farmacoproteómica del condroitín sulfato- unidad de proteómica- proteored

Farmacoproteómica del

condroitín sulfato I

m/z

Valentina Calamia & Cristina Ruiz-Romero

Unidad de Proteómica-ProteoRed/ISCIII

Grupo de Investigación en Reumatología

INIBIC-Hospital Universitario A Coruña Jornada Cátedra Bioibérica

A Coruña, 18 Noviembre 2015

Búsqueda de marcadores diagnósticos o pronósticos de la enfermedad en fluidos biológicos

Comprensión de los mecanismos patofisiológicos

SUERO/PLASMA LIQUIDO SINOVIAL

CARTÍLAGO CONDROCITOS

PROTEÓMICA Y ARTROSIS (OA)

Introducción

Evaluación de fármacos o de sustancias con potencial

farmacológico (Drug profiling)

Monitorización de ensayos clínicos

Personalización y optimización del tratamiento

FARMACOPROTEÓMICA

CONDROITÍN SULFATO

Búsqueda de marcadores diagnósticos o pronósticos de la enfermedad en fluidos biológicos

Comprensión de los mecanismos patofisiológicos

SUERO/PLASMA LIQUIDO SINOVIAL

CARTÍLAGO CONDROCITOS

Introducción

Evaluación de fármacos o de sustancias con potencial

farmacológico (Drug profiling)

Monitorización de ensayos clínicos

Personalización y optimización del tratamiento

FARMACO-PROTEÓMICA

CONDROITÍN SULFATO (CS)

PROTEÓMICA Y ARTROSIS

TRATAMIENTOS: ESCALERA TERAPÉUTICA

• Terapia física

• Calzado apropiado / ayudas para

andar

• Hidroterapia

• Rehabilitación

• Lavado articular

• Transplante de condrocitos

• Artroscopia

• Artroplastia

• Medicina regenerativa

• Dieta

• Terapia farmacológica

sistémica, tópica y/o

• Intra-articular

• Ejercicio moderado

colaboración y educación

paciente

protección articular

ejercicio

tratamiento farmacológico

tratamiento quirúrgico

Introducción

Efecto rápido y potente No modifican la evolución

de la enfermedad Escasa seguridad

Posibles interacciones

SINTOMÁTICOS DE ACCIÓN RÁPIDA:

• PARACETAMOL • AINEs • GLUCOCORTICOIDES • COXIB

SINTOMÁTICOS DE ACCIÓN LENTA (SYSADOA):

• CONDROITÍN SULFATO • SULFATO DE GLUCOSAMINA • ÁC. HIALURÓNICO • DIACEREÍNA

Efecto lento y prolongado Modifican el curso de la enfermedad

Elevada seguridad Baja relación coste/efectividad

TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO DE OA

Introducción

DMOAD (DISEASE MODIFYING OSTEOARTHRITIS DRUG)

1. Análisis del efecto del CS y GS sobre el proteoma de condrocitos articulares humanos normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β).

ESTUDIOS FARMACOPROTEÓMICOS DEL CS

2. Análisis del efecto del CS sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos y normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β).

3. Análisis del efecto del 3 CS sobre el proteoma y secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos.

4. Análisis del efecto de CS y GH sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos mediante iTRAQ.

1. Análisis del efecto del CS sobre el proteoma de condrocitos articulares humanos normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β).

Efecto del CS en el proteoma de condrocitos N tratados con IL1b



A

B

2-DE

650 spots detectados 48 spots alterados 35 spots identificados

EFECTO DEL CS EN EL PROTEOMA DEL CONDROCITO N

EFECTO DEL CS EN EL PROTEOMA DEL CONDROCITO N


GS CS

PDIA1 PDIA3#

HSP7C GELS

ANXA1 ANXA2#

TPIS AK1C2 KPYM1

GS+CS

ANXA5 GDIR

GRP78 ACTB SODM

ENOA*

PRDX1 HSPB1*

CO6A1

HSPB1*

DPYL2 PGAM1 TAGL2

GANAB SEPT2

GSTP1 ENOA*

EF1G TCPG UGDH PGK1 ATPA G3P

ALDOA CO6A1

Grp78: UPR, propiedades antiinflamatorias SOD2: enzima relacionada con estrés oxidativo

CS Y FUNCIÓN MITOCONDRIAL

CS y mitocondria

CTL IL1β IL1 β +CS

SOD2

TUB

Calamia V et al., ART 2010

*

*

&

Incrementa producción ATP

*

&

Disminuye ROS Disminuye actividad SOD

Mitocondria, posible diana de la condroprotección mediada por CS

ESTRUCTURA DEL CARTÍLAGO ARTICULAR

COMPONENTE CELULAR Condrocitos (1,5% del volumen total) MATRIZ EXTRACELULAR (98% del volumen total) Peso total

• Agua (70-80%) • Proteínas (20-30%)

Peso seco • Colágeno tipo II (50%) • Proteoglicanos (30-35%) • Otras proteínas de matriz (15-20%)

Adaptada J. Martel-Pelletier et al. OA&C (2010)

keratan sulfato

condroitín sulfato

MATRIZ EXTRACELULAR

2. Análisis del efecto del CS sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos y normales estimulados con interleuquina 1-beta (IL1β).

Efecto del CS en el secretoma de condrocitos N tratados con IL1b y condrocitos OA


A

B

Cultivo de condrocitos en medios pesado y ligero

Tratamiento con CS e IL Extracción de proteínas Separación por LC Análisis por MS

EFECTO DEL CS EN EL SECRETOMA DEL CONDROCITO

HPLC


Arg 0/Lis 0 “light”

Arg 10/Lis 6 “heavy”

ΔDa

SILAC

EFECTO DEL CS EN SECRETOMA DE CONDROCITOS


Ratio CS/BASAL

pValue

Collagen alpha-1(I) chain 2,63 0,0027

Collagen alpha-1(VI) chain 1,97 0,0062

Collagen alpha-2(I) chain 2,61 0,0001

Lumican 1,38 0,0003

Decorin 2,70 0,0071

Chitinase-3-like protein 1 (YKL-40) 1,52 0,0699

Insulin-like growth factor-binding protein 3

2,99 0,0099

Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1) 2,04 0,0668

Fibronectin 1,81 0,0001

Vimentin 2,01 0,0005

20%

10%

10%

60%

componentes MEC factores de crecimiento

remodelación MEC estructurales

AN

AB

ÓLI

CO

Ratio IL/BASA

L

Ratio IL+CS/IL

Interstitial collagenase (MMP1) +++ 0,69

72 kDa type IV collagenase (MMP2) 3,45 0,74

Stromelysin-1 (MMP3) +++ 0,8

Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1) 1,4 0,8

Secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC)

0,4 1,5

Glia derived nexin (SERPINE2) 17,6 1,41

Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein (TNFAIP6)

+++ 2,99

Decorin 0,66 1,27

Tenascin 1,9 0,7

Fibromodulin - 1,27

Cartilage oligomeric matrix protein (COMP)

1,61 0,74

Interleukin-6 +++ 0,61

Interleukin-8 +++ 0,57

Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 (TGFBI)

2,87 0,73

AN

TI-

CA

TAB

ÓLI

CO

A

NTI

-IN

FLA

MA

TOR

IO

Condrocitos OA

Condrocitos N+IL1b

3. Análisis del efecto de 3 CS sobre el proteoma y secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos.


Efecto de 3 CS en el proteoma y secretoma de condrocitos OA


EFECTO DIFERENCIAL DE 3 CS EN EL CONDROCITO OA

CS1 CS2 CS3

SPECIES

PURITY 90.4 % 96.2 % 99.9 %

Proteoma (2D-DIGE)

Secretoma (SILAC)

Modulated proteins CS1 CS2 CS3

Actin, cytoplasmic 2 0,82 0,54 1,22

Annexin A2 0,66

Cartilage oligomeric matrix protein (COMP) 1,29

Cathepsin D 0,72

Chitinase-3-like protein 2 3,01

Collagen alpha-1(I) chain 1,37

Collagen alpha-1(III) chain 1,60

Collagen alpha-1(XII) chain 0,79 0,84

Collagen alpha-1(XV) chain 0,51 0,62 1,30

Collagen alpha-3(VI) chain 0,44

Connective tissue growth factor 1,59

Fibronectin 1,27

Fibulin-1 1,54

Follistatin-related protein 1 1,20

Glia-derived nexin 1,54

Hyaluronan and proteoglycan link protein 1 0,65

Insulin-like growth factor-binding protein 2 1,28 1,27

Insulin-like growth factor-binding protein 3 1,19

Insulin-like growth factor-binding protein 7 1,64 1,43 1,53Interstitial collagenase (MMP1) 28,71Metalloproteinase inhibitor 1 (TIMP1) 1,37

Nucleobindin-1 1,20

Pentraxin-related protein 2,41

Periostin 0,58

Plasminogen activator inhibitor 1 1,33

Prolargin (PRELP) 1,93

Serpin H1 0,61

Stromelysin-1 (MMP3) 13,44

Tenascin 1,22 0,74

Thrombospondin-1 1,83 1,24

Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 0,78 0,60

Vimentin 1,46


• El CS porcino induce rutas inflamatorias y catabólicas

• El CS bovino (99%) induce anabolismo

• Utilidad del análisis proteómico para el screening de fármacos anti-OA

4. Análisis del efecto de CS y GH sobre el secretoma de condrocitos articulares humanos artrósicos mediante iTRAQ.


Efecto de CS en el secretoma de condrocitos OA

EFECTO DE CS Y GH SOBRE EL SECRETOMA


GO_id Term Nº of protein p-value

GO:0030198 extracellular matrix organization 41 2.71E-38

GO:0030199 collagen fibril organization 15 5.89E-19

GO:0001501 skeletal system development 33 6.4E-17

GO:0007155 cell adhesion 41 1.41E-13

GO:0046903 secretion 33 1.43E-13

GO:0061448 connective tissue development 17 1.65E-10

GO:0001503 ossification 18 4.2E-10

GO:0051216 cartilage development 15 5.71E-10

GO:0016192 vesicle-mediated transport 35 8.41E-9

GO:0001525 angiogenesis 19 9.22E-9

GO:0032963 collagen metabolic process 8 2.98E-8

GO:0001502 cartilage condensation 6 2.12E-7

GO:0030334 regulation of cell migration 21 2.52E-7

GO:2000145 regulation of cell motility 21 6.18E-7

GO:0006950 response to stress 68 6.76E-7

GO:0036293 response to decreased oxygen

levels 16 7.52E-7

GO:0042127 regulation of cell proliferation 39 8.03E-7

GO:0006916 anti-apoptosis 16 8.5E-7

260 PROTEÍNAS

DISMINUIDAS POR EFECTO DEL CS

Degradación MEC Cathepsin D 75%

Cathepsin L1 69%

Chaperonas Calreticulin 49%

Heat shock protein HSP 90-beta 57%

INCREMENTADAS POR EFECTO DEL CS

Componentes MEC Aggrecan core protein 56%

Hyaluronan and proteoglycan link prot 1 73%

Adhesión celular Tenascin 71%

Thrombospondin-1 90%

Vascular cell adhesion protein 1 43%

Coiled-coil domain-containing protein 80 77%

Thrombospondin-1 (TSP1): Inhibidor de angiogénesis

INCREMENTO DE TSP1 POR CS


1,00

0,07

0,22*

0,01

0,1

1

10

BASAL IL1β IL1β+CS

1,00

2,09

0

0,5

1

1,5

2

2,5

BASAL CS

OA N

CTL CS CTL IL1β IL1β+CS

1,00

0,45

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

N OA

N OA

mRNA TSP1

WB

CTL GH CS C+G

TSP1

TUB

CTL IL1β IL+CS

TSP1 (secretoma)

TSP1 (proteoma)

TUB

WB Los niveles de TSP1 están

disminuidos en condrocitos OA vs N y en condrocitos N

estimulados con IL1β.

mR

NA

TSP

1/m

RN

A h

ou

seke

epin

g ge

ne

CS aumenta los niveles de TSP1 (mRNA y proteína) en

ambos casos.

La inhibición de angiogénesis, posible mecanismo de acción del CS

CONCLUSIONES

Conclusiones

Los estudios de farmacoproteómica del CS han permitido:

• Profundizar en el conocimiento de los mecanismos de acción del CS en las células del cartílago articular.

• Poner de manifiesto el papel del CS sobre la función mitocondrial y la inhibición de la angiogénesis, entre otros.

• Evaluar el efecto de diferentes composiciones de CS en las células del cartílago articular.

MÁS FÁRMACOPROTEÓMICA…

Estudio proteómico MOVES

Identificación de proteínas marcadoras de respuesta terapéutica a CS+GS (Droglican) o Celecoxib (Celebrex)

Estudio proteómico en suero de pacientes del Multicentre Osteoarthritis interVEntion trial with Sysadoa (MOVES)

Identificación mediante iTRAQ y LC-MS/MS de proteínas cuantitativamente alteradas en respondedores a los fármacos

…Continuará!

Proteomics Group ProteoRed-PRB2/ISCIII

Cristina Ruiz-Romero Dr. Francisco J.

Blanco

Rheumatology Division INIBIC-Hospital Universitario de A

Coruña

Valentina Calamia

Jesús Mateos

Patricia Fernández-Puente

Beatriz Rocha

Lucía Lourido

María Camacho

Nancy M. Parra

Lucía González

MJ López-Armada

(CS y mitocondria)

Colaboradores

farmacoproteómica del condroitín sulfato- unidad de proteómica- proteored

Health & Medicine