evaluación de he como potencial biocontrolador de la hormiga arriera atta colombica. colombia
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EVALUACIÓN DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS COMO POTENCIAL
BIOCONTROLADOR DE LA HORMIGA ARRIERA Atta colombica ( G.)
DEL MUNICIPIO DE LLORÓ - CHOCÓ
SANDRA VICTORIA MENA CORDOBA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE AGRONOMÍA
BOGOTÁ, D.C.
2010
2
EVALUACIÓN DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS COMO POTENCIAL
BIOCONTROLADOR DE LA HORMIGA ARRIERA Atta colombica (G)
DEL MUNICIPIO DE LLORÓ - CHOCÓ
SANDRA VICTORIA MENA CORDOBA
Presentado como requisito para optar el título de
Magister en Ciencias Agrarias con énfasis en Entomología
Directores
DANIEL URIBE VÉLEZ PhD.
ANDREAS GAIGL PhD.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE AGRONOMÍA
BOGOTÁ, D.C.
2011
3
Nota de aceptación
_______________________
_______________________
_______________________
Director
_______________________
Jurado
_______________________
Jurado
Bogotá, D.C. febrero de 2011
4
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN 14
I Revisión de literatura 17
1.1 Generalidades de las hormigas cortadoras de hojas 17
1.2 Distribución de las hormigas arrieras 17
1.3 Descripción taxonómica de las hormigas arrieras 17
1.4 Los nidos de las hormigas arrieras 19
1.5 Generalidades de los Sistemas Productivos del Chocó 20
1.6 Métodos de control de las hormigas cortadoras de hojas 21
1.7 Generalidades de los Hongos Entomopatógenos 24
1.8 Mecanismo de Acción de los hongos entomopatógenos 27
1.9 Bioensayo para el evaluación de la capacidad entomopatogenica
de los HEP 29
1.10 Asociación de las hormigas cortadoras con HEP 31
1.11 Bioensayos con hormigas cortadoras de hojas con HEP 32
II Planteamiento del problema 36
III OBJETIVOS 38
3.1 Objetivos General 38
3.2 Objetivos específicos 38
IV HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN 39
V MATERIALES Y MÉTODOS 40
5.1 Localización del Área de Estudio 40
5.2. Medios de cultivo 40
5.3 Aislamiento de hongos entomopatógenos 40
5.31 Obtención de muestras para el aislamiento de hongos
entomopatógenos. 40
5
5.3.2 Aislamientos de HEP desde individuos muertos 41
5.3.3 Aislamientos de HEP desde los desechos de Atta colombica 42
5.4
Captura, establecimiento y mantenimiento de la colonia entomológica
en laboratorio: Hormiga reina, obreras y hongo simbionte de Atta
colombica 44
5.5 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENTOMOPATOGÉNICA DE
LOS AISLAMIENTOS NATIVOS 49
5.5.1 Reactivación de los aislamientos 49
5.5.2 Obtención del cultivo para el Bioensayo 50
5.5.3 Evaluación de los aislamientos de hongos entomopatógenos 50
5.6 CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50) DE LOS AISLAMIENTOS
PROMISORIOS. 51
5.7 ANALISIS ESTADISTICO 52
VI RESULTADOS 53
6.1 AISLAMIENTO DE HONGO ENTOMOPATÓGENOS (HEP) 53
6.2 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENTOMOPATOGÉNICA DE
LOS HEP. 54
6.2.1 Mortalidad Acumulada 56
6.2.2 Tiempo de manifestación de la micosis 57
6.3 CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50) DE LOS AISLAMIENTOS
PROMISORIOS 60
VII DISCUSIÓN 64
VIII CONCLUSIONES 70
RECOMENDACIONES 71
BIBLIOGRAFIA 72
ANEXOS 83
6
INDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Número de Hongos entomopatógenos (HEP) asociados a individuos de Atta sp., y los desechos producidos por A. colombica del municipio de Lloró – Chocó 53
Tabla 2. Aislamiento de los HEP obtenidos 55
Tabla 3.Relación del TL50 con el TM50 de los HEP nativos 56 Tabla 4. Segunda evaluación del TL50 y TM50 de los seis aislamientos de HEP nativos
58
7
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.Montaje del establecimiento de la colonia de A. colombica en el IBUN
45
Figura Nº 2. Porcentaje de mortalidad de A. colombica vs concentración de conidias/ml del hongo utilizado con las cepas nativas y el control positivo
61
Figura N° 3. TL50 de los aislamientos nativos vs control positivo con la
concentración 1x106 conidias/ml sobre A. colombica en condiciones de
laboratorio.
62
Figura N° 4. TL50 de los aislamientos nativos vs control positivo con la
concentración 1x107 conidias/ml sobre A. colombica en condiciones de
laboratorio
62
8
ÍNDICE DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1. Ubicación del CMUTCH en Lloró - Chocó - Colombia América.
Captura de Hormigueros de Atta sp.
81
Anexo 2. Análisis de correlación de Spearman de la mortalidad vs micosis de
individuos de hormiga arriera Atta colombica en laboratorio al ser infectados
con Metarhizium sp.
82
Anexo 3. Descripción del aislamiento de hongos entomopatógenos desde
individuos de Atta sp., y los desechos de A. colombica.
83
Anexo 4. Descripción del almacenamiento en papel y el líquido
85
Anexo 5. Captura, establecimiento y mantenimiento de la colonia 86
Anexo 6. Evaluación de la actividad entomopatogénica de los aislamientos
nativos 87
Anexo 7.Bioensayo; actividad entomopatogénica de los aislamientos nativos 88
9
DEDICATORIA A mi Dios nuestro señor, quien en cada momento y pasos de mi vida, me
demuestra que no hay nada más perfecto que el amor a Dios. A través del cual,
me ilumina, das sabiduría y orientación para superar las adversidades de la vida y
alcanzar el éxito. En especial por bendecirme con ese pequeño ser que creció
dentro de mí, “mi bebecito” y que hoy esta en el cielo, nunca te olvidaré mi amor,
tu huella esta en mi corazón y vivirá por siempre. Y por la segunda oportunidad
que hoy con la presencia de Yair Francisco Casas Mena creciendo dentro de mi,
y a través del cual me bendices doblemente.
A mi madrecita linda, que es una demostración del grandioso amor que Dios tiene
por mi, Francisca Córdoba Lenis, por dar y dedicarme los mejor de tu vida. Por
ser mi pilar, mi mejor amiga, mi fuerza y mi fortaleza. Te amo muchísimo.
A mi amor, amigo, novio, esposo y apoyo incondicional Juan Yair Casas
Agualimpia, por estar siempre ahí y darme lo mejor de ti. Te amo mi vida
A mis hermanos Mabel, Marino, Henry, Jhon y Aracelis Mena Córdoba gracias por
todo. A mis pequeñitos que le dan tanta alegría a mi vida Hirwing Francisco,
Andres Francisco, Kevin Arley, Dayanna Sofía, Fran Sebastian, Jhofran David,
Laury Yoceli, Mariana y Alisso por su alegría, los amo muchísimo.
A mi viejita hermosa, Cruz Arecelis Lenis Saucedo (Q.E.P.D), abuelita, por mi
madre y porque estoy segura que si los muertos tienen poder, tu desde donde
estas, me sigues enviado tu amor y con el permiso de Dios me libras del peligro.
Dedico mi trabajo a la búsqueda del conocimiento que contribuya de forma
progresiva al mejoramiento de la calidad de vida de la población rural del
departamento del Chocó, a la cual se le niega de una u otra forma la oportunidad
de ser protagonistas.
SANDRA VICTORIA MENA CORDOBA
10
AGRADECIMIENTOS En primer lugar a Dios por darme la vida, esta profesión y proveer para que este
sueño sea una realidad, y a todas las personas que fueron parte de este paso tan
importante en mi vida.
A mi madre querida FRANCISCA CORDOBA DE LENIS, por su amor, oraciones,
confianza y apoyo incondicional.
A mi esposo JUAN YAIR, por su amor incondicional, ayuda, paciencia,
comprensión y apoyo; eres mi amigo, mi cómplice, mi otra mitad. Con cariño a mi
familia gracias, los amo muchísimo.
A los docentes, directivos de la Universidad Tecnológica del Chocó: Eduardo A.
García Vega, Rodrigo Escobar Duran, Alicia Ríos Hurtado, por su impulso, apoyo,
confianza e incondicional. Gracias por creer en mí y hacer posible esta realidad.
A los integrantes y amigos del Grupo de investigación en Sistemas Productivos de
la UTCH, en especial a Rodrigo Escobar, Karina Quiroz y Juan C. Cortes, gracias
por su amistad y confianza.
Al Centro Internacional de Agricultura Tropical “CIAT”, por su colaboración y apoyo
en mi formación profesional y desarrollo del trabajo, en especial al Dr. Andreas
Gaigl, Rosalba Tobón, Elsa L. Melo y Carmen Eliza.
Al Grupo de Investigación en Microbiología Agrícola del Instituto de Biotecnología
de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, en especial al profesor
Daniel Uribe Vélez, por ser una bendición de Dios en mi vida, por creer en mí,
darme confianza y por su amistad y consejos tan precisos y acertados en los
momentos difíciles y felices de mi vida, que han hecho de mi una mejor persona y
profesional integral. Profe de corazón y para siempre, Muchísimas Gracias. A los
chicos Lisney, Nathalia, Paola, Claudia, Mayra, Javier, de corazón gracias.
11
Igualmente al Dr Jairo Cerón del grupo de Biopesticida del IBUN, en especial, por
su apoyo y colaboración en el préstamo del laboratorio para la cría de insecto.
A la Profesora Jimena Sánchez por su colaboración en la identificación de los
aislamientos de hongos nativos.
Al Doctor Sergio Orduz, por su colaboración en el préstamo de la cepa utilizada
como control positiva Metarhizium anisopliae (M-137).
A COLCIENCIAS, por el apoyo brindado durante el proceso de formación como
investigadora para la generación de conocimiento e innovación, a beneficio del
Chocó.
A los Docentes de la escuela de posgrado en Ciencias Agrarias que durante mi
estadía en la Universidad ayudaron a forjarme durante el proceso de enseñanza,
Andreas Gaigl y Elena Luisa Margarita Brochero y muy especial al profesor
Augusto Ramírez Godoy por su apoyo permanente e incondicional.
A mis compañeros de estudio y a todas las personas que de alguna forma
colaboraron en la realización de este trabajo. Y en general a todos los que con su
amistad hicieron más amenos mi paso por la Universidad Nacional de Colombia
sede Bogotá. En fin, Gracias a Dios y a ustedes por todo.
A mis amigas Eyda A. Moreno, Eva D. Ledezma y Yaira A. Abuhada que con su
amistad y confianza, fueron un pilar para soportan las adversidades de la vida
cuando no se esta en casa y se pasan momentos tan pero tan difíciles por los que
me toco atravesar. Gracias por estar siempre ahí. Niñas, entraron en mi vida a
ocupar un lugar muy importante en ella, las quiero muchísimo.
A Gustavo Gómez, por su colaboración amable y oportuna en el procesamiento de
los datos y análisis estadísticos, muchas gracias.
SANDRA VICTORIA MENA CORDOBA
12
RESUMEN La hormiga arriera ó cortadora de hojas (Atta colombica) son reconocidas como el
principal limitante en la producción agrícola, forestal y ornamentales urbanos del
departamento del Chocó. Una de las alternativas de manejo es el uso de
insecticidas químicos, pero los problemas inherentes a este método, han llevado a
buscar otros metodos de manejo. A partir de esto, nace la alternativa de
seleccionar aislamientos nativos de hongos entomopatógenos y evaluar su acción
sobre las hormigas cortadoras de la especie A. colombica. Se analizaron 30 cepas
de hongos nativos obtenidos de individuos muertos de Atta sp., y de los desechos
producidos por A. colombica, de los cuales 21 aislamientos fueron evaluados
sobre esta misma especie en laboratorio. Se compararon los aislamientos en
cuanto a la mortalidad acumulada, el TL50, TM50 y la CL50. Los aislamientos H-M-
03 y H-M-08 de Metarhizium sp., alcanzaron 100% de mortalidad al quinto día de
inoculación. Con una diferencia con relación al control positivo (M-137) de 1,3 y
2,0 días (P>0,05) en matar el 50% de los individuos. Esta situación es de gran
interés desde el punto de vista de la diseminación de la enfermedad causada por
un hongo entomopatógeno, y como herramienta de control de este insecto
teniendo en cuenta las características comportamentales de las hormigas
cortadoras como una población social. Para los aislamientos seleccionados de
Metarhizium la CL50 de H-M-03 fue de 1.12x106, para H-M-08 de 1.16x106
conidias/ml y el control positivo M 137 con 1.04x106. Por último, se concluyó que
en general las cepas nativas obtenidas en este estudio del género Metarhizium en
especial H-M-03 y H-M-08, presentaron un alto grado de virulencia contra A.
colombica en laboratorio y potencialmente viable para llevar a pruebas con la
colonia completa en laboratorio y posteriormente para campo en la región de
origen.
Palabras Claves: Hormigas cortadoras de hojas, Atta colombica, Sistemas
Productivos Lloró-Chocó, Hongos entomopatógenos nativos.
13
INTRODUCCIÓN
Las hormigas arrieras o cortadoras de hojas pertenecen a los géneros Atta y
Acromyrmex agrupados dentro de la tribu Attini, subfamília Myrmicinae de la
familia Formicidae, se distribuyen en todo el neotrópico (Longino 2005). Se
encuentran ubicadas desde el sur de Estados Unidos hasta Argentina de los 0 a
los 3000 metros de altura (Folgarait et al. 1996; Longino 2005). Las hormigas
cortadoras son dependientes del cultivo de hongos (Attamyces spp.) para su
alimentación (Currie et al., 2003) al que le retribuyen proporcionando material
vegetal como sustrato para el crecimiento, dispersión y producción del hongo
simbionte del cual se alimentan (Ricci et al 2005). Las hormigas son organismos
polífagos en términos de la cantidad y variedad de especies vegetales que
emplean para el cultivo del hongo, del cual se alimentan (Wirth et al. 2003),
ocasionando daño en las áreas agrícolas cercanas al establecimiento de su nido.
Por lo anterior son conocidas como una de las plagas más limitantes en diferentes
cultivos de importancia económica para regiones como Antioquia, Amazonas y el
Chocó (Riaño 2003; citado por Ricci et al. 2005).
La producción agrícola del departamento del Chocó es sustentada por cultivos
como arroz, maíz, tomate, cebolla junca, achin (papa china), caña panelera, coco,
ñame, yuca, frutales, cacao, árbol del pan, bacao, papaya, marañón, borojó,
chontaduro, piña, lulo, granadilla, limón, musáceas, hortalizas, leguminosas
forrajeras, ornamentales y algunas plantaciones forestales como el cedro,
guerregue, guamo, entre otras (Escobar et al. 2002; Longino 2005; IGAC 2006).
El impacto económico del daño causado por las hormigas arrieras (HA), depende
del estado de desarrollo del cultivo y de las condiciones ambientales imperantes
en el momento (Ricci et al 2005). Sin embargo, Lima (1992) a indicado, que un
hormiguero puede llegar a consumir entre 50 y 150 kilos de hojas por día y las
pérdidas podrían exceder 1.000 millones de dólares anuales para Norte y Sur
14
América, lo que da una idea de la presión que ejerce este insecto sobre la
producción agrícola en las zonas que afecta.
Para el manejo de las hormigas arrieras existen diferentes métodos de control
como son; mecánicos, físicos, biológicos, culturales y químicos. Este último ha
sido el método más empleado, a pesar de que puede alterar el equilibrio biológico
mediante la aniquilación de especies benéficas para el ambiente, puede
seleccionar insectos resistentes, llevando a una magnificación del problema,
genera la contaminación del ambiente y acarrea riesgos para la salud humana
(Barrera et al 2006). Lo anterior, sumado a los costos para la consecución de los
mismos, lo convierte en una alternativa poco viable para el control de este insecto.
En el control de la hormiga arriera se puede destacar, que en regiones como
Antioquia, el Amazonas y el departamento del Chocó, dados los efectos
devastadores de las hormigas sobre los cultivos, además del manejo quimíco a
través de productos como Clorpirifos y acetato, (Madrigal y Yepes 1997) Pirimifós
metilo (López y Orduz 2003), recientemente se han venido realizando esfuerzos
con otras alternativas de control, algunas de las cuales pueden ser consideradas
ambientalmente amigables y económicas para el manejo de este insecto plaga.
Dentro de las estrategias de manejo se destacan el control cultural, a través del
traslado de los desechos de Atta colombica de un hormiguero a otro y/o la
aspersión de estos desechos utilizando bomba de espalda (Ricci et al 2005;
Palacios y García 2006). Igualmente se ha empleado la aplicación de compuestos
químicos como cal viva y jabón (Van Gils 2006). El control biológico se ha
promovido con la aplicación de hongos entomopatógenos (López y Orduz 2003),
el uso de parasitoides como la mosca de la familia Phoridae (Currie et al. 2003) y
ciertas plantas repelentes y/o con alta capacidad insectida, sembradas en los
hormigueros o aplicadas en forma de cebo (Escobar et al. 2002; Van Gils 2006;
Agúdelo 2007).
15
Para disminuir el impacto causado por las hormigas cortadoras es necesario
desarrollar prácticas de control que sean factibles, aplicables, eficientes y en lo
posible económicas. Ante esta realidad, el control biológico a través de hongos
entomopatógenos, constituye una herramienta viable y en teoría de bajo riesgo
para el hombre y el ambiente (López y Orduz 2003).
Ante esta realidad y teniendo en cuenta lo anterior, este trabajo se justifica porque:
En el Departamento del Chocó no se han realizado estudios relacionados con
la bioprospección de la diversidad de microorganismos, en especial los hongos
entomopatógenos como una herramienta potencial para ser utilizada en las
áreas agrícolas de importancia en la región.
Finalmente trabajos previos han demostrado que las estrategias de control
biológico basados en los hongos entomopatógenos (HEP) son una alternativa
viable para controlar y así, mitigar la presión de este insecto plaga sobre los
cultivos afectados (López y Orduz, 2003).
16
1. REVISIÓN DE LITERATURA
1.1. GENERALIDADES DE LAS HORMIGAS CORTADORAS DE HOJAS
Las hormigas cortadoras de hojas de los géneros Atta y Acromyrmex, son insectos
que se adaptan a gran variedad de ecosistemas, viven en colonias organizadas,
con castas definidas y altamente sociales. Con presencia de 210 especies de
hormigas cortadoras en los bosques húmedos tropicales de Suramérica (López y
Orduz, 2003); Tienen preferencia sobre especies vegetales asociadas a las áreas
agrícolas de importancia para el hombre como frutales (guanábana, limón), granos
básicos (arroz, trigo, frijoles), hortalizas (cebolla de rama, tomate), árboles
forestales (pino, cedro) y plantas ornamentales, pastos y algunas especies del
bosque (Longino 2005).
1.2 DISTRIBUCIÓN DE LAS HORMIGAS ARRIERAS
En Colombia, de acuerdo con Mackay y Mackay (1986), existen cuatro especies
dentro del género Atta: A. cephalotes, A. colombica, A. laevigata y A. sexdens; en
tanto que Cherret et al. (1989) y Fernández (2003) reportan cuatro especies para
el género Acromyrmex: Ac. aspersus, Ac. landolti, Ac. octospinosus y Ac. rugosus.
En la zona Central del Departamento del Chocó, se han registrado individuos
pertenecientes a los géneros Atta y Acromyrmex, y particularmente para el genero
Atta las especies Atta cephalotes y Atta colombica (Escobar et al. 2002).
1.3 DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA DE LAS HORMIGAS ARRIERAS
Según Ortiz y Guzmán (2007) la especie Atta colombica se caracteriza
morfologicamente por tener la cabeza y el abdomen opacos, coloración castaño
claro a oscuro en todo el cuerpo y abdomen, la casta de los soldados se
17
caracteriza porque son de mayor tamaño, la cabeza en forma de corazón mas
pronunciado que la especie A. cephalotes, no presentan una abundante pilosidad
sobre la frente, son de color amarillo opaco a café; las obreras cortadoras se
caracterizan por las espinas que se encuentran en el tórax, dispuestas en pares
de una manera regular, al igual que las especies del género presentan un alto
polimorfismo de las obreras esto significa que en el nido se encuentran hormigas
de tamaños diferentes.
Las obreras son de color amarillo a café, el tono es opaco y se caracteriza por que
la superficie del cuerpo esta cubierta de pelos cortos, delgados y de color dorado.
El color de las obreras pueden variar entre colonias e incluso al interior de cada
nido, se puede observar que hormigas que han madurado son de tono mas
oscuros (Ortiz y Guzmán 2007).
Algunas características taxonómicas para las hembras mencionadas por Mackay y
Mackay (1986). Las castas reproductoras de la especie A. colombica es más
pequeña que la hembra de la especie A. cephalotes, las reinas miden en promedio
2.1 cm. Son de color café, tiene un abdomen grande y una joroba en la parte del
torax, la cabeza esta bien desarrollada, presentan una mancha de color café
alrededor de la vena costal y ancho de la cabeza menor de 4.5 mm. Después del
apareamiento, la hembra inicia la búsqueda de un lugar apropiado para construir
el nido y durante la excavación de la primera cámara pierde las alas, la cual le
proporciona proteína hasta que se inicia el cultivo del hongo.
Según Mackay y Mackay (1986) los machos son de menor tamaño que las
hembras (1.7 cm) y se caracterizan por que la cabeza es mas pequeña y el
aparato bucal es atrofiado. La función de los machos es la de fecundar a las
hembras reproductoras, por lo cual compiten durante el vuelo nupcial y después
mueren.
18
1.4 LOS NIDOS DE LAS HORMIGAS ARRIERAS
Los nidos de A. colombica se caracteriza por ser construido en tierra y de forma
subterránea, siendo muy semejante a los nidos de A. cephalotes, sin embargo
esta última prefiere establecer los nidos en áreas abiertas mientras que A.
colombica prefiere área más cerradas, cubiertas como zonas boscosas, entre los
cultivos y otras áreas. Los nidos se pueden hallar en las orillas de los ríos o
canales de drenaje, los problemas de este comportamiento no solo están
relacionadas con la erosión que esto causa sobre el terreno, sino que durante el
invierno muchos nidos se inundan y la fuerza del agua arrastra grandes
cantidades de tierra causando perdidas significativas en áreas de cultivos
importantes (fincas bananeras, agroforestales, entre otras) (Ortiz y Guzmán 2007).
Generalmente el nido en su superficie esta desprovisto de vegetación, la cual es
retirada por las hormigas, esta característica se observa principalmente en nidos
maduros dependiendo de la época del año. En invierno es posible observar
montículos en forma de volcán lo que evita que los nidos se inunden.
Al interior de los nidos están dispuestas las cámaras en las que se encuentran los
jardines de hongos y las crías. Cuando los nidos son recién establecidos los
basureros son ubicados en el interior del nido, luego cuando la colonia crece el
basurero puede encontrarse lejos del nido o junto a la base de los árboles (Ortiz y
Guzmán 2007), que se encuentran a distancias variadas y la ubicación del
basurero depende de la preferencia de la hormiga a la especie vegetal o la
ubicación del árbol dentro del sistema de cultivos.
A. colombica corta principalmente plantas cultivadas y en menor proporción pasto
y vegetación en bosques. El principal daño lo producen al cortar las hojas de las
plantas, este daño no lo hacen con el fin de alimentarse de las hojas, sino para
usarlas en los nidos para el cultivo de un hongo simbionte denominado
19
Leucoagaricus gongylophorus, de la tribu Leucocoprineae (Basidiomicota:
Agaricales: Lepiotaceae) (Chapela et al., 1994; citado por Ortiz y Guzmán, 2007).
Se ha comprobado que los hongos son el único alimento de la reina y larvas, para
las castas obreras apenas un 5% es consumido, las cuales obtienen la mayor
parte de los nutrientes de la savia vegetal que emana cuando realizan la actividad
de cortes. Esta relación ecológica entre hongos y hormigas es de tipo mutualista
obligada, en la cual las hormigas proporcionan cuidado y dispersión del hongo
simbionte (Ortiz y Guzmán 2007).
Durante el proceso de corte y acarreo del material vegetal para el cultivo del
hongo, es frecuente encontrar a las arrieras forrajeando yuca, cacao, café, maíz,
caña de azúcar, cítricos, soya, entre otras. Este forrajeo tiene un efecto
devastador para los cultivos, por ejemplo para el caso del cultivo de cítricos en
Honduras, las pérdidas económicas están estimadas en más de 600.000 dólares
por año (Lima 1992; López y Orduz 2003).
1.5 GENERALIDADES DE LOS SISTEMAS PRODUCTIVOS DEL CHOCÓ
Los sistemas productivos del Chocó se definen como las actividades y técnicas
agrícolas, de extracción forestal, pecuarias, de caza, pesca, la recolección de
productos naturales en general y estos combinados con la minería, que han
utilizado tradicionalmente las comunidades negras para garantizar la conservación
de la vida y el desarrollo autosostenible (Escobar et al, 2002).
En los Sistemas Agrícolas del departamento del Chocó, la actividad económica
está asociada al desarrollo diversificado de la agricultura (cultivos permanentes y
transitorios), la ganadería (extensiva e intensiva), la pesca, la extracción forestal y
el aprovechamiento no sostenible de los bosques nativos. Además existen amplias
áreas de resguardos indígenas y de titulaciones colectivas, zonas destinadas a la
conservación de parques naturales, reserva y forestación (Escobar et al., 2002). El
20
desarrollo agropecuario del Chocó, por su biodiversidad y por la fragilidad de sus
suelos, debe estar supeditado a determinadas áreas; en general las actividades
agropecuarias e industriales son incipientes y las actividades pesqueras son
artesanales (IGAC, 2006).
Dentro de los sistemas productivos se encuentran los huertos mixtos, los cuales
están ubicados en los alrededores de las viviendas, constan de una gran
diversidad de árboles frutales y maderables, cultivos anuales y por lo general con
un complemento de animales domésticos. Y las azoteas, consiste en una
estructura elevada construida en madera con canoas fuera de servicio o tendido
de palma, donde se cultivan una gran variedad de plantas herbáceas alimenticias,
medicinales y aromáticas todas de gran interés en la economía y abastecimiento
de las comunidades afro e indígenas del Chocó, zona donde es frecuente
encontrar a las hormigas cortadoras haciendo parte de las diferentes áreas
cultivadas (Escobar et al., 2002).
1.6 MÉTODOS DE CONTROL DE LAS HORMIGAS CORTADORAS DE HOJAS
En general, para el manejo de insectos plagas como la hormiga arriera el mejor
control es aquel que, conociendo todas las alternativas; química, física/mecánica,
cultural y biológica, las aplica en forma adecuada e integrada atendiendo a cada
situación y considerando cada ambiente particular. Dado que las hormigas
cortadoras tienen un alto potencial de daño en cultivos de importancia agrícola y
que poseen además una fauna de insectos asociada a ellas, el manejo de las
poblaciones de hormigas es un trabajo que requiere la integración adecuada de
estrategias y/o métodos de control que permita mantenerlas en niveles que no
causen perdidas económicas significativas en las áreas agrícolas de las zonas que
afecta. Dentro de los métodos de control se pueden mencionar los siguientes:
21
Control mecánico. Escobar et al., (2002) describe este método de control como
una práctica que se realiza de forma rutinaria por las comunidades negras e
indígenas de la región Chocoana; se programa a partir de las fechas de ocurrencia
de los vuelos nupciales y la apertura del primer orificio, el cual hace presencia a
los tres meses. Para este control se excava el hormiguero recién formado con una
pala o pica, a una profundidad de 15 a 20 cm hasta localizar la reina, desenterrarla
y matarla. Requiere el conocimiento adecuado de las épocas de vuelo nupcial, el
cual se identifica fácilmente por la cantidad de machos alados muertos en el suelo.
Para este sistema de control es indispensable que toda la comunidad lo realice, de
manera permanente, lo cual se logra a través de la organización de la comunidad
de agricultores o mingas (unión de varios agricultores vecinos).
Control físico. Es una práctica común de algunos agricultores la cual consiste en
aplicar gasolina dentro del hormiguero, encenderlo para su posterior detonación.
Este método no presenta un buen nivel de control debido a que no alcanza a
afectar la totalidad de las cámaras y es un hecho poco probable que se logre
alcanzar y destruir a la reina (Escobar et al. 2002).
Control cultural. Consiste en la utilización de especies vegetales con capacidad
formícida presentes en la región y de fácil consecución. Para el uso de esta
técnica se emplean cebos como sustrato o cultivos trampas sembrados sobre o
cerca del hormiguero cuyas hojas tienen efectos tóxicos sobre el hongo y/o las
castas obreras. Este es el caso de la higuerilla (Ricinus comunis), el ajonjolí
(Sesamum indicum), Canavalia (Canavalia ensiformis) y la batata (Ipomoea
batata) (Escobar et al. 2002; López y Orduz 2003). Una vez las hormigas utilizan
estas plantas como sustrato para el crecimiento del hongo del cual se alimentan,
las plantas actúan como inhibidoras de la actividad de las hormigas y además sus
compuestos tóxicos evitan el crecimiento del hongo (Ortiz y Guzmán 2007).
22
Es importante resaltar que en el departamento del Chocó para el control de las
hormigas cortadoras de hojas se utilizan de forma artesanal los desechos de la
hormiga arriera Atta colombica (tierra de hormiga), los cuales son empleados por
las comunidades rurales, como distractores de la actividad de forrajeo. Para tal
efecto, transportan los desechos que produce un hormiguero a otro hormiguero y/o
es asperjado con una bomba de espalda sobre las hormigas arrieras en horas de
actividad de forrajeo, con lo que se logra la disminución de la actividad de forrajeo
(Palacios y García 2006).
Hart y Ratnieks (2002) encontraron que el manejo de los deshechos de A.
colombica es una labor organizada e importante ya que el 11% de las castas
externas desarrollan actividades relacionadas con el transporte de los residuos y
la manipulación en las áreas de los botaderos. La organización registrada en el
manejo de los deshechos se considera una labor adaptativa para reducir la
transmisión de parásitos y patógenos.
Control químico. Consiste en el uso de sustancias químicas sintéticas, las cuales
son la forma más generalizada de combatir la hormiga arriera desde décadas
atrás. En este control se emplea formulaciones con ingredientes activos como;
Clorpirifós, clordano, diazinon, lindano, fenitotrión, mercaptotión, sulfluramida,
fipronil y cipermetrinas (Rodríguez et al, 2008). Otros productos como acetamiprid
e imidacloprid, principios activos y tratamientos que combinan un atrayente con un
insecticida (cebos tóxicos) (Vez 2005).
Los productos son aplicados de distinta formas: directamente en los nidos o al
lado de los caminos de forrajeo, dispuestos en los hormigueros o alrededor de los
mismos principalmente en forma de cebo granulado, en polvos secos y líquidos
termonebulizables (Escobar et al. 2002). Para la aplicación se deben tener en
cuenta las condiciones climáticas, hora de aplicación y el tamaño de la colonia, las
cuales determinan la cantidad de producto químico a utilizar (Vez 2005).
23
Es así como en el Chocó, García y Palacios (2006), evaluaron un producto
químico (Attakill® - Sulfluramida) en forma de gránulos comparado con dos
productos utilizados tradicionalmente por la comunidad (Cebo a base de Canavalia
ensiformis y aspersión de los desechos de Atta colombica con bomba de espalda)
para el control de las especies de hormiga arriera Atta cephalotes y Atta
colombica. Los resultados obtenidos García y Palacios (2006) permitieron
constatar que el control químico fue el más efectivo ya que se obtuvo una
disminución del 100% en la actividad de forrajeo. A diferencia del control natural C.
ensiformis, en forma de cebo que logró una reducción del 72% y el control con los
desechos de A. colombica, aplicados en forma líquida con una disminución del
74%.
Control biológico. Consiste en la manipulación de macro y microorganismos que
actúan como enemigos naturales de los insectos plaga, con el fin de limitar la
población del insecto blanco (Carrillo y Blanco 2009). Entre los enemigos naturales
que afectan a las hormigas se encuentra algunos parasitoides que atacan a las
obreras adultas (moscas de la familia Phoridae), las cuales pueden reducir su
actividad forrajera (Bragança et al., 1998; Currie et al 2003). Sin embargo, aún no
está demostrada la efectividad de estos y otros parasitoides en este tipo de
hormigas. A diferencia de los hongos micoparasitos como Trichoderma sp., que
ataca el hongo simbionte cultivado para su alimentación y hongos
entomopatógenos de los géneros Beauveria y Metarhizium que afectan a las
hormigas (Currie et al., 2003; López y Orduz 2003; Carrillo y Blanco 2009).
1.7 GENERALIDADES DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
Los hongos entomopatógenos (HEP), son un grupo de microorganismos que
emplean artrópodos de diferentes órdenes como hospederos para desarrollar
parte de su ciclo de vida: Esta interacción generalmente termina en el desarrollo
de enfermedad en el hospedero terminando en la muerte del mismo (Butt et al.,
24
2001; Khachatourians 1991; Khachatourians y Uribe 2004; St Leger; 2007). Los
HEP son utilizados en un amplio rango de grupos taxonómicos, siendo los
Ascomycota, aquellos que agrupan el mayor número de grupos con potencial
bioplaguicida; en general los hongos forman esporas microscópicas con conidias
de paredes delgadas desarrolladas por los conidióforos con diseminación por el
viento, agua u otros agentes (Butt et al. 2001; St Leger; 2007).
Existen un número importantes de reportes en la literatura de hongos
entomopatógenos como enemigos naturales de la hormiga arriera, los cuales han
sido propuestos como una forma natural de mantener el equilibrio de las especies
vegetales de importancia agrícolas que son afectadas por este insecto (St Leger;
2007; Rodriguez et al 2008).
Los hongos entomopatógenos pueden ocasionar enfermedad y propagarse en la
población de artrópodos, dependiendo de las interacciones y factores relacionados
con: el patógeno (patogénicidad, virulencia, dispersión y persistencia), el
hospedero (susceptibilidad, densidad, distribución y comportamiento) y el medio
ambiente (abióticos: temperatura, humedad, viento, lluvias y bióticos: parásitos,
depredadores, planta - huésped) (Lecuona et al. 1996; St Leger; 2007).
Los micoinsecticidas (Productos formulados con hongos entomopatógenos),
constituyen una pequeña fracción de los bioplaguicidas (Charnley 1997). Sin
embargo, el incremento en el costo de producción de los pesticidas químicos, la
resistencia desarrollada por las plagas y la presión que existe para reducir la
contaminación en el ambiente han asegurado el creciente interés en métodos
alternativos para el manejo de plagas (Butt et al. 2001; St Leger 2007), en las que
se incluyen las hormigas arrieras (López y Orduz 2003).
Entre los géneros de HEP se destacan: Beauveria, Hirsutella, Metarhizium,
Paecilomyces y Lecanicillium (St Leger 2007). Específicamente los hongos del
25
género Metarhizium y Beauveria, han sido utilizados exitosamente en el control de
algunos insectos sociales, destacando los estudios con hormiga roja Solenopsis
invicta, en donde se demostró que las colonias resultaron ser susceptibles a
Beauveria bassiana (Brinkman y Gardner 2000). Las termitas subterráneas
Heterotermes tenuis (Gutierrez 2003) y las hormigas arrieras Atta cephalotes
mostraron susceptibilidad a Metarhizium y Beauveria (Lopez y Orduz, 2003;
Longino, 2005). Merece mencionar que los estudios demuestran que tanto B.
bassiana como M. anisopliae tienen ciclos de desarrollo similares que se
diferencian solo en la forma de penetración al insecto y en la rapidez de la
mortalidad (Moino et al. 2002; St Leger 2007), lo cual puede explicar en alguna
medida porque la hormiga arriera es susceptible a cepas de ambos géneros,
aunque es de mencionar igualmente que existe un mayor número de estudios
sustentando la capacidad de HEP del genero Metarhizium spp, como alternativa
de control de este insecto (Currie et al., 2003; López y Orduz 2003; St Leger
2007).
En este sentido García y Palacios (2006), evaluaron dos productos utilizados
tradicionalmente por la comunidad (Cebo a base de planta con potencial
formícidas Canavalia ensiformis y aspersión de los desechos de Atta colombica
con bomba de espalda) y estos comparados con un producto químico, para el
control de las especies de hormiga arriera Atta cephalotes y Atta colombica. Los
resultados obtenidos permitieron constatar que el control con los productos de
origen natural (C. ensiformis, en forma de cebo), permitió una reducción del 72% y
el control con los desechos de A. colombica, aplicados en forma líquida se logró
una disminución del 74% de la actividad de forrajeo, lo cual sugiere un potencial
en estas estrategias para el manejo de la hormiga arriera en el Chocó.
26
1.8 MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
Los hongos entomopatógenos constituyen un grupo de microorganismos en donde
la ingestión por el hospedero no es un prerrequisito para llevar a cabo el proceso
de infección, debido a que la enfermedad puede ser desarrollada por contacto del
patógeno con su hospedero, logrado una penetración directa de la cutícula (St
Leger 2007). La patogénicidad y el desarrollo de la infección de un HEP en su
insecto huésped son el resultado de la interacción entre el patógeno y el
hospedero, dicha interacción esta determinada por la velocidad de germinación, y
de reproducción del patógeno, así como la tasa y velocidad de esporulación, el
tiempo de exposición del insecto al patógeno, la producción de toxinas por parte
del HEP y el estado de desarrollo y ciclo de vida del insecto hospedero
(Kachatourians, 1991; Cañedo y Ames, 2004; St Leger, 2007).
El proceso de la enfermedad de los HEP sobre los hospederos se puede dividir en
las siguientes fases: adhesión, germinación, formación de apresorios y estructuras
de penetración, colonización y reproducción del patógeno. En todos los casos la
unidad infectiva es la espora o el conidio que inician su proceso infectivo cuando
las esporas viables son retenidas en la superficie del integumento y se realiza la
asociación entre patógeno y hospederos (Khachatourians y Uribe 2004).
La adhesión. La adhesión de la espora a la cutícula del hospedero es el primer
contacto que hace la espora con la superficie del hospedero; las características
físicas y químicas de las superficies de la cutícula del insecto y la espora son las
responsables de esta unión. En algunos hongos, la adhesión es un fenómeno no
específico, mientras en otros, esto es un proceso específico, determinado por
componentes como la glicoproteínas que pueden servir como un receptor
específico para las esporas (Brinkman y Gardner, 2000; St Leger, 2007).
27
La germinación. Es el proceso mediante el cual una espora emite uno o varios
pequeños tubos germinativos, que al crecer o alargarse dan origen a las hifas
(Cañedo y Ames 2004; St Leger, 2007). La espora que germina en el insecto
forma un tubo germinativo a través de las hifas penetrando en la cutícula del
insecto, después que las hifas penetran en el insecto forma un apresorio el cual
ayuda a la adhesión de la espora (St Leger, 2007).
La penetración. Ocurre en la cutícula del insecto como resultado de la
combinación entre la degradación enzimática de la cutícula y la presión mecánica
por el tubo germinal. La acción enzimática está determinada principalmente por
proteasas, lipasas y quitinasas, las cuales causan degradación de la cuticula, lo
que facilita la penetración física (St Leger 2007). Esta acción depende de las
propiedades de la cutícula como su grosor, esclerotización y la presencia de
sustancias antifúngicas y nutricionales, así las enzimas del HEP degradan la
cutícula del insecto ayudadas por presión mecánica, algunos hongos como M.
anisopliae, producen un mucílago y un apresorio que asiste el anclaje de la espora
a la superficie. Estructuras como estas crean focos de fuerzas hidrostáticas, tan
necesarias como las enzimas líticas en el sitio de penetración (Khachatourians
1991; Khachatourians y Uribe 2004).
El resultado de la germinación y la penetración no depende necesariamente del
porcentaje total de germinación sino del tiempo de duración de la germinación,
modo de germinación, agresividad del hongo, el tipo de espora y la susceptibilidad
del hospedero (Samson et al. 1988; Shapiro et al 2008).
Invasión y proliferación. Los hongos producen cuerpos hifales que flotan
libremente e invaden el hemocel hasta ocasionar la muerte. La muerte de los
insectos que se produce por agotamiento de los nutrientes de la hemolinfa,
bloqueo o inmovilización de elementos del sistema inmune y/o por toxemia,
causada por metabolitos tóxicos del hongo (Khachatourians, 1991; St Leger,
28
2007). En este contexto, la habilidad de un hongo entomopatógeno para superar
los mecanismos de defensa de sus huéspedes se debe en gran parte a la
producción de toxinas, lo cual constituye uno de los componentes principales de
patogénicidad y uno de los mas difíciles de establecer; dentro de estos metabolitos
se destacan toxinas como Destruxinas, Citocalasina, Beauvericina y Metaricina,
algunas de las cuales son especificas para algunos géneros de HEP (St Leger
2007). Algunos biotipos producen suficientes toxinas para causar la muerte del
insecto antes de que los órganos estén invadidos (Hajek y St. Leger, 1994;
Cañedo y Ames, 2004).
1.9 BIOENSAYO PARA LA EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD
ENTOMOPATOGENICA DE LOS HEP
Los bioensayos consisten en la realización de pruebas con organismos vivos, con
el objeto de determinar una característica de interés dentro de un grupo de
estudio. En el caso de los HEP estos se desarrollan con el objeto de evaluar la
capacidad bioplaguicida de un microorganismo y determinar su virulencia a través
de parámetros establecidos como el tiempo letal medio (TL50) y la concentración
letal media (CL50). Estos parámetros que son identificados bajo condiciones
controladas en laboratorios especializados, permiten identificar el potencial de un
insecticida microbiano sobre el insecto que se desea controlar, como una primera
aproximación en el desarrollo de una estrategia de control que involucre los
bioplaguicidas como componentes estructurales de la misma (Tanada y Kaya,
1993; Butt et al., 2001; Cañedo y Ames, 2004). Posteriormente una vez
identificadas las cepas con potencial bioplaguicida estas deberán proseguir hacia
una siguiente fase de bioprospección que involucre evaluaciones en campo, las
cuales demandan periodos extensos de tiempo ya que requiere las repeticiones en
el tiempo y en diferentes ambientes para determinar de forma exhaustiva el
potencial biocontrolador de los microorganismos bajo estudio.
29
La patogenicidad de un microorganismo depende del aislamiento y la especie del
patógeno que se desea emplear como estrategia de control. En el caso específico
de los HEP es importante que en el momento del montaje del ensayo este sea
pasado o repicado (sembrado y recuperado nuevamente), sobre el hospedero
apropiado, esto con el objeto de mantener o mejorar patogenicidad del hongo y
así, lograr aumentar el grado de virulencia del HEP sobre el insecto de interés.
Estas estrategias han sido ampliamente empleadas en HEP, como Metarhizium
anisopliae (Fargues y Roberts, 1983), Paecilomyces farinosus (Prenevora, 1994) y
Beauveria bassiana (Wasti y Hartman, 1975) (St Leger 2007) entre otros.
Uno de los elementos mas importantes en el diseño de un bioensayo reside en la
cepa entomológica que se emplea, estas deben ser en la medida de lo posible de
insectos producidos en laboratorio con el objeto de asegurar la homogenidad
genética, estado de desarrollo y condiciones sanitarias similares (Cañedo y Ames,
2004). Existen diversos métodos para la inoculación de los insectos los cuales van
desde el empleo de mecanismos por aspersión mediante lluvia conidial, inmersión
(mínimo por 10 segundos en la suspensión de conidias), exposición a material
vegetal previamente inoculado, inyección, ingesta directa, entre otros
(Khachatourians 1991; Toledo et al., 2008). Sin embargo, el método de contacto
conidial, es el más usado para insectos en estado larval y formas adultas para el
caso de los HEP (Papierok y Hajek 1997; Shapiro et al., 2008). De cualquier forma
es importante anotar que la decisión en relación al sistema a emplear va a
depender del tipo de agente biocontrolador, el insecto hospedero, la pregunta de
investigación y el material disponible este, de que haya o no más factores, lo
importante es que la decisión tomada este en concordancia con la pregunta de
investigación que se desea abordar
En el caso de los HEP, la suspensión de conidias que se desea evaluar, debe ser
obtenida en una suspensión conidial partiendo de un cultivo fresco esporulado, la
cual se debe preparar agregándole agua destilada estéril o un agente dispersante
30
como el tween 80 a bajas concentraciones (Cañedo y Ames 2004; Toledo et al.,
2008).
De acuerdo con Cañedo y Ames, (2004); Rodríguez y Arredondo, (2007) y St
Leger, (2007) las condiciones de humedad y temperatura ambiental son factores
que inciden proporcionalmente en la germinación y proliferación de los HEP, es
por esto que una vez expuestos los insectos que han sido tratados, estos deben
ser mantenidos en grupos o individualmente, dependiendo de la especie de
insecto, en ambientes controlados con fotoperiodo especifico, temperatura y
humedad relativa constante, de acuerdo a los requerimientos del hongo y el
insecto a evaluar. Así mismo se deben hacer observaciones diarias hasta que
muera el 100 % de la población o por un periodo suficiente e igual para todos los
tratamientos, con el objeto de mantener un registro acumulado del desarrollo de la
enfermedad y mortalidad del hongo y de esta manera determinar su virulencia a
través del Tiempo Letal 50 (TL50) (Cañedo y Ames 2004).
La mortalidad del tratamiento testigo, es decir los insectos tratados con agua
destilada estéril, no debe ser mayor al 10 % ni éstos deben presentar signos de
micosis. La mortalidad de los tratamientos debe ser corregida mediante algunas
de las fórmulas existentes, como la de Abbott (Cañedo y Ames 2004).
% mortalidad tratamiento - % mortalidad testigo MC = X 100
100 - % mortalidad testigo
1.10 ASOCIACIÓN DE LAS HORMIGAS CORTADORAS CON HEP
Son pocos los trabajos que se han llevado a cabo sobre la diversidad microbiana
asociada a las hormigas y en particular, de las hormigas cortadoras de hojas. Sin
31
embargo, se han registrado algunos estudios (Samson et al. 1988; Currie et
al.,1999; Currie et al., 2001; Currie et al., 2003) sobre la presencia de
entomopatógenos asociados o infectando las hormigas, como son Metarhizium
anisopliae aislado de la reina de Atta sexdens rubropilosa (Alves y Sosa 1983),
Beauveria bassiana en las hormigas obreras de Atta sexdens piriventris (Diehl-
Fleig et al. 1992b) e igualmente fue aislado Metarhizium anisopliae de una reina
de la especie Atta cephalotes Lopez et al. (1999).
Las hormigas arrieras tienen como mecanismo de defensa, la limpieza
permanente del hongo simbionte del cual se alimentan y del hormiguero para
evitar el crecimiento de microorganismos antagónicos y/o patógenos de las
hormigas que afecten la supervivencia del hongo y por ende de las hormigas
cortadoras (Currie et al., 2003). Los desechos de hormigas (animal=hormigas y
larvas muertas, vegetal y hongo simbionte) dependiendo de la especie de
hormiga, son depositados en un basurero interno (Ej: Atta cephalotes) o externo
(Ej: Atta colombica) Holldobler y Wilson (1996). Dentro de estos desechos se
desarrollan una gran cantidad de microorganismos micopatógenos y
entomopatógenos cuya fuente es el hongo simbionte del cual se alimentan las
hormigas cortadoras. (Currie et al., 2003). Es por esto que el presente trabajo
pretende aportar información sobre el potencial de virulencia de cepas de hongos
entomopatógenos aisladas de los desechos producidos por la especie Atta
colombica e individuos muertos tanto de Atta colombica como de Atta cephalotes
en el departamento del Chocó, sobre hormigas cortadoras de hojas de la especie
Atta colombica provenientes de la misma región.
1.11 BIOENSAYOS CON HORMIGAS CORTADORAS DE HOJAS CON HEP
Las hormigas arrieras cortadoras de hojas (Atta spp y Acromyrmex spp), son una
de las plagas económicamente más perjudiciales en la agricultura, consideradas
entre las más importantes de Suramérica y Centroamérica, las cuales para su
control han presentado grandes complicaciones, principalmente por el
32
comportamiento alimenticio nocturno del adulto, su adaptación a diferentes
ecosistemas, la compleja composición social y la ineficacia de los insecticidas
químicos, los cuales se han limitado debido a su contaminación ambiental y
baja especificidad (Butt et al 2001; Lemus et al 2008). Por esto, es necesario el
desarrollo de nuevos métodos y productos para el control de la hormiga, tal como
el uso de enemigos naturales, entre los que se encuentran los hongos
entomopatógenos (López y Orduz 2003; Lemus et al 2008; Pérez 2009).
Entre los HEP mas usados para el control de las hormigas cortadoras de hojas, se
destacan aislamientos de los HEP Metarhizium anisopliae y B. bassiana
Particularmente merece destacar los aislamientos obtenidos por López et al.
(1999) de una hormiga reina muerta de Atta cephalotes, los cuales fueron
evaluados tanto en laboratorio como en campo con resultados de mortalidad del
100% Lopez y Orduz (2003).
Otro estudio importante ha sido desarrollado por Quiroz (1996) citado por Boaretto
y Forti (1997), quien evaluó aislamientos de M. anisopliae, y B. bassiana,
destacando la patogénicidad de algunos aislamientos de este último en el control
de reinas de A. mexicana, la cual es originaria de México.
En un estudio similar desarrollado en la región del Choco por Escobar et al.
(2002), se evaluó el efecto de aplicación de hongos comerciales de B. bassiana,
M. anisopliae y T. lignorum en forma de cebos preparados con hojuelas de avena
y jugo de naranja sobre la actividad de forrajeo de hormigas arrieras (A. colombica
y A. cephalotes). Estos insectos disminuyeron la actividad desde la primera a la
séptima semana después a la aplicación, aunque posteriormente la actividad de
corte se reanudo con gran intensidad. De acuerdo con los autores, esta respuesta
es posiblemente el resultado de la composición sobre la cual fueron fabricados los
cebos para la comercialización de los productos biológicos, sumado a las
condiciones especiales del Chocó, por lo cual recomiendan que los hongos
33
evaluados pueden ser utilizados como un componente dentro de una estrategia de
manejo integrado de la hormiga arriera. Sin embargo, en dicho estudio los autores
recomiendan identificar cepas nativas que garanticen una mayor eficacia y menor
inversión de recursos económicos.
Posteriormente, López y Orduz (2003), evaluaron aplicaciones en laboratorio y
campo, empleando cebos (hojuelas de trigo y jugo de naranja) que contenían M.
anisopliae cepa M-137 y T. viride, cepa T-26 antagonista del hongo simbionte de
A. cephalotes y una combinación de ambos. En este estudio en los experimentos
desarrollado bajo condiciones de laboratorio, el control de los hormigueros a los
que se les aplicó cualquier tratamiento de hongos fue 100% efectivo. En
condiciones de campo, la eficacia en el control de los cebos con los hongos se
comparó con el producto químico Metil Pirimiphos (Arrierafin) aplicado con bomba
insufladora. Las hormigas no detectaron los agentes fúngicos contenidos en los
cebos que introdujeron a sus nidos y no se detectaron comportamientos de
rechazo. Todos los tratamientos fueron medidos teniendo en cuenta el número de
hormigas que pasaban por un punto determinado durante un minuto y por una
semana, antes y después de aplicar los tratamientos. La mortalidad de los
hormigueros tratados con cebos que contenían M. anisopliae y la combinación de
los hongos (M. anisopliae combinado con T. viride) el control fue del 100% y en el
tratamiento con T. viride únicamente la mortalidad fue del 80% en tanto que con
Methil-pirimiphos la efectividad fue del 60%. Esto muestra el potencial del
desarrollo de estrategias de control biológico de la hormiga arriera especialmente
cuando están acompañadas por estrategias que se complementan en su
mecanismo de acción.
Banderas (2004) determinó la efectividad de T. harzianum y B. bassiana para el
control de A. colombica y el efecto antagónico de T. harzianum sobre el hongo del
cual se alimentan las hormigas L. gongylophorus y los resultados de estos
comparado con Malation. Este trabajo fue realizado bajo condiciones de
34
laboratorio sobre hormigas soldados y reinas. Para esto, se colectaron en campo
cuatro colonias activas de hormigas de la especie A. colombica, con su respectivo
hongo simbionte y las diferentes castas de hormigas presentes en el hormiguero al
momento de la colecta. Cada muestra colectada fue homogenizada mezclando el
hongo y las castas, posteriormente se extrajeron cuatro muestras de 300 gramos
(g) y depositadas en baldes plásticos individuales de 20 cm de diámetro por 35
cm de altura. Cada muestra correspondía a una unidad experimental. De la
muestra de 300 g, se extrajeron 100 g de hongo más las castas, de la cual se
contó el número de obreras y de estas se extrapoló la cifra a los 300 g de cada
tratamiento.
Utilizando una bomba de espalda para la aplicación de cada uno de los
tratamientos, para cada producto se agregaron 4g de cada producto en
recipientes que fueron cubiertos con una malla metálica para evitar la salida de los
individuos. Durante las evaluación de los tratamientos los insectos muertos eran
extraídos y depositados en condiciones de cámara húmeda previamente
esterilizada para la determinación de la presencia del hongo B. bassiana sobre el
insecto.
Teniendo en cuenta los trabajos anteriormente expuestos, esta investigación
pretendío obtener aislamientos de hongos entomopatógenos a partir de los
desechos producidos por las hormigas cortadoras de hojas de la especie A.
colombica e individuos muertos de la misma especie y de la especie A.
cephalotes. Hongos que una vez aislados y purificados serán evaluados para
determinar la actividad entomopatogénica sobre individuos de las castas
cortadoras de la especie A. colombica bajo condiciones de laboratorio, como un
primer paso necesario para el desarrollo futuro de una estrategia de manejo de la
hormiga arriera para la región.
35
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El Chocó Biogeográfico es reconocido a nivel mundial por sus altos niveles de
biodiversidad de especies vegetales y animales gracias a sus condiciones
ambientales particulares. Lo anterior hace pensar que existe igualmente un amplio
potencial en términos de la biodiversidad de la microbiota asociada a esta región,
la cual se debe estudiar con el objeto de poder darle un valor agregado a dicha
biodiversidad para que deje de ser un recurso potencial y empiece a ser un
recurso explotable para la región, particularmente en el marco de la identificación
de cepas nativas de HEP para el control de insectos plagas propios de la región.
Para el control de las hormigas cortadoras de hojas se han usado principalmente
insecticidas químicos, trayendo como consecuencia de selección de individuos
resistentes, resurgencia de nuevas plagas, contaminación ambiental, toxicidad al
hombre y la presencia de residuos químicos en los lugares de aplicación; situación
que ha llevado a la búsqueda de productos no perjudiciales (Cañedo y Ames
2004) y considerar los programas de control microbiológico, basados en la
búsqueda de cepas entomopatogenicas capaces de infectar y causar mortalidad
en corto tiempo a un grupo específico de insectos (López y Orduz, 2003; Pérez,
2008).
En las áreas agrícolas del departamento del Chocó, la importancia económica
de la hormiga arriera está relacionada con el daño que ocasionan a las plantas
cultivadas y que consiste en su defoliación parcial o total, donde más del 50%
de las especies vegetales presentes en las áreas agrícolas son forrajeadas con
una mayor preferencia por los cultivos que se encuentran en las fincas
tradicionales, huertos, azoteas (Escobar et al., 2002).
36
Aunque en Colombia no se han cuantificado las perdidas económicas que
ocasiona este insecto, en regiones como Antioquia, el Amazonas y el
departamento del Chocó, dados los efectos devastadores de las hormigas sobre
los cultivos, recientemente se han venido realizando esfuerzos con alternativas de
control, algunas de las cuales pueden ser consideradas de bajo impacto en el
ambiente (limpias) amigables y económicas, como es el caso de enemigos
naturales contra las hormigas cortadoras. Es así como investigaciones realizadas
por; García y Palacios, (2006); Escobar et al., (2002); Van, (2006); Agudelo,
(2007); Roa y Roldan, (2007); Madrigal y Yepes, (1997); López y Orduz, (2003)
han registrado resultados promisorios como alternativa para el control de este
insecto.
Ante esta realidad el control biológico a través de los HEP constituye una
herramienta viable como agentes con un gran potencial contra las hormigas
cortadoras de hojas Atta colombica y libre de riesgo para el hombre y el ambiente
(López y Orduz, 2003).
En la región chocoana hasta el momento no se han realizado estudios sobre la
presencia de microorganismos patógenos de insectos plagas, específicamente
asociado a las hormigas cortadoras de hojas que son el principal limitante de la
producción agrícola de los sistemas productivos del Chocó. Es por esto que este
trabajo es el primer paso para la obtención de aislamientos de HEP nativos con
alta capacidad de virulencia presentes en las áreas agrícolas del departamento y
que están adaptados a las mismas condiciones ambientales en las que se
encuentra este insecto, como una alternativa que pueda ser evaluada en sus
diferentes formas e implementada para el manejo de la hormiga arriera.
37
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Realizar aislamientos y caracterización de cepas de hongos entomopatógenos
nativos del departamento del Chocó, con capacidad bioplaguicida sobre hormigas
cortadoras de hojas de la especie Atta colombica (G) provenientes de la misma
región.
3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Realizar aislamientos de hongos entomopatógenos nativos presentes en
sistemas de producción agroforestal del departamento del Chocó, municipio
de Lloró, a partir de los desechos de la hormiga Atta colombica (G) e
individuos muertos de Atta colombica y Atta cephalotes.
Determinar la actividad entomopatogénica de las cepas de hongos
entomopatógenos obtenidas en condiciones de laboratorio.
Determinar el Tiempo Letal 50 (TL50) y la Concentración Letal 50 (CL50) de
las cepas de hongos más promisorias con el objeto de medir su virulencia
sobre individuos de hormigas cortadoras de hojas.
Realizar la descripción taxonómica a nivel de género de las cepas de
hongos evaluadas con mayor capacidad de virulencia sobre los individuos
de Atta colombica (G).
38
4. HIPÓTESIS DE INVESTIGACIÓN
Existen cepas de hongos entomopatógenos nativos presentes en los basureros de
los nidos de Atta spp y/o los desechos de Atta colombica asociados a los sistemas
productivos de importancia agrícola, que despliegan alta actividad patogénica
sobre la hormiga arriera Atta colombica originaria de la región chocoana.
39
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. LOCALIZACIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO
El trabajo se realizó en el Centro de Investigación Multipropósito “CMUTCH” de la
Universidad Tecnológica del Chocó, ubicado sobre la margen derecha del río
Atrato aguas abajo, a unos 10 minutos de la cabecera municipal de Lloró,
geográficamente está a 5º 30’52,37” de latitud Norte y a los 76º 33’33,15” de
longitud Oeste, pertenece a la zona de vida de Bosque Pluvial Tropical, con una
precipitación promedio anual de 6532,75 mm, humedad relativa alta-muy alta
(8.494 a 13.670 mm/año), temperatura megatermal superior (25,7 a 27,9 °C),
balance hídrico perhúmedo a superhúmedo (248,9 a 385,8 mm/año) (Rangel
2004), fueron transportados al Centro de Investigación en Agricultura Tropical
“CIAT” y en el cuarto de cría de insectos del laboratorio de Microbiología Agrícola
del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia “IBUN” sede
Bogotá (Anexo Nº 1).
5.2 MEDIOS DE CULTIVO
Los aislamientos de HEP fueron obtenidos utilizando medios selectivos
específicos para hongos: Sabouraud Dextrosa Agar (SDA Difco ® 65 g/L), Agar
Germen de Trigo (AGT infusión de 30gr de germen de trigo, 15 de agar-agar/L de
agua destilada estéril) y Papa Dextrosa Agar (PDA, Difco ®, 39 gr/L).
5.3 AISLAMIENTO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS
5.3.1 Obtención de muestras para el aislamiento de hongos
entomopatógenos. Para el aislamiento de los HEP se realizó la búsqueda e
identificación de 10 colonias de hormiga de A. colombica y 10 de las especie A.
40
cephalotes ubicadas en los diferentes sistemas de cultivos agroforestales
localizadas dentro del centro de estudio CEMUTCH. Una vez identificados los
hormigueros se localizaron los basureros, que es el lugar donde hormigas de la
especie A. colombica depositan los desechos provenientes de la colonia, los
cuales están compuestos por individuos muertos, residuos del hongo y residuos
de material vegetal, los dos últimos generados durante el proceso de limpieza del
jardín del hongo y de la colonia en general para evitar el crecimiento y desarrollo
de agentes extraños. En cada basurero de la colonia se tomó una muestra de los
desechos en un recipiente plástico con capacidad de 300 ml, tomando
aproximadamente 250 g por basurero.
De forma simultánea se localizaron hormigueros de A. cephalotes y en éstos se
realizó una exploración en los alrededores de la colonia en un perímetro
correspondiente a 2 m alrededor del hormiguero, con el objeto de hacer una
captura manual de individuos muertos. Los individuos muertos de las dos especies
de Atta y los desechos de A. colombica fueron depositados en recipientes
plásticos y trasportados al laboratorio para el aislamiento de los HEP.
5.3.2. Aislamientos de HEP desde individuos muertos. Una vez obtenido el
material biológico compuesto por cadáveres colectados de los alrededores o de
los desechos de la colonia para A. cephalotes y A. colombica respectivamente,
este fue transportado al Centro de Investigación en Agricultura Tropical “CIAT”,
ubicado en la ciudad de Palmira – Valle, con el objeto de ser procesado en el
laboratorio de Manejo Integrado de Plagas y Control Biológico. Una vez allí cada
individuo fue desinfectado con hipoclorito de sodio al 1% durante 1 minuto.
Seguido, fueron lavados utilizando abundante agua destilada estéril, para la cual
se depositó un individuo por caja de Petri. Posteriormente cada individuo fue
lavado nuevamente con agua destilada por tres veces, cambiando el recipiente
cada vez, luego, los insectos fueron levemente secados con toallas de papel
estériles y dispuestas en cajas de Petri previamente preparadas en condiciones de
41
cámara húmeda, con el fin de mantener una humedad relativa elevada y favorecer
el crecimiento del hongo. Las cajas así preparadas fueron colocadas en
incubación a 28oC por un tiempo máximo de 10 días hasta observar el desarrollo y
esporulación del hongo sobre el insecto. Los insectos con micosis fueron extraídos
de la cámara y con la ayuda del estereomicroscopio y una pinza entomológica de
punta fina, se extrajo de forma cuidadosa una porción del hongo que crecía sobre
el insecto con el objeto de hacer el aislamiento en medio de cultivo PDA para
incubarlo a 25ºC durante 7 días (Ver anexo 3). Los hongos inoculados fueron
revisados diariamente para descartar a tiempo posibles contaminantes,
garantizando así el crecimiento y obtención del hongo puro.
5.3.3. Aislamientos de HEP desde los desechos de A. colombica. Para
aislamiento de los hongos de los desechos de A. colombica se utilizó como
estrategia de aislamiento de HEP insectos trampa de larvas de la polilla mayor de
la cera (Galleria mellonella, suministradas por el “CIAT”). Estos insectos fueron
seleccionados ya que son altamente susceptibles a especies de hongos y
nemátodos entomopatógenos (Vanninen, 1997). Se tomaron muestras de los
desechos de A. colombica, luego se depositaron dentro de un vaso de plástico de
8 onzas (200 g de suelo), en esta cantidad de suelo se depositaron cinco
individuos de G. mellonella por muestra), el vaso así preparado se tapó y se
invirtió en repetidas ocasiones con el objeto de favorecer el movimiento de las
larvas al interior de los vasos, para así lograr una mayor infección de los insectos
trampa. Posteriormente, los vasos se cubrieron con bolsas plásticas negras y se
llevaron a un cuarto oscuro a 25ºC durante 7 días siguiendo la metodología de
Hatting et al. (1999). Pasado este tiempo, las larvas se recuperaron y se
desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% por 3 minutos. Luego estas fueron
lavadas con abundante agua destilada estéril por tres veces consecutivas en
recipientes plásticos diferentes y finalmente las larvas fueron secadas con toallas
de papel estéril. Seguidamente las larvas fueron pasadas a cámara húmeda para
la estimulación y crecimiento de los hongos.
42
A las larvas que presentaron micosis se procedió a hacer el aislamiento del HEP
en medio PDA, siguiendo el procedimiento descrito antes. Para garantizar que
cada uno de los aislamientos obtenidos estuvieran puros, unas vez aislados se
realizó un repique final en medio de cultivo PDA o SDA para finalmente llevar a
cabo la conservación de los hongos, mediante el almacenamiento de las esporas
en viales previamente preparados con agua destilada estéril a uno temperatura de
-70°C y mediante el procedimiento de almacenamiento en papel filtro estéril
siguiendo el procedimiento estándar del CIAT a una temperatura de 4°C. Este
procedimiento brevemente consiste en el crecimiento del hongo que se desea
almacenar en trozos de papel filtro Watman No. 1. De esta forma el papel es
esterilizado y partido en cuadros pequeños para ser dispuestos de forma uniforme
en cajas de petri con medio PDA. Posteriormente sobre el papel filtro se disponen
trozos de agar con el HEP que se desea almacenar, teniendo cuidado de colocar
la cara inoculada del agar en contacto con el papel filtro. Una vez realizado el
montaje estos se colocan en la incubadora a 25oC con el objeto de llevar a cabo el
crecimiento del hongo sobre el papel filtro durante un periodo de 10 días. Luego
los trozos de papel con el hongo son extraídos del medio de cultivo para ser
depositados en una caja de Petri vacía y llevados nuevamente a la incubadora
para que realicen un secado completo de 8 a 12 días. Una vez secos los papeles
con la biomasa fúngica, fueron depositados en sobres de papel Glicin o mantequilla
previamente esterilizados depositando por caja máximo 12 trozos de papel con el
hongo. A cada sobre se le asignó un código respectivo de almacenamiento en el
CIAT y en el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia
“IBUN”, donde se encuentran una copia de la colección de trabajo de este estudio
(Ver anexo 4).
43
5.4. CAPTURA, ESTABLECIMIENTO Y MANTENIMIENTO DE LA COLONIA
ENTOMOLÓGICA EN LABORATORIO: HORMIGA REINA, OBRERAS Y
HONGO SIMBIONTE DE Atta colombica.
5.4.1. Captura de los hormigueros de A. colombica. Con el objeto de llevar a
cabo la captura de los hormigueros que serian llevados al IBUN para el
establecimiento de la colonia de A. colombica, se realizaron exploraciones en
campo en zonas aledañas a áreas cultivadas. Allí se seleccionaron hormigueros
jóvenes (con uno o dos orificios o bocas de entrada) y una vez localizados se
excavaron y extrajeron del hormiguero (utilizando una pala y guantes quirúrgicos
al momento de la captura) la reina, porción del hongo simbionte y la mayor
cantidad de individuos de diferentes castas de A. colombica. Posteriormente los
individuos fueron depositados en recipientes plásticos de cierre hermético para su
traslado al cuarto de cría de insectos del Instituto de Biotecnología de la
Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, el cual cuenta con temperatura
estable controlada de 28ºC y Humedad relativa de 68% y un fotoperiodo de 12:12
luz/oscuridad, aunque los hormigueros fueron cubiertos con cartulina negra para
disminuir el exceso de luz. En este lugar se establecieron los hormigueros para
llevar a cabo los diferentes ensayos (Ver anexo 5).
5.4.2. Establecimiento del hormiguero en laboratorio. Se colectaron dos
hormigueros, cada uno con una hormiga reina con su respectiva población y
hongo simbionte, cada hormiga fue dispuesta en cámaras artificiales siguiendo la
metodología descrita por López et al., (1999) y Serna y Correa (2003). En este
contexto se utilizaron dos cámaras de arcilla destinadas una para la disposición
de los desechos producidos en el hormiguero y otra para el área de forrajeo del
material vegetal y dos recipientes plásticos (modificados) para la cría del hongo,
alojamiento de la reina y las obreras.
44
Las cámaras instaladas fueron diseñadas utilizando bases de arcilla de 22 cm de
alto y 4 cm de grueso, barnizadas en su exterior con el fin de mantener la
humedad interna. Luego se pegaron cilindros transparentes de acrílico de 3 mm
de espesor x 20 cm de diámetro x 20 cm de altura sobre la base de arcilla.
Posteriormente se colocaron tapas de vidrio transparente de 4 mm de grosor para
cubrir la superficie de los cilindros de acrílico, y finalmente se colocaron
mangueras plásticas transparentes de 2 cm de diámetro con el fin de conectar las
cámaras entre sí y estas con los recipientes plásticos a través de orificios
dispuestos en la parte inferior de cada cámara para facilitar el desplazamiento
interno de las hormigas (Figura 1).
Figura 1: Montaje del establecimiento de la colonia de Atta colombica en el
IBUN
Foto; Mena 2009
La cepa entomológica de ambas colonias de hormigas desarrolladas en el IBUN,
fueron determinadas taxonómicamente como pertenecientes a la especie A.
colombica mediante la utilización de la clave de Mackay y Mackay (1986), así
como la comparación con ejemplares del museo entomológico de la Facultad de
Agronomía de la Universidad Nacional sede Bogotá. Finalmente la determinación
taxonómica de ambas colonias fue corroborada gracias a la colaboración del
45
Doctor Fernando Fernández del Instituto de Ciencias de la Universidad Nacional
de Colombia sede Bogotá.
Una vez los hormigueros se establecieron en el laboratorio, estos se dejaron
durante 8 días sin suministrarle ningún tipo de material vegetal para evitar que se
llevaran acabo labores de forrajeo y de esta forman se concentraran en organizar
la nueva colonia, y así pasar la etapa de estrés ocasionada por el traslado de
campo al laboratorio.
Con el fin de establecer y aumentar la población de individuos que serían
utilizados en las pruebas de patogénicidad, se evaluó la preferencia de tres
especies vegetales que según Escobar et al. (2002), son las preferidas por las
hormigas para el forrajeo en condiciones naturales, De esta forma se
suministraron diariamente trozos de hojas de marañón (Syzygium malaccense),
yuca (Manihot esculenta Crantz) y plátano (Musa balbisiana) cortados en trozos
pequeños con un saca bocado para facilitar el acarreo de una mayor cantidad de
material vegetal. Es importante mencionar que el material vegetal era previamente
lavado con agua destilada estéril y una solución de hipoclorito de sodio al 0.5 %,
como estrategia para evitar el transporte de agentes extraños a la colonia. De
cada una de las hojas de las especies vegetales mencionadas se les agregó 100 g
para su forrajeo, suministrando nuevamente igual cantidad de material vegetal
dependiendo de la apetencia de forrajeo de las hormigas sobre cada especie
evaluada.
Los hormigueros fueron limpiados cada 4 días en cada una de las cámaras, utilizando
hipoclorito al 1%, solución jabonosa y agua destilada estéril, momento en el cual los
residuos de material vegetal del hongo y los individuos muertos eran extraídos.
Durante el mantenimiento de los hormigueros se pudo determinar que la especie
de mayor acarreo por las hormigas cortadoras fue la yuca (M. esculentum C), con
46
300 gr de trozos de hoja diariamente. Las otras dos especies (marañon y plátano)
no excedieron la cantidad mínima de 100 gr suministrada al momento del
establecimiento del hormiguero. De esta forma para el forrajeo y cultivo del hongo
por las hormigas se suministraron hojas frescas de yuca (M. esculenta), marañon (Z.
malacensi) y hojuelas de avena, las cuales resultaron ser de gran apetencia por las
hormigas y de respuesta positiva en el crecimiento de la colonia, manifestado por el
aumento progresivo de la población.
El suministro del material vegetal a las hormigas se realizó de la siguiente forma:
al iniciar la etapa de establecimiento del hormiguero se agregó 100g de cada una
de las plantas arriba mencionada durante tres veces al día, en los horarios de
9:00am, 2:00pm y 6:00pm, a cada hora de aplicación la cantidad de material
vegetal fue suministrado dependiendo de la actividad (mayor o menor acarreo de
material vegetal) de las hormigas, en la mayoría de los casos fue necesario
suministrarles de tres a cuatro veces mas (300 a 400g) hojas de yuca por ser la
especie de mayor acarreo para el cultivo del hongo. De acuerdo a lo anterior las
hormigas estarían forrajeando semanalmente un total de 2.000 a 2.800 g de hojas
de yuca para el cultivo de hongo del cual se alimentan.
Durante el desarrollo del presente trabajo se utilizaron un total de 2.440 individuos
de hormigas para todos los bioensayos, En la evaluación con los primeros 21
aislamientos de hongos se utilizaron 1.280. Seguida de estas, se evaluaron los 6
aislamientos que mayor mortalidad presentaron, para los cuales se utilizaron 360
individuos y por último la evaluación para la determinación de la concentración
letal media de los dos mejores aislamientos y estos comparados con un control
positivo con 5 concentraciones por cada aislamiento, para un total de 900
individuos para esta prueba. Merece mencionar que a pesar de la presión que se
ejercía en los hormigueros con la extracción permanente de hormigas para el
ensayo, la cantidad de hormigas aproximados que la reina mantuvo disponible
47
durante el tiempo de evaluación fue entre 300 a 360 cada 3 a 4 días, es decir de
600 a 720 por semana.
5.5. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENTOMOPATOGÉNICA DE LOS
AISLAMIENTOS NATIVOS.
5.5.1. Reactivación de los aislamientos. Los aislamientos seleccionados fueron
reactivados sobre las castas de mayor tamaño de A. colombica las cuales se
encuentran en la parte externa del hormiguero, razón por la cual fue seleccionada
dicha casta con el fin de potencializar la patogénicidad de los seleccionados. El
procedimiento de reactivación se realizó siguiendo las recomendaciones de
Álvarez et al. (2005) con algunas modificaciones.
Para la reactivación, se tomaron cinco individuos de la casta de hormiga arriera de
A. colombica, mencionada anteriormente, por cada aislamiento. Luego estos se
sumergieron en una suspensión de conidias de 1x107 en solución de Tween 80 al
0.03%, luego se depositaron en cajas de petri con papel filtro previamente
humedecido (1ml) con agua destilada estéril. Las hormigas muertas se llevaron a
cámara húmeda estéril e incubación a una temperatura de 25°C (Ver anexo 6).
Después de presentarse la esporulación del hongo sobre los individuos, estos se
extrajeron de la cámara húmeda y se sumergieron durante 30 segundos en
hipoclorito de sodio al 0.5%. Posteriormente el insecto fue lavado con abundante
agua destilada estéril por tres veces consecutivas, secado con toallas
debidamente esterilizadas y llevados a siembra directa en las respectivas cajas de
Petri con medio de cultivo SDA y AGT, donde se incubó el insecto completo o una
parte de esté (patas, antenas), que presentara un buen crecimiento del hongo,
luego las cajas de Petri fueron incubadas a una temperatura de 25ºC, hasta
obtener el crecimiento del hongo nuevamente.
A los individuos que desarrollaron micosis prominente se les realizó un aislamiento
48
del hongo con la ayuda del estereomicroscopio y utilizando un asa de punta fina
entomológica para tomar de forma cuidadosa una porción del hongo esporulado
para ser sembrado sobre las cajas de petri con medios de cultivo SDA y/o AGT e
incubadas a 25°C en oscuridad, hasta obtener una adecuada esporulación. Los
hongos así obtenidos fueron considerados cultivos de HEP reactivados listos para
el bioensayo.
5.5.2. Obtención del cultivo para el Bioensayo. A partir de los cultivos
reactivados se multiplicó cada aislamiento en medio AGT el cual fue el medio con
mejores resultado para la obtención de biomasa, siguiendo la metodología de
Aponte y Uribe (1999). Dichos aislamientos fueron denominados como primer
repique y empleados para las pruebas de actividad entomopatogenicas (López et
al, 1999; Daoust et al. 1982; Aponte y Uribe 1999; Álvarez 2005). Los Cultivos
esporulados de cada HEP fueron recuperados en una solución de Tween 80 al
0,03%, agitada por 15 minutos y luego se determinó la concentración de conidias
utilizando la cámara de Nuebauer, haciendo diluciones hasta obtener una
concentración de 1x107 conidias/ml de la suspensión respectiva para el bioensayo
(Ver anexo 6).
5.5.3. Evaluación de los aislamientos de hongos entomopatógenos. Este
procedimiento se realizó teniendo en cuenta la metodología de Staples y Milner
(2000) y Álvarez et al., (2005). Por cada aislamiento de hongo obtenido se
emplearon 20 individuos por triplicado para un total de 60 individuos por
tratamiento. Al momento del contacto de las hormigas con la superficie conidial, se
agregó en una caja de Petri ocho mililitros de la suspensión de esporas a 1x107
conidias/ml. Luego fueron dispuestas 20 hormigas de las castas cortadoras por
cada caja de Petri durante un minuto con el objeto de favorecer el contacto tarsal
de las hormigas con la suspensión conidial; después de este tiempo se
depositaron las hormigas en un embudo con rejilla de donde fueron colocadas las
hormigas, a las cajas de Petri definitivas las cuales estaban preparadas con papel
49
filtro previamente humedecido con 1ml de agua destilada estéril. Este
procedimiento fue repetido para cada una de las cepas de hongos que fueron
evaluados.
Durante la evaluación del bioensayo, se determinó el porcentaje de mortalidad
acumulada mediante el reporte diario de los individuos muertos haciendo
evaluaciones cada 24 horas por 10 días consecutivos con el objeto de medir la
virulencia de cada aislamiento a través del tiempo letal 50 (TL50). Así mismo se
observó cada 24 horas el desarrollo de micosis, partiendo del momento en que los
individuos muertos eran dispuestos en las cajas de petri bajo condiciones de
cámara húmeda.
Los aislamientos que presentaron los mejores resultados en las primeras pruebas
de patogénicidad, fueron repetidos en el tiempo siguiendo la misma metodología
descrita antes junto con el control positivo M-137, (correspondiente a una cepa de
Metarhizium anisopliae, prestada amablemente por el Dr. Sergio Orduz de la
Corporación para Investigaciones Biológicas de Medellín “CIB”) y como testigo
absoluto se empleo agua destilada estéril. Durante las evaluaciones diarias se
disponían 1ml de agua destilada estéril en las cajas de Petri con el objeto de
mantener las condiciones de la cámara húmeda y favorecer así la actividad del
hongo sobre los individuos infectados (Ver anexo 7).
5.6. CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50) DE LOS AISLAMIENTOS
PROMISORIOS.
Para realizar las pruebas de CL50 (Dosis de los hongos nativos vs control positivo
más virulenta sobre A. colombica) se tuvieron en cuenta los dos aislamientos
nativos de HEP que presentaran los mejores valores de patogénicidad en términos
de TL50 y micosis. Para este objetivo teniendo en cuenta la metodología de
Gutiérrez et al. (2005), se utilizaron cinco concentraciones 1x103, 1x104, 1x105,
50
1x106 y 1x107 conidias/ml, un control positivo (cepa de hongo entomopatógeno de
M. anisopliae M137 validada en pruebas anteriores) y el testigo absoluto. El
procedimiento de bioensayo se llevo a cabo siguiendo los lineamientos descritos
arriba para la determinación de la capacidad letal de los aislamientos. Se midió la
mortalidad diaria y acumulada de las hormigas cortadoras de A. colombica y la
verificación de muerte por micosis.
5.6 ANALISIS ESTADISTICO
Para el análisis de los datos en el bioensayo, los tratamientos se distribuyeron en
un Diseño Completamente Aleotorizado (DCA) con tres repeticiones. Cada
aislamiento evaluado, incluyendo el control positivo, correspondió a un tratamiento
con 60 individuos de la casta mayor de las cortadoras presentes al momento del
ensayo el cual fue dividido en tres replicas de 20 individuos cada una. Se utilizó un
análisis descriptivo, prueba no parametrica de Kruskal Wallis, uno de correlación
no parametrico de Spearman empleando el programa estadístico de SAS.
Posteriormente para las dos cepas con mayor capacidad de virulencia sobre los
individuos se calculó la concentración letal media (CL50) y el tiempo medio (TL50)
empleando un análisis a través del programa estadístico Probit.
51
6. RESULTADOS
6.1. AISLAMIENTO DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS (HEP)
Bajo el esquema metodológico planteado en la sección anterior, se emplearon 100
individuos muertos de hormigas arrieras para el aislamiento de HEP, (50 de A.
colombica, 50 de A. cephalotes). Así mismo se emplearon 50 individuos de larvas
de G. mellonella, como insecto trampa y de estos 48 fueron positivos en la
manifestación de algún tipo de patogénicidad, para los cuales se logró obtener un
total de 30 aislamientos puros provenientes de insectos con micosis de HEP. Es
así como de las muestras obtenidas de cadáveres de hormigas cortadoras
colectadas de las dos especies en campo, 23 lograron ser reaislados, 15 de
cadáveres de A. colombica y 8 de A. cephalotes. Para el caso de las larvas de G.
mellonella 28 de las muestras de los basureros presentaron patología y de estos,
7 larvas mostraron aislamientos con manifestación de micosis. La identificación
taxonómica de estos aislamientos permitió agruparlos en 4 géneros; 12
aislamientos de Metarhizium sp., 11 de Aspergillus sp., 3 de Fusarium sp., 1 de
Penicillium sp., y 3 aislamientos por identificar. Tabla 1.
Tabla Nº 1. Numero de HEP asociados a individuos de Atta sp., y los desechos producidos por Atta colombica del municipio de Lloró – Chocó.
Sp HEP X Fuente
Metarhizium sp. (*)
Aspergillus sp. (+)
Fusarium sp (�)
Penicillium sp (�)
sp. (�)
Total de aislamientos
Cadáveres de Atta colombica 5 6 3 - -
14
Desechos de Atta colombica 4 2 - 1 1
8
Cadáveres de Atta cephalotes 3 3 - - 2
8
Total 12 11 3 1 3 30 * = Reactivación de los 12 aislamientos � = Reactivación de 3 aislamientos 1 de cada fuente + = Reactivación de 3 aislamientos. Sp = individuos de HEP no identificados taxonómicamente
52
Los aislamientos de los géneros Metarhizium sp., y Aspergillus sp., fueron aislados
tanto de los cadáveres de hormigas de ambas especies y de los desechos de los
basureros de Atta colombica, lo cual puede dar cuenta del asocio de estos
microorganismos entomopatógenos a las colonias de hormigas cortadoras. Es así
como el 50% de los aislamientos fueron obtenidos a partir de la hormiga A.
colombica, el 26,67% para A. cephalotes y el 23,33% de los desechos producidos
por A. colombica Tabla 1 y 2.
6.2. INDETERMACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENTOMOPATOGÉNICA DE LOS
AISLAMIENTOS DE HEP.
De las 30 cepas de HEP obtenidos en este estudio en la fase de aislamiento,
únicamente 21 lograron ser reactivados presentando una mortalidad en individuos
de hormiga arriera y micosis positiva al ser dispuestos en cámara húmeda (Tabla
2). De acuerdo al diseño metodológico estos fueron los aislamientos
seleccionados para producción de biomasa en medio de cultivo AGT para pasar a
la siguiente fase del tamizaje consistente en el desarrollo del bioensayo para medir
porcentaje de mortalidad acumulada.
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yo
54
6.2.1. Mortalidad Acumulada. En la evaluación de los aislamientos que
presentaron mayor capacidad de virulencia contra individuos de la hormiga
cortadora Atta colombica en laboratorio, se pudo observar dos grupos en términos
de la capacidad bioplaguicida contra la hormiga arriera, claramente separados por
las diferencias altamente significativas. En primer lugar se encuentran los
aislamientos pertenecientes a los géneros Fusarium, Aspegillus y Penicillium en
segundo lugar están los aislamientos del género Metarhizium, siendo este último
el que mayor mortalidad acumulada de individuos presentó para cada uno de los
aislamientos evaluados (Tabla 3).
Tabla Nº 3. Relación del TL50 con el TM50 de los HEP nativos
Cepa % Mortalidad TL50/días % Mi TM50/días
Eficacia (Mortalidad Total Corregida)
H-M-03 100 1 100 2,6 100 H-M-05 100 2,2 100 4,5 100 H-M-06 100 2,9 100 3,7 100 H-P-7 40,0 9,5 0,0 �10 33,0
H-M-08 100 1,9 100 4,2 100 H-M-10 100 2,2 100 3,9 100 H-A-11 46, 7 10 16,7 �10 41,0 H-M-13 100 2,5 100 4,3 100 H-F-14 38,3 >10 18,3 �10 31,0 H-M-15 100 2,7 100 3,1 100 H-M-16 100 2,4 100 4,4 100 H-A-19 35,0 >10 0,0 �10 28,0 H-A-20 33,3 >10 0,0 �10 26,0 H-F-22 41,7 >10 31,7 �10 35,0 H-M-23 100 2,9 100 5,1 100 H-M-26 100 2,2 100 4,2 100 H-M-27 100 2,6 100 4,3 100 H-M-28 100 2,7 100 3,2 100 H-F-30 35,0 >10 33,3 �10 28,0 H-Sp-1 93,3 9,78 21,7 �10 93,0 H-Sp-2 30,0 >10 28,3 �10 22,0
Cont. Posit (M-137) 100 2,7 100 3,3 100 Testigo absoluto 10 X X X 0,0 TL50= Tiempo letal 50 TM50= Tiempo micosis 50 %Mi= porcentaje de micosis�10 = Mayor a diez días de mortalidad o micosis. H-M-03 y H-M-08 más entomopatogénica
55
La patogenicidad obtenida con los diferentes aislamientos, fue evaluada a partir del
porcentaje de mortalidad acumulada y la micosis desarrolla en los individuos muertos,
variables empleadas como criterio de selección de las cepas con mayor
manifestación de laenfermedad sobre individuos de A. colombica en laboratorio.
Los análisis de resultados de mortalidad acumulada mostraron que las cepas nativas
de Metarhizium presentaron el 100% de mortalidad en comparación a las cepas de
los géneros Fusarium, Aspergillus y Penicillium, que presentaron datos de mortalidad
acumulada entre 30 y 47%. Merece destacar además el aislamiento sin determinar H-
sp-1 que presentó una mortalidad del 93% pero un TL50 más alto en relación a los
aislamientos de Metharrizium (Tabla 3). Igualmente es importante resaltar que el
testigo del ensayo (Individuos en caja de Petri con agua destilada estéril) nunca
mostró un porcentaje de mortalidad superior al 10%. (Tabla 3).
Los aislamientos nativos de Metarhizium evaluados en este estudio presentaron un
100% de efectividad patogénica sobre los individuos de A. colombica en condiciones
de laboratorio a los 2.9 días de evaluación. Aunque estos aislamientos no mostraron
diferencias significativas en términos de porcentaje de mortalidad con el control
positivo del mismo género, es importante resaltar que dos de estos obtuvieron una
diferencia menor en el TL50, con 1,9 día para el aislamiento H-M-08 y de 1,0 día para
H-M-03 (Tabla 3).
6.2.2. Tiempo de manifestación micosis. El tiempo de manifestación de micosis
de los individuos de hormiga con Metarhizium osciló entre el 2,6 día y el 5,1 día
después de su muerte bajo condiciones de cámara húmeda. Merece anotar que
para el tercer día después de la muerte más del 50 % de los individuos dispuestos
por cada tratamiento ya presentaban micelio del hongo entomopatógeno en todos
los aislamientos de Metarhizium incluyendo el control positivo.
56
La mortalidad acumulada y particularmente la presencia de un TL50 igual o menor
en relación con control positivo fue el criterio utilizado para la selección de los 6
aislamientos que continuaron con la siguiente etapa del ensayo, teniendo en
cuenta específicamente los aislamientos con un TL50 inferior a los 3 días y con
estos realizar la repetición en el tiempo. Tabla 4.
Tabla Nº 4. Segunda evaluación del TL50 y TM50 de los seis aislamientos de HEP nativos
Cepa %
Mortalidad TL50 % Mi TM50
Eficacia (Mortalidad Total
Corregida)
H-M-03 100 1,3 100 2,3 100
H-M-05 100 2,5 100 3,8 100
H-M-08 100 1,5 100 3,8 100
H-M-10 100 3 100 4,5 100
H-M-16 100 3,4 100 4,3 100
H-M-26 100 2,5 100 4,5 100
C.P: M-137 100 2,7 100 3,5 100 TL50= Tiempo letal 50 TM50= Tiempo micosis 50 %Mi= porcentaje de micosis a 10 días de evaluación H-M-03 y H-M-08 = aislamientos con mejor TL50 y micosis durante le ensayo
El análisis de correlación no paramétrico de Spearman mostró una alta correlación
(0.99) entre la mortalidad y micosis con respecto al tiempo, lo que indica además
de una alta capacidad patogénica de los aislamientos seleccionados una buena
capacidad del inoculo para multiplicarse en el organismo hospedero.
Los resultados de la evaluación del potencial bioplaguicida en términos de % de
mortalidad indican que las 12 cepas nativas de Metarhizium presentaron una
capacidad de virulencia alta sobre individuos de A. colombica logrando todos un
57
TL50 menor o igual a 2,9 días con una mortalidad del 100% al quinto día de
evaluación, independientemente de su origen. La capacidad entomopatogénica de
los aislamientos fue significativa en términos de TL50 y TM50, donde el origen de
las cepas de estudio (asociación con cadáveres de insectos del blanco y con los
desechos producidos por los hormigueros de A. colombica) y la metodología de
reactivación de los mismo fue un factor protagónico en la respuesta obtenida.
Merece resaltar que 8 de los aislamientos nativos pertenecientes a este género
presentaron un TL50 inferior a la cepa control positivo (M. anisopliae M-137), cinco
de las cuales requirieron entre 1 y 2,2 días menos para lograr la muerte del 50% de
la población, tiempo que es fundamental al momento de definir la capacidad de
virulencia de un HEP. Este tiempo es esencial, particularmente para el desarrollo de
la enfermedad en insectos como las hormigas arrieras, ya que de esta forma se
aumenta la posibilidad de que un individuo infectado con un HEP desarrolle la
micosis al interior de la colonia, disminuyendo la capacidad de respuesta de la
misma a la infección por el HEP (Currie et al., 2003; St Leger 2007).
Los aislamientos H-M-03 y H-M-08 presentaron un TL50 menor que el presentado
por el control positivo (M-137) con más de un día de diferencia en la segunda
evaluación (con 1,2 día menos para el aislamiento H-M-08 y de 1,4 día para H-M-
03 para matar los individuos expuestos) y un tiempo de manifestación de micosis
entre 2,4 y 3,8 día después de su muerte, situación esta que resalta la capacidad
entomopatogénica de las cepas nativas para el control de las hormigas cortadoras
de hojas, como lo muestra la tabla 3 primera evaluación.
Considerando los resultados obtenidos en la primera evaluación se consideró la
realización de una segunda evaluación, pero solo con los aislamientos que
presentaron el menor TL50y TMM con relación al control positivo y así demostrar la
consistencia de los aislamientos en cuanto a su capacidad entomopatogénica
sobre A. colombica y la tabla 4 de la segunda evaluación que corrobora la
58
capacidad entomopatogénica de las seis cepas sobre los individuos de A.
colombica respectivamente.
6.3 CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50) DE LOS AISLAMIENTOS
PROMISORIOS
De acuerdo a los resultados descritos arriba, los aislamientos seleccionados para
la siguiente fase de evaluación consistente en la determinación de la DL50 fueron
los H-M-03 y H-M-08. El análisis de los resultados obtenidos en dichas pruebas
mostró un efecto de concentración respuesta para los tres aislamientos evaluados
(incluyendo el control positivo M137), donde a mayor concentración del inoculo se
presentó mayor mortalidad de individuos de A. colombica. Por otra parte, el
análisis Probit mostró que la CL50 para el aislamiento H-M-03 correspondiente a
1.12x106 y para H-M-08 de 1.16x106 conidias/ml no son estadísticamente
diferentes en relación con el control positivo M 137 con 1.04x106. Sin embargo, es
importante resaltar nuevamente la diferencia del TL50 menor expresado por los
aislamientos nativos potencialmente mejores con relación al control positivo, lo
que sugiere un mayor potencial entomopatogénico de estos aislamientos como se
explico anteriormente.
59
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1x10(3) 1x10(4) 1x10(5) 1x10(6) 1x10(7)
% d
e M
ort
ali
dad
Dosis Vs cepas
H-M-03
H-M-08
M-137
Concentración de esporas/ml
Figura Nº 2. Porcentaje de mortalidad de A. colombica vs concentración de conidias/ml del hongo utilizado con las cepas nativas y el control positivo
La figura 2 muestra los valores promedio de mortalidad acumulada (%) al último
día (10) de evaluación para los aislamientos nativos (H-M-03 y H-M-08) y el control
positivo (M-137) cada uno con cinco concentraciones diferentes de los HEP. Los
resultados mostraron como era de esperar un incremento de la mortalidad a
medida que aumenta la concentración de conidias de hongos. Los aislamientos
nativos al igual que el control positivo, alcanzaron el 100% de la mortalidad con las
concentraciones mayores de 1x106 y 1x107 mientras que las concentraciones
menores 1x103 1x104 y 1x105 no obtuvieron al día 10 el 50% de mortalidad de
individuos de hormiga arriera.
60
0
0,5
1
1,5
2
2,5
H-M-03 H-M-08 M-137
TL
50
Aislamientos con 1x10(6) Figura N° 3. TL50 de los aislamientos nativos vs control positivo con la concentración
1x106 conidias/ml sobre Atta colombica en condiciones de laboratorio
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
H-M-03 H-M-08 M-137
TL
50
Aislamientos 1x10(7) Figura N° 4. TL50 de los aislamientos nativos vs control positivo con la concentración
1x107 conidias/ml sobre Atta colombica en condiciones de laboratorio
61
La transformación Probit permitió determinar la concentración letal media (CL50) de
los dos (H-M-03 y H-M-08) aislamientos nativos más virulentos, para las cuales el
tiempo estimado en matar el 50% de individuos fue de 1,5 días para la
concentración 1x107 a 2,31 días para la concentración 1x106, los datos arrojados
comparados con el control positivo (2,35 días) no presentaron diferencias
estadísticas significativas (P<0,01) entre los valores de Concentración evaluadas
ver figura 3 y 4.
El comportamiento patogénico de los aislados H-M-03, H-M-08 y el control positivo
M-137 con relación a las concentraciones 1x106 y 1x107 demostraron que a mayor
concentración menor fue el tiempo del HEP en causar efecto patogénico sobre las
hormigas infectadas. Este estudio mostró una correlación directa entre la
Concentración de hongo utilizada y la mortalidad presentada por cada dosis,
encontrándose mayor mortalidad a concentraciones altas. Sin embargo es
destacable el comportamiento virulento de la cepa nativa H-M-03 para la
concentración 1x106 la cual presento un TL50 con una diferencia de 0,85 días,
más rápido que el control positivo en matar individuos de A. colombica.
62
7. DISCUSIÓN
La metodología empleada en este trabajo para el aislamientos de hongos
entomopatógenos nativos a partir de desechos de los basureros de colonias de la
hormiga Atta colombica, así como de individuos muertos de Atta colombica y Atta
cephalotes fue exitoso, permitiendo evidenciar la estrecha relación entre los HEP y
las hormigas cortadoras de hojas. La evaluación de la actividad biocontroladora de
los aislamientos obtenidos permitió detectar diferencias en la actividad
entomopatogénica de estos hongos, diferencias que han sido asociadas a las
variables de evaluación como el grupo taxonómico al que pertenece el HEP
aislado, la mortalidad acumulada, el TL50, tiempo de manifestación de micosis y
estimación de la CL50 de las dos cepas mas virulentas sobre individuos de la
hormiga aplicados en condiciones de laboratorio.
Por otra parte merece mencionar que en este estudio también se logró el
establecimiento bajo condiciones controladas de dos colonias de la especie A.
colombica partiendo de la información reportada por López et al. (1999) y Serna y
Correa (2003) para el establecimiento en condiciones de laboratorio de la especie
de hormiga Atta cephalotes. En otros estudios Rodriguez et al., (2004) evaluaron
individuos de los géneros Atta sp y Acromyrmex sp capturados al momento de la
evaluación sin su establecimiento en laboratorio. Por otra parte Banderas (2004)
realizó la captura de hormigas obreras de diferentes tamaño y el hongo simbionte
de A. colombica, llevado a laboratorio para evaluar la patogenicidad de hongos
entomopatógenos, sin previo establecimiento de los hormigueros bajo condiciones
controladas. Merece mencionar que de acuerdo a la revisión de literatura realizada
y de los reportes anteriormente expuestos, este es el primer reporte del
establecimiento de una colonia de A. colombica en condiciones artificiales, lo cual
fue un factor importante en la evaluación dentro de la metodología utilizada para la
63
determinación de la patogenicidad de los aislamientos nativos de HEP sobre esta
especie de hormiga.
Los hormigueros estudiados en este trabajo han sido asociados a diferentes
cultivos agroforestales de importancia agrícola para el departamento del Chocó y
para el municipio de Lloró. La hormiga arriera A. colombica esta asociada o
presenta mayor apetencia por especies vegetal como: la yuca, plátano, banano;
especies sobre las cuales este insecto ejerce una gran presión por la actividad de
forrajeo en los sistemas productivos de importancia agrícola (Escobar et al., 2002),
lo que pone de manifiesto la importancia de esta plaga en la zona. En este estudio
se tuvo en cuenta la apetencia de las hormigas por los cultivos anteriormente
expuestos bajo condiciones naturales para ser utilizados para su actividad de
forrajeo, mantenimiento del hongo y de los hormigueros en laboratorio.
Las pruebas de patogenicidad realizadas mostraron que los aislamientos nativos
del género Metarhizium, en especial de H-M-03 y H-M-08 son promisorios para el
control de la hormiga arriera A. colombica, con los que se puede plantear un
control efectivo de esta especie a pesar del comportamiento de limpieza
permanente que realizan las hormigas a la colonia y en especial al hongo
simbionte del cual se alimentan para evitar el crecimiento de organismos
patógenos como los HEP (Currie et al 2003), dado los bajos valores mostrados en
términos de la TL50 y TM50. El TL50 y el TMM (tiempo de manifestación de micosis)
obtenidos por las cepas nativas, es un factor importante para el control de insectos
sociales (Gutiérrez et al 2004) y en especial de las hormigas arrieras López y
Orduz (2003).
La presencia de HEPs asociados a las hormigas cortadoras de hojas (basureros
producidos por Atta colombica, individuos muertos de A. cephalotes y A.
colombica), pueden ser una respuesta de la actividad de limpieza constante del
jardín del hongo y de la colonia en general en la que se mantienen las hormigas,
64
como estrategia de defensa contra microorganismos patógenos que ponen en
riesgo el bienestar del hormiguero (Currie et al. 2003), de allí que esta sea un
reservorio y una fuente ideal especifica para la obtención de HEP con actividad
contra este insecto plaga (Hughes et al 2003; Curri et al 2003). De esta forma una
que una vez obtenidos y caracterizados como se hizo en este estudio se pueden
realizar aplicaciones e inundaciones a los hormigueros de los hongos nativos,
garantizando la proliferación y el control biológico de la hormiga arriera. Merece
resaltar que los resultados obtenidos en este estudio sugieren una gran
potencialidad de los aislamientos obtenidos en este sentido gracias a
patogenicidad y virulencia especialmente de los aislamientos H-M-03 y H-M-08.
El género Metarhizium, el cual ha sido reportado como biocontrolador en una gran
variedad de insectos plagas, entre las que se destacan las hormigas cortadoras de
hojas (Lopez y Orduz, 2003; Hughes et al. 2003; Rodriguez 2008), se obtuvo en
todas las fuentes evaluadas. Particularmente merece resaltar los desechos de Atta
colombica donde se presentaron el 57.2% de los aislados obtenidos, posiblemente
como resultado de las actividades de limpieza y mantenimiento constante del
jardín del hongo y de la colonia en general (Currie et al. 2003).
En este trabajo se aislaron cepas de hongos asociadas a desechos de basurero
de A. colombica e incluso a cadáveres de A. cephalotes de los géneros Fusarium
y Aspergillus. De acuerdo con Tanada y Kaya (1993) citado por Cañedo y Ames
(2004) estos géneros han sido asociados al grupo de los hongos
entomopatógenos para el control de plagas agrícolas diferentes al insecto blanco
objeto de estudio. El género Penicillium fue aislado de los desechos de A.
colombica y se evaluó el potencial de patogenicidad sobre individuos de esta
misma especie de hormiga bajo condiciones controladas de laboratorio. Aunque el
grado de patogenicidad obtenidos por Penicillium (equivalente al 40%) no alcanzó
un porcentaje de mortalidad de individuos significativo con relación a los
aislamientos de Metarhizium, es igualmente rescatable la capacidad patogénica de
65
este género sobre la hormiga arriera, del cual no se conoce un registro en insectos
plagas.
Si bien con la metodología utilizada los aislamientos lograron ser reactivados en el
insecto blanco, no mostraron una actividad entomopatogénica importante al
momento del tamizaje inicial. Sin embargo, dado que Peniillium no es una especie
de HEP reconocido, se podría decir que este género al igual que Fusarium y
Aspergillus mostraron un potencial interesante como controladores de las
hormigas cortadoras de hojas, ya que aunque no alcanzaron el 50% de mortalidad
si mostraron cierto grado de virulencia manifestado en la mortalidad acumulada
durante el tiempo de evaluación del ensayo, resultado que resalta la metodología
de reactivación de hongos sobre insectos de importancia agrícola. Los resultados
también permiten sugerir la gran capacidad de adaptación de los hongos
saprofiticos a los diferentes sustratos presentes en la naturaleza.
La respuesta patogénica de los aislamientos nativos de Metarhizium corrobora la
importancia de este género y su utilización en el control biológico de insectos
plagas (Butt et al., 2001; St Leger, 2007). Además de lo anterior, la respuesta
patogénica de las cepas nativas también se le suma la metodología de
reactivación de los HEP sobre el mismo insecto, lo cual indudablemente potencia
la capacidad bioplaguicida (Hebling et al., 2000, Currie et al., 2003),
Es destacable el tiempo medio y porcentaje de mortalidad de las doce cepas
nativas de Metarhizium, ya que nueve de las 12 cepas evaluadas,
correspondiente al 75%, presentaron un TL50 (tabla 3), menor al registrado por el
control positivo M137, confirmando nuevamente el potencial bioplaguicida de este
genero de HEP y particularmente de las cepas aisladas contra la hormiga arriera
(tabla 4).
66
La importancia de un corto TL50 para un HEP, reside en que entre más rápido
suceda el proceso de diseminación de la enfermedad dentro de la colonia, mas
contundente será el efecto sobre la misma (St Leger 2007), ya que las hormigas
durante su proceso de cuidado y limpieza del hongo simbionte desarrollan un
ambiente propicio para el crecimiento y proliferación de agentes extraños que
ponen en riesgo la supervivencia de la colonia (Holldobler y Wilson, 1996; Currie
et al., 2003; Pérez, 2009). Lo anterior resulta importante teniendo en cuenta el
comportamiento de las hormigas cortadoras como insectos sociales Holldobler y
Wilson (1996).
El tiempo de mortalidad de los hongos entomopatógenos evaluados presentó una
correlación positiva con el tiempo de esporulación en el insecto o manifestación de
micosis. De acuerdo con López et al, (1999); este hecho es importante y de gran
trascendencia, teniendo en cuenta a las hormigas cortadoras como insectos
sociales. Esta importancia reside en que la rápida mortalidad de los individuos,
sumado a la rápida capacidad de esporulación del inoculo inicial, aumenta la
posibilidad de proliferación de la enfermedad en un mayor numero de insectos
plagas en la población blanco generando epizootias, a través de programas de
control biológico de las hormigas cortadoras en las áreas agrícolas donde se
busca disminuir la presión que estas ejercen sobre los cultivos (Jiménez, 1992;
Butt et al., 2001; Hughes et al., 2004; St Leger, 2007).
Según St. Leger et al (1992), López et al.(1999), St Leger (2007), Metarhizium, es
un hongo patógeno de insectos que debido a las características del género en el
ámbito de hospedantes, patogénicidad, virulencia y condiciones ambientales, han
sido utilizados para el control de insecto plagas de diferentes grupos de insectos
incluyendo algunos sociales, (langostas, escarabajos, grillos, insectos hemípteros,
termitas etc), por la capacidad de adaptación sobre su hospedero, la rapidez para
ingresar y causar efecto letal en el mismo, por lo que ha sido determinado como
un organismo con características de especialista, o sea que existen algunos
67
linajes especializados que filogenéticamente pueden infectar efectivamente a un
grupo especifico de insectos.
Los resultados de patogénicidad (alta mortalidad acumulada, un TL50 corto, al igual
que una alta micosis) presentados en este estudio para los aislamientos nativos de
Metarhizium, posiblemente corresponda a una respuesta genética y fisiológica del
entomopatógeno de acuerdo a la especificidad reportada para algunos
aislamientos con sus hospederos (Lecuona et al., 1996; Alves 1998; St Leger,
2007), sin embargo se deben llevar a cabo estudios genéticos posteriores para
poder establecer algún tipo de correlaciones entre la virulencia encontrada en este
estudio y el acervo genético de los aislamientos nativos.
68
7. CONCLUSIONES
Los resultados del presente trabajo permitieron identificar aislamientos nativos
de HEP pertenecientes a los géneros Metarhizium, Aspergillus y Fusarium y
Penicillium activos contra Atta spp, siendo este el primer reporte de Penicillium
Fusarium activos sobre el insecto plaga A. colombica.
Los aislamientos de Metarhizium mostraron un 100% de mortalidad
destacando su actividad biocontroladora sobre individuos de A. colombica .
Del género Metarhizium, registró un TL50 promedio para los aislamientos H-M-
03 de 1,2 y de 1,9 para H-M-08 teniendo en cuenta las diferentes pruebas, lo
que equivale a 1,37 y 0,7 días más rápido que el control positivo con 2,6 días,
lo que pone en evidencia el gran potencial de dichos aislamientos como
especies promisorias para el control de las hormigas cortadoras en las áreas
agrícolas del Chocó.
Los basureros de A. colombica (residuos del hongo y residuos del material
vegetal cortado para el cultivo del hongo) e individuos muertos de la misma
especie e individuos de A. cephalotes, son una fuente importante y especifica
de aislamientos de HEP, destacando la presencia del género Metarhizium.
De acuerdo a este estudio se logro mantener y establecer las condiciones de
un hormiguero de Atta colombica en laboratorio y la importancia de la yuca
(Manihot esculenta Crantz) como especie forrajera para el cultivo del hongo
simbionte.
69
8. RECOMENDACIONES
Llevar a cabo bioensayos utilizando las cepas promisorias de este estudio (H-M-03
y H-M-08), para pruebas de control de hormigas cortadoras aplicados
directamente sobre los hormigueros en condiciones de laboratorio y posterior
pruebas de validación y extensión a nivel de campo, a fin de confirmar su actividad
patogénica en condiciones naturales.
Una vez obtenidos los resultados de validación en campo, es importante realizar
pruebas de formulaciones con productos naturales a manera de cebos que
garanticen la eficacia y control de los HEP al ser aplicados para el manejo de A.
colombica e incluso otras especies de hormigas cortadoras.
70
BIBLIOGRAFIA
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(Atta sexdens F. Smith) en las chagras indígenas ticuna (sectos Sur P.N.N.
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81
ANEXOS
Anexo Nº 1. Ubicación del CMUTCH en Lloró - Chocó - Colombia América. Localización de Hormigueros de A. cephalotes y A. colombica
82
Anexo 2. Análisis de correlación de Spearman de la mortalidad vs micosis de
individuos de hormiga arriera Atta colombica en laboratorio al ser infectados con
Metarhizium sp.
y = 0,99
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 3 4 5 6 7
regres
Lineal
Micosis
Mor
tali
dad
Analisis de Correlación de la Mortalidad / Micosis de las hormigas infestadas con Metarhizium sp., en condiciones de laboratorio.
83
Anexos 3. Descripción del aislamiento de hongos entomopatógenos desde
individuos de Atta sp., y los desechos de Atta colombica.
84
85
Anexo 4. Descripción del almacenamiento en papel y en líquido
86
Anexo 5. Captura, establecimiento y mantenimiento de la colonia.
87
Anexo 6. Evaluación de la actividad entomopatogénica de los aislamientos
nativos.
88
Anexo 7. Bioensayo; actividad entomopatogénica de los aislamientos
nativos