“exposição à hiperoxia leva à morte celular no desenvolvimento cerebral” hyperoxic exposure...
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“Exposição à hiperoxia leva à morte celular no desenvolvimento cerebral”
Hyperoxic exposure leads to cell death in the developing brain
Uluc Yis a,*, Semra Hız Kurul a, Abdullah Kumral b, Serap Cilaker c,
Kazım Tug˘yan c, Sermin Genc d, Osman Yılmaz e
Brain & Development 2008 Oct ;30 (9): 556–562
Realizado por: Ana Graziela S. Antón1; Eduardo Carrari1; Rodolfo Bregion1.
Coordenação: Paulo R. Margotto
. www.paulomargotto.com.br
1 Ddos curso de medicina da Escola Superior de Ciências da Saúde – ESCS.
Obrigado!
Dr. Paulo R. Margotto, Ddo Eduardo, Dda Ana e Ddo Rodolfo
25-10-2008
Introdução• Evidências: prematuros apresentam elevada prevalência de
comprometimento cognitivo e motor devido a encefalopatia hipóxico-isquêmica, hemorragia intracerebral, infarto cerebral.
• Mas: uso de concentrações supra-fisiológicas de O2 em UTINeo (ressuscitação, desconforto respiratório...) altas concentrações de O2 exercem efeitos tóxicos;prematuros possuem menos antioxidantes enzimáticos;
• Hiperoxia: fator de risco aditivo para morte neuronal em RN que apresentaram asfixia intraparto;
• Poucos estudos analisaram os efeitos da hiperoxia no desenvolvimento cerebral.
Objetivo
• “investigar os efeitos da hiperoxia em diferentes regiões do desenvolvimento cerebral”.
Materiais e métodos• Modelo animal:
– Em conformidade com as orientações do Laboratório Animal Experimental e aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados Animal do Dokuz Eylul University School of Medicine;
– Filhotes de ratos Wistar (IG semelhante) em 2 grupos acompanhados do nascimento ao 5º dia pós-natal P(5):caso (n=8): expostos, em câmara, a 80% de O2, com concentração do O2 controlada 2x/dia, umidade mantida a 80% e CO2 removido;controle (n=8): mantidos em local com ar ambiente (21% O2);
– Mães trocadas a cada 24h (prevenção de dist. respiratório no adulto);– Determinação da concentração sanguínea de O2 : coleta em cavidade
cardíaca esquerda (sob anestesia);– Em P(5): sacrifício dos animais animais pesados, anestesiados com
éter e tecidos cerebrais coletados.– Desenvolvimento cerebral desses ratos (nesta idade pós-natal) é
semelhante ao de um RN nascido com ± 24 sem de gestação.
• Avaliação histopatológica:– Realizada por investigador “cego” em relação
ao estudo;– Animais perfundidos por formalina, tecidos
fixados em formol, processados em blocos de parafina, cortados em 6µm e corados com cresilo violeta;
– Imagens analisadas em microscópio equipado com câmera de vídeo, computador e software (padronizados).
Materiais e métodos
• Estimativa do hipocampo, córtex pré-frontal, córtex parietal, subiculum e córtex retrosplenial :
– Estimativa das áreas cerebrais em toda as amostras (de acordo com Mouse Brain Atlas);
– Densidade/contagem de neurônios determinadas com uso de software;
– Procedimentos realizados às cegas.
Materiais e métodos
• Detecção de morte celular in situ :– Detecção de fragmentação de DNA com “deoxynucleotidyl
transferase-mediated dUTP nick endlabeling (TUNEL)”;• Morte celular detectada por ELISA:
– Para detecção de fragmentação de DNA;– Técnica utilizada para detecção específica de fração citoplasmática
de tecido cerebral;• Peso dos cérebros:
– Após removido da cavidade craniana, encéfalos pesados em balança com sensibilidade de 0,0001g;
• Análise estatística:– Valores apresentados como média ±SEM;– Comparações: teste Mann-Whitney U;– p<0,05: estatisticamente significativo.
Materiais e métodos
Resultados • Avaliação de pesos corporais e gasometria
sanguínea:
– Média do peso corporal: sem diferença estatística (12.14 ± 0.69 vs 12.57 ± 0.53; P = 0.318);
– PaO2 arterial: 82 ± 2 mm Hg nas crias expostas a 21% O2 e 324 ± 18 mm Hg naquelas expostas a 80% O2 (n = 2 por grupo);
• Efeitos da densidade neuronal em hiperoxia:– TUNEL: revelou típicas características morfológicas de
apoptose (condensação de cromatina e corpos apoptóticos);
– Seguem tabelas e figuras.
Resultados
• Efeitos da densidade neuronal em hiperoxia:
Resultados
Fig. 1: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL na região CA1 do hipocampo. Ampliações de secção coronal de CA1 tecidos cerebrais de ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas reforçada no grupo de hiperoxia (D) (setas).
Fig. 2: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no córtex pré-frontal. Ampliações de secção coronal partir do córtex pré-frontal tecidos cerebrais de ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas significativamente reforçada no grupo de hiperoxia (D).
Fig. 3: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no córtex parietal. Ampliações de secção coronal de córtex parietal dos tecidos cerebrais dos ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C e D) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas reforçada no grupo hiperoxia (E e F).
Fig. 4: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no subiculum. Ampliações de secção coronal de córtex parietal tecidos cerebrais de ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas reforçada no grupo de hiperoxia (D).
Fig. 5: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no córtex retrosplenial. Ampliações da secção coronal de tecidos do córtex retrosplenial dos ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL reforçada nas células positivas grupo de hiperoxia(D).
• Efeitos da hiperoxia em quebra da fita de DNA:
Resultados
• Efeitos da hiperoxia sobre a morte celular no ELISA:
Resultados
Fig 6: Comparação dos resultados teste ELISA morte celular (grama / absorvância proteína) entre os grupos controle e hiperóxia.
• Peso dos cérebros:
Resultados
Fig 7: Comparação dos pesos dos cérebros entre controle e grupo de hiperoxia.
• Estudo:
– Concentrações suprafisiológicas levam a reação apoptótica e neurodegenerativas, morte celular e diminuição da massa cerebral alteração do desenvolvimento cerebral;
– Morte celular relacionada à hiperoxia em todas as regiões estudadas locais importantes de controle cognitivo, motor, sensorial, além de funções de memória e aprendizagem.
Discussão
• Animais selecionados devido à semelhança com o desenvolvimento pós-natal de um RN nascido com ± 24sem de IG:– Período crítico para o desenvolvimento cerebral;– RN comumente intubados e recebendo quantidades excessivas de
O2;• Estudos sobre os efeitos da hiperoxia no desenvolvimento
cerebral são escassos;• Um estudo: exposição de prematuros à hiperoxia é
importante fator de risco para desenvolvimento de paralisia cerebral, piora o resultado em RN com asfixia;
• Lembrar que em UTINeo existem muitos fatores de risco que levam a morte neuronal silenciosa (sedativos, antiepiléticos), que somam os riscos com a hiperoxia.
Discussão
• Mecanismos da hiperoxia responsáveis pela morte celular no cérebro em desenvolvimento ainda não são conhecidos;
• Hiperoxia: produção de radicais livres: -danos ao DNA-mitocôndria- membranas; -mudança na expressão de
genes; -fosforilação de proteínas;
Discussão
Conclusão
• Hiperoxia:
– Capaz de produzir morte celular no cérebro em desenvolvimento, assim como no pulmão e na retina;
– Estudo sugere que a morte neuronal induzida pela hiperoxia pode ter parte na responsabilidade da deficiência cognitiva e motora desenvolvida posteriormente em prematuros.
Consultem também:
• Danilov CA, Fiskum G. Hyperoxia promotes astrocyte cell death
after oxygen and glucose deprivation. Glia. 2008 May;56(7):801-8
(A hiperoxia promove a morte celular do astrócito após deprivação de oxigênio e glucose)
Impacto das práticas clínicas no cérebro em desenvolvimentoAutor(es): Augusto Sola (EUA). Realizado por Paulo R. Margotto