expresiÓn de la proteÍna asociada con plasticidad …
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Profesor Patrocinante
Dra. Carola Otth L
Instituto de Microbiología Clínica
Facultad de Medicina
EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA ASOCIADA CON PLASTICIDAD
NEURONAL ARC EN CÉLULAS DE NEUROBLASTOMA Y
NEURONAS CORTICALES INFECTADAS CON HSV-1
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
MELISSA VALERIA HOTT OGALDE
VALDIVIA – CHILE
2012
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer a la Dra. Carola Otth por haberme aceptado como tesista en su
laboratorio. Crecí mucho en la parte profesional y también en lo personal. Gracias por depositar
su confianza en mi trabajo.
Muchas gracias a mis papás por entender que esto no es una carrera fácil y que hay veces que hay
que sacrificar una reunión familiar o un fin de semana para poder lograr los objetivos propuestos.
Gracias por su paciencia y preocupación en todos estos años.
A mi hermana por incentivarme siempre diciendo que soy la más “ñoña” y a Leito por
acompañarme durante la gran parte de mi carrera. Aunque no tienes una formación científica
aprendiste lo que es una célula y me leíste muchísimos libros de bioquímica cuando mis ojos se
cansaban.
A mis amigos/as y compañeros de laboratorio que han estado en los malos y buenos momentos.
Gracias por sus consejos y por su energía positiva, gracias a mi Marion que a pesar de los 800
kilómetros que nos separan siempre te diste el tiempito para conversar. A la Ely por ser muy
“partner” dentro y fuera del laboratorio, a la Coral por sus tecitos y cafecitos en bioquímica. A la
Yenny y Jorge, por alivianarme mucho la carga y estar dispuestos siempre a ayudar. A la Karo y
Gustavo por su confianza y apoyo.
El presente trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de virología molecular del Instituto de
Microbiología Clínica, Facultad de Medicina, de la Universidad Austral de Chile, y contó con el
financiamiento de los proyectos Fondecyt 11080067 y 1120464.
i
ÍNDICE GENERAL
Página
1. RESUMEN 1
1.1 SUMMARY 2
2. INTRODUCCIÓN 3
2.5. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 11
2.6. OBJETIVO GENERAL 12
2.6.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 12
3. MATERIALES Y MÉTODOS 13
3.1. MATERIAL BIOLÓGICO 13
3.1.1. HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1 13
3.1.2. LÍNEAS CELULARES 13
3.2. REACTIVOS Y SISTEMAS COMERCIALES 14
3.3. METODOLOGÍA 14
3.3.1. PROPAGACIÓN DE HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1 14
3.3.2. TITULACIÓN VIRAL 14
3.3.3. CULTIVO CELULAR 17
3.3.4. CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS CORTICALES 17
3.3.5. CINÉTICA DE INFECCIÓN 18
3.3.6. INFECTIVIDAD CELULAR 19
3.3.7 VIABILIDAD CELULAR 19
3.3.8. EXTRACCIÓN RNA TOTAL. 22
3.3.9. RT-PCR SEMICUANTITATIVO 23
ii
3.3.10. INMUNOFLUORESCENCIA. 27
3.3.11. CUANTIFICACIÓN INTENSIDAD FLUORESCENCIA 27
3.3.12. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. 28
4. RESULTADOS 29
4.1 CULTIVOS CELULARES 29
4.2 INFECTIVIDAD CELULAR 31
4.3 CONTROL DE INFECCIÓN 33
4.3.1 INFECCIÓN PRODUCTIVA 33
4.3.2. INFECCIÓN NO PRODUCTIVA 33
4.4 VIABILIDAD CELULAR 38
4.5 EXPRESIÓN DEL TRANSCRITO Y PROTEÍNA ARC 41
4.6 DISTRIBUCIÓN Y EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA ARC 45
5. DISCUSIÓN 49
5.3 CONCLUSIONES 58
6. BIBLIOGRAFÍA 69
7. ANEXOS 71
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. 5
Transporte viral desde y hacia el sitio inicial de infección durante una
Infección productiva a nivel epitelial.
Figura 2. 10
Esquema de activación de transcripción de Arc a nivel neuronal (Inoue et al., 2010).
Figura 3. 21
Distribución tratamientos utilizados para ensayo de reducción del MTT.
Figura 4. 30
Caracterización de cultivos celulares
Figura 5. 32
Infectividad de HSV-1 en cultivos celulares.
Figura 6. 34
Expresión de mRNAs virales en infección productiva con HSV-1 en células N2a.
Figura 7. 35
Expresión de mRNAs virales en infección productiva con HSV-1 en cultivos
neuronales.
Figura 8. 36
Expresión de mRNAs virales en una infección no productiva con HSV-1
en células N2a.
iv
Figura 9. 37
Expresión de mRNAs virales en infección no productiva con HSV-1
en células neuronales.
Figura 10. 39
Ensayo de viabilidad celular utilizando método de reducción del MTT.
Figura 11. 40
Cálculo de viabilidad celular mediante inmunofluorescencia.
Figura 12. 42
Expresión de mRNA Arc en infección productiva y no productiva con HSV-1
en células N2a.
Figura 13. 43
Expresión de mRNA Arc en infección productiva y no productiva con HSV-1
en cultivos primarios de neuronas corticales.
Figura 14. 44
Expresión de la proteína Arc en infección productiva en células N2a y
neuronas corticales.
Figura 15. 46,47
Distribución subcelular de la proteína Arc y cuantificación de fluorescencia en
neuronas corticales infectadas con HSV-1.
Figura 16. 71
Expresión del transcrito LAT determinada por RT-PCR en
cultivos neuronales utilizando distintas preparaciones de aciclovir 50 uM.
v
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla I. 15
Clasificación alfabética de acuerdo al nombre del fabricante
de los reactivos utilizados en este trabajo.
Tabla II. 24
Partidores utilizados en las reacciones de RT-PCR.
Tabla III. 25
Componentes de las reacciones de RT-PCR.
Tabla IV. 26
Programa de amplificación para RT-PCR.
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
DMEM: Medio Eagle modificado por Dulbecco
EA: Enfermedad de Alzheimer
EDTA: Ácido etilendiamino tetraacético
HBSS: Solución salina balanceada Hank
hpi: Horas post infección
HSE: Encefalitis por herpes simplex
HSV-1: Herpes simplex virus tipo 1
LAT: Transcrito asociado a latencia
MOI: Multiplicidad de infección
MTT: Bromuro de 3(4,5 dimetil-2-tiazoil)-2,5-difeniltetrazólico
PBS: Tampón fosfato salino
PFA: Paraformaldehído
PFU: Unidades formadoras de placa
SDS: Dodecilsulfato sódico
SFB: Suero fetal bovino
SNC: Sistema nervioso central
TBE: Tampón Tris/Borato/EDTA
TEMED: N,N,N´,N´-tetrametiletilendiamina
Tris: Tris hidroximetil aminometano
1
1. RESUMEN
El herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) es un patógeno ubicuo, neurotrópico y la causa más
común de encefalitis esporádica aguda en humanos. La encefalitis causada por herpes simplex se
asocia con una alta mortalidad y puede generar graves secuelas neurológicas que afectan al
paciente de por vida. En la actualidad, se desconoce si existe riesgo asociado a reactivaciones
recurrentes de HSV-1 a nivel del SNC en pacientes portadores asintomáticos, que puedan
desencadenar deterioros progresivos de las funciones neuronales subclínicamente. La proteína
asociada al citoesqueleto regulada por actividad (Arc), es una proteína de expresión temprana que
participa en modificaciones del citoesqueleto de actina implicadas en plasticidad sináptica y
consolidación de la memoria. Aunque se ha demostrado su importancia en neurogénesis y
resistencia al estrés, no existen estudios que analicen su modulación por patógenos neurotrópicos.
El objetivo del presente trabajo consistió en evaluar la expresión de la proteína Arc durante una
infección productiva por HSV-1 mediante técnicas de RT-PCR, Western Blot e
inmunofluorescencia indirecta. Los resultados muestran que se induce un aumento significativo
en la expresión del mRNA de Arc a horas tempranas de la infección en cultivos neuronales
infectados independiente de la replicación viral. Esto sugiere que durante una infección neuronal
por HSV-1 se inducen cambios en la expresión celular de genes implicados en modificaciones del
citoesqueleto en etapas tempranas de infección, que pueden tener consecuencias tanto para la
movilidad intracelular del virus hacia el núcleo de la neurona, como para la funcionalidad celular.
Financiamiento: Proyecto FONDECYT 11080067 y 1120464.
2
1.1. SUMMARY
Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is an ubiquitous, neurotropic, and the most common
pathogenic cause of sporadic acute encephalitis in humans. Herpes simplex encephalitis is
associated with a high mortality rate and significant neurological sequelae to afflict patients for
life. Currently, it is unclear whether a neuron that undergoes viral reactivation and produces
infectious particles in asymptomatic patients may generate neuronal dysfunction. The associated
regulated cytoskeleton protein (Arc) is an immediate early expression protein which participates
in actin cytoskeleton modifications that are implicated in synaptic plasticity and memory
consolidation. Although, it has been demonstrated their relevance in neurogenesis and stress
resistance, there are not studies about neuronal plasticity modulation induced by neurotropic
pathogens. The goal of this work was to evaluate the expression of the Arc protein in primary
neuronal culture infected with HSV-1, using semicuantitative RT-PCR, Western Blot and
Inmunofluorescent approach. The results show that HSV-1 induces an overexpression of Arc in
the first hours of infection over neuronal cultures, independently of viral replication. These
results suggest that activation of immediate gene expression implicated in changes of the
cytoskeleton dynamics may have consequences in the intracellular mobility of virus and in
neuronal functionality.
Funding: FONDECYT 11080067 and 1120464.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1. HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1
HSV-1 es un virus ubicuo, neurotrópico y de amplia distribución en la naturaleza. El comité
internacional de Taxonomía de Virus (ICTV), clasifica a HSV-1 dentro del orden Herpesvirales
(Davison et al., 2009), familia Herpesviridae, subfamilia Alfaherpesvirinae y género
Simplexvirus. Es un virus de fácil transmisión, afectando al 90% de la población adulta a nivel
mundial (Xu et al., 2006; Schillinger et al., 2004; Withley et al., 2001). Los viriones presentan
una forma esférica con un tamaño de 150-200 nm. Estructuralmente, los viriones están
constituidos por cuatro componentes esenciales, en los cuales se incluye una cápside de simetría
icosahédrica de 125 nm de diámetro compuesta por 162 capsómeros (Pellet y Roizman, 2007).
Esta cápside contiene el genoma viral compuesto por un DNA de doble hebra de 152 kpb que
codifica para 84 proteínas virales (Roizman et al., 2007). Rodeando la nucleocápside existe una
estructura de naturaleza proteica y característica amorfa denominada tegumento que está rodeada
por una envoltura membranosa, la cual contiene insertas glicoproteínas que desempeñan una
función importante en la entrada del virión a la célula hospedera (Itzhaki et al., 2006).
HSV-1, se asocia a infecciones que generan vesículas o aftas herpéticas a nivel de la región
orofacial y se caracteriza por producir infección persistente latente, quedando de por vida en las
personas infectadas. La primoinfección o infección primaria ocurre a través del contacto de
fluidos infectados con lesiones en la piel o en mucosa oral, faríngea u ocular. Ocurre con
frecuencia en la niñez o en la adolescencia y es usualmente leve o asintomática en un hospedero
inmunocompetente. En la infección primaria, luego de infectar la mucosa oral, el virus es capaz
de alcanzar terminales de neuronas sensoriales como ganglio trigémino (Van den Pol et al.,
2006), donde ingresa y viaja a través de los axones por transporte retrógrado y establece una
4
infección latente en el núcleo de estas neuronas, estado que se caracteriza por no existir
replicación del genoma viral ni tampoco traducción de sus proteínas. Estrés, exposición a luz UV,
calor, fiebre, cambios hormonales, menstruación y traumas neuronales resultan en la reactivación
del virus (Jenkins y Turner, 1996), donde éste viaja por transporte axonal anterógrado al sitio
inicial de infección o a uno cercano, contribuyendo de ésta manera a la formación de nuevos
viriones y por consiguiente a la propagación del virus (Ortiz et al., 2003), ver Figura 1.
La transcripción del material genético de HSV-1 está catalizada por la enzima RNA polimerasa II
de la célula hospedera (McGeoch et al., 2006). La expresión génica ocurre en una cascada
regulada, la cual comienza en estadíos tempranos de la infección, donde se transcriben genes
denominados inmediatamente tempranos como ICP0, ICP4, ICP22, ICP47 e ICP27.
Posteriormente hay transcripción de genes tempranos como el de la DNA polimerasa viral, ICP8
y timidina quinasa (UL23). Finalmente se produce la transcripción de genes tardíos entre los
cuales se encuentran glicoproteínas de superficie como glicoproteína B (gB) (Jenkins y Turner,
1996). Debido a que la transcripción de genes virales es regulada, requiere que los genes
inmediatamente tempranos se transcriban para que el producto proteico, ejerza su acción sobre la
transcripción de genes tempranos cuyas proteínas ayudarán en la transcripción de genes tardíos.
Una vez que el virus entra en estado de latencia a nivel neuronal, la infección se denomina
persistente latente, caracterizada por ser no productiva y porque la transcripción se limita sólo a
un gen capaz de codificar moléculas de RNA denominadas transcritos asociados a latencia (LAT)
ubicados en núcleo y citoplasma de neuronas (Li et al, 2010), los cuales son capaces de bloquear
el inicio de la replicación viral (Itzhaki et al., 2008).
5
1
Figura 1. Transporte viral desde y hacia el sitio inicial de infección durante una infección
productiva a nivel epitelial. 1.- Al infectar la célula epitelial, HSV-1 viaja por transporte axonal
retrogrado hacia el ganglio sensorial donde establece latencia. 2.- Al salir del estado de latencia
los viriones regresan al sitio inicial de infección o lugares cercanos a éste mediante transporte
axonal anterógrado. 3.- Bajo ciertas condiciones, HSV-1 alcanza el SNC, probablemente vía
neuronal. HSV: Herpes simplex virus; CNS: Sistema nervioso central. (Adaptado de Perkins,
2002).
1
2
1 3
1
6
2.2. HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1 Y SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
Por razones que hasta la fecha se desconocen, una vez que el virus alcanza las neuronas
sensoriales, específicamente los ganglios, lugar donde establece una infección latente, puede
seguir avanzando por transporte retrogrado hasta llegar a neuronas del sistema nervioso central
(SNC) y ahí establecer una infección latente pudiendo generar daño neuronal, la que en algunos
casos puede producir encefalitis herpética (HSE) (Norgren et al., 1998).
HSE es una de las manifestaciones más severas de la infección por HSV-1. Se clasifica como una
encefalitis esporádica (Johnson, 1998), la cual tiene una incidencia anual de 1 caso cada 250.000
- 500.000 habitantes (Whitley et al., 2002) en la que de no recibir un tratamiento antiviral
efectivo, la posibilidad de fallecer es de un 70%. Del 30% restante, un pequeño porcentaje de las
personas recupera la función cerebral normal (Whitley et al., 1986), mientras que el resto
desarrolla deterioro cognitivo, de memoria y personalidad (Levitz, 1998; Tyler, 2004), secuelas
similares a las observadas histopatológicamente en la enfermedad de Alzheimer (EA).
Se ha demostrado que HSV-1 alcanza el SNC de personas mayores de 50 años posiblemente
debido a que su sistema inmune se ve debilitado con el transcurso de los años por lo que no es
capaz de controlar la infección (Jamieson et al., 2002; Wozniak et al., 2005). Las principales
regiones cerebrales afectadas por HSE son lóbulo temporal, lóbulo frontal y sistema límbico, las
mismas regiones que presentan características neuropatológicas en la EA. Se han propuesto dos
vías por las cuales el virus podría infectar neuronas del SNC. Una de ellas sería a través de la
porción V1 del nervio trigémino, la cual conecta con las meninges basales. La otra vía de entrada
sería a través del nervio olfatorio, llegando al bulbo olfatorio, región del SNC donde HSV-1
puede alcanzar la amígdala, ínsula y sustancia perforada, componentes del sistema límbico, lo
que puede explicar las lesiones en este sistema, en pacientes que desarrollan HSE (Perkins,
7
2002). Independiente de la vía de entrada del HSV-1, el transporte hacia y desde los ganglios de
neuronas sensoriales es de tipo axonal, en dirección retrógrada y anterógrada respectivamente.
Además, el virus es capaz de diseminarse a través de neuronas conectadas sinápticamente.
La diseminación viral entre células y sinapsis es un complejo proceso que involucra la
participación de varias glicoproteínas virales como gE y gI (Dingwell et al., 1995, McGraw et al.,
2009) y proteínas del tegumento como VP26 (Vittonne et al., 2005).
2.3. PLASTICIDAD SINÁPTICA
La función principal de una neurona es recibir, integrar y transmitir la información como señal
eléctrica o química a otras neuronas en el cerebro. En respuesta a estímulos extrínsecos como
patrones del comportamiento y demandas metabólicas, las neuronas pueden cambiar y adaptar la
fuerza de sus conexiones o sinapsis, lo que se conoce como plasticidad sináptica. Desde 1982, la
Organización mundial de la Salud define el término plasticidad sináptica o neuroplasticidad como
la capacidad de las células del sistema nervioso para regenerarse anatómica y funcionalmente,
después de estar sujetas a influencias patológicas ambientales o del desarrollo, incluyendo
traumatismos y enfermedades. Para que se formen nuevas sinapsis es vital que el citoesqueleto
neuronal se reorganice. El citoesqueleto neuronal corresponde a la estructura interna principal
que define la forma y polaridad neuronal. Esta estructura se compone de microtúbulos,
neurofilamentos y filamentos de actina (Georgiev et al., 2004). En las neuronas, actina
corresponde a la proteína del citoesqueleto más prominente en sinapsis, ya que es posible
encontrarla tanto en la membrana pre y post-sináptica (Landis, 1982). Además es el componente
del citoesqueleto principal en espinas dendríticas, determinando la morfología espinal y su
plasticidad (Chiaramello et al., 1995).
8
Cambios en la morfología neuronal y perdida de neuritas conducen a una serie de alteraciones
como disminución en la conductividad sináptica y perdida de sinapsis (Li et al., 2007). Esta
disfunción podría participar en varios desordenes que van desde la enfermedad de Alzheimer
(EA) hasta el desarrollo de estados crónicos del dolor (Fitzpatrick et al., 1998), demostrando la
importancia del citoesqueleto en la conservación de la integridad neuronal, lo que lleva a un
correcto desarrollo y mantenimiento de la función del SNC.
Estudios in vitro han demostrado que la infección por HSV-1 sobre cultivos neuronales genera
daño neurodegenerativo, el cual se manifiesta por una disminución y retracción progresiva de los
procesos neuronales a medida que avanza la infección. Además se ha demostrado que HSV-1
induce alteraciones en los filamentos de actina, componente principal en la formación de sinapsis
(Zambrano et al., 2008).
Desde la última década se han realizado numerosos estudios sobre algunos genes de expresión
inmediata asociados con plasticidad neuronal, con el fin de dilucidar modificaciones generadas en
circuitos neuronales frente a distintas formas de plasticidad sináptica como procesos de
aprendizaje y memoria, donde son necesarias formaciones de nuevas conexiones para transmitir y
almacenar los conocimientos adquiridos (Guzowski et al., 1999; Montag-Sallaz et al., 1999;
Vazdarjanova et al., 2002; Vazdarjanova y Guzowski, 2004; Gusev et al., 2005; Kubik et al.,
2007). Sin embargo, hasta la fecha no existe evidencia concreta sobre lo que ocurre con
plasticidad sináptica en procesos neuroinfecciosos como es el caso de una infección por HSV-1 a
nivel del SNC.
9
2.4. PROTEINA ASOCIADA A CITOESQUELETO, ARC
La neuroplasticidad es un proceso que requiere expresión temprana de genes y síntesis de novo de
proteínas con el fin de generar modificaciones sinápticas que puedan perdurar en el tiempo
(Deisseroth et al., 2003). Arc pertenece a la familia de los genes de expresión inmediatamente
tempranos. Es una proteína asociada a citoesqueleto regulada por actividad sináptica que fue
descubierta en el año 1995 por dos laboratorios independientes entre si (Link et al., 1995, Lyford
et al., 1995). Se expresa en respuesta a actividad sináptica de neuronas de estructuras cerebrales
como corteza, hipocampo, amígdala y cuerpo estriado. Una de las características que la diferencia
de otros genes de expresión inmediata es que su expresión se correlaciona de manera temporal y
espacial con el estimulo que induce la expresión de su mRNA (Guzowski et al., 2000; Lyford et
al., 1995). La transcripción del mRNA de Arc ocurre en el núcleo, el cual es posteriormente
transportado como ribonucleoproteína hacia las dendritas para su traducción (Bramham y Wells,
2007). La traducción de esta proteína no ocurre en todas las dendritas, sino que en la región del
árbol dendrítico donde se genera la sinapsis que gatilla su transcripción (Steward et al., 1998;
Steward y Worley, 2001). Sinapsis glutamatérgicas estimulan la transcripción del gen Arc debido
a la unión del neurotransmisor glutamato a los receptores ionotrópicos NMDA y AMPA. La
unión de glutamato a sus receptores gatilla la apertura de canales de calcio los cuales
desencadenan la activación de una cascada de señalización que lleva a la activación de factores
de transcripción que promueven la transcripción del gen de Arc. Además de la activación del
receptor NMDA, la transcripción de Arc también se genera en respuesta a la activación de la
quinasa ERK (Steward et al. 1998; Steward and Worley 2001; Panja et al. 2008). En la Figura 2
se observa un esquema que resume la activación de la transcripción del gen Arc en una célula
neuronal.
10
Figura 2. Modelo de regulación dependiente de actividad neuronal del gen Arc. 1.- Al
activarse los receptores NMDA producto de actividad neuronal, se desencadenaría un aumento
del flujo intracelular de Ca+2
. 2.- Quinasas como MAPK o CaMK activadas por Ca+2
fosforilarían
al complejo SARE compuesto por tres factores de transcripción gatillando el comienzo de la
transcripción del gen Arc. 3.- Los mRNAs sintetizados saldrían del núcleo como
ribonucleoproteína para traducirse en lugares donde se generaron sinapsis que gatillaron la
transcripción de este gen. Ca+2
: Ión calcio; MAPK: Proteinas quinasas activadas por mitógenos;
CaMK: Calcio calmodulina quinasa; SARE: Elemento de respuesta a actividad sináptica; CREB:
Proteína de unión a CRE (Elemento de respuesta a cAMP); MEF2: Factor estimulador de
miocitos 2; SRF: Factor de respuesta a suero; Pol II: RNA polimerasa. (Adaptado de Inoue et al.,
2010).
11
La expresión de la proteína Arc ha sido estudiada principalmente en estímulos como aprendizaje
y memoria y se ha descrito que, frente a estos estímulos, los niveles de expresión de la proteína
Arc aumentan significativamente en las primeras horas del estímulo y su localización se visualiza
principalmente a nivel de las espinas dendríticas. Arc es una proteína cuya función se asocia a
remodelación de los filamentos de actina. Según Bramham et al., 2010, actuaría activando a la
quinasa LIMK, la cual fosforila a la proteína cofilina, miembro de la familia de los factores
depolimerizantes de actina. Esta fosforilación ocurre en Serina 3 y es causal de perdida de la
función depolimerizante, permitiendo la formación y/o regeneración de conexiones sinápticas.
La función de Arc en procesos neuroinfecciosos no se encuentra bien establecida. Sin embargo
estudios in vivo utilizando lipopolisacárido (LPS) como inductor de procesos neuroinflamatorios
han demostrado que existe una correlación entre neuroinflamación y expresión del gen Arc (Rosi,
2011).
2.5. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Teniendo en cuenta que no existe evidencia de lo que ocurre con plasticidad sináptica en una
infección neuronal por HSV-1, y considerando a la proteína Arc como un marcador de actividad
sináptica, nuestro grupo de trabajo propone que “Durante una infección productiva por HSV-1, se
generan cambios en la plasticidad neuronal”. Es por esto que la hipótesis del presente trabajo de
tesis es que:
“Durante una infección productiva por HSV-1 se evidencian variaciones a nivel molecular
en la expresión de la proteína Arc”.
12
2.6. OBJETIVO GENERAL
Evaluar cambios de expresión de la proteína Arc inducidos por una infección productiva de
HSV-1 sobre células de neuroblastoma N2a y cultivos primarios de neuronas corticales.
2.6.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.- Determinar viabilidad celular frente a una infección con HSV-1 a un MOI 10 sobre
cultivos de neuroblastoma N2a y neuronas corticales mediante ensayo de reducción del MTT e
inmunofluorescencia indirecta.
2.- Validar infección productiva y no productiva con HSV-1 MOI 10 sobre cultivos de
células de neuroblastoma N2a (0, 1, 2, 4, 8, 18 y 24 hpi) y neuronas corticales (1, 4, 8, 18 y 24
hpi), determinando expresión de mRNAs virales, mediante RT-PCR semicuantitativo.
3.- Analizar expresión del mRNA de la proteína Arc durante una cinética de infección
productiva y no productiva con HSV-1 MOI 10 sobre cultivos de neuroblastoma N2a (0, 1, 2, 4,
8, 18 y 24 hpi) y cultivos de neuronas corticales (1, 4, 8, 18 y 24 hpi), mediante RT-PCR
semicuantitativo.
4.- Evaluar expresión de la proteína Arc durante una cinética de infección con HSV-1 MOI
10 sobre cultivos de neuroblastoma N2a (0, 1, 2, 4, 8, 18 y 24 hpi) y cultivos de neuronas
corticales (2, 4, 8, 18 y 24 hpi), mediante Western Blot.
5.- Evaluar expresión y localización de la proteína Arc durante una cinética de infección con
HSV-1 MOI 10 sobre cultivos de neuronas corticales (2, 4, 8, 18 y 24 hpi), mediante
inmunofluorescencia indirecta.
13
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. MATERIAL BIOLÓGICO
3.1.1. HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1
Se utilizó la cepa F del herpes simplex virus tipo 1, la cual fue donada por la Dra. María José
Martínez del Programa de Virología, Universidad de Chile. Esta cepa es utilizada como cepa de
referencia en estudios a nivel mundial debido a su reconocida neurovirulencia.
3.1.2. LÍNEAS CELULARES
Para el desarrollo de este estudio se utilizaron 2 líneas celulares:
Línea celular VERO E6 (riñón de mono verde africano Cercopithecus aethiops):
Corresponde a una línea epitelial utilizada en este trabajo para propagación y titulación viral.
Estas células se cultivaron y mantuvieron en monocapa en medio DMEM suplementado con 10%
SFB y 1% v/v penicilina/estreptomicina (100 U/mL). La incubación se realizó a 37ºC en una
atmósfera al 5% de CO2 y 95% humedad relativa.
Línea celular N2a (Neuroblastoma de ratón): Ésta línea celular se obtuvo de la American Type
Culture Collection (Manassas,USA) y se utilizó para realizar cinéticas de infección. Las células
N2a se cultivaron y mantuvieron en monocapa en medio DMEM suplementado con 10% SFB,
1% v/v penicilina/estreptomicina (100 U/mL). La incubación se realizó a 37ºC en una atmósfera
al 5% de CO2 y 95% humedad relativa.
14
3.2. REACTIVOS Y SISTEMAS COMERCIALES
Los reactivos utilizados a lo largo de este trabajo se detallan en la Tabla I.
TABLA I. Clasificación alfabética de acuerdo al nombre del fabricante de los reactivos
utilizados en este trabajo.
Nombre del Fabricante Reactivos
Abcam Anticuerpo anti-Arc
Ambion, Inc. Agua libre de nucleasas
BioAxis Bis-acrilamida
Calbiochem Dodecilo sulfato de sodio
Cell signaling Anticuerpo anti- α-tubulina
Gibco Laboratories Life Technologies, Inc. DMEM, Tripsina 10X, EDTA, B-27,
SFB, L-Glutamina 100X.
IDT Partidores forward y reverse GAPDH
Invitrogen Partidores forward y reverse para los
genes Arc, ICP27, UL23, gB, LAT y
P27. Anticuerpos anti-rabbit y anti-
mouse IgG Alexa 488 y 594.
KODAK Solución reveladora y fijadora
Merck Na2HPO4, KH2PO4, NaCl, KCl, Tris
Base
New England BioLabs, Inc. DNA ladder 100 pb
OMEGA bio-tek Kit extracción RNA E.Z.N.A
Promega ImProm-II™ Reverse Transcription
System
Santa Cruz Biotechnology, Inc. Anticuerpo monoclonal anti-ICP8.
Sigma Aldrich Poli-L-lisina.
Thermo SCIENTIFIC Membrana de nitrocelulosa 0,45 um,
anticuerpos secundarios anti-Rabbit y
anti-Mouse, Pierce BCA Protein Assay
Kit, SuperSignal West Pico
Chemiluminiscent Substrate, Suero fetal
bovino, HyClone Antibiotic Antimycotic
Solution, CL-XPosure Film
Winkler Tween-20, Temed
15
3.3. METODOLOGÍA
3.3.1. PROPAGACIÓN DE HERPES SIMPLEX VIRUS TIPO 1
Para propagar HSV-1 se utilizaron células VERO, las cuales se mantuvieron en monocapa en
medio DMEM al 10% SFB en botellas de 150 cm2. Éstas se infectaron con 1 mL de stock de
HSV-1. La adsorción del virus se realizó durante una hora, con agitación cada 10 minutos a 37ºC
y 5% CO2. Posteriormente se eliminó el medio y se incubaron las células en medio DMEM al
10% SFB hasta visualizar efecto citopático en el 95% de las células (48-72 horas post-infección).
Una vez visualizado éste efecto, las células se sometieron a ciclos de congelamiento (-80°C) y
descongelado a temperatura ambiente. Luego se centrifugó el medio a 10.000 rpm durante 5
minutos. A partir del sobrenadante se obtuvieron los stocks virales utilizados en el presente
estudio, los cuales se conservaron en alícuotas a -80°C para su posterior titulación.
3.3.2. TITULACIÓN VIRAL
A partir de una alícuota obtenida al propagar el virus, se prepararon 6 diluciones de ésta, en base
10 (X * 10 -y
). Cada dilución se agregó sobre células VERO crecidas en monocapa en placas de 6
pocillos. Esta placa se infectó 1 hora a 37oC al 5% CO2, con agitación manual cada 10 minutos.
Pasado ese tiempo, se adicionó a cada pocillo una mezcla de 1,2% agarosa en agua y DMEM 2X
al 1% SBF en una relación 1:1 y se incubó a 37°C al 5% CO2 por 72 horas. Luego se le adicionó
37% formalina + cristal violeta por 30 minutos con el fin de fijar y teñir las células. Finalmente se
eliminó la agarosa de cada pocillo. El título de la preparación viral se calculó contando el número
de placas de lisis que produjo una determinada dilución de la alícuota viral.
Cada partícula infecciosa da origen a una placa de lisis y se denomina unidad formadora de placa
(PFU). El título se expresa como PFU/mL o PFU/g, según corresponda.
16
Ejemplo de cálculo:
Título viral (PFU/mL) = No de placas de lisis
(Volumen virus x dilución del virus)
Título viral (PFU/mL) = 60
(0,5 mL x 10-5
)
1,2x107 (PFU/mL) = 60
(0,5 mL x 10-5
)
La concentración viral corresponde a 1,2x107 (PFU/mL). Para obtener un MOI de 10, es decir, 10
partículas virales infecciosas por célula, se necesita saber el número de células en la placa. Para
saber la cantidad necesaria de partículas virales para obtener un MOI 10 se realizó el siguiente
cálculo:
10PFU -------------> 1 célula
X -------------> 1*106 células
X = 1 * 107 PFU
Al saber la concentración del virus y el número de partículas virales necesarias para obtener un
MOI 10 de infección, se determinó el volumen necesario de virus que se debe agregar al medio.
1,2*107PFU --------> 1mL
1*107PFU --------> X mL
X =0,833mL
Por lo tanto, con 833 uL del virus por pocillo se obtiene un MOI de 10.
17
3.3.3. CULTIVO CELULAR
Para obtener células N2a indiferenciadas, se cultivaron y mantuvieron en botellas de 25 cm2
utilizando DMEM al 10% SFB y 1% penicilina/estreptomicina. Las células se crecieron a 37°C
al 5% CO2 y 95% de humedad.
3.3.4. CULTIVO PRIMARIO DE NEURONAS CORTICALES
Se realizó según lo descrito por Zambrano et al., 2007. Se utilizaron ratonas Rockefeller preñadas
de 18 días de gestación (provistas por el vivero del Instituto de Inmunología de la UACh). Se
sacrificaron y se disectaron las cortezas de los embriones extraídos. Se colocaron en solución
salina balanceada Hanks, suplementada con 10 mM Hepes (pH 7,4), 50 U/mL penicilina, 50
mg/mL estreptomicina y 0,5% glucosa (HBSS); eliminando manualmente las meninges. El tejido
se lavó tres veces por decantación en HBSS 1X y luego se incubó por 5 minutos a 37ºC con
0,25% tripsina. Luego se inactivó y eliminó la tripsina y se le adicionó medio DMEM al 10%
SFB para disociar el tejido mecánicamente utilizando pipetas de vidrio (5, 2 y 1 mL) y pipetas
Pasteur de mayor a menor diámetro hasta no percibir resistencia. Las células disgregadas
recolectadas del sobrenadante, se sembraron en placas de 60 mm (densidad 0,3x106 células por
placa) cubiertas con poli-L-lisina, y fueron mantenidas en DMEM suplementado con 10% SFB.
Luego de 30 minutos se cambió el medio por uno libre de suero (Neurobasal suplementado con
B27, 2 mM L-glutamina, 1% v/v penicilina/estreptomicina 100 U/mL). Pasados 3 días de
crecimiento, se agregó al medio de cultivo 1uM de AraC, un compuesto inhibidor de
proliferación celular con el fin de disminuir la presencia de células gliales. Finalmente las células
se mantuvieron durante 8 días a 37ºC en un ambiente al 5% CO2 y 95% de humedad hasta la
realización de los experimentos. Los restos no utilizados de los animales se eliminaron de
acuerdo a la Norma Institucional de Bioseguridad de la Universidad Austral de Chile.
18
3.3.5. CINÉTICA DE INFECCIÓN
Las células N2a crecieron en placas de 60 mm hasta alcanzar una confluencia de 3 x106 células
por placa, mientras que las neuronas se mantuvieron hasta alcanzar 8 días de crecimiento.
Posteriormente se realizó la infección con HSV-1 (infección productiva). Para realizar una
cinética de infección no productiva, se agregó aciclovir (50 μM) al medio de cultivo 24 horas
antes de la infección con HSV-1 y posterior a ésta con el fin de inhibir la replicación viral debido
a que la estructura de éste compuesto corresponde a un análogo sintético de guanosina que actúa
inhibiendo a la DNA polimerasa viral. La infección con HSV-1 se realizó agregando a las placas
de cultivo el volumen de virus correspondiente para alcanzar un MOI 10 de infección, el cual se
incubó durante una hora a 37ºC y 5% CO2, agitando suavemente cada 10 minutos para así poder
obtener una adsorción homogénea del virus. Posteriormente se removió el virus y se restauró el
medio de crecimiento. Inmediatamente después se extrajo la primera placa correspondiente al
tiempo 0 horas post infección (hpi). Para poner fin a la infección se aspiró el medio y se
realizaron 3 lavados con PBS 1X. Una vez finalizado este punto, las placas pueden ser utilizadas
para extracción de RNA total o proteínas. Una vez transcurrida 1 hora de infección, se extrajo la
correspondiente placa de cultivo y se realizó el procedimiento detallado anteriormente. Este
proceso se repitió a 2, 4, 8, 18 y 24 hpi en caso de células N2a y a las 4, 8, 18 y 24 hpi en caso de
neuronas. Al finalizar la cinética, se extrajo la placa correspondiente al Mock (control).
19
3.3.6. INFECTIVIDAD CELULAR
La infectividad celular fue medida utilizando la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Para
esto se cultivaron células N2a y neuronas corticales en coverslips. Ambos tipos celulares se
infectaron con HSV-1 MOI 10 a 24 hpi y posteriormente se fijaron en 4% paraformaldehído.
Después de varios lavados con PBS 1X suplementado con CaCl2 y MgCl2 (PBS 1X-CM), se
bloquearon los sitios de unión inespecíficos con 0,2% gelatina-PBS 1X-CM y se incubaros con el
anticuerpo primario contra la proteína viral temprana ICP8 1:100. Se utilizó el anticuerpo
secundario IgG Anti-Mouse monoclonal, Alexa 488, 1:300. Los núcleos fueron teñidos con
DAPI. Los coverslips se montaron en portaobjetos para su posterior análisis en microscopio de
fluorescencia OLYMPUS BX51. Todas las imágenes fueron capturadas a 40x de amplificación y
se obtuvieron 3 campos distintos por cada tiempo de infección. La unidad experimental se repitió
al menos tres veces con cultivos celulares diferentes. Una vez obtenidas las imágenes, se
contaron las células que presentaron marca de la proteína viral ICP8 a nivel nuclear utilizando el
programa Image J y se obtuvo el porcentaje de células infectadas con respecto al total de células.
Este procedimiento se realizó utilizando 3 campos diferentes por cada tiempo de infección en tres
experimentos independientes entre sí.
3.3.7. VIABILIDAD CELULAR
Para medir viabilidad celular se utilizó el método de reducción del MTT y el conteo de células
viables mediante inmunofluorescencia. El ensayo de reducción del MTT se basa en la capacidad
que tiene la enzima succínico deshidrogenasa mitocondrial en reducir el Bromuro de 3(4,5
dimetil-2-tiazoil)-2,5-difeniltetrazólico o MTT a su forma insoluble llamada formazán. Así, se
puede cuantificar la cantidad de MTT reducida mediante un método colorimétrico, ya que, como
20
consecuencia de la reacción, se produce un cambio de coloración de amarillo a azul. Por lo tanto,
mientras mayor sea la actividad de las mitocondrias, mayor es el porcentaje de viabilidad celular
esperado. Este ensayo se realizó en placas de 96 pocillos, donde se sembraron 5x104 células
neuronales por pocillo. Las células N2a se crecieron hasta alcanzar un 70% de confluencia. Las
células N2a se mantuvieron en medio DMEM sin rojo fenol, mientras que las neuronas lo
hicieron en medio neurobasal sin rojo fenol. La distribución de los compuestos en placas de 96
pocillos se ilustra en la Figura 3.
Se utilizó un control con agua debido a que el compuesto aciclovir se encuentra disuelto en este
líquido.
Veinticuatro horas antes de la infección con HSV-1 se agregó aciclovir 50 uM a los pocillos que
recibirían éste tratamiento. Una vez transcurrido el tiempo, se infectaron los pocillos
correspondientes con HSV-1 a un MOI 10 durante 1 hora a 37°C al 5% CO2, con agitación
manual cada 10 minutos. Cuatro horas antes que finalice la infección se agregó el reactivo MTT
(0,05 mg/mL). Una vez finalizada la infección se agregó dimetilformamida/SDS con el fin de
solubilizar el formazán producido. Pasadas 24 horas se midió la absorbancia a 570 nm en el lector
de placas de ELISA Multiskan EX, Thermo SCIENTIFIC. Los resultados obtenidos se
compararon en relación al Mock (control sin infección) y se calculó el porcentaje de viabilidad
tomando los valores de absorbancia del Mock como 100% de viabilidad celular.
Para realizar el ensayo de viabilidad celular utilizando la técnica de inmunofluorescencia se
cultivaron células N2a y neuronas corticales en coverslips de la misma manera como se realizó
para el ensayo de infectividad en la sección 3.3.6. Estos coverslips fueron infectados con HSV-1
a un MOI 10 a 24 hpi. Una vez finalizada la infección, las células se fijaron en 4%
paraformaldehído. Después de varios lavados con PBS 1X suplementado con CaCl2 y MgCl2
21
Figura 3: Distribución tratamientos utilizados para ensayo de reducción del MTT.
Células Células +
HSV-1 MOI 10
Células +
HSV-1 MOI 10
+
Aciclovir
Células +
Aciclovir
Células+
H2O
22
(PBS 1X-CM), se bloquearon los sitios de unión inespecíficos con 0,2% gelatina-PBS 1X-CM y
se tiñeron los núcleos con DAPI (coloración azul). Los coverslips se montaron en portaobjetos
para su posterior análisis en microscopio de fluorescencia OLYMPUS BX51. Todas las
imágenes fueron capturadas a 40x de amplificación y se obtuvieron 3 campos distintos por cada
tiempo de infección. La unidad experimental se repitió al menos tres veces con cultivos celulares
diferentes. Una vez obtenidas las imágenes, los núcleos teñidos con DAPI fueron contados
utilizando el programa Image J, utilizando como criterio que una célula viable corresponde a una
célula cuyo núcleo se encuentra teñido. Para el cálculo del porcentaje de viabilidad celular se
utilizó el promedio de células contadas en el Mock como 100% de viabilidad. Los valores
obtenidos utilizando tanto el método de reducción del MTT como la técnica de
inmunofluorescencia, se graficaron con el programa GraphPad Prism 5 utilizando el análisis
estadístico One-way ANOVA. Un valor de p<0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
3.3.8. EXTRACCIÓN RNA TOTAL.
La obtención del RNA total se realizó utilizando el kit E.Z.N.A. Una vez realizada la cinética de
infección se lavaron las placas con PBS 1X para agregarles buffer de lisis. Utilizando un rastrillo,
se despegaron las células adheridas a la placa y se transfirieron a un tubo eppendorf el cual se
centrifugó a 13000 g por 5 minutos. Luego de sucesivos traspasos por una columna provista por
el kit, se realizó la digestión con DNasa y después de varios lavados, se agregó agua DEPC con el
fin de eluir todo el RNA adherido a la columna. El RNA total extraído se almacenó a -80ºC y se
cuantificó utilizando el espectrofotómetro Nanodrop 2000.
23
3.3.9. RT-PCR SEMICUANTITATIVO
La transcripción reversa del RNA se realizó utilizando 500 ng/uL de RNA para sintetizar el
correspondiente cDNA. Esta síntesis se realizó utilizando el kit ImProm-II™ Reverse
Transcription System. Las concentraciones de cDNA obtenidas con este kit fueron de 140 ± 5
ng/uL. Posteriormente se realizó la amplificación de distintos fragmentos génicos utilizando los
partidores detallados en la Tabla II. Los compuestos y concentraciones utilizadas en todas las
reacciones de RT-PCR, así como los programas de amplificación se detallan en las Tablas III y
IV respectivamente. La temperatura de annealing utilizada para los partidores Arc, GAPDH, gB,
UL23 y P27 fue de 55°C. Para la amplificación del transcrito LAT se utilizó una temperatura de
52 °C, mientras que para amplificar el gen ICP27 la temperatura fue de 72°C.
24
TABLA II. Partidores utilizados en las reacciones de RT-PCR
Gen Secuencia (5´- 3´) Tamaño amplicón (pb)
Arc 750
Forward GGCACCCTGCAGCCCAAACT
Reverse CCTGGGCGGCAGCTAGGGTA
GAPDH 530
Forward AGGCCGGTGCTGAGTATGTC
Reverse TGCCTGCTTCACCACCTTCT
gB 192
Forward ATTCTCCTCCGACGCCATATCCACCACCTT
Reverse AGAAAGCCCCCATTGGCCAGGTAGT
LAT 200
Forward CGGCGACATCCTCCCCCTAAGC
Reverse GACAGACGAACGAAACGTTCCG
ICP27 306
Forward GTGCAAGATGTGCATCCACCACAACCTGCC
Reverse GCCAGAATGACAAACACGAAGGATGCAATG
UL23 172
Forward CAACAAAAAGCCACGGAAGT
Reverse ACACCCGCCAGTAAGTCATC
P27
Forward TTGGAGAGGGGCTGCGTTCG 444
Reverse GCTTGGGGTGCTCCGCTTGT
25
TABLA III. Componentes de las reacciones de RT-PCR
Master Mix Volumen 1X (ul/tubo) Concentración final
GoTag Flexi Buffer 5X 2,5 1X
MgCl2 25 mM 1,0 2 mM
dNTP 1 mM 1,25 0,1 mM
Partidor Forward 10 uM 0,5 0,4 uM
Partidor Reverse 10 uM 0,5 0,4 uM
GoTag DNA polimerasa 5 U/uL 0,065 1,25 U
Agua libre de nucleasas 5,685
cDNA 1 140 ng/uL
Volumen total 12,5
26
TABLA IV. Programa de amplificación para RT-PCR
Etapa de amplificación Temperatura °C Tiempo
Denaturación inicial 95 2 minutos
Denaturación 95 20 seg Repetición
Annealing Según partidor 30 seg 28
Extensión 72 1 minutos 30 seg Ciclos
Extensión final 72 10 minutos
27
3.3.10. INMUNOFLUORESCENCIA.
Las células crecieron sobre cubreobjetos redondos (coverslips) depositados al interior de placas
de cultivo de 40 mm de diámetro. Posterior a la infección, se fijaron en 4% paraformaldehído
(PFA) o metanol, dependiendo de las características de los anticuerpos a utilizar. Los coverslips
fijados en 4% PFA debieron permeabilizarse con 0,2% Tritón X-100 y luego se bloquearon con
0,2% gelatina-PBS 1X-CM a temperatura ambiente. Posteriormente se incubaron con el
anticuerpo primario diluido en gelatina-PBS 1X-CM a 37°C por 30 minutos. Se lavaron con PBS
1X y se incubaron con anticuerpos secundarios a 37°C por 30 minutos; para luego ser
nuevamente lavados e incubados con DAPI. Finalmente los coverslips, se montaron en
preparaciones con medio de montaje especial para fluorescencia y se procedió a su análisis
utilizando microscopio de fluorescencia OLYMPUS BX51 y microscopio confocal marca Zeiss
Pascal. Las imágenes fueron procesadas utilizando el programa Adobe Photoshop 8.0.
3.3.11. CUANTIFICACIÓN INTENSIDAD FLUORESCENCIA
Las fotos obtenidas con el microscopio de fluorescencia OLYMPUS BX51 fueron analizadas con
el fin de poder cuantificar la intensidad de la fluorescencia emitida por el fluoróforo Alexa 488.
En este caso se cuantificó la fluorescencia emitida del anticuerpo anti-Arc al unirse con Alexa
488. Para esto se utilizó el programa Image J, en el cual se transformaron todas las fotos a 32
bits. Posteriormente se seleccionó el área total de la fotografía a cuantificar y se obtuvieron
valores correspondientes al área seleccionada, promedio de pixeles cuantificados y el valor de
IntDen, el cual corresponde al Área x pixeles totales. Para corregir el valor de
inmunofluorescencia, se seleccionaron cinco regiones en la fotografía donde no se aprecia
fluorescencia y se determinó el valor del promedio de los pixeles medidos. Esto se realizó con el
28
fin de eliminar el background de la fotografía y obtener el valor real de fluorescencia. El valor de
fluorescencia total corregida (CTCF) se obtuvo utilizando la siguiente fórmula.
CTCF = IntDen – (Área seleccionada x Promedio de fluorescencia del background)
Este procedimiento se realizó en 5 campos por tiempo de infección en 3 cinéticas de infección
distintas. Posteriormente los valores se graficaron utilizando el programa GraphPad Prism 5.
3.3.12. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Los resultados obtenidos representan al menos tres experimentos separados. La cuantificación de
éstos resultados se realizó utilizando el programa Image J, mientras que los datos obtenidos se
graficaron en el programa GraphPad Prism 5 utilizando el análisis estadístico One-way ANOVA.
Un valor de p<0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
29
4. RESULTADOS
4.1 CULTIVOS CELULARES
Para el desarrollo de todos los experimentos realizados en este trabajo, fue necesario realizar un
correcto cultivo de células N2a y neuronas corticales. Para esto, se observó la morfología celular
característica de cada cultivo. Las células N2a presentan una forma redondeada de acuerdo a su
estado indiferenciado (Figura 4 A). En lo que respecta a los cultivos de neuronas corticales, a los
8 días de incubación in vitro, se observó desarrollo de procesos dendríticos característicos de
estos cultivos (Figura 4 B). Además, como marcador del estado celular proliferativo, se evaluó
expresión de un inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas (cdk), p27, cuya función es
impedir la proliferación celular. Mediante RT-PCR semicuantitativo se observó diferencias
significativas (P= 0,0418) en la expresión del mRNA de p27 entre células N2a y neuronas
corticales. Así se determinó que células en proliferación N2a expresan una menor cantidad de
p27 en comparación con células neuronales cuya proliferación se encuentra detenida (Figura 4
D).
30
Figura 4: Caracterización de cultivos celulares (A) Células de neuroblastoma N2a después de
3 días de proliferación. (B) Cultivos de neuronas corticales mantenidas 8 días en condiciones
óptimas de crecimiento. Ambas imágenes corresponden a cultivos celulares sin infección.
Magnificación 25X. (C) Expresión del mRNA p27 en cultivos de células N2a y neuronas
corticales. (D) Análisis densitométrico de los datos obtenidos en B, normalizado con GAPDH. La
unidad experimental se repitió tres veces con cultivos celulares diferentes. Un valor de P<0.05
fue considerado estadísticamente significativo al comparar los niveles de p27 en neuronas con
respecto a células N2a. *P<0,05.
A B
Cultivo células N2a Cultivo neuronas corticales
p27
GAPDH
Cél. N2a Neuronas (-)
D C
Cél
ulas
N2a
Neu
ronas
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
P27/G
AP
DH
31
4.2 INFECTIVIDAD CELULAR
Con el fin de comprobar que HSV-1 es capaz de infectar cultivos de células N2a y de neuronas
corticales, se realizó una infección de ambos tipos celulares crecidos en coverslips con
HSV-1 MOI 10 a 24 hpi. Se eligió este tiempo de infección debido a que es el tiempo de
infección más extenso utilizado en este trabajo. Además se realizó un control sin infectar
(Mock). A las 24 hpi se evidencia ubicación nuclear de la proteína viral ICP8, lo que determina la
infección celular. Al calcular el porcentaje de células N2a infectadas se obtuvo un 67,9% de
células infectadas con respecto a un control de células sin infectar, mientras que en células
neuronales el porcentaje fue de 62,3% (Figura 5).
32
Figura 5. Infectividad de HSV-1 en cultivos celulares. Inmunofluorescencia de una cinética de
infección con HSV-1 MOI 10, utilizando un anticuerpo contra la proteína viral ICP8 (verde).
Para teñir núcleos se utilizó DAPI (azul). (A) Cultivo células N2a y (B) Neuronas corticales
infectadas a 24 hpi. (C) y (D) Gráficas que muestran el porcentaje de células N2a y neuronas
infectadas respectivamente. La unidad experimental se repitió tres veces con cultivos celulares
diferentes.
Mock 24 hpi
Merge
ICP8
DAPI
Mock 24
0
20
40
60
80
100
hpi
Neuronas%
neu
ron
as in
fecta
das
Neuronas
B
Células N2a
A Mock 24 hpi
Merge
ICP8
DAPI
Mock 24
0
20
40
60
80
100
hpi
Células N2a
% c
élu
las N
2a in
fecta
das
33
4.3 CONTROL DE INFECCIÓN
4.3.1 INFECCIÓN PRODUCTIVA
Con el fin de comprobar que HSV-1 infecta correctamente ambos tipos celulares, se realizaron
cinéticas de infección a cultivos de células N2a (Figura 6) y neuronas corticales (Figura 7). Se
utilizaron partidores contra ICP27 para determinar expresión de genes inmediatamente
tempranos, UL23 para determinar genes de expresión temprana, glicoproteína B (gB) para
determinar genes de expresión tardía y contra el transcrito LAT para determinar fase de latencia,
evidenciando que en ambos cultivos celulares se genera la amplificación de los genes virales, lo
que comprueba una correcta infección debido a que los genes virales se están expresando en
forma de una cascada regulada. Estos resultados en conjunto con los resultados de infectividad
obtenidos en el punto 4.2 validan aún más este modelo de infección productiva.
4.3.2 INFECCIÓN NO PRODUCTIVA
Para validar un modelo de infección no productiva se determinó la expresión de los mismos
marcadores utilizados en el punto 4.3.1 pero en presencia de aciclovir. En los cultivos de células
N2a (Figura 8) no fue posible evidenciar mediante RT-PCR expresión del gen temprano UL23 y
del transcrito LAT, mientras que en cultivos primarios neuronales (Figura 9), se observó una
disminución en los niveles de expresión en todos los marcadores virales utilizados con respecto a
una infección productiva.
34
Figura 6: Expresión de mRNAs virales en infección productiva con HSV-1 en células N2a.
(A) Expresión de genes virales ICP27, UL23, gB y LAT mediante RT-PCR semi-cuantitativo
utilizando GAPDH como normalizador. (B, C, D y E) Análisis densitométrico de los valores
obtenidos en A. Un valor P<0,05 fue considerado estadísticamente significativo con respecto a
0 hpi. La unidad experimental se repitió tres veces con cultivos celulares diferentes. (-): Control
negativo (sin templado); M: Mock (control sin infección). **P<0,01; ***P<0,001.
A
B C
D E
Células N2a
Infección productiva
Mock 0 1 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
**
****** *** ***
***
ICP27/G
APDH
Mock 0 1 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
***
***
****
UL
23/G
AP
DH
Mock 0 1 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
**
***
gB/G
APDH
Mock 0 1 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
******
LAT/GAPDH
35
Figura 7: Expresión de mRNAs virales en infección productiva con HSV-1 en cultivos
neuronales. (A) Expresión de genes virales ICP27, UL23, gB y LAT mediante RT-PCR semi-
cuantitativo utilizando GAPDH como normalizador. (B, C, D y E) Análisis densitométrico de los
valores obtenidos en A. Un valor P<0,05 fue considerado estadísticamente significativo con
respecto a 0 hpi. (-): Control negativo (sin templado); M: Mock (control sin infección). *P<0,05;
**P<0,01; ***P<0,001.
A
B
D
C
E
Neuronas
Infección productiva
Mock 1 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
***** *** ***
ICP
27/G
AP
DH
Mock 1 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
* ***
gB
/GA
PD
H
Mock 1 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
** *** ******
UL
23/G
AP
DH
Mock 1 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
*** **
***
LA
T/G
AP
DH
36
Figura 8: Expresión de mRNAs virales en una infección no productiva con HSV-1 en
células N2a. (A) Expresión de genes virales ICP27, UL23, gB y LAT mediante RT-PCR semi-
cuantitativo. GAPDH se utilizó como control de carga. (B y C) Gráficos que representan niveles
de expresión de los genes ICP27 y gB. Un valor de P<0,05 fue considerado estadísticamente
significativo con respecto a 0 hpi. La unidad experimental se repitió tres veces con cultivos
celulares diferentes. (-): Control negativo (sin templado); M: Mock (control sin infección).
*P<0,05; **P<0,01
C B
Mock 0 1 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
gB
/GA
PD
H
Células N2a
Infección no productiva
Mock 0 1 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
** ****
* *
ICP27/G
APDH
A
37
Mock 1 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
LA
T/G
AP
DH
Figura 9: Expresión de mRNAs virales en infección no productiva con HSV-1 en células
neuronales. (A) Expresión de genes virales ICP27, UL23, gB y LAT mediante RT-PCR semi-
cuantitativo utilizando GAPDH como control de carga. (B, C, D y E) Gráficos que representan
niveles de expresión de los genes ICP27, UL23, gB y LAT respectivamente. Un valor de P<0,05
fue considerado estadísticamente significativo con respecto a 0 hpi. La unidad experimental se
repitió tres veces con cultivos celulares diferentes. (-): Control negativo (sin templado); M: Mock
(control sin infección).
Mock 1 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
ICP
27/G
AP
DH
Mock 1 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
gB
/GA
PD
H
Mock 1 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
UL
23/G
AP
DH
B C
D E
Neuronas
Infección no productiva
A
38
4.4 VIABILIDAD CELULAR
Una vez comprobada la infección de ambos tipos celulares a 24 hpi, se determinó si transcurridas
24 horas de infección, las células N2a y neuronas permanecen viables ya que es posible que la
carga viral aplicada a los cultivos sea demasiada y genere la muerte de todas las células,
imposibilitando la detección de mRNA y proteína Arc. Para determinar viabilidad celular se
utilizó el método de reducción del MTT y el conteo de células viables por inmunofluorescencia.
Para llevar a cabo el método de reducción del MTT se utilizaron cultivos de células en
proliferación N2a y cultivos primarios de neuronas corticales, los cuales se infectaron con HSV-1
MOI 10 durante 24 horas. Utilizando el Mock como 100% de viabilidad celular, se determinó que
en una infección productiva a 24 hpi, el porcentaje de células N2a viables fue de un 75% (Figura
10 A) y un 85% en neuronas corticales (Figura 10 B). En una infección no productiva, es decir,
utilizando un inhibidor de la replicación viral (aciclovir), el porcentaje de células N2a vaibles fue
de un 80% (Figura 10 A), mientras que en neuronas corticales este valor fue de un 87% (Figura
10 B) con respecto al control sin infección. Tanto en células N2a como en neuronas corticales no
se obtuvieron diferencias significativas al comparar los porcentajes de viabilidad en una
infección productiva y no productiva.
Teniendo en cuenta que una célula viable corresponde a una célula que presenta tinción nuclear,
se determinó la cantidad de células que presentan tinción nuclear después de 24 hpi. Así, se
obtuvo que un 57,9% de células N2a presentaban tinción con DAPI en comparación con la
cantidad de células calculadas en un control sin infección (100% viabilidad) (Figura 11 C). El
mismo procedimiento se realizó en neuronas corticales, obteniéndose un porcentaje del 48,5% de
células con tinción nuclear (Figura 11 D).
39
Figura 10. Ensayo de viabilidad celular utilizando método de reducción del MTT. Viabilidad
celular en distintos tratamientos como infección con HSV-1 a un MOI 10 (24 hpi) y presencia de
aciclovir (50 uM). (A) Grafica que muestra porcentaje de viabilidad en células N2a y (B) en
neuronas corticales. Los valores obtenidos corresponden a 3 experimentos independientes entre
sí. Un valor de P<0,05 fue considerado estadísticamente significativo con respecto al Mock.
*P<0,05; **P<0,01
Mock
Agua
destil
ada
HSV-1
HSV-1
+ A
cicl
ovir
Aci
clovi
r
0
50
100
150
Células N2a
*** ***
% v
iab
ilid
ad
celu
lar
Mock
Agua
destil
ada
HSV
-1
HSV
-1 +
Aci
clovi
r
Aci
clovi
r
0
50
100
150
Neuronas
*
% v
iab
ilid
ad
celu
lar
A
B
40
Figura 11. Cálculo de viabilidad celular mediante inmunofluorescencia. Inmunofluorescencia
de una cinética de infección con HSV-1 MOI 10 cuyos núcleos fueron teñidos con DAPI. (A)
Células N2a y (B) neuronas corticales infectadas por 24 horas. (C) y (D) Gráficas que
representan el porcentaje de células viables después de 24 horas de infección en células n2a y
neuronas respectivamente. Los valores obtenidos representan 3 experimentos independientes
entre si. Un valor de P<0,05 fue considerado estadísticamente significativo con respecto al Mock.
**P<0,01, ***P<0,001.
DAPI
Mock 24 hpi
Neuronas
B
Mock 24
0
20
40
60
80
100
hpi
***
Neuronas
% v
iab
ilid
ad
celu
lar
Células N2a
A Mock 24 hpi
DAPI
D
Mock 24
0
20
40
60
80
100
hpi
**
Células N2a
% v
iab
ilid
ad
celu
lar
C
41
4.5 EXPRESIÓN DEL TRANSCRITO Y PROTEINA ARC
Una vez que se evidenció infección con producción de proteínas virales, se procedió a determinar
si la infección con HSV-1 altera la expresión del mRNA y de la proteína Arc. Para esto, se
realizaron ensayos de RT-PCR semicuantitativo y Western Blot respectivamente. Como se
observa en la Figura 12 A, una infección productiva con HSV-1 en células N2a no genera
cambios significativos en la expresión del mRNA de Arc con respecto al Mock en ningún tiempo
de infección. Lo mismo ocurre bajo tratamiento con aciclovir para generar infección no
productiva o latente (Figura 12 C). Sin embargo, al realizar el mismo ensayo en cultivos
primarios de neuronas corticales se observaron diferencias significativas en la expresión del
mRNA de Arc desde 1 hpi hasta 24 hpi (Figura 13 A), evidenciando un aumento en los niveles de
Arc con respecto al Mock. En cuanto a la expresión de la proteína Arc, en células N2a, no se
evidencian cambios significativos con respecto al Mock (Figura 14 A). En cultivos neuronales la
proteína Arc presenta una tendencia a aumentar su expresión con respecto al control en horas
tempranas de infección (2 y 4 hpi), sin embargo estos resultados no son significativos.
Posteriormente los niveles se normalizan a los encontrados en el mock (Figura 14 C).
42
Figura 12: Expresión de mRNA Arc en infección productiva y no productiva con HSV-1 en
células N2a. (A) y (C) RT-PCR semi-cuantitativo del mRNA de Arc durante una cinética de
infección productiva y no productiva respectivamente. (B y D) Gráficas de los valores obtenidos
en la Figura A y C respectivamente, en las cuales no se aprecian diferencias significativas. La
unidad experimental se repitió tres veces con cultivos celulares diferentes. Un valor P<0,05 fue
considerado estadísticamente significativo con respecto al Mock. (-): Control negativo (sin
templado); M: Mock (control sin infección). *P<0,05.
Mock 0 1 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
Arc/G
APDH
Mock 0 1 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
hpi
Arc/G
APDH
A
B
C D
Células N2a
Infección productiva
Células N2a
Infección no productiva
C
43
Figura 13: Expresión de mRNA Arc en infección productiva y no productiva con
HSV-1 en cultivos primarios de neuronas corticales. (A y C) RT-PCR semi-cuantitativo del
mRNA de Arc durante una cinética de infección productiva y no productiva respectivamente. (B
y D) Gráfico de los valores obtenidos en las Figuras A y C respectivamente. La unidad
experimental se repitió al menos tres veces con cultivos celulares diferentes. Un valor P<0,05 fue
considerado estadísticamente significativo con respecto al Mock. (-): Control negativo (sin
templado); M: Mock (control sin infección). * P<0,05; ***P< 0,001.
Mock 1 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
******
******
***
hpi
Arc
/GA
PD
HA
C
B
(-) M 1 4 8 18 24 hpi Neuronas
Arc
GAPDH
C
D
Mock 1 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
*
Arc
/GA
PD
H
Neuronas
Infección productiva
Neuronas
Infección no productiva
44
Mock 1 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
Arc
/tu
bu
lin
a
Figura 14: Expresión de la proteína Arc en infección productiva en células N2a y neuronas
corticales. (A y C) Inmunodetección de la proteína Arc en extractos proteicos totales de cultivos
de células N2a y neuronas infectadas a MOI 10. (B y D) Gráfica de los valores obtenidos en las
Figuras A y C respectivamente. En ambos gráficas fue utilizado α-tubulina como normalizador.
La unidad experimental se repitió al menos tres veces con cultivos celulares diferentes. Un valor
de P<0,05 fue considerado estadísticamente significativo con respecto al mock.
B M 1 2 4 8 18 24 hpi
Células N2a
Arc
Tubulina
ICP8
A
M 2 4 8 18 24 hpi Neuronas
Arc
Tubulina
ICP8
C
D
Neuronas
Infección productiva
Células N2a
Infección productiva
D
Mock 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
hpi
Arc
/tu
bu
lin
a
45
4.6 DISTRIBUCIÓN Y EXPRESIÓN DE FLUORESCENCIA DE LA PROTEÍNA ARC
Debido a que los ensayos de RT-PCR y Western Blot utilizando células N2a no evidenciaron
diferencias significativas en los niveles de Arc, se utilizaron cultivos primarios de neuronas
corticales para determinar distribución y localización celular de la proteína Arc ya que en este
tipo de cultivos se generaron diferencias significativas con respecto al Mock al analizar niveles
del mRNA y de la proteína Arc. En la Figura 15 A se evidencia localización nuclear de la
proteína Arc en el Mock, la cual aumenta a las 2-4 hpi. A medida que avanza la infección se
observa una distribución de Arc en la región perinuclear (2-4 hpi) y citoplasmática (8-18 hpi). A
las 24 horas post-infección se aprecia una disminución de la inmunotinción para Arc, aunque
mantiene su localización a nivel perinuclear y citoplasmático. Al cuantificar la intensidad de
fluorescencia de Arc se observó un aumento significativo en los niveles de fluorescencia emitida
a las 2 y 4 hpi, los cuales disminuyeron hasta alcanzar niveles cercanos al Mock en los tiempos
18 y 24 hpi (Figura 15 B).
46
Figura 15 A. Distribución subcelular de la proteína Arc y cuantificación fluorescencia de
neuronas infectadas con HSV-1. (A) Las células se incubaron con anticuerpo anti-Arc
policlonal, detectadas con Alexa 488 y visualizadas mediante microscopia de
inmunofluorescencia. Se utilizó metanol como fijador. Las flechas rojas indican zonas de
acumulación nuclear de Arc. Cada imagen es representativa de tres experimentos independientes.
Aumento 100x.
A
Arc
Dapi
Merge
Mock 2 hpi 4 hpi
47
Continuación Figura 15 A.
Arc
Dapi
Merge
8 hpi 18 hpi 24 hpi
48
Mock 2 4 8 18 24
0
5000000
10000000
15000000
20000000
***
*
hpi
N°
pix
ele
s in
mu
no
flu
ore
scen
cia
to
tal A
rc
Figura 15 B. Distribución subcelular de la proteína Arc y cuantificación fluorescencia de
neuronas infectadas con HSV-1. (B) Grafica de la cuantificación de los niveles de fluorescencia
emitida al detectar la proteína Arc en una cinética de infección. La unidad experimental se repitió
tres veces con cultivos celulares diferentes. Un valor de P<0,05 fue considerado estadísticamente
significativo con respecto al Mock. *P<0,05; ***P<0,001.
B
49
5. DISCUSIÓN
Si bien se sabe que una infección por HSV-1 afecta la integridad de neuronas del SNC, poco se
conoce el efecto que esta infección tiene sobre proteínas relacionadas con plasticidad sináptica,
cuya función principal es actuar reforzando y/o favoreciendo la formación de conexiones
neuronales. Una de estas proteínas es la proteína asociada a citoesqueleto regulada por actividad
sináptica, Arc.
Con el fin de determinar si se generan cambios en la expresión del transcrito y proteína Arc en
una infección productiva con HSV-1 se utilizaron células de neuroblastoma de ratón en estado
indiferenciado y neuronas corticales de ratón. Además, al utilizar dos cultivos celulares distintos
fue posible determinar si la expresión de Arc varía según el estado de diferenciación neuronal y
por consecuencia, se pudo determinar el cultivo celular adecuado para estudiar expresión de esta
proteína.
La línea celular N2a tiene la característica de generar precursores neuronales, bajo ciertos
estímulos como deprivación de suero, tratamiento con acido retinoico u hormona T3, entre otros
(Perez-juste y Aranda, 1999), mientras que al utilizar un cultivo primario de neuronas corticales
se obtienen neuronas sin necesidad de algún estímulo. Para desarrollar correctos cultivos
celulares se midieron los niveles del mRNA del gen p27, correspondiente a un inhibidor de
quinasa dependiente de ciclina (cdk) con el fin de determinar el estado indiferenciado de células
en proliferación como es el caso de células N2a y el estado diferenciado de neuronas corticales.
Como se observa en la Figura 4, existe un aumento significativo en los niveles de p27 en cultivos
neuronales en comparación con cultivos celulares N2a, determinando el estado proliferativo e
indiferenciado de las células N2a. Así mismo los altos niveles de p27 alcanzados en cultivos
50
primarios neuronales se pueden relacionar con un estado de diferenciación alcanzado por
neuronas corticales.
Una vez caracterizados los cultivos celulares, se determinó que el virus utilizado es infectivo ya
que como se observa en la en la Figura 5, las células N2a presentaron un 67,9% de infectividad,
mientras que en neuronas, el porcentaje llegó a un 62% transcurridas 24 hpi. Debido a que la
viabilidad celular se determinó utilizando dos técnicas, se obtuvieron valores de viabilidad
distintos. Mediante el ensayo de reducción del MTT se obtuvo un porcentaje de viabilidad del
75%, en células N2a mientras que en neuronas fue de 85%. Al contar núcleos celulares teñidos
con DAPI, se observó una disminución del 50% en la viabilidad celular en neuronas con respecto
al Mock, mientras que en células N2a el porcentaje de viabilidad celular calculado fue de 57,9%.
Las diferencias observadas en los porcentajes de viabilidad celular utilizando ambas técnicas
pueden deberse a que el método de reducción del MTT se basa en la capacidad de las
mitocondrias para metabolizar el MTT. Según lo postulado por nuestro grupo de laboratorio, en
una infección por HSV-1, se activaría la maquinaria que participa en procesos de biogénesis
mitocondrial en etapas tempranas y tardías de la infección. Así, al aumentar la función
mitocondrial, también estaría aumentando en número de mitocondrias en células infectadas con
HSV-1, lo que se traduciría en una mayor funcionalidad. Es por esto que la determinación de la
viabilidad celular detectada mediante el método de reducción del MTT, no corresponde a la
sobrevida celular sino que a la función mitocondrial. Teniendo en cuenta todos estos antecedentes
es que se llegó a la conclusión que el método de reducción del MTT no es el ensayo adecuado
para determinar viabilidad celular en este modelo de infección.
Los valores de viabilidad celular obtenidos utilizando el tratamiento con aciclovir en ambos
cultivos no generaron diferencias significativas con respecto a cultivos sin tratamiento con este
51
compuesto debido a que el aciclovir utilizado en este trabajo se encontraba defectuoso al
momento de su utilización, lo cual se comprobó al utilizar un nuevo Aciclovir (VER ANEXO,
Página 71).
5.1 CONTROL DE LA INFECCION
Una infección productiva con HSV-1 se caracteriza por la transcripción regulada de los genes
virales por lo tanto al evidenciar expresión de genes en cada etapa de la replicación viral, se
puede inferir que se realizó una correcta infección. Al analizar la expresión de mRNA virales, se
observó que tanto en células N2a como en neuronas corticales todos los genes virales se expresan
en los cultivos como se aprecia en las Figuras 6 y 7. Por otro lado al analizar la expresión de
genes durante el modelo de infección no productiva, se observan cambios en la expresión de los
genes virales en células N2a en comparación con la infección productiva. Se evidencia presencia
del mRNA de expresión inmediata ICP27 (Figura 8 B), el cual no necesita transcripción previa de
genes para su expresión. Sin embargo, se evidencian bajos niveles de expresión de gB en
comparación con infección productiva en células N2a. Esto puede deberse al estado proliferativo
en el cual se encuentran las células N2a, por lo que puede ser posible que una dosis de aciclovir
en el medio de cultivo no sea suficiente para mantener el efecto inhibitorio durante toda la
infección ya que estudios sobre el metabolismo de aciclovir en células VERO infectadas con
HSV-1 han determinado que el peak del producto aciclovir-trifosfato capaz de inhibir a la DNA
polimerasa viral es de 8 hpi el que posteriormente decrece rápidamente probablemente por
degradación de esta molécula, disminuyendo así la capacidad inhibidora de la replicación viral
(Colby et al., 1981). A principio de los años 80 se desarrollaron varios estudios sobre la acción de
aciclovir principalmente en células epiteliales como células VERO o WI38 (Fibroblastos
embrionarios humanos). Al testear el efecto generado por aciclovir en diferentes tipos celulares,
52
Furman y colaboradores determinaron que la sensibilidad del aciclovir en cultivos celulares
infectados con HSV-1 se encuentra íntimamente relacionada con el tipo celular infectado
(Furman et al., 1981), es por esto que, si bien en células VERO el peak del efecto inhibitorio del
aciclovir se obtiene a las 8 hpi, en células N2a o neuronas éste peak podría variar en comparación
con células Vero y ocurrir antes de las 8 hpi por lo que en horas tardías de la infección se podrían
observar transcritos virales.
En cultivos primarios neuronales, a diferencia de lo ocurrido en células N2a, al utilizar aciclovir,
se expresaron todos los genes virales analizados pero en menor cantidad en comparación con una
infección productiva. Probablemente este resultado se deba a que el aciclovir utilizado en este
trabajo se encontraba defectuoso. Debido a que este problema fue detectado al final de este
trabajo, no fue posible realizar todos los experimentos nuevamente. Sin embargo si fue posible
realizar experimentos preliminares con el nuevo aciclovir para demostrar que una concentración
de 50uM induce el período de latencia viral caracterizado por un aumento en los niveles del
transcrito LAT (Ver ANEXO). Como se aprecia en la Figura 8 no se evidencia presencia del
transcrito LAT al tratar los cultivos de células N2a con aciclovir, mientras que en neuronas
corticales (Figura 9) sí se observó presencia de LAT. Al comparar los resultados de RT-PCR de
LAT en cultivos neuronales tratados con aciclovir de distinta marca comercial se evidencia un
patrón diferente en la expresión. El aciclovir preparado al final de este trabajo (Aciclovir 2)
genera un aumento en los niveles del transcrito LAT el cual es más evidente en 18 y 24 hpi,
mientras que el aciclovir con el cual se realizó esta tesis (Aciclovir 1) no genera el mismo efecto
(Figura 16). Teniendo en cuenta que el compuesto aciclovir actúa inhibiendo la replicación viral
y favoreciendo la entrada en latencia de HSV-1 es que se puede concluir que los resultados
obtenidos con Aciclovir 2 deben repetirse para así poder establecer una correcta infección latente.
53
5.2 CAMBIOS DE EXPRESION DE PROTEINA ARC
El gen Arc es un gen versátil y finamente regulado, capaz de acoplarse a cambios en la actividad
neuronal. Una de sus funciones mejor descritas es la participación en almacenaje de información
en el sistema nervioso. Guzowski y colegas demostraron mediante estudios in vivo que al utilizar
Arc antisense (AS) en la región hipocampal de ratas, se impide un correcto desarrollo de la
memoria a largo plazo en estos animales (Guzowski et al., 2000; Messaoudi et al., 2007).
Además ratones knockout de Arc mostraron impedimento para generar aprendizaje,
reconocimiento de objetos, audición, entre otros (Plath et al., 2006). Todos estos procesos
impedidos por el mal funcionamiento de la proteína Arc involucran procesos de plasticidad
sináptica con el fin de generar o reforzar conexiones neuronales para poder almacenar o procesar
lo aprendido. El mRNA de Arc se sintetiza en respuesta a actividad neuronal y es transportado
rápidamente en lugares del árbol dendrítico donde se genera la sinapsis con el fin de traducirse.
En una infección con HSV-1 a nivel del SNC hasta la fecha no existe evidencia de lo que ocurre
con los niveles génicos ni proteicos de Arc. Existe un modelo propuesto por Rosi et al., 2011, en
el cual se relaciona la activación de la transcripción de Arc con eventos neuroinflamatorios, en el
cual se propone que al activarse las microglias en un modelo in vivo utilizando diversos
inductores como LPS, interferón γ y citoquinas proinflamatorias, éstas enviarían señales al
astrocito con el fin de generar una salida de glutamato hacia el espacio sináptico y gatillar la
transcripción de Arc. Debido a que esto solamente es un modelo de lo que podría ocurrir con Arc
en neuroinflamación, lo único que se ha podido demostrar es que aumentos (Lacor et al., 2004;
Rosi et al.,2009, 2005b, 2006) o disminuciones (Frank et al., 2010; Hein et al., 2010; Rosi et al.,
2008, 2012) anormales del gen Arc resultan en alteraciones de las funciones cognitivas.
54
Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por generar pérdida en las sinapsis
neuronales, acortamiento de los terminales axonales, el cual se acompaña de una disminución en
el transporte intracelular generando una perdida en la memoria y función cerebral (Mandelkow et
al., 2003). Al utilizar cultivos neuronales de ratón infectados con HSV-1, Zambrano y
colaboradores determinaron que este virus genera cambios en la dinámica del citoesqueleto y
daño neurodegenerativo, caracterizado por una hiperfosforilación de la proteína Tau (Zambrano
et al., 2008). La hipótesis generada en este trabajo es que una infección productiva con HSV-1
altera la expresión de Arc debido al carácter neurotrópico de este virus. Debido al daño que
genera el virus sobre proyecciones neuronales es que Arc puede tener una función importante en
la reparación del daño viral generado. Como se observa en la Figura 13 B, en una infección
productiva con HSV-1, a nivel neuronal los niveles del transcrito Arc aumentan
significativamente con respecto al Mock. Lo más destacable es que se aprecia un incremento en
el mRNA de Arc en las primeras horas post-infección. Esta rápida transcripción de Arc también
ha sido establecida en neuronas de roedores posterior a diversos estímulos como generación de
convulsiones, aprendizaje e inducción de potenciación a largo plazo (LTP) utilizando un estímulo
de alta frecuencia (HFS) o factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (Link et al., 1995;
Lyford et al., 1995; Steward et al., 1998; Waltereit et al., 2001; Ying et al., 2002; Kubik et al.,
2007). Al estimular la transcripción de Arc, el mRNA es posible detectarlo después de 1 hora de
generado el estímulo en dendritas distales de neuronas del giro dentado (Link et al., 1995; Lyford
et al., 1995; Steward et al., 1998; Wallace et al., 1998).
Durante la infección por HSV-1 los niveles de Arc se mantuvieron aumentados con respecto al
Mock durante toda la infección, siendo significativos en todos los puntos, incluso a 24 hpi.
Debido a que durante todos los tiempos, la infección es de tipo productiva, las sinapsis
55
excitatorias se estarían generando durante toda la infección, por ende no dejaría de gatillar la
transcripción de Arc. Este aumento sostenido en Arc puede deberse también a que en una
infección por HSV-1, las neuronas infectadas podrían estar enviando señales a neuronas vecinas
para alertarlas que están siendo infectadas, generando aún más estas sinapsis. Estudios utilizando
neurotoxinas con el fin de comparar el efecto que generan en neuronas granulosas y células N2a
sobre la homeostasis del Ca+2
, determinaron que las células N2a no expresan receptores de
glutamato NMDA ya que al estimular las células N2a con diferentes neurotoxinas los niveles de
calcio no variaron a diferencia de lo ocurrido en neuronas granulosas donde el Ca+2
intracelular
aumentó drásticamente y se generó un efecto neurotóxico en la célula (LePage et al., 2005).
Como se observa en la Figura 12 A, en células N2a no se genera un aumento significativo en los
niveles del mRNA Arc probablemente por la nula expresión que tienen los receptores NMDA en
estas células, por lo que los niveles de mRNA encontrados en las células durante toda la infección
pueden ser niveles basales de Arc, ya que al no expresar receptores NMDA, no se generaría un
flujo de Ca+2
que gatillaría su transcripción. Si relacionamos lo observado en la Figura 13 A con
lo observado en la Figura 14 C, se evidencia un aumento en los niveles del transcrito Arc que se
correlaciona con el aumento en los niveles proteicos de Arc a horas tempranas de la infección.
Sin embargo la cantidad de proteína Arc no se sostiene durante toda la infección y disminuye
gradualmente (Figura 14 C). Al cuantificar la intensidad de la fluorescencia emitida por Arc a
distintos tiempos de infección (Figura 15 B) se obtuvo el mismo resultado evidenciado en
ensayos de Western Blot, lo que se correlaciona con lo obtenido por RT-PCR ya que los niveles
del mRNA de Arc aumentaron significativamente después de 1 hora de infección, mientras que el
aumento en los niveles proteicos de Arc se evidencia desde las 2 a las 8 hpi. En los tiempos 18 y
24 hpi los niveles proteicos de Arc se reestablecen como los observados en el Mock. Sin embargo
56
al analizar los niveles de mRNA, se evidencia aumento significativo en tiempos 18 y 24 hpi, lo
que no se correlaciona con los niveles proteicos encontrados. Esto puede deberse a que Arc, al ser
una proteína que se traduce en regiones del árbol dendrítico no pueda traducirse normalmente
debido a que en horas tardías de infección estos procesos dendríticos pierden el largo normal o se
destruyen, impidiendo la traducción de esta proteína ya que en cultivos neuronales y gliales
infectados con HSV-1 se genera un deterioro de los procesos dendríticos además de una
alteración de la dinámica microtubular, indispensables para el correcto funcionamiento de
procesos neuronales (Otth et al., 2009). Es más, se ha demostrado que al inhibir
farmacológicamente la enzima MNK1 se bloquea la expresión de la proteína Arc pero no del
mRNA (Panja et al., 2008), por lo que no es extraño que los niveles de mRNA permanezcan
aumentados durante la infección a diferencia de los niveles proteicos.
Existen estudios en los cuales se ha detectado presencia de la proteína Arc en dendritas y también
en el núcleo de células como neuronas hipocampales, HEK 293T, COS7, entre otras. (Wang et
al., 2004; Irie et al., 2000). Su función en el núcleo todavía permanece en un enigma pero se ha
logrado determinar por inmunofluorescencia que Arc co-localiza con cuerpos nucleares o ND10
debido a que Arc interacciona con β-espectrina (Bloomer et al., 2007), la cual se asocia a cuerpos
nucleares y matriz nuclear (Tse et al., 2001). En la Figura 15 A se observa que al realizar una
inmunofluorescencia utilizando Arc y DAPI, se evidencia ubicación principalmente nuclear de la
esta proteína en zonas de inmunofluorescencia muy concentrada, coincidiendo con lo demostrado
por Bloomer et al., 2007, donde se obtiene el mismo patrón de fluorescencia al co-localizar Arc y
cuerpos nucleares. A estos cuerpos les han atribuido varias funciones como actuar como sitios de
almacenaje y liberación de proteínas, sitios para modificaciones post-traduccionales, activación y
represión de la transcripción y formación de heterocromatina (Zhong et al., 2000a; Borden,
57
2002). También se ha demostrado que responden frente a virus de DNA doble hebra como HSV-
1. Debido a que los cuerpos nucleares es posible encontrarlos entre cromosomas (Plehn-
Dujowich et al., 2000), es posible que exista un espacio reducido entre el núcleo de la partícula
viral y el DNA de la célula hospedera lo que impediría la transcripción y posterior replicación
viral. Es por esto que existe una posibilidad que la interacción entre el genoma viral y los factores
de transcripción asociados a cuerpos nucleares puedan afectar la eficiencia de la infección viral
en etapas tempranas. Aunque existen trabajos que apoyan esta hipótesis, ésta todavía sigue siendo
controversial. Como se aprecia en la Figura 15, a medida que avanza la infección, el patrón
puntiforme de fluorescencia se va perdiendo, posiblemente debido a que el efecto antiviral
generado por estos cuerpos es inhibido por la proteína viral ICP0. Esta proteína tiene actividad
ubiquitin E3 ligasa induciendo la degradación de la proteína PML, principal proteína estructural
de estos cuerpos nucleares. Como Arc es una proteína que co-localiza con estos cuerpos, no es
extraño evidenciar también una dispersión en el patrón de fluorescencia de esta proteína, al ser
infectados con HSV-1. A pesar del efecto generado por el virus a nivel nuclear, la proteína Arc se
expresa durante toda la infección en el núcleo. Sin embargo en tiempos finales de infección (18 y
24 hpi) este patrón comienza a ubicarse en la región perinuclear, en el cuerpo neuronal y
dendritas, probablemente debido a que en horas finales de la infección, cuando el núcleo neuronal
se encuentra en un estado apoptótico, la proteína Arc saldría del núcleo para favorecer plasticidad
sináptica y así intentar reparar el daño generado por la infección en proceso dendríticos.
58
5.3 CONCLUSIONES
En una infección neuronal por HSV-1 se observa un aumento significativo en la expresión del
mRNA y proteína Arc a horas tempranas de la infección mientras que en células N2a no se
evidencian cambios en el transcurso de la infección, sugiriendo que la infección neuronal por
HSV-1 induciría alteración de la funcionalidad neuronal.
59
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71
7. ANEXOS
Expresión del transcrito LAT en cultivos neuronales tratados con distintas preparaciones de
aciclovir.
Figura 16. Expresión del transcrito LAT determinada por RT-PCR en cultivos neuronales
utilizando distintas preparaciones de aciclovir 50 uM. Al comparar ambos reactivos, se
evidencian diferencias en el patrón de expresión de LAT. Al utilizar aciclovir 1, se obtuvieron
altas desviaciones estándar en todas las horas de infección, mientras que al cambiar de
preparación (aciclovir 2), estas desviaciones disminuyeron.
Mock 2 4 8 18 24
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0Aciclovir 1
Aciclovir 2
hpi
LA
T/G
AP
DH