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Clave: FER36PAT20111215
EVALUACION Y CINETICA DE CRECIMIENTO DE
LACTOBACILLI UTILIZANDO FRUCTANOS DE AGAVE
Anel Karina Bernal Martínez, Patricia Araceli Santiago García,
Mercedes Guadalupe López Pérez
DIRECCIÓN DE LOS AUTORES
Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional
CIIDIR-IPN Oaxaca, Oax., 68030 y Depto. de Biotecnología y Bioquímica, Centro de
Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Campus Guanajuato, Irapuato Gto.,
36500 México.
CORREO ELECTRÓNICO
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INTRODUCCIÓN
Los prebióticos son ingredientes
alimentarios no digeribles con efectos
benéficos por su capacidad de estimular el
crecimiento o la actividad de bacterias
probióticas en el colon, y de este modo
mejorar la salud del anfitrión. Estos a su
vez son fermentados por probióticos que
son microorganismos vivos con efectos
beneficos para el anfitrión y para la
mejora del equilibrio de la flora intestinal
(Astiasarán y col. 2003). Dentro de los
probióticos más populares se encuentran
los del género: Lactobacillus,
Streptococcus y Bifidobacterium (Chow,
2002). Los fructanos de agave son
carbohidratos no digeribles y
fermentables que por su estructura
(Mancilla-Margalli y López 2006) son
considerados como prebióticos. La
extracción de los fructanos, es una
alternativa para los productores de agave
en Oaxaca, la producción es de 130,240
toneladas, del cual solo se cosecha el
27%, de modo que se cuenta con la
disponibilidad de la materia prima para su
obtención, además de su importancia
como prebiótico.
OBJETIVO
Evaluar la cinética y el crecimiento de
cuatro cepas de Lactobacilli
(Lactobacillus acidophilus, L. casei, L.
paracasei y L. rhamnosus), utilizando
como fuente de carbono fructanos de
Agave angustifolia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los fructanos utilizados se obtuvieron de
Agave angustifolia Haw., de 8 años de
edad, provenientes de Totolapan,
Tlacolula Oaxaca.
Bacterias
Cuatro cepas de Lactobacillus a) L.
acidophilus LA-2 25302; b) L. casei
LCC-1 53103; c) L. paracasei LPC-1 393
y d) L. rhamnosus LR 4356 fueron
probadas como probióticas siguiendo el
método reportado por Gibson y Wang
(1994).
Diseño experimental
El experimento se estableció con un
arreglo factorial 4x5x2. Los factores de
estudio fueron: 1) Cuatro cepas de
Lactobacillus; 2) cinco diferentes fuente
de carbono: fructanos de A. angustifolia
cadena larga (A), cadena corta (B) y
totales (C) y dos tipos de inulina de
achicoria Raftiline (RN) y Raftilose (RS)
3) la obtención de los fructanos de agave,
fueron extraídos por dos métodos:
convencionalmente (C): utilizando
solución etanol-agua y secados por
aspersión (100-80°C) y extraídos solo con
agua (H) clarificado con carbón activado
y secados por convección a 50°C.
Identificación de fructooligosacáridos
(FOS) y contenido de carbohidratos
Se utilizaron placas de gel sílice para
cromatografía en capa fina, para
visualizar la separación de compuestos se
utilizó un revelador específico para
azúcares. En la placa de gel de sílice se
aplicaron 10 µL de cada muestra
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utilizando los estándares de glucosa,
fructosa, sacarosa, 1-kestosa, 1,1-
kestotetraose, 1,1,1-kestopentaose. La
determinación de azúcares directos,
totales y fructosa fueron realizados por
métodos colorimétricos.
Cinética de crecimiento
Se utilizó el 1% de cada fuente de
carbono y se disolvieron con caldo MRS
(Man-Rogosa-Sharpe), el medio de
cultivo y la fuente de carbono se
esterilizaron en un autoclave marca
Market Forge-Sterilmatic, posteriormente
se inoculó el 1% de bacterias y se
incubaron a 37 ºC en condiciones
anaeróbicas, midiendo su crecimiento
por densidad óptica a 600 nm, a
diferentes tiempos; t=0, 2, 4, 6, 9,12, 15,
18, 24 y 30 horas.
Crecimiento bacteriano
El crecimiento bacteriano de
Lactobacillus acidophilus, L. casei, L.
paracasei y L. rhamnosus, fueron
evaluadas como cepas probióticas,
siguiendo la metodología de Gibson y
Wang (1994) con una concentración de
10 g/L de fructanos, Raftiline y Raftilose
como única fuente de carbono.
El crecimiento bacteriano fue medido por
densidad óptica a 600 nm en un
espectrofotómetro UV-Visible 1601
marca SHIMADZU y la ingesta de los
fructanos por las bacterias fue evaluada
midiendo los cambios de pH con un
potenciómetro. Los resultados se reportan
como el promedio de tres
determinaciones independientes para cada
caso.
Análisis estadístico
El análisis estadístico fue realizado
usando SAS para Windows versión 8. El
procedimiento GLM y la prueba de
Tukey fueron usados para determinar las
diferencias significativas entre las
poblaciones bacterianas usando los
diferentes fructanos. Diferencias fueron
consideradas significativas cuando P <
0.05.
DESARROLLO
Fructanos
Bifidobacterias y lactobacilli
Fermentación
Acetato, propionato
H2, H2S, CO2 y
CH4
Lactato y succinato
Biomasa
Figura 1. Fermentación de fructanos
RESULTADOS Y DISCUSION
Identificación de fructooligosacáridos.
La figura 2 muestra el perfil de una TLC
de los fructanos de A. angustifolia
utilizados. En ella se observa que en (AC)
hubo mayor intensidad de la mancha en la
base del cromatógrafo similares al
estándar de inulina con un DP
aproximado de 20 que en la muestra
(AH), en el cual se observa también la
presencia de fructanos de cadena corta o
de menor grado de polimerización (DP) y
con mayor intensidad fructosa y glucosa;
este hecho se puede asociar a que hubo
una hidrólisis mayor en (AH), debido al
método de extracción utilizado y al ser
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secado por convección, comparado con
(AC).
Figura 2. TLC de Fructano de cadena larga
convencional (AC) y en agua (AH); fructano de cadena
corta convencional (BC) y en agua (BH); fructanos
totales convencional (TC) y en agua (TH). Estándares:
F=fructosa; G=glucosa; S=sacarosa; 1-kestosa (DP3);
1,1 kestotetraose (DP4) y 1,1,1 kestopentaose (DP5) e
inulina de achicoria.
Tabla 1. Contenido de azúcares en los fructanos de A.
angustifolia secos
Fructano
Carbohidratos
totales
mg/g
Reductores
directos
mg/g
Fructosa
mg/g
AC 878.16 79.72 385
AH 726.21 135.25 280
BC 579.86 124.75 275
BH 511.01 90.79 410
TC 892.52 82.67 585
Se observa que la producción de
azúcares libres se debió a la hidrolisis de
los fructanos de cadena corta durante la
extracción. Además de que la velocidad
de formación de fructosa durante la
hidrólisis depende de la longitud de la
cadena para transformarse en fructosa.
Cinética de crecimiento
La figura 3 muestra las cinéticas de
crecimiento de las cuatro cepas de
Lactobacillus en fructanos de cadena
larga de A. angustifolia extraídos de
forma convencional y secados por
aspersión a una temperatura de 100-80 ºC
(AC). En ella observamos que cada cepa
de Lactobacillus tuvo un comportamiento
diferente con este susbtrato. L.
rhamnosus, tuvo una fase lag más corta,
teniendo una tasa de crecimiento
específico ( =0.3256 h-1
) mayor que los
otros Lactobacillus, y un tiempo de
duplicación menor (2.1288 h).
Figura 3. Cinética de crecimiento de L. acidophilus
(L.a); L. casei (L.c); L. paracasei (L.pc) y L. rhamnosus
(L.r), utilizando como fuente de carbono (AC).
Utilizando los fructanos de alto DP
extraídos en agua (AH), se observa que
la cinética de crecimiento de las cuatro
cepas de Lactobacillus, en donde L.
acidophilus tuvo una fase exponencial
con un coeficiente de determinación de
r2=0.9752, lo que indica que el 97.52% de
la variación en el crecimiento del
lactobacilli se debió a la relación lineal
que existe entre el tiempo de incubación y
la fuente de carbono, la cual cómo
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podemos ver fue más eficiente para L.
acidophilus. Con respecto a L. casei se
encontró un r2= 0.9520 ligeramente
menor que para L. acidophilus pero muy
similar a la de L. paracasei y L.
rhamnosus los cuales tuvieron un
coeficiente de determinación similar. El
comportamiento de los lactobacilos
usando como substrato (BH), fue similar
para L. acidophilus y L. casei en la fase
lag a diferencia del L. rhamnosus que
resultó más corta que en las anteriores,
en el caso de L. paracasei se encontró que
la fase lag fue más larga que para L.
rhamnosus (Fig.4). De la comparación de
los substratos (BC) y (BH) el mejor
crecimiento de estas bacterias fue con
(BC), ya que el crecimiento de los
lactobacilos en (BH) no tuvieron el mejor
rendimiento como substrato
probablemente por la deficiencia del
método de secado y tal vez a una
caramelización de los azúcares los cuales
ya no puedieron ser utilizados
0
0.5
1
1.5
2
0 10 20 30 40
D.O
a 6
00 n
m
Tiempo, hr
L.a L.c
L.pc L.r
Figura 4. Cinética de crecimiento de L. acidophilus
(L.a); L. casei (L.c); L. paracasei (L.pc) y L. rhamnosus
(L.r), utilizando como fuente de carbono (BH).
Efecto de los fructanos de agave sobre
el crecimiento de Lactobacilli
El crecimiento del L. acidopilus se
muestra en la figura 5, en ella se observa
que no hubo diferencia significativa en
los fructanos (BH y TH) además del
estándar (RN). Raftilose (RS) resultó el
mejor substrato, seguido de fructanos de
agave de alto DP extraído en agua (AH)
este probablemente porque fue
hidrolizado más durante su extracción y
secado, y por lo tanto incrementó la
presencia de fructanos de DP corto, así
como azúcares libres, que seguramente
fueron consumidos primero por los
lactobacilos antes de comenzar a degradar
las cadenas ramificadas de los fructanos
de agave.
Figura 5. Crecimiento de L. acidophilus. Valores con
letras diferentes fueron significativamente diferentes
(P 0.05).
L. acidophilus con el susbstrato (BC) tuvo
un buen crecimiento (DO=1.3532) y con
(BH) un crecimiento de OD=1.2667.
Esto concuerda con estudios realizados
por (Biedrzycka y Bielecka, 2004;
Roberfroid y col. 1998) en que los
fructanos de cadena corta son mejor
utilizados como fuente de carbono para
las bifidobacterias y lactobacilos.
Santiago y López (2009) reportaron
mayor crecimiento de L. acidophilus en
fructanos de A. angustifolia de cadena
corta resultando el mejor tratamiento que
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los estándares (Raftiline y Raftilose
Synergy 1), sin embargo en los fructanos
de cadena larga el crecimiento de esta
bacteria resultó por debajo de los
fructanos de cadena corta y de los de tipo
comercial. El resultado obtenido del
crecimiento del L. acidophilus, se puede
comparar con las cinéticas anteriores para
esta misma bacteria, el cual coincide en
que fue el lactobacilo que mayor
crecimiento tuvo en cada substrato
utilizado con respecto a las otras cepas.
Los fructanos de agave evaluados fueron
degradados por el L. acidophilus,
seguramente por enzimas β-fructosidasa,
el cual se ha encontrado en el genoma de
algunas cepas de Lactobacillus (Makras y
col. 2005). Para el caso del crecimiento
de L. casei (Fig. 6) utilizando los
fructanos de A. angustifolia fue en
general menor que el presentado por L.
acidophilus, L. paracasei y L. rhamnosus.
Figura. 6. Crecimiento de L. casei
Para el crecimiento del L. paracasei, el
mejor substrato considerado por el efecto
que tuvo en el crecimiento de esta
bacteria es el AH, (DO=1.0395), otro
substrato en el que hubo también mayor
crecimiento fué el de cadena corta BC,
(DO=0.9247), estos fructanos resultaron
mejor fuente de carbono que los
estándares Raftiline y Raftilose.
En cuanto a los fructanos BH y TH no
hubo diferencia significativa, lo mismo
con los fructanos AC y Raftiline.
CONCLUSIONES
El método de extracción y secado tuvo un
efecto significativo en el contenido de
fructanos de cadena corta. De la cinética
de crecimiento observamos que
dependiendo de la capacidad de cada
lactobacilli se lleva a cabo su duplicación.
A mayor contenido de fructanos de
cadena corta se incrementa el crecimiento
de las cepas de lactobacilli.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Mancilla-Margalli NA, López MG. 2006.
Journal of Agricultural and Food
Chemistry 54, 7832-7839
Gibson GR, Wang X. 1994. Food
Microbiology 11, 491-498
Biedrzycka E, Bielecka M. 2004. Trends
in Food Science and Technology 15: 170-
175
Makras L, Van Acker G, De Vuyst L.
2005. Applied and Environmental
Microbiology. Vol. 71, 11: 6531-6537.
Santiago GP, López MG. 2009. Dynamic
Biochemistry, Process Biotechnology and
Molecular Biology 3.