicar el tratamiento de extracción correcto y obtener los mejores resultados posibles;
para el EDC de Ibuprofeno, Ramírez en el 2007 realizaron un análisis de productos farmacéuticos en
peces de dos arroyos del condado de Denton, TX; utilizando el método de extracción en fase solida o
SPE y Cromatografía liquida con espectrometría de masas tándem para su identificación, obteniendo
resultados para la detección del Ibuprofeno con un LQD entre 3.14 y 10.4 µg/Kg y recuperaciones de
145% (Ramirez, 2007); Peña-Herrera y col, realizaron una validación de un método para la
determinación de productos farmacéuticos en músculo de pescado basado en QuEChERS y SPE HLB
prime y limpieza de lípidos por d-SPE EMR para su eliminación, extracción con método SWATH y
UPLC-MS/MS un LQD de 23,74 µg/Kg y recuperación de 54.10% (Peña-Herrera et al., 2019a); Rojo
y col, estudiaron la presencia de 17 productos farmacéuticos incluido el diclofenaco donde se utilizó
el método QuEChERS acoplado a UPLC espectrómetro de masas con trampa de iones triple
cuadrupolo lineal con un LQD de 2.5 µg/Kg y una recuperación de 50% a 118%. (Rojo et al., 2019);
Togunde y col optimizaron un método de micro extracción en fase solida SPME usando LC-MS/MS
con un LQD entre 0.08 y 0.21 ng/g y RSD de 9-18% pero el Ibuprofeno no fue detectado en los tejidos
(Togunde et al., 2012). Xie y col realizaron un estudio en el delta del río Pearl donde evaluaron
diferentes matrices entre ellas el músculo de peces y encontraron que en un 97% de ellas se encontraba
diclofenaco, mientras que el ibuprofeno solo se encontró en la matriz de sedimento y en un punto de
muestreo (Xie et al., 2019) con valores entre 0.03 a 5.6 ng/g y recuperaciones de 56 a 125%.
La validación del método de análisis para la identificación y cuantificación de los EDC, se hizo
siguiendo las recomendaciones de la AOAC, apéndice F (Guidelines for Standard Method
Performance Requirements) (AOAC, 2016) y los lineamientos de la norma técnica NTC-ISO / IEC
17025 de 2017. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una metodología para la extracción de
tres EDC en peces utilizando QUEChERS, se evaluó su rendimiento, extracción y limpieza de TCS
en músculo del pez de agua dulce Pseudoplatystoma magdaleniatum, de los ríos Magdalena y Cauca-
Colombia.
Validación del método para la determinación de TCS en músculo de bagre Rayado.
Para la determinación y cuantificación de TCS en músculo de pescado Pseudoplatystoma
magdaleniatum, fue necesario desarrollar un método analítico para la matriz, debido a que no se
contaba con un método estandarizado o validado en el laboratorio GDCON con los equipos y
reactivos disponibles dentro del mismo.
Por esta razón y luego de realizar una revisión bibliográfica exhaustiva sobre las diferentes
metodologías y procesos realizados para esta matriz y los equipos y reactivos disponibles, se inicia
un proceso de ensayos preliminares que permitirán identificar la mejor manera de extracción y
61
cuantificación del compuesto.
La validación se realizó siguiendo la guía de la AOAC apéndice F, “Guidelines for Standard Method
Performance Requirements, 2016” de la Association of Official Agricultural Chemists (AOAC) Los
parámetros de validación evaluados fueron: linealidad, límites de cuantificación, selectividad (efecto
matriz), veracidad y precisión (repetibilidad). Debido a que el proyecto macro, del cual se desprende
este proyecto de investigación se identifican y cuantifican tres contaminantes emergentes que son el
Diclofenaco, Ibuprofeno y Triclosán, en agua y músculo de bagre rayado, la metodología se desarrolla
y aplica a estos tres compuestos.
Materiales y Métodos
Condiciones para la preparación de la muestra
Los pescadores artesanales pescan durante unas horas y vuelven a vender sus capturas en la playa
mientras el pescado está todavía vivo o muy fresco, no requieren un complicado sistema de garantía
de calidad. Generalmente el pescado es capturado, vendido y consumido el mismo día, sin embargo,
se deben tomar algunas características y cuidados para garantizar la calidad del producto y evitar
cualquier tipo de contaminación o degradación (Huss, 1988).
Manejo de campo.
Debe evitarse el crecimiento de bacterias (que causan la formación o descomposición de histamina),
la decoloración y la "trituración" de los filetes. Las medidas de control consisten en restringir el
tiempo de manipulación (tiempo desde la captura hasta el enfriamiento). Se debe hacer un registro
detallado de cada porción de muestra, el marcado apropiado de las bolsas sellables con la
identificación del día, la hora y el lugar y las observaciones que sean necesarias frente al sitio de
muestro o las características del pescado como el sexo, el tamaño y el peso.
Transporte y conservación.
Se deberá mantener el control visual del hielo en el pescado. El límite crítico para la temperatura del
pescado es de 1 °C y se debe llevar un registro de las observaciones sobre la temperatura y la
congelación; en caso de que se pierdan las condiciones de conservación, se debe comprobar el
producto (clasificación) y rechazar los productos de baja calidad que presenten presencia de
decoloración u olor.
Condiciones de laboratorio.
Se deberá reducir al mínimo el riesgo de aceptar material de calidad inferior, y su estado deberá
verificarse mediante evaluación sensorial (visual) y control de la temperatura a la llegada al
laboratorio.
62
Para la preparación - fileteado, desuello/molienda
Se debe utilizar equipo de protección personal como gafas, guantes y gorra para evitar la
contaminación del producto. Además, el equipo, las mesas y los cuchillos utilizados deben lavarse y
desinfectarse con alcohol al 70% de antemano.
Envasado.
Debe reducirse al mínimo el peligro de deterioro durante el almacenamiento en congelador debido a
un envasado inadecuado. Por esta razón, se utilizan bolsas herméticas con un calibre entre 2 y 3 mm
para evitar que la muestra se rompa y se seque, perdiendo calidad y propiedades.
Congelación.
Debe mantenerse a -18 °C para garantizar su conservación. La muestra debe ser procesada en
menos de 3 meses.
Foto 8. revisión de condiciones organolépticas
para el procesamiento de la muestra
Foto 9. Molienda del músculo para ser
almacenado en bolsas sellables y tubos Falcón
de 50ml.
Foto 10. Muestras procesadas y rotuladas
para conservación en freezer a -18°C
Tratamiento y Análisis de las muestras.
Para la realización de la validación, se usaron 5 ejemplares de bagre de diferentes supermercados y
se analizaron para determinar la presencia de TCS, para poderlos usar como muestras blanco. Luego
63
de comprobar que no tenían residuos de TCS, se utilizaron los bagres para enriquecerlos con el
compuesto.
Las muestras de músculo de bagre fueron adquiridas en las plazas de mercado de los 10 municipios
seleccionados (Figura 6) y en las estaciones de lluvia, seca y de transición Tabla 4.
En cada uno de los sitios de muestreo seleccionados, se compraron 2 filetes o porciones de 500 gr de
músculo de pez bagre rayado, supervisando que las muestras pertenecieran a diferentes bagres, éstas
se guardaron en bolsa sellable, rotulada e identificando sitio y hora. Las muestras fueron preservadas
en una cava con hielo a una temperatura entre -10°C y 0°C, hasta que llegaron a las instalaciones del
laboratorio ubicado en la Sede Investigaciones Universitarias SIU, de la Universidad de Antioquia en
la ciudad de Medellín. En el laboratorio, los peces fueron desollados y homogeneizados en un
procesador de alimentos, empacados en bolsas sellables, marcados, rotulados y preservados en
congelación a -20°C.
Preparación de la muestra
Se descongeló una porción de la muestra y se tomaron 5 g de muestra por duplicado, en tubos Falcons
de 50 ml se pesaron las muestras en una balanza analítica (Shimadzu, ATX224). Se hizo el
enriquecimiento de la muestra utilizando 0.06 mL de mix de 10 ppm (30%) y 0.14 mL de mix de 10
mg ppm (70%). A cada tubo Falcon, se le añadió 5 ml de H2O acidificada a pH 2, se homogeneizó
con el equipo Ultra-Turrax T 10 basic (IKA) y se agregaron 10 mL de Acetonitrilo + 1 cerámico + 1
sobre de QuEChERS original (6 g MgSO4 + 1.5 g NaCl) (Kits QuEChERS, Agilent Technology). El
sistema se agitó vigorosamente durante 1 min y se centrifugó (centrífuga Boeco, 0320R) a 5000 rpm
por 5 min para la separación de las fases. Luego de 30 minutos de congelación, se tomaron 500 μL
del sobrenadante y se llevó a un vial, completando a un volumen de 1 mL con fase móvil. Finalmente,
cada muestra fue analizada en el UPLC/MS/MS (Xevo TQD, Waters) para su cuantificación.
Reactivos, solventes y materiales
Los estándares internos utilizados para la validación fueron: Diclofenaco Sódico 100% ([o-(2.6-
dicloroanilino)enil]acetato) de sodio U.S Pharmacopeial Convention; Ibuprofeno 100% (ácido ( ± )-
2-(p-Isobutilfenil)propionico) U.S Pharmacopeial Convention; Triclosán 99.7%, Sigma-Aldrich. Se
prepararon soluciones intermedias individuales de los analitos objetivo en MeOH grado LC/MS
(Merck), a una concentración de 1mg/L a 100µg/L, mientras que el nivel de cada compuesto, las
soluciones madre de estándar interno fueron de 1mg/L. Para la validación, calibración y soluciones
estándar de trabajo que contienen todos los compuestos se prepararon en MeOH y agua tipo I de
64
calidad Milli-Q (conductividad menor a 0.05 μS/cm) a concentraciones de 100 µg/L, 10 µg/L y 1
mg/L. Todas las soluciones se almacenaron en la oscuridad a -20 ° C.
Condiciones Cromatográficas
Para la cuantificación de Triclosán, Ibuprofeno y Diclofenaco se usó un UPLC Acquity (Waters)
acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent 6460 con fuente de ionización
por electroespray (ESI). La separación cromatográfica se realizó usando una columna C18 (Waters,
2.1 x 100 mm, 2.7 μm de tamaño de partícula) a una velocidad de flujo de 0.3 mL/min. La fase móvil
fue C = 1 L de agua tipo I, 0.5 mL de ácido acético, D = acetonitrilo: metanol (1: 1) (grado MS,
Merck), la columna se mantuvo a 40 °C mientras que el administrador de muestras se mantuvo a 15
ºC. El tiempo de ejecución del análisis fue de 7 min y el volumen de inyección fue de 20 μl de muestra.
Todos los datos fueron adquiridos y procesados con el software Masslynx v 4.1 (Waters).
Parámetros del espectrómetro de masas: Temperatura de la fuente: 130°C; Temperatura de
desolvatación: 350°C; Flujo de gas de desolvatación: 1000L/h; Flujo de gas del cono: 100L/h;
Ionización: ESI (-) y ESI (+); Voltaje del capilar: 3.5kV; para la confirmación de los compuestos se
hizo con las transiciones presentadas en la Tabla 7.
Tabla 7. Condiciones usadas de los compuestos en el UPLC/MS/MS
Compuesto Formula Molecular Confirmación
Transición m/z
Cuantificación
Transición m/z
Diclofenaco C14 H11 295.81 > 252 294.1 >249.98
Ibuprofeno C13H18 205.12 > 161.1 205.12 >161.1
Triclosán C12H7Cl 286.9 > 35 288.9 > 35 - 288.9 > 37
Proceso de Validación del Método.
La validación se realizó basada en la guía de validación “Guidelines for Standard Method
Performance Requirements, 2016” de la Association of Official Agricultural Chemists (AOAC). Los
parámetros de validación evaluados fueron: linealidad, límites de cuantificación, selectividad (efecto
matriz), veracidad y precisión (repetibilidad).
La linealidad fue evaluada mediante el análisis de curvas de calibración de estándar externo en matriz
(pez) para cada compuesto. El rango de trabajo fue 5 a 100 μg/L que correspondió a 20 μg/Kg y a
400 μg/Kg, teniendo en cuenta los pesos de las muestras y las diluciones del procedimiento analítico.
Se prepararon 7 niveles de calibración a concentraciones de 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 µg/L en
extracto de matriz. La veracidad se evaluó con 10 muestras enriquecidas al 30 y 70% de los tres
contaminantes, mientras que la repetibilidad se determinó con 10 réplicas a tres niveles de
65
concentración (bajo, medio y alto de los 3 analitos). Para determinar el límite de cuantificación se
analizaron extractos de peces que no contenían los compuestos en estudio (blancos), además, dichos
extractos fueron utilizados como controles de verificación de contaminación del sistema durante el
proceso de validación.
Los criterios de aceptación de la validación fueron tomados del apéndice F de la guía de validación
de la AOAC. De acuerdo con lo anterior, para la linealidad el coeficiente de ajuste es (R 2)> 0.99 y el
error relativo (%ER) de ± 20 % y porcentajes de recuperación de las enriquecidas en matriz deben
estar entre el 62.2 - 114.4% R, y los %RSD < 20.3%.
Linealidad
Se realizó con el fin de determinar el rango lineal entre la concentración y la respuesta cromatográfica,
las curvas para la calibración se prepararon con una mezcla de los 3 compuestos a partir de una
solución patrón de 1000 µg/L. Las curvas de calibración se realizaron con 7 niveles de calibración y
3 repeticiones de cada punto (5; 10; 20; 40; 60; 80; 100 µg/L) correspondientes a 20, 40, 80, 160,
240, 320 y 400 µg/Kg en pescado.
Los criterios de aceptación para la linealidad fueron: Coeficiente de determinación (R2) > 0.995;
Prueba Shapiro-Wilk: p calculado >0.05, normalidad de los residuales; Estadístico Durbin-Watson:
DW > 1.5 y p calculado >0.05, independencia de los residuales; Test Breusch-Pagan: p calculado
>0.05, homocedasticidad de los residuales.
Límites de detección y cuantificación
La sensibilidad se evaluó estableciendo un LOD como la concentración más baja de analito que podía
detectarse con cromatografía aceptable en forma de pico, con iones de cuantificación y confirmación
presentes en la señal de ruido mayor a 3. El LOQ fue el valor más bajo de concentración que cumplió
los criterios de LOD, pero con una relación señal ruido de 10 y el 1% de sesgo como desviación
estándar relativa o RSD por debajo de 20.3%, cada nivel de concentración fue preparado como
extractos de matriz de Bagre enriquecidos con estándares a una concentración. Para el nivel más bajo
o primer nivel de las curvas de calibración (0.005 ml/L), se tomaron 0.025 mL (25 µL) del estándar
de 0.001ml/L. Para un factor de dilución final de 4 realizando los cálculos en masa (µg/Kg). Se
realizaron ensayos de repetibilidad (10 réplicas) para verificar el cumplimiento de los criterios de
%RSD menores a 20.3% (AOAC, 2016).
El LOQ calculado es la concentración del analito correspondiente a la desviación estándar obtenida
(S´o) a niveles bajos multiplicada por un factor, kQ, donde el valor por defecto para kQ es 10 según
Eurachem (Morillas, 2016) ver LOQ = kQ × S´o (Ecuación 2).
66
𝑺´𝒐 =𝑺𝒐
√𝒏 (Ecuación 1)
LOQ = kQ × S´o (Ecuación 2)
El límite de detección o LOD se calcula multiplicando por 3 la desviación estándar calculada o S´o,
tal como se muestra en la LOD = 3 × S´o (Ecuación 3.
LOD = 3 × S´o (Ecuación 3)
Selectividad y Efecto matricial
La selectividad del método se determinó evaluando la matriz en blanco para la presencia de señal de
interferencia y tiempos de retención cromatográfica. Se evaluó el efecto matricial fortificando las
muestras con Triclosán, Ibuprofeno y Diclofenaco en 2 niveles de concentración de 30 y 70%
(tomando 60 y 140 µL del mix de estándar de 10 ppm).
Se llevaron a cabo las pruebas de t-Student y F- Snedecor para comparar la homogeneidad de las
medias y varianzas de la solución patrón con respecto a la muestra fortificadas en cada uno de los
compuestos. Para la identificación de los valores atípicos en las muestras fortificadas se realizó a
través de la prueba de Grubbs y Dixon. Para estas pruebas se tuvieron como criterios de aceptación:
t-Student: p calculado > 0.05, medias homogéneas; F-Snedecor: p calculado > 0.05, varianzas
homogéneas y Grubbs: p calculado > 0.05.
Veracidad
Se realizó la medición de experimentos de recuperación utilizando 10 muestras de ensayo adicionadas
con el analito de interés en un intervalo de concentraciones enriquecidas a 30 y 70% (tomando 60 y
140 µL del mix con los 3 compuestos de 10ppm). Se determinaron los porcentajes de recuperación,
los cuales deben estar en el rango 62.2 -114.4% y los porcentajes de desviación estándar relativa
(%RSD) que debe ser < 20.3%. Se utilizaron los parámetros establecidos para monitorear la
estabilidad del sistema de análisis.
Precisión (repetibilidad)
La precisión se midió como repetibilidad para determinar la variabilidad de los resultados de pruebas
independientes obtenidos con el mismo método, por el mismo operador y con el mismo equipo en
una serie de análisis sobre la misma muestra. Se analizaron 10 réplicas de los controles con
Ibuprofeno, Diclofenaco y Triclosán en 3 niveles de concentración bajo (20 µg/Kg), medio (200
µg/Kg), alto (400 µg/Kg) y se calcularon los porcentajes de recuperación según el Apéndice F de la
AOAC, los cuales deben estar entre el 62.2 - 114.4% con %RSD < 20.3%. Se calculó la desviación
67
estándar relativa predicha (PRSDR) por cada nivel de concentración utilizando la fórmula de Horwitz
y el valor HorRatr que estuviera por debajo del límite establecido < 2.
PRSDR = 2C-0.15 (Ecuación 4)
donde C se expresa como una fracción de masa
HorRatr = RSDr /PRSDR, (Ecuación 5)
donde RSDr es la desviación estándar relativa debido a la repetibilidad.
La precisión intermedia se evaluó con ensayos de dos analistas en diferentes días, 10 réplicas de los
controles con Ibuprofeno, Diclofenaco y Triclosán en 3 niveles de concentración (20, 200 y 400
µg/Kg), y se calcularon los porcentajes de recuperación según los criterios establecidos en el ítem de
repetibilidad.
Estabilidad
La estabilidad se verificó midiendo la respuesta a tres niveles de concentración (bajo, medio y alto):
20, 200 y 400 µg/Kg en n=10/concentración, en solvente y en la matriz en blancos que fueron
almacenados durante 3 meses a -20°C. La estabilidad se consideró aceptable si la medición de la
concentración no se desvía más del 15% de la medición inicial.
Monitoreo en matrices ambientales
Se realizó el monitoreo de la presencia de los tres contaminantes en músculo de bagre, realizando la
compra de éstos en las plazas de mercado local de los 10 municipios ubicados en la rivera de los ríos
Cauca y Magdalena. El muestreo se realizó durante 2 años (marzo de 2017 a octubre de 2019) en 3
épocas climáticas (lluvia, seca y transición); ver Figura 6 y Tabla 4, con el fin de determinar la
presencia de estos contaminantes en músculo para consumo humano.
Resultados y Discusiones
Linealidad
En la Figura 12 se presentan las curvas de calibración obtenidas para Triclosán, Ibuprofeno y
Diclofenaco con la ecuación de la regresión lineal y el coeficiente de correlación para todos los
compuestos R > 0.995.
68
El coeficiente de determinación (R2) indica que el modelo ajustado para todos los compuestos está
entre 99.88% y 99.98% de la variabilidad en Y. Los coeficientes de correlación (R) de los análisis de
los tres compuestos fueron 0.999, indicando una relación muy fuerte entre las variables.
(a)
(b)
(c)
Figura 12. (a) Curva de Calibración para Triclosán, (b) Curva de Calibración Ibuprofeno (c)
Curva de Calibración Diclofenaco
La independencia de los residuales se determinó a través del estadístico de Durbin-Watson, se
encontraron valores significativos (p calculado > 0.05), indicando que no hay autocorrelación en los
residuos con un nivel de confianza del 95%. La prueba de Shapiro-Wilk se realizó para determinar la
normalidad de los residuos, los valores p significativos para los tres compuestos fueron significativos.
En este caso, se puede señalar que los residuos provienen de una distribución normal. Se realizó la
prueba de Breusch-Pagan para determinar si la varianza de los residuos fue constante, obteniendo
para los tres compuestos el valor p calculado > 0.05. De acuerdo con esto, se concluyó que las
y = 0,4874x + 14,469R² = 0,9977
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 500 1000 1500 2000
Inte
nsi
ty
Concentration µg/L
Triclosan
y = 2,0279x + 19,453R² = 0,9993
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 500 1000 1500 2000
Inte
nsi
ty
Concentration µg/L
Ibuprofeno
y = 1,4411x - 14,692R² = 0,9991
0
500
1000
1500
2000
2500
0 500 1000 1500 2000
Inte
nsi
ty
Concentration µg/L
Diclofenaco
69
varianzas son constantes (homocedasticidad) en todas las concentraciones para cada compuesto (Ver
Tabla 8 ).
Tabla 8. Resultados R2, tests Shapiro-Wilk, Durbin-Watson y Breusch-Pagan
Compuesto
Prueba
R2 Shapiro-Wilk Durbin-Watson Breusch-Pagan
p valor p valor p valor
Diclofenaco 0.9988 0.5315 0.438 0.3353
Ibuprofeno 0.9993 0.5190 0.596 0.3988
Triclosán 0.9998 0.5312 0.449 0.2529
La linealidad y el coeficiente correlación para todos los compuestos fue R > 0.995 y el R2 para todos
los compuestos estuvo entre el 99.88% y el 99.98% de la variabilidad en Y. Los coeficientes de
correlación de los compuestos fueron iguales a 0.999 indicando una relación muy fuerte, casi exacta
entre las variables. A través del estadístico de Durbin-Watson, se encontró que no hay autocorrelación
en los residuos con un nivel de confianza del 95%, y se comprobó que hay normalidad en los residuos
y que la varianza entre estos es constante (homocedasticidad) para todas las concentraciones de cada
compuesto usando la prueba Shapiro-Wilk.
Las condiciones cromatográficas y transiciones definidas para la confirmación de los compuestos
establecidas en la Tabla 7 se muestran los cromatogramas para TCS de las transiciones, muestra
positiva Figura 14 y blanco Figura 15.
70
Figura 13. Cromatograma Transición del Triclosán 288.9˃37 y 288.9˃35
Figura 14. Cromatograma Muestra Positiva
71
Figura 15. Cromatograma Blanco
Límite de cuantificación
En la Tabla 9 se muestran los valores obtenidos de LOQ definido, el LOQ calculado por medio de la
ecuación 2 y LOD para cada compuesto. El LOQ definido y aceptado para el método es el límite
inferior de reporte del método (20 µg/Kg ó 5μg / ml), como nivel más bajo en el cual el desempeño
es aceptable para una aplicación y cumple con el valor de repetibilidad o RSD < 20.3%. Los
parámetros de linealidad, veracidad, selectividad y precisión se evaluaron en este LOQ.
Tabla 9. Límites de cuantificación para cada compuesto
Compuesto LOQ definido
(μg / ml)
Repetibilidad
o %RSD
So S´o
LOD
(3x S´o)
LOQ
calculado
Diclofenaco 5.0 16.3 2.926 0.9252 2.7758 9.2529
Ibuprofeno 5.0 7.8 1.226 0.3877 1.1632 3.8773
Triclosán 5.0 8.9 1.280 0.4047 1.2141 4.0472
So: Desviación estándar estimada; S´o: Desviación estándar calculada
72
Selectividad y efecto matriz
Se analizaron las muestras de matriz en blanco (n=10) y no observaron picos de interferencia dentro
de la ventana de tiempo de retención consideradas para las transiciones de los compuestos.
En la Tabla 10 se muestran los resultados de las pruebas de t-Student, F- Snedecor y Grubbs para
cada uno de los compuestos, se observa que no hay diferencias entre los valores obtenidos de
soluciones estándar y las muestras enriquecidas. Lo anterior indica que no hay efecto matriz y que
los resultados cumplen con los criterios, ya que no se encontraron valores atípicos para ningún
compuesto. Estos resultados fueron confirmados mediante la prueba de Grubbs.
Tabla 10. Resultados t-Student, F- Snedecor y Grubbs para Ibuprofeno, Diclofenaco y Triclosán
Compuesto
Prueba Estadística
t-Student F- Snedecor Grubbs
P – valor P - valor P - valor
Diclofenaco 0.0815 0.3085 1.0
Ibuprofeno 0.2399 0.3864 1.0
Triclosán 0.1941 0.2386 1.0
Para estas pruebas, los criterios de aceptación fueron: Student calculado > 0.05, significa homogéneo,
de Snedecor F p calculado > 0.05, varianza homogénea, y Grubbs p calculado > 0.05, inexistencia de
valor atípico.
Veracidad
Los porcentajes de recuperación obtenidos durante la realización de los experimentos cumplen con
los porcentajes de recuperación en ambos niveles de concentración trabajados (62.2 -114.4%,) y RSD
< 20.3%, en la Tabla 11 se muestran los datos obtenidos para la evaluación del parámetro.
Tabla 11. Porcentajes de recuperación y RSD
Compuesto Recuperación al 30% %RSD Recuperación al 70% % RSD
Diclofenaco 63.5 -105.3 20.0 68.5 – 105.7 16.3
Ibuprofeno 77.5 – 102.6 8.5 75.71 – 89.8 5.7
Triclosán 62.5 – 112.7 20.2 71.2 – 111.9 16.6
Repetibilidad
Como se presenta en la Tabla 12, los valores obtenidos para la Desviación Estándar Relativa (RSD)
bajo condiciones de repetibilidad o RSDr y bajo condiciones de precisión intermedia Intra-laboratorio
o RSDR, fueron inferiores a los calculados por la ecuación de Horwitz, los cuales cumplen con los
73
criterios para un HorRat < 2. Lo anterior indica que el método tiene una precisión adecuada para el
desempeño provisto.
Tabla 12. Resultados a tres niveles de concentración por analista
Diclofenaco
Nivel de
Fortificación
(μg/Kg)
Parámetro Analista 1 Analista 2 Valor
HorRatR
20 Media ± SD 17.920 ± 2.926 14.204 ± 0.288 0.321
RSD (%) 16.328 2.031
HorRatr 0.572 0.071
200 Media ± SD 0.174 ± 0.019 0.157 ± 0.013 0.484
RSD (%) 11.121 8.443
HorRatr 0.55 0.417
400 Media ± SD 0.324 ± 0.569 0.971 ± 0.644 0.495
RSD (%) 17.539 19.098
HorRatr 0.467 0.523
Ibuprofeno 20 Media ± SD 15.200 ± 1.497 17.582 ± 3.085 0.479
RSD (%) 9.846 17.546
HorRatr 0.345 0.614
200 Media ± SD 0.209 ± 0.010 0.222 ± 0.009 0.219
RSD (%) 4.814 4.037
HorRatr 0.238 0.2
400 Media ± SD 0.335 ± 0.024 0.347 ± 0.025 0.396
RSD (%) 7.294 7.153
HorRatr 0.4 0.392
Triclosán 20 Media ± SD 14.324 ± 1.296 17.409 ± 0.189 0.249
RSD (%) 8.935 8.5494
HorRatr 0.419 0.08
200 Mean ± SD 0.1738 ± 0.018 0.225 ± 0.010 0.493
RSD (%) 10.15 8.454
HorRatr 0.554 0.432
400 Media ± SD 0.3648 ± 0.044 0.265 ± 0.016 0.407
RSD (%) 12.1940 7.531
HorRatr 0.42 0.394
La repetibilidad del método calculada por la ecuación de Horwitz y los criterios de HorRat < 2,
indican que el método es reproducible. Los porcentajes de recuperación obtenidos fueron entre 63 -
112%, 75 - 102% y 62 - 113% para el Triclosán, Diclofenaco e Ibuprofeno, respectivamente.
Adicional, la desviación estándar relativa (%RSD) < 20.3% obtenida cumplió los criterios de
aceptación establecidos dentro del apéndice F de la AOAC.
74
Cada uno de los parámetros establecidos cumplió con los criterios de aceptación, esto indica que el
método es preciso y reproducible, obteniendo resultados confiables y de una forma fácil, rápida y
económica.
Estabilidad
Se realizaron las pruebas de estabilidad en muestras de tejidos almacenadas a -20°C durante 3 meses
y se demostró que las variaciones de la medida de la concentración fueron inferiores al 15% durante
este periodo. Estos valores están de acuerdo con los criterios de validación con %RSD definido.
Prueba del método validado en muestras ambientales
La ventaja y las deficiencias de este método para la detección de Triclosán, Ibuprofeno y Diclofenaco,
basado en la extracción de QuEChERS, presenta ventajas como el factor económico y el reducido
consumo de tiempo debido al uso de pocos materiales, equipo y bajo volumen de disolventes y una
experiencia mínima en la preparación de muestras. Además, hay un bajo contenido de grasas y una
coextracción de la matriz. Los criterios para la selección del método de extracción fueron que tuviera
una buena recuperación de los analitos y que tuviera una menor variabilidad (RDS <20%). El método
de extracción era comparable en eficiencia y RSD con otros métodos similares.
Una desventaja de no disponer de un equipo automático para la agitación de la muestra al añadir
QuEChERS es el gran esfuerzo físico que se requiere para conseguir una buena agitación y soportar
la reacción exotérmica que se produce en las manos del analista. El pH ácido puede estar eliminando
las interferencias de la matriz ayudando a la recuperación de los analitos y favoreciendo la
recuperación de estos analitos. El método validado para la cuantificación de los EDC, en muestras de
tejido de bagre rayado; utilizando QuEChERS y UPLC-MS-MS, se aplicó a muestras reales
recolectadas en los sitios de muestreo seleccionados en los ríos Cauca y Magdalena (Tabla 4). Se
analizaron 84 muestras de músculo de bagre rayado y los resultados se muestran en la tabla 9. Se
detectó la presencia de TCS por encima de 20 µg/Kg en los peces del río Magdalena, municipio de
La Dorada con valores de 54.67 en temporada de transición de lluvias y 22.9 µg /Kg, en época seca
del año 2017 y 2019, respectivamente. En los peces recolectados del río Cauca se detectó la presencia
de TCS en la Ciénaga Ayapel con valores de 26.94 y 20.21 µg/Kg en la temporada transición y lluvia,
respectivamente (Figura 16 y Tabla 13). Para los EDC Ibuprofeno y Diclofenaco no se halló
presencia de estos contaminantes en ninguno de los sitios de muestreo seleccionados, aunque se
encontró la presencia de estos compuestos en muestras de agua en los mismos sitios de muestreo del
presente estudio, esto indica que los compuestos a pesar de estar presentes en aguas superficiales no
han sido bioacumulables en los peces.
75
El ibuprofeno y el diclofenaco son compuestos hidrofílicos (log Kow:1.90 para diclofenaco y 2.48
para ibuprofeno) (Scheytt et al., 2005) lo cual no favorece su bioacumulación. En el caso del Triclosán
que tiene un log Kow de 4.76 (Aldous, E., Rockett, L., Johnson, 2009) puede bioacumularse en los
tejidos grasos. Varios reportes indican que algunos contaminantes presentes en el medio ambiente
pueden ser acumulados por organismos acuáticos debido a su exposición continua a los mismos y por
su fuente de alimentación (Ali et al., 2018; Escarrone et al., 2016; Fan et al., 2019; Gómez et al.,
2006; Vazzoler, 1996a). Sin embargo, también hay estudios que indican que a pesar de su presencia
en el agua no fueron detectados en los tejidos de peces como el diclofenaco e ibuprofeno (Chen &
Ying, 2015; Nallani et al., 2011; Pemberthy M et al., 2020; Togunde et al., 2012; Xie et al., 2019).
Pemberthy y col, estudiaron estos mismos contaminantes en aguas y peces del Golfo de Urabá-Caribe
colombiano, encontrando presencia de estos tres contaminantes en el agua y no en el músculo de los
peces estudiados (Pemberthy M et al., 2020).
Figura 16. Resultados de la Concentración de Triclosán en muestras de bagre rayado y temporada
climática.(Tr: Transición; Sc: Seca; Llv: Lluvia).
22,896
54,676
26,94
20,212
0
10
20
30
40
50
60
La Dorada (Tr) La Dorada (Sc) Ayapel (Tr) Ayapel (Llv)
µg/K
g
Punto de muestreo
Triclosán en músculo de pez
76
Tabla 13. Concentraciones de Triclosán en las muestras de peces recolectadas en río Cauca y
Magdalena.
Temporada Climática/Fecha de
recolección de la muestra
Ubicación µg/Kg de Triclosán
Río Magdalena
Lluvia
(29/03/2017 y 9/04/2019)
Puerto Nare (Puerto Serviez) <LC= 20 µg/Kg
Barrancabermeja <LC= 20 µg/Kg
Puerto Berrío <LC= 20 µg/Kg
Puerto Nare (Puerto Serviez) <LC= 20 µg/Kg
Transición
(7/09/2017 y 25/06/2019)
Puerto Triunfo <LC= 20 µg/Kg
La Dorada 54.67 µg/Kg
Puerto Nare (Puerto Serviez) <LC= 20 µg/Kg
Barrancabermeja <LC= 20 µg/Kg
Puerto Berrío <LC= 20 µg/Kg
Seca
(12/07/2018 y 20/02/2019)
Puerto Triunfo <LC= 20 µg/Kg
La Dorada 22.9 µg/Kg
Puerto Nare (Puerto Serviez) <LC= 20 µg/Kg
Barrancabermeja <LC= 20 µg/Kg
Puerto Berrío <LC= 20 µg/Kg
Lluvia
(29/03/2017 y 22/03/2019)
Ayapel 20.21 µg/Kg
Apartada-San Jorge <LC= 20 µg/Kg
Caucasia <LC= 20 µg/Kg
Nechí <LC= 20 µg/Kg
Guarumo-Cáceres <LC= 20 µg/Kg
Río Cauca
Transición
(29/08/2017 y 07/09/2019)
Ayapel 26.94 µg/Kg
Apartada-San Jorge <LC= 20 µg/Kg
Caucasia <LC= 20 µg/Kg
Nechí <LC= 20 µg/Kg
Guarumo-Cáceres <LC= 20 µg/Kg
Seca
(12/07/2018 y 13/06/2019)
Ayapel <LC= 20 µg/Kg
Apartada-San Jorge <LC=20 µg/Kg
Caucasia <LC= 20 µg/Kg
Nechí <LC= 20 µg/Kg
Guarumo-Cáceres <LC= 20 µg/Kg
La identificación de TCS en las muestras analizadas de los ríos Magdalena y Cauca, sugieren que las
características del pez seleccionado (Pseudoplatystoma magdaleniatum); tales como ser una especie
depredadora ubicada en lo más alto de la cadena trófica, por su gran tamaño y por ser una especie
migratoria que tiene un importante desplazamiento en los ríos, influyen en la bioacumulación de estos
contaminantes, lo que lo posiciona como una especie bioindicadora muy importante en los ríos de
Colombia. Como consecuencia de los efectos ya comprobados de estos contaminantes en los
organismos acuáticos, puede verse afectada el desarrollo, supervivencia y reproducción de dicha
especie.
77
La no detección de estos contaminantes en los tejidos de los peces provenientes de los diferentes sitios
de muestreo es posible explicar dada su presencia a nivel de trazas o ser eliminados por los
organismos. Sin embargo, para poder determinar estos procesos se deben realizar estudios más
detallados, como incluir el análisis de otros tejidos como el hígado, que es el principal órgano de
depuración, metabolización y acumulación (Escarrone et al., 2016).
Conclusiones
Se desarrollo un método analítico para la determinación de tres disruptores endocrinos, en músculo
del pez bagre rayado del Magdalena Pseudoplatystoma magdaleniatum. El método se basó en la
extracción por QuEChERS, siendo modificado para minimizar los efectos de la matriz, aplicando el
método de congelación para dividir la fase de material orgánico y lípidos contenidos en la muestra, y
esto presentó ventajas de tiempo de preparación de muestra, bajo consumo de insumos y de volumen
de muestra y reactivos. La espectrometría de masas tándem y de alta resolución ha demostrado ser
una técnica que proporciona resultados cuantitativos fiables, con buena linealidad, adecuada
precisión, alta sensibilidad, especificidad y selectividad. La validación se realizó teniendo como base
la AOAC apéndice f en términos de linealidad, precisión, selectividad y repetibilidad, el efecto
matricial a tres niveles de concentración 20, 200 y 400 µg/Kg dw de músculo de pescado. Para la
mayoría de los analitos, las recuperaciones fueron entre 62.2 y 114 % y un RSD >20.3%, con un LOQ
definido en 5 μg/ml como concentración más baja de analito que podía detectarse con cromatografía.
Se aplicó satisfactoriamente al monitoreo de muestras reales y se demostró que es sensible y
reproducible. Se hace necesario seguir con los avances en el desarrollo de metodologías analíticas de
alto rendimiento para la determinación de EDC para ofrecer información pública como herramienta
para la toma de decisiones y determinar su afectación a la salud ambiental y humana.
Debido a que los EDC actúan de manera aleatoria en el sistema hormonal de los organismos, y que
su monitoreo en matrices ambientales genera un desafío científico para su identificación, evaluación
y seguimiento, se deben continuar los análisis y generar herramientas sensibles, selectivas y
específicas para su seguimiento.
El campo de aplicación de este método podría extenderse a otras partes del pez, con el fin de poder
analizar la presencia de estos compuestos es órganos tales como hígado, intestinos, branquias y bazo.
Es útil y efectivo para el monitoreo de los compuestos seleccionados en matrices ambientales.
78
CAPITULO 4
Evaluación de la calidad seminal de bagre Rayado Pseudoplatystoma magdaleniatum
expuesto a Triclosán.
La calidad del semen es conferida por la adquisición de la movilidad espermática, sus características
bioquímicas, capacidad de ser almacenado por corto tiempo y la resistencia a la crioconservación, así
como la capacidad del espermatozoide para fecundar (Ramirez-Merlano et al., 2011; Vazzoler,
1996a). En peces, parámetros como la movilidad total, duración de la movilidad y concentración
espermática han sido tradicionalmente utilizadas como patrón de calidad seminal (Ramirez-Merlano
et al., 2011; Tabares et al., 2005). Para la evaluación espermática se utiliza programas
computacionales conocidos como CASA (Computer Assisted Sperm Analysis); los cuales comparan
los parámetros de movimiento y velocidad de los espermatozoides bajo diferentes condiciones
fisiológicas, desempeñando un rol importante para la acuicultura mediante la optimización de las
condiciones de manejo y almacenamiento del semen usado para la fecundación de los ovocitos
(Ramirez-Merlano et al., 2011; Vazzoler, 1996b). Para bagre rayado se ha reportado una
concentración espermática de 55.500 ± 22.900 millones/mL y un tiempo de activación de 31.2 ± 2.1
seg (Peña-Herrera et al., 2019b).
Los espermatozoides de la mayoría de los peces teleósteos difieren de los mamíferos en aspectos
importantes como su inmovilidad en el fluido seminal, la movilidad es inducida cuando entra en
contacto con el agua, tienen un corto tiempo de activación y no presentan acrosoma (Ramirez-
Merlano et al., 2011; Tabares et al., 2005; Valdebenito et al., 2009). De igual forma, para la
determinación de las características del semen es necesario entender la bioquímica básica que ocurre
en la movilidad del espermatozoide y durante la fertilización. El plasma seminal en su composición
contiene sustancias de soporte y otras que reflejan las funciones de los espermatozoides y del sistema
reproductivo, cuyo objetivo es crear un ambiente óptimo para el almacenamiento de los
espermatozoides (Pineda, 2007; Ramirez-Merlano et al., 2011; Vazzoler, 1996b).
Metodología
Material biológico
Se utilizaron nueve ejemplares de bagre rayado capturados en el río Magdalena en cercanías de Puerto
Berrío (Antioquia) con peso entre 800 y 1860g y una longitud estándar entre 61 y 80cm. Antes de los
ensayos para reducir el estrés por manipulación y cambio de ambiente fueron adaptados al cautiverio
en la Estación Piscícola San José del Nus de la Universidad de Antioquia en tres tanques circulares
79
de 5 m de diámetro con un volumen de agua de 3500L, con una columna de agua de 80 cm y aireación
programada cada tres horas por 15 min para mantener las condiciones adecuadas de oxígeno.
Los animales fueron alimentados con peces forrajeros (alevinos de tilapia roja Oreochromis spp). En
la estación Piscícola San José del Nueve fueron mantenidos por siete meses (abril a octubre de 2019)
(Foto 11). Durante ese periodo se observó que la temperatura del agua fue factor limitante en el
desarrollo y adaptación de esta especie (22 a 25°C), durante la primera etapa de adaptación y
producción de productos sexuales (septiembre-octubre de 2019). Solo dos de los nueve bagres
produjeron esperma, y la calidad y cantidad de los productos no fue satisfactoria, debidoa que
contenia poco contenido seminal que se caracteriza por su color blanco o beige y mayormente se
obtenía era un líquido traslucido o líquido seminal. La falta de maduración o producción de semen
podría ser atribuido posiblemente a las temperaturas del agua que osciló entre 22 a 25°C, por fuera
del rango térmico descrito para las especies nativas.
Foto 11. Estanques en Geomembrana Circulares y aireación asistida para la experimentación
con bagres
Debido a lo anterior los peces se trasladaron a las instalaciones del CINPIC (Centro de Investigación
Piscícola de la Universidad de Córdoba, Colombia), donde las temperaturas del agua oscilaron entre
26 y 28°C, con una carga sedimentaria similar a la del ambiente natural. Los estanques eran
rectangulares de 3x1.5m y una columna de agua de aproximadamente 0.5m, se realizó una nueva
aclimatación antes de empezar los experimentos (Foto 12 y Foto 13). En esta etapa (mayo a junio de
2020) los bagres de control y expuestos a la concentración de 50 µg/L de TCS produjeron buena
cantidad y calidad de esperma y con los cuales se realizaron los análisis; pero los peces expuestos a
la concentración de 25 µg/L de TCS solo uno de los tres ejemplares produjo esperma.
80
Foto 12. Instalaciones del Centro de
Investigación Piscícola – Universidad de
Córdoba- CINPIC
Foto 13- Estanques de experimentación
rectangulares -CINPIC
Manejo y tratamientos
Se evaluaron tres concentraciones de TCS: 0 (control), 25 y 50 μg /L de TCS, agregando una solución
estándar de 1mg/L a partir de TCS a 99.7%. Cada semana se verificó la concentración en cada tanque
tomando alícuotas en viales de vidrio de 5mL para ser identificadas y cuantificadas por inyección
directa por Cromatografía Liquida de alto rendimiento acoplado a espectrometría de masas en tándem
UPLC MS/MS (Xevo TQD, Waters). Las condiciones se mantuvieron constantes durante la
experimentación adicionando la solución de TCS necesaria para que mantuvieran las condiciones
experimentales requeridas. Las concentraciones monitoreadas para el estanque de 50 μg/L oscilaron
entre 35 y 42 μgTCS /L y para el estanque de 25 μg/L fueron entre 17 y 22 μgTCS /L.
Colecta y análisis de semen
Los machos fueron revisados semanalmente en los periodos reproductivos de la especie (mayo-junio
y septiembre-octubre). El semen se colectó mediante masaje abdominal en sentido craneocaudal y se
colectaron en viales Eppendorf estériles. Cada muestra de semen fue analizaba por triplicado con
ayuda de un microscopio de contraste de fase (Nikon E 51) y la ayuda del CASA Sperm Class
Analyzer (Microptic, SCA®, España). El volumen de muestra de semen fue medido directamente en
los tubos Eppendorf de 2 ml estériles y secos, el color se evaluó para evidenciar la posible presencia
de sustancias contaminantes como heces, orina o sangre. Las muestras fueron mantenidas bajo
condiciones de laboratorio (26 ± 1oC) para posterior evaluación.
81
Foto 14. Masaje craneocaudal para extracción de esperma
Movilidad total y tipos de movilidad.
Se estimaron con ayuda de un microscopio óptico de contraste de fase (Nikon, E50i, Japón) y el
programa SCA® (Microptic SL, SCA® VET 01, España); para lo cual una muestra de 0.25 μL de
semen y 75 μL de agua bidestilada (dilución 1:300) fueron depositados en una cámara de conteo
Makler (Sefi Medical Instruments Ltd, Israel) (Foto 15 y Foto 16). Las muestras fueron analizadas
en un periodo de cuatro segundos por el programa SCA®, obteniéndose la movilidad total y tipos de
movilidad (a, b, c y d). Los porcentajes de espermatozoides con velocidad rápida “tipo a” fueron
aquellos con velocidades mayores a 100 µm/s, media o tipo b, aquellos con velocidades entre 45 y
100 µm/s, lenta o tipo c, con velocidades entre 10 y 45 µm/s y el porcentaje de células estáticas tipo
d o sin movimiento. Este procedimiento se realizó tres veces para obtener un valor promedio de las
velocidades espermáticas del semen analizado.
Foto 15. Microscopio óptico de contraste de fase y
el programa SCA® utilizados en las instalaciones
del CINPIC
Foto 16. Cámara de conteo Makler
82
Progresividad, velocidad e índices espermáticos.
La velocidad progresiva indicó las células que presentaban un movimiento hacia delante. La
velocidad curvilínea (VCL; μm/s) se definió como la velocidad de la cabeza del espermatozoide a lo
largo de la trayectoria curvilínea real. La velocidad rectilínea (VSL; μm/s) se fijó como la velocidad
de la cabeza de espermatozoide a lo largo de la línea recta entre la primera y la última posición
detectada. La velocidad de la trayectoria promedio (VAP; μm/s) se calculó como una interpolación
entre los puntos correspondientes a la trayectoria de la VCL. El índice de rectitud (STR; %) se definió
como la linealidad de la distancia de trayectoria promedio, VSL/VAP, y la linealidad (LIN; %) fue la
relación entre la distancia en línea recta y la distancia de la trayectoria real (VSL/VCL). Otros
parámetros cinéticos que se consideraron para caracterizar la calidad del movimiento espermático
fueron el índice de oscilación (WOB = VAP/VCL; %), y la frecuencia de batimento (BCF; Hz),
expresada como el número de veces que la trayectoria curvilínea cruza la lineal (Valverde, 2018).
Tiempo de activación.
Se evaluó con ayuda de una cámara de conteo Makler, sobre la cual se colocó 1 μL de semen,
analizando la muestra con un microscopio óptico de contraste de fase. La movilidad espermática fue
activada con 10 μL de agua destilada, y se estimó hasta que aproximadamente el 90% de los
espermatozoides dejaron de moverse. Este procedimiento se realizó tres veces para obtener un valor
promedio del semen analizado.
Concentración espermática.
El semen fresco se diluyó (1:700), para lo cual 1 μL de semen se mezcló con 699 μL de glucosa al
6% en un Eppendorf de 2 mL (dilución 1:700), la mezcla fue homogenizada durante cinco segundos
en vórtex a 1200 rpm (Velp Scientific, Zxclasic, China) (Cruz Casallas et al., 2006); luego 10 μL del
semen diluido fue colocado en una cámara Makler (Sefi Medical Instruments Ltd, Israel) y con la
ayuda del programa asistido por computadora para análisis de semen Sperm Class Analyzer SCA®
(Microptic SL, SCA® VET 01, España). Este procedimiento se realizó por triplicado para obtener un
valor promedio de la concentración espermática, y no se permitió una diferencia mayor al 10% entre
las lecturas; en tal caso se repitió el proceso.
Consideraciones éticas y experimentación con especímenes
La Universidad de Antioquia, por medio de su comité de ética para la experimentación con animales,
concedió el aval para su ejecución al Grupo Diagnostico y Control de la Contaminación -GDCON-
en el acta N° 89 del 29 de mayo de 2014. Debido a que es una especie en peligro crítico de extinción,
la Autoridad Nacional de Licencias Ambientales-ANLA- otorgó el aval para la recolección de
83
especímenes de especies silvestres de la diversidad biológica con fines de investigación científica no
comercial mediante la Resolución No.0525 del 27 de mayo de 2014.
Análisis estadístico
Todos los datos se presentaron como media ± DE, los datos obtenidos fueron normalizados por
transformación antes de los análisis estadísticos. Se usó un análisis de varianza unidireccional
(ANOVA) para identificar la diferencia significativa (P <0.05) entre tratamientos y grupos de control.
Se utilizó la prueba Levene's para la verificación de varianza (P <0.05). Todos los análisis estadísticos
fueron realizados usando el Paquete Estadístico Statgraphics Centurion XVI versión 16.1.18.
Resultados y Discusiones
El volumen de la muestra de semen para los bagres sometidos a la concentración de 50 μgTCS/L por
12 meses (abril de 2019 a abril de 2020) era mayor a los sometidos a la concentración de 25 μgTCS/L
Tabla 14 , resaltando además que los peces sometidos a la mayor concentración, espermiaron en los
tiempos de reproducción establecidos para la especie (mayo a junio y septiembre-octubre) mientras
que los de concentración más baja (25 μgTCS/L), en solo uno de los tres bagres se pudo extraer el
producto sexual, los otros dos ejemplares no espermiaron en la temporada esperada ni en los meses
posteriores, lo que puede indicar una posible disrupción causando la inhibición de productos sexuales.
La exposición a TCS da como resultado la elevación de expresión génica de Vitelogenina y reducción
en el recuento de espermatozoides de diferentes especies de peces. Varios estudios de exposición in
vivo de TCS ha demostrado un potencial efecto androgénico o estrogénico (Bera et al., 2020; Ishibashi
et al., 2004), y que el TCS tiene un alto potencial para alterar el sistema inmune y puede actuar como
un agente inmunomodulador en variada flora y fauna acuática (Bera et al., 2020). Las hormonas
liberadoras de Gonadotropina (GnRH) son secretadas principalmente por el hipotálamo. Es bien
sabido que las GnRH regulan la hipófisis gonadal y son fundamentales para regular la gametogénesis
y esteroidogenesis en teleósteos (F. Wang et al., 2018) si este es afectado o inhibido por algún factor
externo o interno, la producción de esperma se efectúa de manera tardía o interrumpida.
Evaluación microscópica.
Con la ayuda del programa asistido por computadora para análisis de semen Sperm Class Analyzer
Evolution SCA® (Microptic SL, SCA® VET 01, España versión 6.4.0.98 2018) se evaluó el tiempo
de activación y concentración del semen obtenido de cada ejemplar (n=3 por cada tratamiento y
control o sin tratamiento). Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 14.
84
Tabla 14. Volumen, concentración espermática y tiempos de activación de bagre rayado P.
magdaleniatum a tres concentraciones de Triclosán.
Parámetro Tratamientos (μg/L TCS)
0 25 50
Volumen (mL) 3.7 ± 0.4 2.0 ± 0.7 3.1 ± 0.8
Concentración (*106/mL) 51905.9 ± 12867.2 67151.4 ± 10907.9 67148.8 ± 4325.4
Tiempo de movilidad (s) 29.7 ± 0.5 29.7 ± 0.4 29.7 ± 0.5
Para el bagre rayado se ha reportado una concentración espermática de 55.500 ± 22.900 millones/mL
y un tiempo de activación de 31.2 ± 2.1 seg (Peña-Herrera et al., 2019b). por lo que los datos obtenidos
son consistentes.
El análisis ANOVA mostró que no hay diferencias significativas (p˃ 0.05) entre el control y el
tratamiento aplicado de 25 y 50 μg/L. En el estadístico exploratorio la prueba Shapiro-Wilk (p˃ 0.05)
mostró que los datos se encuentran dentro de una distribución normal y los residuos evaluados por la
prueba Levene´s también cumplen con el supuesto (p˃ 0.05).
Movilidad total y Velocidad Espérmica
Las características seminales evaluadas fueron:
• Velocidad rápida o tipo a mayores a 100 µm/s
• Velocidad media o tipo b, entre 45 y 100 µm/s.
• Velocidad lenta o tipo c, con velocidades entre 10 y 45 µm/s
• Sin movimiento o tipo d.
Los datos obtenidos fueron en términos de porcentaje y estos fueron explorados estadísticamente para
comprobar su normalidad (prueba Shapiro-Wilk P <0.05) y su varianza (Levene's P <0.05), luego de
verificar su cumplimiento se realizó una prueba ANOVA para observar si hay diferencias
significativas entre los tratamientos y el grupo control. Los datos obtenidos para las pruebas de
velocidad muestran que sí hay un efecto en las velocidades de los espermatozoides cuando son
expuestos a TCS, en ambas concentraciones hubo una respuesta significativa p˃ 0.05, lo que indica
que el TCS afecta las velocidades del espermatozoide del bagre rayado.
El porcentaje de movilidad total promedio para los peces expuestos a 25 μg/L fue 32.17%, para los
peces expuestos a 50 μg/L de TCS, el promedio de velocidad fue de 32.83% siendo en la mayoría de
los casos inferior al 50%; la respuesta de los controles o peces sin tratamiento la movilidad total
promedio fue 33.72% similares a los obtenidos a los peces expuestos a 25 μg/L de TCS. Los datos
resumidos pueden observarse en la Figura 17.
A continuación, se presentan los datos obtenidos del análisis de movilidad espermática para los peces
expuestos a 0, 25 y 50 μg TCS/L Tabla 15.
85
Tabla 15. Resultados de movilidad total, tipos de movilidad y progresividad total para peces
expuestos a 25 y 50 μg/L de TCS
Parámetro Promedio Mínimo Máximo Desviación
estándar
25 μg/L
Movilidad total (a+b+c) 32.17 4.41 67.91 23.44
% Progresivos (a+b) 34.96 4.41 67.91 29.04
% Inmóviles 3.48 2.55 4.27 0.87
50 μg/L
Movilidad total (a+b+c) 32.83 9.57 52.91 14.29
% Progresivos (a+b) 36.44 9.57 52.91 15.40
% Inmóviles 1.52 0.28 2.88 0.95
Control o Sin tratamiento
Movilidad total (a+b+c) 53.72 2.06 63.79 20.24
% Progresivos (a+b) 30.75 2.06 63.79 23.87
% Inmóviles 1.85 0.31 12.05 3.77
Con los resultados obtenidos, se puede inferir que debido a que el valor promedio de las movilidades
fue inferior al 50% hay un efecto del TCS en la movilidad de los espermatozoides, por lo que este
puede inferir en la capacidad reproductiva del bagre rayado del Magdalena.
Figura 17. Porcentaje de movilidad total de los espermatozoides de bagre rayado
Velocidad y Progresividad Espermática
El porcentaje de espermatozoides con velocidad y progresividad evaluados como rápido progresivo,
medio progresivo, no progresivo e inmóvil, mostraron que hay una diferencia significativa en el
porcentaje de espermatozoides rápidos progresivos (P ˃0.05) cuando los peces fueron expuestos a la
32,1734,96
3,48
32,8336,44
1,52
53,72
30,75
1,85
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3
% P
orc
enta
je
Parametros evaluados
1- %Movilidad Total 2- %Progresivos 3- % Inmoviles25 μg/L 50 μg/L Control o Sin tratamiento
86
concentración de 50 μg/L de TCS, mientras que los expuestos a concentraciones de 25 μg/L de TCS
no tuvieron ninguna diferencia estadística.
Para los peces expuestos a la concentración de 25 μg/L de TCS, los porcentajes de espermatozoides
de progresividad total oscilaron entre 4.02 ± 3.92 y 41.55 ± 8.90 %, pero sin superar el 50%. Los
espermatozoides no progresivos fueron 50.96 ± 11.44 % e inmóviles 3.48 ± 0,86%.
Para los peces expuestos a 50 μg/L de TCS la progresividad total osciló entre 11.77 ± 10.0 y 34.45 ±
8.18 %, los espermatozoides no progresivos estuvieron en el orden de 52.31 ± 16,71 % y para los
inmóviles 1.46 ± 1,02 % (Figura 18). Haciendo la comparación entre los dos tratamientos se observa
claramente una notable disminución de espermatozoides con una motilidad progresiva superior al
50% capaz de fertilizar y un porcentaje considerable de espermatozoides no progresivos que para
ambos tratamientos supera el 50% por lo que se puede inferir que el TCS afecta la motilidad
progresiva y, por ende, la fecundidad de los peces expuestos a este contaminante.
Figura 18. Resultados de progresividad espermática a 3 niveles de concentración (0-
control, 25 μgTCS/L y 50 μgTCS/L
Los espermatozoides No progresivos para ambos tratamientos supera el 50% por lo que se puede
inferir que el TCS afecta la motilidad de estos. La progresividad total no supera el 50%, por lo tanto,
se puede afirmar que afecta la fecundidad de los peces expuestos a este contaminante.
A continuación, en la Tabla 16 se presentan los datos obtenidos de la progresividad espérmica
después de ser sometidos a 0, 25 y 50 μg/L de TCS.
4,02
41,55
50,96
11,77
34,45
52,31
36,85
54,32
4,33
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3
%
Parámetros
1- Rápido progresivo 2- Progresividad Total 3- No progresivos
25 μg/L 50 μg/L Control o Sin tratamiento
87
Tabla 16. Resultados de progresividad total para peces expuestos a 25 y 50 μg/L de TCS
Parámetro (%) Promedio Mínimo Máximo Desviación
estándar
25 μg/L
Rápido Progresivo 4.02 1.70 8.54 3.92
Progresividad total 41.55 31.65 48.93 8.91
No Progresivo 50.96 43.14 64.10 11.45
Inmóvil 3.48 2.55 4.27 0.87
50 μg/L
Rápido Progresivo 11.77 3.54 28.33 10.02
Progresividad total 34.45 25.97 44.55 8.18
No Progresivo 52.31 33.89 69.14 16.72
Inmóvil 1.47 0.28 2.88 1.03
Control- Sin tratamiento
Rápido Progresivo 36.85 10.84 50.10 12.51
Progresividad total 54.32 42.80 80.97 12.92
No Progresivo 4.33 0.78 7.69 2.50
Inmóvil 4.52 0.31 12.05 3.68
Velocidad Curvilínea (VCL)
La velocidad curvilínea (VCL) (μm/s), se define como la velocidad de la cabeza del espermatozoide
a lo largo de la trayectoria curvilínea real. Esta fue analizada por medio de las variables VCL móvil,
medio progresivo, rápido progresivo y no progresivo.
Para los peces expuestos a 25 μg/L de TCS hay diferencias significativas en las VCL medio y rápido
(p˃0.05) y en los expuestos a 50 μg/L de TCS hay diferencias significativas en la VCL móvil y medio
(p˃0.05). Los datos obtenidos de estos parámetros por medio del análisis SCA muestran que para los
peces expuestos a 25 μg/L de TCS, los valores obtenidos de VCL rápido, medio y móviles variaron
entre 59.63 ± 7.18 y 113.39 ± 0,56 μm/s; los VCL no progresivos son del orden de 48.33 ± 1.0 μm/s.
Para los expuestos a 50 μg/L de TCS, los valores de VCL rápido, medio y móviles varíaron entre
63.64 ± 14.78 y 130.64 ± 6.52 μm/s. Los VCL no progresivos 52.78 ± 2.89 μm/s y los datos de control
o peces sin tratamiento, la VCL rápido, medio y móviles osciló entre 45.42 ± 8.99 y 118.59 ± 118.59
y los no progresivos 43.43 ± 6.84 μm/s. Lo que indica que el TCS afecta la velocidad curvilínea de
los espermatozoides expuestos a ambas concentraciones, pero aún no está afectando la viabilidad
puesto que se considera como referencia una VCL mayor a 10 μm/s y ninguno de los parámetros
evaluados fue cercano a este valor.
88
Velocidad de la trayectoria promedio (VAP)
La velocidad de la trayectoria promedio (VAP) se mide en μm/s por las variables VAP móvil, medio
progresivo, rápido progresivo y no progresivo. Para los peces expuestos a 50 μg/L de TCS se
encontraron diferencias significativas (p˃0.05) en las variables VAP móviles, medio progresivo y
rápido progresivo; mientras que en los expuestos a 25 μg/L de TCS no se evidenció ningún efecto.
Velocidad Lineal o rectilínea (VSL)
La velocidad lineal o rectilínea se mide en μm/s por las variables VSL móviles, medio progresivo,
rápido progresivo y no progresivo. Para los peces expuestos a 50 μg/L de TCS se encontraron
diferencias significativas (p˃0.05) en la variable de VSL móviles, mientras que en los peces expuestos
a 25 μg/L de TCS no se evidencia ningún efecto.
Índice de rectitud (STR)
Se define como la linealidad de la distancia de trayectoria promedio y se expresa como porcentaje de
espermatozoides que presentaron movimiento con un índice de rectitud (STR) ≥75% y definido como
movimiento progresivo (Valverde, 2018). Se expresa por medio de las variables STR móviles, medio
progresivo, rápido progresivo y no progresivo. Para los peces expuestos a 50 μg/L de TCS se
encontraron diferencias significativas (p˃0.05) en la variable de medio progresivos, mientras que en
los peces expuestos a 25 μg/L de TCS hubo diferencias significativas en las variables STR móviles y
medio progresivo.
Teniendo en cuenta la definición, se tiene en cuenta un STR ≥75% como movimiento progresivo, se
observa que para los peces expuestos a 25 μg/L de TCS, las variables STR móviles, medio progresivo
y rápido progresivo oscilaron entre 70.1 ± 5.89 y 91.48 ± 2.83 % y para los expuestos a 50 μg/L de
TCS oscilaron entre 62.10 ± 7.21 y 90.87 ± 2.37 % y para los peces control o sin tratamiento variaron
de 65.81 ± 7.32 y 91. 08 ± 3.19 %, muy similares a los encontrados en los peces expuestos a 25 μg/L
de TCS, mientras que en los expuestos a 50 μg/L de TCS presentan una leve disminución.
Índice de Linealidad o LIN
Es la relación porcentual entre la velocidad rectilínea y la velocidad curvilínea, (LIN = (VSL/VCL)
X 100), se expresa por las variables LIN móviles, medio progresivo, rápido progresivo y no
progresivo.
En ninguno de los dos tratamientos se encontraron diferencias significativas (P<0.05) entre
tratamientos y grupos de control, debido posiblemente a que los efectos no son aún relevantes para
89
afectar este indicador, pues los valores de VSL y VCL aun cumplen con los criterios de buena calidad
seminal (VSL ≥50% y VCL≥10 μm/s).
Índice de Oscilación (WOB)
Se define como la relación porcentual entre la velocidad media y la velocidad rectilínea (WOB =
(VAP/VCL) X 100) por medio de las variables móviles, medio progresivo, rápido progresivo y no
progresivo, Para los peces expuestos a 25 μg/L de TCS se encontraron diferencias significativas
(p˃0.05) en las variables móviles y medio progresivos, mientras que en los peces expuestos a 50 μg/L
de TCS se encontraron diferencias significativas en la variable medio progresivos.
Los porcentajes de índice de oscilación para los peces expuestos a 25 μg/L de TCS de las variables
móviles, medio progresivo, rápido progresivo oscilaron entre 80,98 ± 4.47 y 89.43 ± 4.72% y los no
progresivos en un 73.06 ± 1.29%. Para los peces expuestos a 50 μg/L de TCS las variables móviles,
medio progresivo, rápido progresivo oscilaron entre 71.29 ± 7.30 y 85.40 ± 3.70 % y los no
progresivos en 62.92 ± 13.02%. Los peces control o sin tratamiento arrojaron valores muy parecidos
a los obtenidos en los peces expuestos a las dos concentraciones de TSC con porcentajes que variaron
entre 78.30 ± 5.61 y 88.42 ± 6.38 % para las variables móviles, medio progresivo, rápido progresivo
y para los no progresivos 69.97 ± 2.28%.
Frecuencia de Batida (BCF)
La frecuencia de batida es expresada como el número de veces que la trayectoria curvilínea cruza la
lineal y se expresa en Hz por medio de las variables BCF móviles, medio progresivo y rápido
progresivo. Para los peces expuestos a 50 μg/L de TCS no se encontraron diferencias significativas
entre (P<0.05) entre el tratamiento y grupo de control, mientras que para los peces expuestos a 25
μg/L de TCS se encontraron diferencias en las variables BCF móviles y medio progresivos (p˃0.05).
Las frecuencias de batido encontradas en los dos tratamientos y control son muy similares, sin
variaciones significativas aparentes, se encontró que para los peces expuestos a la concentración de
25 μg/L de TCS, la BCF móviles fue 9.79 ± 0,52 Hz; BCF medio progresivos 12.39 ± 0,26 Hz y BCF
rápido progresivo 13.20 ± 1,17 Hz. Para los peces en concentración de 50 μg/L de TCS, la BCF
móviles fue 9.53 ± 1.43 Hz, BCF medio progresivos 11.98 ± 0.67 Hz y BCF rápido progresivo fue
13,6 ± 0,59 Hz. El grupo control con valores de BCF móviles de 9.15 ± 1.72 Hz, BCF medio
progresivos 12.30 ± 1.41 Hz y BCF rápido progresivo 13,74 ± 1.16 Hz. En la Tabla 17 se muestran
los parámetros de motilidad espérmica para las muestras de P. magdaleniatum expuesto a 25 y 50
μg/L de TCS.
90
Tabla 17. Motilidad espérmica evaluados para las muestras de P. magdaleniatum expuesto a 25 y
50 μg/L de TCS.
Parámetro 25 μg/L de TCS 50 μg/L de TCS Sin
Tratamiento
E. Móviles VCL µm/s 64,12 ± 7,18 79,92 ± 14,78b 60,89 ± 8,98
VAP µm/s 53,41 ± 8,68 61,06 ± 13,63b 50,16 ± 9,24
VSL µm/s 40,55 ± 9,42 41,48 ± 13,77b 43,69 ± 9,58
STR (%) 70,09 ± 5,89a 62,11 ± 7,21 65,81 ± 7,32
LIN (%) 59,48 ± 8,13 48,92 ± 9,70 58,66 ± 10,03
WOB (%) 83,44 ± 4,47a 69,96 ± 7,30 78,82 ± 5,61
BCF 9,92 ± 0,52a 9,62 ± 1,43 9,64 ± 1,72
E. Medio VCL µm/s 79,06 ± 8,40a 104,76 ± 12,83b 82,40 ± 7,29
VAP µm/s 69,39 ± 8,45 80,62 ± 6,21b 71,82 ± 4,50
VSL µm/s 59,84 ± 8,60 54,60 ± 6,24 60,61 ± 7,40
STR (%) 87,04 ± 3,80a 69,86 ± 6,78b 84,62 ± 7,00
LIN (%) 82,51 ± 7,03 60,19 ± 9,62 84,37 ± 10,91
WOB (%) 92,05 ± 4,72a 77,24 ± 7,31b 92,14 ± 6,38
BCF 12,29 ± 0,26a 11,93 ± 0,67 12,84 ± 1,41
E. Rápido VCL µm/s 112,95 ± 0,56a 120,159 ± 6,52 111,06 ± 4,50
VAP µm/s 94,37 ± 8,03 102,875 ± 3,40b 97,36 ± 2,50
VSL µm/s 86,87 ± 9,96 93,68 ± 4,94 89,96 ± 3,11
STR (%) 91,48 ± 2,83 90,87 ± 2,37 91,08 ± 3,19
LIN (%) 72,91 ± 9,30 76,56 ± 6,21 80,34 ± 4,35
WOB (%) 80,86 ± 7,67 84,76 ± 3,70 88,06 ± 3,30
BCF 13,13 ± 1,16 13,21 ± 0,60 13,64 ± 1,160
E. Inmóviles VCL µm/s 48,33 ± 1,00 52,78 ± 2,89 43,42 ± 6,83
VAP µm/s 36,64 ± 1,53a 37,015 ± 2,11 31,76 ± 5,29
VSL µm/s 20,19 ± 0,83a 19,39 ± 1,73 17,39 ± 2,53
STR (%) 54,06 ± 1,98a 49,98 ± 1,60 50,08 ± 5,57
LIN (%) 40,26 ± 2,06a 35,82 ± 2,44 37,35 ± 2,91
WOB (%) 73,35 ± 1,29 66,53 ± 13,02 70,58 ± 2,28
BCF SD SD SD VCL: Velocidad curvilínea; VAP: Velocidad promedio; VSL: Velocidad rectilínea; STR: Índice de rectitud; LIN: Índice de
linealidad; WOB: Índice de oscilación; BCF: Frecuencia de Batida. a Diferencias significativas(p˃0.05) para peces expuestos a 25 μg/L de TCS b Diferencias significativas(p˃0.05) para peces expuestos a 50 μg/L de TCS
Los espermatozoides medio progresivos para los parámetros cinéticos de VCL, STR y WOB se vieron
afectados al ser expuestos a 25 y 50 μg/L de TCS, lo que infiere que hay una afectación en la
trayectoria de los espermatozoides, por lo que su capacidad reproductiva se puede ver disminuida.
Los resultados obtenidos confirman que el TCS es un disruptor endocrino que interfiere directamente
con la capacidad reproductiva del bagre rayado (P. magdaleniatum) afectando la motilidad espérmica,
concentración y velocidad, provocando posiblemente, que sus gametos pierdan su capacidad para
fecundar, debido a que los espermatozoides por su poco tiempo de actividad en el agua necesitan
condiciones óptimas para poder encontrar un ovulo y fecundarlo. Si las características reproductivas
91
del esperma se pierden o deterioran, la efectividad de reproducción puede ser considerablemente
disminuida y diezmar una población.
Otros estudios realizados como el de Jenkins et al, analizaron bioindicadores del sistema
reproductivo y endocrino de la carpa común (Cyprinus carpio) en el lago Mead (EEUU), y
encontraron que el metiltriclosán, subproducto del TCS estaba presente en las aguas de lago y en los
tejidos de la carpa común, afectó negativamente la motilidad, disminución de la viabilidad de los
espermatozoides y aumento anormal de la morfología del esperma (Jenkins et al., 2018). Se ha
demostrado que el TCS disminuye el conteo de espermatozoides e induce a la producción de
Vitelogenina (Vtg) en el pez mosquito occidental, Gambusia affinis (Rauty & Angus, 2010) e impacta
las concentraciones de la hormona tiroidea en rata (Montagnini et al., 2018; Pernoncini et al., 2018).
En algunos teleósteos, se ha comprobado que afectan la cascada tiroidea e influye en la
espermatogénesis (Jenkins et al., 2018; Vazzoler, 1996b; F. Wang et al., 2018). Adicionalmente la
estructura química del TCS puede permitir la modulación de la hormona tiroidea (Fan et al., 2019;
Fang et al., 2010) así como también se ha demostrado que tiene efectos negativos sobre la motilidad
del esperma humano (Nag et al., 2018; Nassan et al., 2019), aumenta el ARNm y la producción de
Vitelogenina VTG y disminuye el conteo de esperma del pez mosquito occidental (Rauty & Angus,
2010).
Un estudio desarrollado por Bera et al, muestra que el pez bagre rayado Pangasianodon
hypophthalmus, expuesto a tres concentraciones diferentes de TCS tuvo un efecto significativo en
la respuesta inmune como estallido respiratorio o RBA, actividad peroxidasa, fagocítica,
inmunoglobulina total en suero, entre otros, además de mostrar estrés oxidativo actividad superóxido
dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión-s-transferasa (GST) en el hígado y en el tejido branquial,
exhibiendo un aumento de la actividad relacionada con la concentración de TCS durante los períodos
experimentales. Se observó una reducción significativa en el porcentaje relativo de supervivencia con
el aumento de concentraciones de TCS. Por lo que este estudio revela que el TCS puede inhibir los
componentes celulares y humorales del sistema inmune de los peces y puede elevar la mortalidad
durante una infección bacteriana, debido a la inmunosupresión causada por el TCS en los peces.
La concentración de EDC como el TCS en peces carnívoros como el P. magdaleniatum, es
significativamente mayor a los peces detritívoros, por la posible biomagnificación que este puede
tener a lo largo de la cadena alimenticia. Algunos EDC se alojan en los sedimentos y que los peces
detritívoros y plantívoros los absorben más fácilmente (Fan et al., 2019), por lo que el bagre rayado
Pseudoplatystoma magdaleniatum, puede tener un alto grado de afectación debido a sus hábitos
alimenticios y ecológicos, que puede actuar como un buen bioindicador de acumulamiento de
contaminantes y EDC.
92
Conclusiones
El volumen seminal y concentración espérmica no presentaron variaciones significativas en función
de la concentración de TCS. Los parámetros de movilidad total y progresividad fueron inferiores al
50%. Los espermatozoides no progresivos para ambos tratamientos supera el 50% por lo que se puede
inferir que la capacidad reproductiva y fecundidad del bagre rayado del Magdalena se ve afectada al
ser expuesto a TCS. Los parámetros cinéticos indicaron que el TSC afecta significativamente la VCL,
VAP, VSL, STR, WOB, de los espermatozoides móviles y medios expuestos a 50 y 25 μg/L de TCS.
Se confirma la idea de que el TCS es un EDC capaz de alterar la reproducción del pez P.
magdaleniatum y que puede ser un factor de la diminución de la población en las cuencas de los ríos
Magdalena y Cauca.
93
CAPITULO 5
Cuantificación de Vitelogenina en plasma del bagre rayado del Magdalena
(Pseudoplatystoma magdaleniatum) después de ser expuesto a Triclosán
Se ha reconocido una gama amplia de compuestos químicos encontrados en el ambiente acuático que
comprometen la capacidad reproductiva y el desarrollo sexual de numerosas especies. Los disruptores
endocrinos (DE) son un conjunto diverso y heterogéneo de compuestos químicos, tanto naturales
como producidos por el hombre, capaces de alterar el equilibrio hormonal, pudiendo interferir con
las glándulas endocrinas y sus hormonas, así como con los órganos donde estas actúan(Taborda &
Rodríguez, 2010).
Los mecanismos de acción de los DE estudiados hasta la fecha incluyen: 1) mimetizar la acción de
las hormonas ocupando su lugar, 2) antagonizar la acción de las hormonas, 3) alterar el patrón
de síntesis y metabolismo hormonal, y 4) modular el número de receptores correspondientes (Jenkins
et al., 2018; Taborda & Rodríguez, 2010).
En general, la fisiología reproductiva de vertebrados tanto mamíferos como no mamíferos es similar
en estructura y función. De igual manera las vías biosintéticas para las hormonas esteroideas por sí
mismas también están bien conservadas en vertebrados mamíferos y no mamíferos. Sin embargo, los
peces tienen algunos aspectos de la fisiología reproductiva que puede causar que estos respondan de
una manera diferente a los DE, por ejemplo, en peces, la secreción de Gonadotropina (GnRH)
normalmente cambia en respuesta a señales del ambiente (Mills & Chichester, 2005). En el mismo
sentido, se ha demostrado en especies de peces que, durante una etapa de diferenciación sexual, la
expresión de genes es regulada por factores epigenéticos como la temperatura y otros factores
ambientales, repercutiendo en la diferenciación gonadal y de estructuras sexuales secundarias. Hay
especies de peces que pueden ser dioicas (sexos separados) o hermafroditas (gónadas de macho y
hembra en un individuo) (Bern, 2014; Mills & Chichester, 2005).
La exposición a un contaminante ambiental y la determinación de sus efectos en peces en ecosistemas
acuáticos puede examinarse utilizando biomarcadores como: enzimas de biotransformación como la
citocromo P-450; parámetros de estrés oxidativo a partir de la medición de la actividad de enzimas
como glutatión peroxidasa y catalasa; parámetros hematológicos; inmunológicos; reproductivos y
endocrinos. Así como, parámetros genotóxicos, neuromusculares, e histomorfológicos (Jenkins et
al., 2018; Tato et al., 2018; Yamamoto et al., 2017). Se asume generalmente que los biomarcadores
indican el estado de salud en general del pez siendo el reflejo de los efectos debidos a la exposición
a xenobióticos. Los cambios agudos se observan cuando los niveles de un contaminante son lo
94
suficientemente altos, mientras que se requiere la exposición crónica a agentes contaminantes para
determinar los aspectos subletales de los cambios observados(Taborda & Rodríguez, 2010).
La Vitelogenina, es una proteína específica de las hembras de vertebrados ovíparos (anfibios, aves,
peces y reptiles), durante el ciclo de maduración ovárica (Stifani et al., 1990). Esta proteína es un
complejo fosfoglicoproteico plasmático, cuyo peso molecular oscila entre 250 y 600 kDa (Norberg
& Haux, 1985). Su composición bioquímica es del tipo aminoacídica con lípidos, carbohidratos y
fosfatos. Además, tiene la capacidad de unir cationes divalentes, principalmente calcio. La presencia
de Vitelogenina en el plasma es coincidente con la aparición de los primeros gránulos de vitelo en los
ovocitos. Su síntesis se lleva a cabo en el hígado inducida por la estimulación de los estrógenos
ováricos, de los cuales el más importante es el estradiol (Guzmán Riffo, 2003). Una vez secretada por
el hígado es transportada vía torrente sanguíneo, de donde es captada en forma selectiva por los
ovocitos, los cuales la disocian en dos proteínas fosforadas (lipovitelina y fosvitina), las que actúan
como fuente nutritiva para el desarrollo del embrión. Por lo tanto, la síntesis de Vitelogenina está
estrechamente ligada con el desarrollo gonadal de las hembras, el cual a su vez es gatillado por
factores ambientales exógenos (Guzmán Riffo, 2003)
En los peces, los principales componentes del huevo, como la Vitelogenina (Vtg) y las proteínas de
la cáscara del huevo o proteína de la zona radiada (Zrp), son sintetizados en el hígado de las hembras
bajo regulación endocrina y transportados a la sangre para ser tomados posteriormente por el oocito.
Tanto machos como hembras tienen receptores hepáticos para estrógenos, pero solo el hígado de los
peces hembras están expuestos normalmente a los estrógenos. Por lo tanto, la producción de estas
proteínas en peces macho o peces inmaduros proporciona un indicador útil para detectar la presencia
de disrupción endocrina con actividad estrogénica (Taborda & Rodríguez, 2010).
Algunos de los reportes de efectos de disrupción endocrina del TCS está la producción e incremento
de Vitelogenina (Vtg) en el pez macho medaka (Oryzias latipes) (Ishibashi et al., 2004); del macho
Gambusia affinis (Rauty & Angus, 2010) y de la dorada blanca (Diplodus sargus) (Maulvault et al.,
2019); disminución del recuento de espermatozoides de los machos de carpa amarilla Cyprinus carpio
(F. Wang et al., 2018). Varios estudios demostraron que el estrógeno es generado a través de vías
distintas a lo largo del eje hipotálamo-pituitaria-gónada (HPG) y puede inducir la síntesis y secreción
de Vtg (C. F. Wang & Tian, 2015; F. Wang et al., 2018).
El monitoreo de los EDCs en los organismos tiene la ventaja de ser una evaluación in vivo del
verdadero impacto de la estrogenicidad en una especie objetivo. Además, estas especies habitan en
una variedad de entornos y podrían servir como indicadores biológicos de áreas particularmente
impactadas dentro de una cuenca o ambiente natural (Campbell et al., 2006)
95
Para la medición e identificación de Vtg, se emplean técnicas con bioensayos celulares y no celulares.
Para las técnicas celulares, aunque ofrecen una buena sensibilidad, estos bioensayos pueden no
proporcionar de forma consistente una respuesta cuantitativa repetible para un EDC específico en
muestras ambientales complejas. La rápida respuesta y los menores requisitos de equipo hacen que
los bioensayos celulares sean una atractiva alternativa a la técnica analítica convencional para la
vigilancia del medio ambiente, en particular cuando el objetivo de la vigilancia es medir los aumentos
relativos de la actividad estrogénica total. Los ensayos celulares a menudo utilizan células de levadura
o humanas (por ejemplo, el cáncer de mama o el riñón), que se han utilizado tal cual, o se han
modificado mediante bioingeniería de manera que la unión de un estrógeno a los receptores de
estrógeno produce un dímero capaz de unirse y estimular un elemento de respuesta al estrógeno que
promueve la expresión de una proteína mensurable. Dos ejemplos de las proteínas de respuesta
incluyen la luciferasa y la b-galactosidasa que pueden ser cuantificadas usando un luminómetro
(después de la lisis celular) y un espectrofotómetro (retrocalculando a partir de la cantidad de producto
coloreado medido después de que la reacción catalizada por la enzima se haya detenido),
respectivamente (Campbell et al., 2006).
Para las técnicas que no requieren células enteras, se pueden evitar algunas de las dificultades
relacionadas con la permeabilidad de las membranas, la función de las células, las etapas de la vida
de los organismos y las respuestas de toxicidad a una muestra determinada. Muchos de estos ensayos
son cuantitativos y proporcionan límites de detección razonables para la medición de los EDC.
Algunos ensayos cuantitativos, como los ensayos inmuno enzimáticos (ELISA) y el ensayo de
receptores vinculados a enzimas (ELRA), requieren un laboratorio para la cuantificación, pero
proporcionan una medición de la concentración de EDC (Seifert, 2004). Actualmente se dispone de
kits ELISA para muchos de los surfactantes y compuestos de estrógeno relevantes para el medio
ambiente, así como para pesticidas, antibióticos y otros productos de cuidado personal (Neogen Corp
Lexington, KY; ALPCO Diagnostics Salem, NH; Assay Designs Inc. Ann Arbor, MI; Bio-Quant Inc.,
San Diego, CA; BioSource Internacional, Camarillo,CA; Cayman Chemical Company, Ann Arbor,
MI; ImmunoBiological Laboratories, Inc., Minneapolis, MN; Envirologix. Portland, Me: York
Nutritional Laboratory, Osbaldwick, York, UK). Tanto el ELISA como el ELRA se han aplicado con
éxito a muestras ambientales y también se han desarrollado en biosensores utilizando un sistema
BiacoreTM (Campbell et al., 2006).
Debido a que el TCS es estructuralmente similar a los estrógenos naturales, se formula la hipótesis
de que el TCS puede inducir la producción de Vtg en el bagre Rayado del Magdalena
(Pseudoplatystoma magdaleniatum) por lo que se seleccionaron tres grupos de experimentación, con
agua a concentraciones de 0 (control), 25 y 50 µg/L de TCS, durante doce meses, para determinar si
96
hay un incremento en la producción de Vtg en el plasma del bagre, se utilizó un kit ELISA (BioSource
Internacional, Camarillo,CA) para su cuantificación, y así, confirmar si el TCS tiene efectos
estrogénicos en el bagre rayado, y determinar si están en riesgo de exposición a concentraciones
estrogénicas ambientales relevantes que pueda poner en riesgo su supervivencia.
Materiales y Métodos
Animales de Experimentación.
Se sigue la metodología descrita en el numeral 4.2. y 4.3 del capítulo 4
Colecta y Análisis de Plasma para medición de Vtg
Las muestras de sangre fueron recolectadas de los bagres en tiempo cero (sin ser expuestos a TCS) y
a los 10 meses de exposición a 25 y 50 μgTCS /L. Estas fueron tomadas por punción en la vena caudal
con una aguja Vacutainer® conectado al tubo EDTA para evitar su coagulación. Estos fueron
rotulados y conservados en una cava con gel refrigerante para su preservación y transporte hasta el
laboratorio (Foto 17 y Foto 18).
Foto 17. Extracción de sangre en vena
caudal con aguja Vacutainer
Foto 18. Tubos EDTA con muestras de sangre
para análisis
En el laboratorio, el plasma fue Centrifugado a 2000 RPM durante aproximadamente 20 minutos para
su separación y fue recogido el sobrenadante con cuidado y recolectado en tubos de microcentrífuga
de 1.5mL los cuales fueron nuevamente rotulados y llevados a congelación a -80°C para su
preservación antes de su lectura.
Los niveles de Vtg de los peces macho de bagre rayado (Pseudoplatystoma magdaleniatum) se
detectaron utilizando el kit de ensayo inmunoenzimatico (ELISA) (BioSource Internacional,
Camarillo, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante así: los estándares de antígenos preparados
y las muestras fueron añadidas en una placa de 96 pozos precubiertos con anticuerpos primarios.
97
Foto 19. Muestra de plasma en tubos de
microcentrífuga
Foto 20. Siembra de muestras en Kit ELISA
Después de añadir el reactivo de conjugado de biotina y el reactivo de conjugado de enzimas en cada
pozo, la placa se incubó a 37 °C durante 60 min. Luego la placa fue enjuagada 5 veces con solución
de lavado. Luego de 15 minutos de la reacción cromogénica, fue leída la absorbancia a 450 nm usando
un lector de microplacas Multiskan FC Thermoscientific, con el protocolo ELISA previamente
definido para el mismo. El límite de detección del ensayo es de 1.0 ng/ml.
Análisis Estadístico
Todos los datos se presentaron como media ± DE, se usó un análisis de varianza unidireccional
(ANOVA) para identificar la diferencia significativa (P <0.05) entre tratamientos y grupos de control.
Se utilizó la prueba Levene's par la verificación de varianza (P <0.05) .Todos los análisis estadísticos
fueron realizados usando el Paquete Estadístico Statgraphics Centurion XVI versión 16.1.18.
Resultados
Concentración de Vtg en las muestras de plasma de P. magdaleniatum.
Para determinar la concentración de Vtg en plasma del bagre rayado, se procedió a realizar la curva
de absorbancia (450nm) v/s la cantidad de Vitelogenina (Vtg) (Figura 19), para lo cual se siguieron
las instrucciones de cálculo establecidas en el protocolo del Kit ELISA (BioSource Internacional,
98
Camarillo, CA). Los resultados de la concentración de Vtg están presentados en la Tabla 18, en
tiempo cero (sin exposición) con medidas realizadas por triplicado.
Tabla 18. Concentración de Vtg en P. magdaleniatum, tiempo cero de exposición.
Figura 19. Interpolación de datos con la curva de absorbancia obtenida por regresión lineal- Kit
ELISA. Tiempo cero.
El coeficiente de regresión presentado por la curva ELISA estándar fue 97%, lo que ratifica una
relación directamente proporcional entre la cantidad de Vitelogenina y la absorbancia. Para calcular
la concentración de Vitelogenina los datos fueron interpolados en la curva.
A continuación, se expresan en la Tabla 19, Figura 20, las concentraciones de Vtg obtenidas después
de 9 meses de exposición a 25 y 50 µg/L TCS.
Identificación del
pez
Concentración de
TCS
Fecha de
análisis
Absorbancia
obtenida (nm)
Concentración
Vtg (ng/L)
MV T1 Blanco 2019-04-15 0,878 162,51
MR T1 Blanco 2019-04-15 0,560 97,33
MR T2 50 µg/L 2019-04-15 0,567 98,76
MM T2 50 µg/L 2019-04-15 0,577 100,71
MA T2 50 µg/L 2019-04-15 0,673 120,49
MN T3 25 µg/L 2019-04-15 0,539 92,92
MR T3 25 µg/L 2019-04-15 0,616 108,70
MV T3 25 µg/L 2019-04-15 0,596 104,60
DATOS CURVA DE CALIBRACIÓN
ng/mL Absorbancia
Ecuación de la gráfica:
Y=204,98x - 32,522
R² = 0,9728
0 0,000
30 0,194
60 0,436
120 0,870
240 1,629
480 2,457
99
Tabla 19. Concentración de Vtg después de 9 meses de exposición a 25 y 50 µg/L TCS.
Figura 20. Interpolación de datos con la curva de absorbancia obtenida por regresión lineal- Kit
ELISA, tiempo final (9 meses de exposición a 25 y 50 µg/L TCS)
Los datos resumidos de la concentración de Vitelogenina en tiempo cero y tiempo final se pueden
observar en la Figura 21, donde se observa que no hay variaciones significativas entre ambos
resultados.
y = 187,93x - 19,913R² = 0,971
-100
0
100
200
300
400
500
600
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Co
nce
ntr
ació
n n
g/L
Absorbancia (nm)
Concentración Vtg - Tiempo final
Concentración (ng/mL) Interpolar Lineal (Concentración (ng/mL))
Identificación
del pez
Concentración de
TCS
Fecha de
análisis
Absorbancia
obtenida (nm)
Concentración
Vtg (ng/L)
MV T1 Blanco 2020-01-29 0,6225 97,973
MR T1 Blanco 2020-01-29 0,6355 100,417
MR T2 50 µg/L 2020-01-29 0,663 105,585
MM T2 50 µg/L 2020-01-29 0,6675 106,430
MA T2 50 µg/L 2020-01-29 0,6225 97,973
MN T3 25 µg/L 2020-01-29 0,632 99,759
MR T3 25 µg/L 2020-01-29 0,67 106,900
MV T3 25 µg/L 2020-01-29 0,7155 115,451
DATOS CURVA DE CALIBRACIÓN
ng/mL Absorbancia
Ecuación de la gráfica:
y = 187,93x - 19,913
R² = 0,971
0 0,000
30 0,194
60 0,436
120 0,870
240 1,629
480 2,457
100
Figura 21. Concentración de Vitelogenina tiempo cero y tiempo final.
Análisis estadístico por medio de la prueba ANOVA y Levene’s
Los resultados obtenidos se analizaron por medio de ANOVA para identificar la diferencia
significativa (P <0.05) entre tratamientos y grupos de control (número de observaciones=9; y 3
niveles (0; 25 y 50) y la prueba Levene's par la verificación de varianza (P <0.05) para observar si
hay similitudes entre los tratamientos y la concentración adicionada de TCS. Los resultados se
expresan en la Tabla 20.
Tabla 20. Prueba estadística Levene´s- y ANOVA para los tratamientos (0, 50 y 25 μgTCS /L)
Tratamiento
(μgTCS /L)
Desviación
estándar
Coeficiente de
Variación
ANOVA
P <0.05
Levene's
P <0.05
Blanco 19.940 15.96%
0.3495
0.1786 50 12.328 11.044%
25 8.398 7.854%
La tabla ANOVA descompone la varianza de los datos en dos componentes: un componente entre
grupos y un componente dentro-de-grupos. La razón-F, que en este caso es igual a 1,25882, es el
cociente entre el estimado entre grupos y el estimado dentro de grupos. Puesto que el valor-P de la
razón-F es mayor o igual que 0,05, no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las
medias de las 3 variables.
92
,51
97
,33
98
,76
10
0,7
1
12
0,4
9
92
,92 10
8,7
10
4,6
97
,97
3
10
0,4
17
10
5,5
85
10
6,4
3
97
,97
3
99
,75
9
10
6,9
11
5,4
51
0
20
40
60
80
100
120
140
Blanco Blanco 50 µg/L 50 µg/L 50 µg/L 25 µg/L 25 µg/L 25 µg/L
Co
nce
ntr
acio
n e
n n
g/L
Tratamientos
Concentración de Vitelogenina
Tiempo cero Tiempo Final
101
La Prueba Levene´s evalúa la hipótesis nula de que las desviaciones estándar dentro de cada una de
las 3 columnas son iguales. Puesto que el valor-P es mayor o igual que 0,05, no existe una diferencia
estadísticamente significativa entre las desviaciones estándar.
Comparación de dos muestras – tiempo cero y tiempo final
Para el análisis estadístico de los dos grupos de muestra definidos como tiempo cero o sin tratamiento
y tiempo final después de ser expuestos por 9 meses a dos concentraciones de TCS 25 y 50 µg TCS/L,
se definen los siguientes parámetros para su análisis y se expresan en la Tabla 21.
Muestra 1: tiempo 0
Muestra 2: final
Muestra 1: 9 valores en el rango de 97,543 a 138,909
Muestra 2: 9 valores en el rango de 97,973 a 115,451
Tabla 21. Resumen estadístico comparación de dos muestras - Tiempo cero y tiempo final de Vtg
después de ser expuesto a dos concentraciones de TCS
Tiempo 0 Tiempo final
Recuento 9 9
Promedio 114,483 104,154
Desviación Estándar 14,8355 5,2691
Coeficiente de Variación 12,9587% 5,05899%
Mínimo 97,543 97,973
Máximo 138,909 115,451
Rango 41,366 17,4779
Sesgo Estandarizado 0,8556 1,4552
Curtosis Estandarizada -0,6446 1,1294
De particular interés en la Tabla 21 son el sesgo y la curtosis estandarizados que compara si las
muestras provienen de distribuciones normales. Valores de estos estadísticos fuera del rango de -2
a +2 indican desviaciones significativas de la normalidad, lo que tendería a invalidar las pruebas que
comparan las desviaciones estándar. En este caso, ambos valores de sesgo estandarizado se
encuentran dentro del rango esperado. Ambas curtosis estandarizadas se encuentran dentro del rango
esperado.
Los intervalos están basados en el procedimiento de la diferencia mínima significativa (LSD) de
Fisher. Están construidos de tal manera que, si dos medias son iguales, sus intervalos se traslaparán
un 95,0% de las veces. Se puede ver gráficamente los intervalos seleccionando en la Figura 22, En
las Pruebas de Rangos Múltiples, estos intervalos se usan para determinar cuáles medias son
significativamente diferentes de otras.
102
Figura 22. Diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher para los 3 niveles de concentración de
TCS
Como puede observarse, No hay diferencias estadísticamente significativas entre cualquier par de
medias.
Prueba de Kolmogorov-Smirnov
Estadístico DN estimado = 0,444444
Estadístico K-S bilateral para muestras grandes = 0,942809
Valor P aproximado = 0,338843
Prueba de Kolmogorov-Smirnov para comparar las distribuciones de las dos muestras. Esta prueba
calcula la distancia máxima entre las distribuciones acumuladas de las dos muestras. En este caso, la
distancia máxima es 0,444444, que puede verse gráficamente en la Figura 23. De particular interés
es el valor-P aproximado para la prueba. Debido a que el valor-P es mayor o igual que 0,05, no hay
diferencia estadísticamente significativa entre las dos distribuciones con un 95,0%.
Figura 23. Gráfico de Cuartiles para tiempo cero y tiempo final de la concentración de Vtg en
peces expuesto a dos concentraciones de TCS (25 y 50µg/L).
Tratamiento
Co
ncen
tració
n
25ppb 50ppb blancot1
Medias y 95,0% de Fisher LSD
92
102
112
122
132
142
Variablestiempo 0
final
Gráfico de Cuantiles
97 107 117 127 137 147
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
pro
po
rció
n
103
Discusiones
La Vtg es una proteína específica de las hembras y típicamente sintetizada en los hígados de teleósteos
femeninos en respuesta a estrógenos endógenos. Sin embargo, los jóvenes y los machos también
pueden sintetizar y secretar Vtg cuando se exponen a estrógenos exógenos. Por tanto, la presencia de
niveles de Vtg en peces juveniles y machos puede servir como un biomarcador útil para evaluar la
contaminación estrogénica del medio acuático (Y. Li et al., 2018).
En el presente estudio, estadísticamente no hay diferencias significativas en el incremento de Vtg en
los peces expuestos a dos concentraciones de TCS (25 y 50µg/L), las concentraciones de Vtg iniciales
y finales, parecieran ser las mismas sin aparente variación, pero si se observa bien, estas
concentraciones indican que los peces ya tienen previamente una disrupción endocrina, pues los
valores obtenidos de Vtg oscilan entre 97 y 138ng/ml de Vtg. ver
Tabla 21. Que son valores relativamente altos si se compara con otros estudios y principalmente
porque es una proteína exclusiva de las hembras.
Un estudio realizado por Wang et al.,2017, donde expone a la carpa de río Cyprinus carpio por 42
días a 0.0; 0.04; 0.08 y 0.16 mg/L de TCS se obtuvieron concentraciones de 9,99 ± 1,35; 8,92 ±
1,14; 9,29 ± 0,40 y 24,71 ± 0,71 ng/mg de Vtg respectivamente (F. Wang et al., 2017); Scott et
al.,2017, después de exponer durante 7 días al pez arco iris (Melanotaenia fluviatilis) y el pez
mosquito (Gambusia holbrooki), registraron concentraciones de Vtg 75±12 mg/L y 106±5 mg/L
respectivamente (Scott et al., 2017). Yamamoto et al., 2017, registro los niveles de Vtg de tres
especies de peces nativos (Astyanax bifasciatus , Chrenicicla iguassuensis y Geophagus brasiliensis
) en el rio Iguazú, encontrando que para los peces macho oscilaron entre 95 ng/ml y 38 ng/ml
(Yamamoto et al., 2017). Es por lo anterior que se puede inferir, que los peces al ser recolectados de
su ambiente natural (ríos Magdalena y Cauca) ya tienen una condición previa de disrupción.
Los sistemas de recolección de aguas residuales descargan aguas residuales sin o casi sin tratamiento,
especialmente en algunos países en desarrollo (Song et al., 2020; WHO, 2005). La mayoría de los
municipios de Colombia no cuentan con un sistema de tratamiento de aguas residuales o PTAR
eficiente o simplemente no tienen (Contraloría General de la República de Colombia, 2018), lo que
conlleva a que los peces de ambos ríos estar expuestos constantemente a contaminantes que están
afectando sus funciones hormonales y reproductivas.
Las concentraciones de TCS encontradas en las aguas superficiales de los ríos Magdalena y Cauca
variaron entre 3.46 y 0.96 µg/L, lo que indica que los peces ya están expuestos a concentraciones de
TCS en su ambiente natural y que estos pueden generar una respuesta autoinmune o combatir los
efectos sistémicos en el organismo, sin causar un estrés mayor o respuesta medible.
104
Conclusiones
La comparación entre las muestras de tiempo inicial (sin tratamiento) y tiempo final (9 meses de
exposición) no arrojaron diferencias significativas entre sus medias, y la curtosis y el sesgo
estandarizado se encuentran dentro del rango esperado.
La Vtg es una proteína específica de las hembras y típicamente sintetizada en el hígado de teleósteos
femeninos en respuesta a estrógenos endógenos, por ello la concentración de Vtg encontrada en los
machos de bagre rayado, indica que los peces ya tienen previamente una condición de disrupción
desde su ambiente natural y que los tratamientos a los que fueron sometidos no afectaron su condición
preexistente, sino que se mantuvieron en el tiempo.
105
CAPITULO 6
Determinación de pérdida del potencial de membrana y daño de ADN del bagre rayado
Pseudoplatystoma magdaleniatum expuesto a Triclosán.
La muerte de las células en los tejidos humanos y en otros organismos multicelulares es un hecho
normal y no produce alteración de las funciones. Por el contrario, el número de células en los
diferentes tejidos está determinado por un balance homeostático entre la proliferación de células
nuevas y la muerte de células agotadas o seniles, existiendo una tasa o ritmo de relación
proliferación/muerte que varía de un tejido a otro (Elena, 2002).
Existen muchos métodos para investigar las funciones mitocondriales y su integridad, como el
análisis de la cadena respiratoria mitocondrial por medio de la oxigenación y la evaluación de
potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨM) por fluorimetría (Cléach et al., 2020). ΔΨM es
esencial para la fosforilación del ADP y el ATP o actividad de la sintetasa. También está involucrada
en muchas otras menos estudiadas funciones como: homeostasis, regulación de la función
mitocondrial, y transporte de iones, proteínas y ácidos nucleicos.
En el presente estudio, se pretende determinar la diminución del potencial de la membrana
mitocondrial y daño del ADN en sangre del pez bagre rayado del Magdalena (Pseudoplatystoma
magdaleniatum) después de ser sometido a dos concentraciones de TCS (25 y 50µg/L) durante diez
meses y verificar si hay efectos sobre el mismo que puedan estar afectando la supervivencia de la
especie en ambientes naturales.
Materiales y Métodos
Animales de Experimentación.
Se sigue la metodología descrita en el numeral 4.2 y 4.3 del capítulo 4
Colecta y Análisis de Plasma
Las muestras de sangre fueron recolectadas de los bagres en tiempo cero (sin ser expuestos a TCS) y
a los 10 meses de exposición a 25 y 50 μg TCS /L. Estas fueron tomadas por punción en la vena
caudal con una aguja Vacutainer® conectado al tubo EDTA para evitar su coagulación. Estos fueron
rotulados y conservados en una cava con gel refrigerante para su preservación y transporte hasta el
laboratorio.
Análisis mediante citometría de flujo
El potencial de membrana mitocondrial ( ΔΨM ) en plasma se evaluó con una versión de los
protocolos descritos por (Rojas et al., 2000). Un tubo de poliestireno se utilizó para depositar yoduro
106
de 3,3'-dihexiloxacarbocianina (DiOC6, Molecular Probes, EE. UU.) en PBS a concentración final
de 80 nM y 7-aminoactinomicina D (7-AAD, Molecular Probes, EE. UU.) en una concentración de 2
µg mL -1. Los compuestos se pipetearon y luego se distribuyeron por igual en tres tubos. Luego, se
agregaron 10 μL de sangre. Posteriormente, para teñir las células para evaluar simultáneamente su
viabilidad, 1 µg mL -1 de yoduro de propidio (PI, Live / Dead®, Molecular Probes, EE. UU.). Se
añadió a cada tubo. Las muestras fueron incubadas durante 30 min, y el ΔΨM se midió mediante
citometría de flujo (LSRFortessa ™, BD Biociencias, Estados Unidos). Las muestras se excitaron
utilizando un láser de fase sólida de 488 nm y se detectó una fluorescencia de 2 DiOC6 y 7-AAD a
530/30 nm y 630/30 nm, respectivamente.
La fragmentación del ADN de la sangre, se evaluó mediante tinción con PI (yoduro de propilo), como
describen (Darzynkiewicz et al., 1992). Las células se fijaron con 300 µL de etanol al 70% (Merck,
Alemania) preparado en PBS (pH 7,4), por 12 ha 4ºC. Las muestras se centrifugaron (500 g, 5 min,
4 ° C) y los sedimentos resultantes se lavaron dos veces más con 3,0 mL de PBS. Las células se
tiñeron con PI 1 µg mL -1 en PBS con EDTA al 0,37% p / v y 0,01% v / v de Triton X-100 y 200 U
mL -1 de RNasa A (Sigma, Aldrich). Después de 30 min de incubación en la oscuridad a temperatura
ambiente, los datos se recogieron con un citómetro de flujo (LSRFortessa ™, BD Biosciences, EE.
UU.). Los datos de citometría de flujo de todas las pruebas se analizaron utilizando el Software
FlowJo versión 7.6.2 (FlowJo, LLC, EE. UU.)
Análisis estadístico
Normalidad de datos se evaluó para cada variable mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov, y las
medias se compararon mediante la Prueba Tukey. Los resultados se expresaron como media ± error
estándar de la media. El análisis estadístico fue realizado utilizando el software Statgraphics
Centurion XVI versión 16.1.18.
Resultados y Discusión
El potencial de membrana mitocondrial (ΔΨM) se ha utilizado como una medida de la función
mitocondrial y está vinculado a una serie de funciones, incluida la síntesis de ATP, la importación de
proteínas a las mitocondrias, homeostasis del calcio y transporte de metabolitos (Restrepo et al.,
2019). En la Tabla 22, se puede observar los resultados obtenidos de ΔΨM de la sangre de los peces,
después de ser sometidos a dos concentraciones de TCS y grupo control o sin tratamiento. Para
ninguno de los tratamientos estudiados, se encontraron diferencias significativas (p <0,05).
La función mitocondrial ha sido evaluada en diferentes tipos que utilizan tintes lipofílicos catiónicos
como DiOC6, JC-1 y TMRE, estos se acumulan en el organelo según el potencial de la membrana
107
mitocondrial interna (ΔΨM)(Castedo et al., 2002). Este potencial se correlaciona directamente con la
actividad metabólica de las células (González Maglio et al., 2011).
Tabla 22. Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨM) en sangre expuesto a dos concentraciones
de TCS
Tratamiento PI+ (%) DiOC 6+ (%) Recuento de células
Control 0.57 ± 0.24 99.45± 0.21 50000
50 µg/L 6.26 ± 2.06 93.73 ± 2.05 50000
25 µg/L 3.88 ± 0.82 96.13 ± 0.85 50000
PI+=%Células con daño de membrana – DiOC6+= %Células viables
Como puede observarse, no hubo daño celular significativo, pues las células viables se mantuvieron
por encima del 90% y las células con daño de membrana no superaron el 10%. Puede notarse un leve
incremento en daño celular a medida que incrementa la concentración de TCS.
En estudios anteriores, se han reportado efectos citotóxicos en peces a concentraciones superiores a
50 mg/L. En el pez cebra, expuesto a TCS (50 y 100 mg/L) resultó en cambios específicos de
concentración en el patrón de metilación del ADN, así como la expresión del ADN metiltransferasa
(Falisse et al., 2018) con una mayor sensibilidad a 50 mg/L de TCS (Elodie et al., 2017). La
modificación epigenética en los patrones de expresión de ADN se ha informado de genes relacionados
con el sexo en los peces. La expresión inducida de Vitelogenina en el pez cebra después de la
exposición a los estrógenos implicó alteraciones en la metilación del ADN (Song et al., 2020). El pez
medaka luego de ser expuesto a TCS (0, 50, 100 y, 200 mg/L), se observó que en los peces expuestos
a 50mg/L hubo hipometilación global en todo el cuerpo, pero no en las células germinales
primordiales o CGP aisladas. Expresión del gen que codifica las metiltransferasas de ADN (dnmt1 y
dnmt3aa ) se redujo en 50 mg/L de exposición a TCS tanto en todo el cuerpo como en PGC (Song et
al., 2020).
Se ha informado que la exposición a TCS produce alteraciones en el ΔΨM potencial de membrana de
las células (X. Li et al., 2019; Padmini & Usha Rani, 2011; Pinto et al., 2014; Weatherly et al., 2018),
en los tres ensayos realizados en este estudio, se ha observado que no hubo alteraciones significativas
en el ΔΨM en los peces expuestos a 25 y 50µg/L de TCS. En la Figura 24, se muestra un análisis
representativo de plasma del bagre rayado basada en la evaluación de ΔΨM.
108
a- Control- 0 µg/L TCS b- 25µg/L TCS
c- 50 µg/L TCS
Figura 24. Análisis representativo por citometría de flujo de viabilidad de células expuestos a 3
tratamientos (0, 25 y 50 µg/L TCS)
Las concentraciones de TCS usadas para este estudio, están por debajo del LC50 reportado para peces
de agua dulce, según la ECHA, (European Chemicals Agency, n.d.) el LC50 es de 0.54 mg/L, por lo
que es posible que los daños estrogénicos y de ADN sean visibles a largo plazo.
la viabilidad celular permanece cercana al 100% para todos los tratamientos, por tanto, la toxicología
de los parámetros evaluados puede considerarse un efecto temprano por que la viabilidad celular no
109
se vio afectada, pero se nota un leve incremento en el daño de membrana a una concentración de 50
µg/L TCS.
La determinación del potencial de la membrana mitocondrial sirve como un medio para proporcionar
evaluación cuantitativa más inmediata del riesgo potencial a exposiciones ambientales de
contaminantes. Por lo tanto, el ΔψM podría funcionar como un nuevo biomarcador y podría ser
utilizado en programas de biomonitoreo (Padmini & Usha Rani, 2011).
La evaluación de parámetros hematológicos en peces es un importante enfoque para comprender los
efectos fisiológicos y toxicológicos de sustancias tóxicas (Paul et al., 2019), En este estudio, la
integridad del ADN no se vio afectada por la exposición a TCS (p <0,05) y se evidencia un leve
incremento en las células 4n o con fragmentación de ADN en el tratamiento de 50 µg/L TCS,
también se evidencia el incremento de leucocitos, que es un indicador de la respuesta inmune a los
tóxicos, efecto de productos químicos (Paul et al.,. 2019)
Figura 25.
a- Control- 0 µg/L TCS b- 25µg/L TCS
110
c- 50µg/L TCS d- Presencia de Linfocitos en muestras de
sangre a 50 µg/L TCS
Figura 25. Representación del análisis por citometría de flujo del daño al ADN después de ser
expuestos.
En la Tabla 23 se muestran los resultados de viabilidad celular, definidos como porcentaje de eventos
únicos o células sin daño celular y presencia de leucocitos como indicador de respuesta autoinmune.
Tabla 23. Viabilidad celular y respuesta autoinmune por la exposición a TCS.
Control 25µg/L TCS 50µg/L TCS
Eventos Únicos (%) 99 ± 0.28 97.5 ± 0.98 96.53 ± 3.67
Leucocitos (%) 1.45 ± 1.11 3.94 ± 1.83 3.05 ± 0.92
2n (%) 97.4 ± 2.75 95.3 ± 1.0 86,9 ± 5.78
4n (%) 2.1 ± 0.33 3.8 ± 0.92 3.1 ± 0.85
El recuento total de leucocitos o RTL es un indicador de la respuesta inmune a los tóxicos por efecto
de los productos químicos. Su función es luchar contra las infecciones, defender el cuerpo contra la
invasión por sustancias extrañas y para producir, transportar y distribuir anticuerpos como respuesta
inmune (Sahu et al., 2018). Se ha encontrado que hay un aumento significativo de leucocitos por
efecto del TCS en Pangasianodon hypophthalmus (Paul et al., 2019; Sahu et al., 2018), también fue
informado por Nwani et al.,2014, en el pez Clarias gariepinus, expuesto al cloranfenicol (Nwani et
al., 2014) y en la tilapia del Nilo O.niloticus, después de ser expuestos a TCS durante 96 horas
(Vijitha, C.K., Asifa, K, P., & Chitra, K, 2017).
111
Es así como a pesar de que estadísticamente no se muestran diferencias significativas en el presente
estudio, el incremento de los valores de leucocitos en las muestras analizadas, indican una posible
afectación al sistema inmune ya comprobado por el TCS y que posiblemente no se ve reflejado debido
a la baja concentración trabajada y a que es un pez de tamaño y peso considerable, que puede tener
estrategias de autoinmunidad efectivos. Sin embargo, es importante resaltar que si los peces se
someten a una reprogramación epigenética durante las primeras etapas de vida tiene el potencial de
generar problemas de fertilidad en edad más adulta y resultados de salud adversos (Song et al., 2020).
Es por esto qué se hace necesario, seguir monitoreando los peces de agua dulce como el bagre rayado
del Magdalena, que es una especie emblemática de los ríos de Colombia, migratoria y en estado
crítico de conservación, con el fin de determinar si la contaminación de su ambiente acuático está
influyendo en su capacidad reproductiva y de supervivencia.
Conclusiones.
El potencial de membrana ΔΨM de la sangre de magdaleniatum, después de ser tratados con dos
concentraciones de TCS (25 y 50 µg/L) y comparados con el grupo control o sin tratamiento. No se
encontraron diferencias significativas (p <0,05) que evidencie el daño celular. La viabilidad celular
permaneció cercana al 100% para todos los tratamientos, por tanto, la toxicología de los parámetros
evaluados puede considerarse un efecto temprano por que la viabilidad celular no se vio afectada,
pero se nota un leve incremento en el daño de membrana a una concentración de 50 µg/L TCS.
La integridad del ADN no se vio afectada por la exposición a TCS (p <0,05) y se evidencia un leve
incremento en las células 4n o con fragmentación de ADN en el tratamiento de 50 µg/L TCS, también
se evidencia el incremento de leucocitos, que es un indicador de la respuesta inmune a los tóxicos,
como efecto de productos químicos.
112
PRODUCTOS ASOCIADOS
Publicaciones Científicas
Food Analytical Methods (Zapata & Peñuela, 2021) https://doi.org/10.1007/s12161-020-01951-
9.
En preparación
Determinación de la disrupción endocrina del Bagre Rayado del Magdalena después de ser
expuesto a Triclosán.
Participación en Congresos:
Presentación oral:
“Monitoring of certain emerging contaminants in the striped catfish, a native fish to
Colombia” Gallego S., Cacua S., Zapata N., Peñuela G. A., 40th International conference on
Environmental & Food monitoring (ISEAC-40) held in Santiago de Compostela (Spain) from
19th to 22nd of June 2018.
Socialización de Resultados
Vía virtual por plataforma de Seccional Magdalena medio el día 24 de septiembre de 2020
Proyecto Colciencias: ¿Serán los Contaminantes emergentes una posible causa de la
extinción del Bagre rayado del Magdalena?
https://www.facebook.com/watch/?v=725655068293101
113
REFERENCIAS
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