www.edu.fi/biogeeni

1

Fermentointi

Johdanto

Proteiinituottotasot ovat useimmiten niin matalia (µg-g/l), että solujen kasvatustilavuutta pitää kasvattaa, jotta tuotetta saadaan tarpeeksi kaupallisiin sovellutuksiin. Kun tasoravistelijat eivät enää riitä, siirrytään usein työskentelemään fermentorien kanssa. Fermentorin tilavuus on laboratoriomittakaavassa usein 1-100 litraa. Teollisuudessa astioiden koko voi olla satoja kuutiometrejä. Pienet (1-5 l) fermentorit ovat usein lasisia ja isommat on valmistettu ruostumattomasta teräksestä.

Tässä työssä tuotetaan meduusasta eristettyä, fluoresoivaa GFP-proteiinia. GFP:n kaltaisia luonnon merkkiproteiineja on runsaasti käytössä eri laboratoriosovellutuksissa ja aiheen tiimoilta on myönnetty kehittäjille Nobel-palkinto. GFP-proteiinin aminohappojärjestystä on muutettu laboratoriossa, jonka ansiosta on saatu tehtyä 20-kertaa kirkkaampi eGFP-proteiini (engl. enhanced GFP). Proteiinin geeni on siirretty plasmidiin ja tämä on siirretty E.Coliin. GFP-geenin pysyminen tuottokannassa varmistetaan lisäämällä plasmidiin antibioottiresistenttiysgeeni (kuva 1).

Kuva 1 Antibioottiliuoksessa (ampisilliini, amp) plasmidi pysyy isännän sisällä ja tuottaa haluttua proteiinia.

www.edu.fi/biogeeni

2

Laboratoriotyö: Fermentointi

HUOM! 1. Geneettisesti muokattujen mikrobien käyttö on luvanvaraista toimintaa. Lisätietoja aiheesta

löydät hakusanalla ”geenitekniikan lautakunta”. 2. Työohje antaa kuvan fermentointiprosessista laboratoriossa tietyllä laitteella. Tutustu

käytettävässä olevaan fermentorin manuaaliin ja muokkaa ohjetta tarvittaessa sopivaksi.

Fermentointityö päävaiheet:

1. Varmista, että käytettävissä on elinkykyinen kanta. Tee siirroste (ymppi) enintään pari viikkoa vanhalta kasvatusmaljalta. Kasvata työtä varten uusi LA-amp -malja jos tarvetta. Maljalla ampisilliinimäärä on 500 µg/ml. Huomaa, että antibiootti hajoaa säilytyksessä eli lisää maljojen pintaan antibiootteja jos maljat ovat vanhoja, mutta muutoin käyttökuntoisia. Kirjaa GMO-käyttö GMO-kirjanpitoon.

2. Valitse maljalta yksi loistoyksilö UV-valossa ymppiin. Laita ymppi, esim. 20 ml LB-mediumia (amp 100 µg/ml) 50 millilitran steriiliin Falcon-putkeen kasvamaan edellisiltana tai heti fermentointipäivän aamulla ensimmäiseksi. E.Colin kasvatusolosuhteet ovat 37 °C, 300 RPM tasoravistelijassa.

3. Kokoa fermentori erillisen ohjeen mukaisesti. Lämpövaippaa ei ilmata ja antureita käytetään tilanteen mukaan. Muista lisätä vaahdonestoaine mediumiin ennen sterilointia.

4. Pyydä henkilökuntaa tarkastamaan fermentori aina ennen steriloinnin aloittamista. Fermentorihuoneessa on oleskelu kielletty steriloinnin aikana (varoituskyltit kiinnitetään oviin). LAITETTA EI SAA JÄTTÄÄ YKSIN STERILOITUMAAN vaan sitä tulee tarkkailla, esim. 10 min välein. Vaipan paine ei saa ylittää 3,5 bar. Ongelmatilanteissa sammuta ohjelma, katkaise laitteesta päävirta tai poista laitteen sähkö sulaketaulusta. Laitteen jäähtymisen jälkeen korjataan ongelma, esim. vaihdetaan rikkinäinen o-rengas tms. jos jokin liitos vuotaa.

5. Steriloinnin jälkeen varo kuumia pintoja. Lisää kasvatuslämpöiseen mediumiin sokean tulpan alla olevan kumitulpan läpi (septum) läpi neulalla antibiootti (amp loppupitoisuus 100 µg/ml) ja lisää tämän jälkeen ymppi samalla neulalla. Aseta kasvatusparametrit (ilmastus 30 L/min, sekoitus 400 RPM) ja laita päiväkirjaan merkintä kasvatuksesta. Autoklavoi kaikki GMO-materiaali. Kasvatusputki, ruisku, neula yms. Steriloinnin jälkeen neulat erilliseen neulankeräyslaatikkoon.

6. Kasvatuksen lopetus ”harvestointi”. Vähennä tuloilman virtaus arvoon 3 L/min ja sekoitus 50 RPM. Poista kannesta yksi sokea tulppa korvausilman varmistamiseksi tyhjennyksen aikana. Tyhjennä sisältö pohjaventtiilistä suoraan isoihin sentrifugointipulloihin (tilavuus noin 400 ml/pullo) ja taaraa painot vaa’an ja muovisen pasteur-pipetin avulla. Maksimitäyttötilavuus on noin 2/3 pullosta kiinteillä roottoreilla ajettaessa. Muutoin soluliuos tihkuu kierteiden välistä sentrifugiin. Sentrifugoi esim. 3000 g, 10 min. Poista supernatantti autoklavoitavaan jäteastiaan ja laske uusi kierros

Esikasvatus Fermentorin

kasaus ja sterilointi

Ymppäys ja kasvatus

Harvestointi ja laitteiston

putsaus

Datan analysointi

www.edu.fi/biogeeni

3

soluliuosta reaktorista pulloihin, joissa on nyt jo pohjalla valmiiksi solupelletti. Taaraa ja fuugaa pullot ja toista tämä kunnes reaktori on tyhjä.

7. Fermentorin tyhjennettyä, korvaa anturit sokeilla tulpilla ja laita 13 L vettä tai soluliuoksen supernatanttia reaktoriin. Valmistele laitteen sterilointi, pyydä joku henkilökunnasta tarkastamaan asennus. Sterilointilämpötila 121 °C ja sterilointiaika 30 min. Pohja- ja näytteenottoventtiili steriloidaan erillisellä höyrynkehittimellä. Höyrynkehitin on hidas eli laita se hyvissä ajoin lämpenemään. Ohjaa venttiileistä ulos tuleva höyry vesiastiaan, höyrytä venttiileitä 30 min.

8. Liuota sentrifugipullojen solut fysiologisella suolaliuoksella (0,9 % NaCl), sentrifugoi (3000 g, 10 min). Jatka tätä niin kauan, että sinulla on lopulta 2 falcon-putkellista solumassaa. Punnitse solumassa ja varastoi solut pakastimeen.

9. Autaklavoi kaikki GM-materiaali ja kirjaa GMO-työn lopetus GMO-kirjanpitoon. 10. Pese fermentori jäähtymisen jälkeen niin, ettei biofilmiä jää astian sisäpinnoille. Tarvittaessa tee

entsyymiliuoskäsittely. 11. Pura ja putsaa fermentorin osat työpöydälle ja laita anturit säilytykseen.

Laboratoriofermentorien säädöt ja toimintaidea ovat laitemerkistä riippumatta samankaltaiset. Yksityiskohtaiset käyttöohjeet ja piirrokset laitteen eri osista löytyvät laitteen ohjekirjasta "Operating Manual". Laitteen käytöstä, huolloista ja toimintahäiriöistä tehdään merkinnät laitepäiväkirjaan.

Huom. 1 Käsittele elektrodien kaapeleita varovasti. Ne eivät kestä voimakasta taivuttamista tai kierteisyyttä. Liittimiä ei saa runnoa väkisin paikoilleen.

Huom. 2 Tarkista tulo- ja poistosuodattimien kunto ennen työn aloittamista. Tukkeentuneen suodattimen takia reaktoriin voi syntyä esim. alipaine steriloinnin jälkeen ja tästä voi seurata erilaisia ongelma/vaaratilanteita.

Huom. 3 Ennen kuin kytket virran laitteeseen, tarkista painemittarista nro 341, että termostaattijärjestelmässä on vettä (paine noin 0,5 bar). Kiertovesipumppu ei kestä kuivakäyntiä.

Huom. 4 Kun työskentelet geenimuunnelluilla mikro-organismeilla (GMO), autoklavoi kaikki GMO-kosketuksissa olleet astiat, kuten:

Falcon-putket, maljat, siirrostussilmukat ja pipetinkärjet autoklaavipussissa Esikasvatuspullot (pieni määrä vettä pohjalle) Sentrifuugipullot (steriloidessa nestettä pohjalla ja korkki löysällä) Solukeräysastiat (”harvest”-astiat) Kasvualusta

Termostaattijärjestelmän toiminnan tarkistus (vaipan ilmastus)

TÄMÄ TEHDÄÄN VAIN TARVITTAESSA, EI RUTIINISTI!

Tarkista, että vesijohdon pääventtiili on auki.

www.edu.fi/biogeeni

4

Avaa jäähdytysvesiventtiili nro 326 ja ylivirtausventtiili nro 323. Kun täyttöääni lakkaa kuulumasta, sulje ylivirtausventtiili nro 323. Termostaattijärjestelmän paineen tulee olla 2 – 3 bar (painemittari nro 341).

Mene säätöyksikössä control loops:eihin ja siellä lämmönsäätöön. Aseta lämpötilan asetusarvoksi 25 °C ja käynnistä säätö (mode: auto).

Odota vaipan lämpenemistä asetusarvoon. Tarkkaile, että järjestelmän paine pysyy muuttumattomana. Mikäli paineessa tapahtuu muutoksia tai järjestelmästä kuuluu ilmakuplien aiheuttamia ääniä, avaa ylivirtausventtiili nro 323 ja juoksuta vettä järjestelmän läpi, minkä jälkeen sulje ylivirtausventtiili jälleen. Tarvittaessa toista tämä toimitus niin monta kertaa, kuin on tarpeen jotta järjestelmän paine pysyy muuttumattomana eikä siellä ole ilmaa.

Sulje jäähdytysvesiventtiili nro 326. Sammuta lämpötilansäätö (valitse mode off ja hyväksy enterillä). Avaa ylivirtausventtiiliä nro 323 hieman ja juoksuta vettä järjestelmästä, kunnes painemittari nro 341 näyttää järjestelmän paineen olevan noin 0,5 bar.

Säätöyksikkö

1. Letkupumput

• Kytkin keskiasennossa = OFF.

• Kannen avaus kääntää kytkimen helposti tahattomasti OFF-asentoon.

• Aseta letkut huolella etteivät ne irtoa kesken ajon.

2. Pulloteline

• Hapolle, emäkselle ja vaahdonestoaineelle

• Pyri minimoimaan letkujen pituudet

• Muista laittaa pulloon korvausilmasuodatin

3. ”Työ kesken” – lappu

• Mitä kasvatetaan, lämpötila

• Oma nimi + puhelinnumero

• Kasvatuksen arvioitu kesto

Muista kuitata kaikki säätöyksikön muutokset enterillä.

1.

2.

3.

www.edu.fi/biogeeni

5

Steriloinnin valmistelu

Fermentorin osien asentaminen

Huom. Älä käytä työkaluja kiertäessäsi laitteita ja osia kiinni reaktoriastiaan. Kierrä vain käsivoimalla. Poikkeuksena ovat luonnollisesti ruuveilla kiinnitettävät osat. Niitäkään ei kannata vääntää kiinni liialla voimalla.

Steriiliyden takaamiseksi tulee kaikkien reaktoriastiassa ja kannessa olevien o-renkaiden olla ehjiä ja niille sopivalla rasvalla voideltuja. Kannattaa tarkistaa kaikki o-renkaat, ennen kuin aloittaa steriloinnin. Vaihda rikkoontuneet uusiin ja voitele kuivuneet ohuelti silikonirasvalla. Käytä silikonirasvaa, koska vaseliini turvottaa ja lopulta tuhoaa o-renkaita.

Tarkista pohjaventtiilin o-renkaat ja kiinnitä pohjaventtiili paikoilleen. Varmista, että venttiili on kiinni ja että se myös toimii. Pane venttiilin hylsy paikalleen. Tarkista näytteenottoventtiilin o-renkaat ja kiinnitä se paikalleen. Näytteenottoventtiili asennetaan läpivientiin, joka on vaakasuora (muut ovat yläviistoon). Varmista, että venttiili on kierretty kiinni.

Tarkista Pt-100 lämpötila-anturin o-rengas ja kierrä anturi paikalleen.

Tarkista pO2-elektrodin elektrolyytin määrä ja o-renkaan kunto. Varmista, ettei elektrolyyttiliuokseen jää ilmakuplia. Tarkista adapterin o-renkaat ja kiinnitä elektrodi paikalleen. Huom. irrota adapteriin kiinnitettävästä muovisesta suojakuoresta takaosan kumitulppa ennen kiinnikiertämistä. Tulppa laitetaan paikoilleen vasta kiertämisen jälkeen. Mikäli elektrodi on ollut irti vahvistajasta, se on polarisoitava ennen sterilointia pitämällä se säätöyksikköön kytkettynä elektrodin kärki ilmassa vähintään 6 tuntia pääkytkimen ollessa päällä.

Tarkista kasvatusastian kylkiin tulevien tulppien o-renkaat. Sulje astian kyljen vapaat läpiviennit tulpilla.

1. Näytteenottoventtiili

2. pH-anturi

3. Liuennut happi – anturi (DO2 / pO2)

4. Lämpövaippa

5. ”Sokea” tulppa

5.

1. 2. 3.

4.

www.edu.fi/biogeeni

6

pH-elektrodin kalibrointi

Paina calibration nappia kerran päästäksesi pH-kalibrointiin. Menussa kursori on man/auto kohdassa. Paina alter ja valitse man. Kuittaa painamalla enter. Kursori siirtyy tempiin.

Pane elektrodi pH 7.0 kalibrointiliuokseen (zero-buffer). Kirjoita lämpötila tempiin. Vahvista enterillä. Kursori siirtyy bufziin.

Kirjoita kalibrointipuskuripullon kyljestä oikea pH bufziin ja vahvista enterillä. Kursori siirtyy okhon ja laite alkaa monitoroida elektrodia. Mikäli mitattu signaali mahtuu annettuihin rajoihin, kursori siirtyy bufsiin.

Huuhdo elektrodi vedellä ja siirrä se pH 4.0 tai 9.0 kalibrointipuskuriin (slope-buffer).

Kirjoita kalibrointipuskuripullon kyljestä oikea pH bufsiin ja vahvista enterillä. Kursori siirtyy okhon ja laite alkaa monitoroida elektrodia. Mikäli mitattu signaali on annetulla mittausalueella, kursori siirtyy recaliin. Kuittaa recal no enterillä. Lämpötilakompensointi muuttuu autoksi.

Tarkista valikosta alaspäin selaamalla että elektrodin nollajännite on välillä -30 - + 30 mV ja slope on välillä 54 – 60 mV/pH. Mikäli jompikumpi poikkeaa annetuista rajoista, kalibroi elektrodi uudelleen.

Jos elektrodin nollajännite ei osu vaaditulle alueelle, käsittele elektrodi joko Thiourea/HCl- tai Pepsin/HCl-liuoksella. Mikäli slope on liian pieni, käsittele elektrodi Pepsin/HCl-liuoksella tai vaihda se uuteen.

Tarkista pH-elektrodin adapterin o-renkaat. Huom. irrota adapteriin kiinnitettävästä muovisesta suojakuoresta takaosan kumitulppa ennen kiinnikiertämistä. Kiinnitä pH-elektrodi adaptereineen paikalleen.

Kannen ja siihen kiinnittyvien osien asentaminen

Tarkista tuloilmansuodattimen kunto sekä suodattimen ja kotelon o-renkaiden kunto. Jos ilmansuodatin on kovin likainen tai rikkoontunut, vaihda se uuteen. Kiinnitä ilmansuodatin kanteen ja spargerputki ilmasuodattimeen.

Kiinnitä tarvittaessa harvest-putki kannen alapintaan.

Sekoituslavat kiinnitetään akselille tasaisin välein siten, että alimmat ovat lähellä pohjaa ja ylimmät lähellä nestepintaa.

Varmista, että kannen tiivisterengas on ehjä ja paikallaan. Aseta kansi varovasti paikoilleen. Varmista, ettei tiivisterengas siirry pois paikaltaan kannen asennuksen aikana. Kiristä kansi kiristysruuveilla kiinni.

Tarvittaessa kiinnitä vaahdoneston anturi kanteen sopivalle korkeudelle, esim. noin 10 cm pinnan yläpuolelle, mutta reilusti fermentoriastian kannen alapuolelle. Liitä anturin kaapeli säätöyksikköön. Tarvittaessa kiinnitä kanteen myös pinnankorkeusanturi. Vaahdoneston anturin tulee olla selvästi ylempänä kuin pinnankorkeusanturi.

Kiinnitä mahdollisesti käytettävät pH ja DO2 –anturit fermentoriin ja kytke ne laitteistoon.

Täytä fermentori halutulla määrällä mediumia tai vettä. Mediumin voi sekoittaa fermentorissa. Huom. Steriloinnin aikana fermentorista haihtuu vettä. Jotta mediumin koostumus ei muuttuisi, kannattaa tässä vaiheessa lisätä hiukan ylimääräistä vettä fermentoriin. Lisää mediumiin vaahdonestoainetta annosteluohjeen mukaisesti.

www.edu.fi/biogeeni

7

LB-medium (1 L)

• 10 g tryptoni • 5 g hiivauute • 10 g NaCl

Tarkista varoventtiilin tiivisterenkaan kunto. Kiinnitä varoventtiili kanteen. Älä kierrä liian tiukkaan, koska tiiviste vaurioituu helposti. Kierrä varoventtiilin mustaa pyörää ylös niin, ettei se paina varoventtiiliä auki.

Nosta tuloilmansuodattimen kotelo “sterilization” asentoon. Kiinnitä ilman tuloletku ja lauhteenpoistoletku paikoilleen.

Kiinnitä sekoitusakselin moottori paikalleen. Tarkista, että sekoitusakselissa oleva nasta ja moottorin akselin hahlo ovat kohdakkain. Kierrä kiristysruuvit moottorin akseliin. Kiinnitä moottorin virta- ja ohjauskaapelit. Varo vioittamasta liittimiä! Kiinnitä High Foam -anturin kaapeli säätöyksikköön, mikäli anturi on käytössä.

Kiinnitä poistoilman lauhdutin paikoilleen. Tarkista o-renkaat. Avaa suodatinkotelo ja tarkasta suodattimen ja o-renkaiden kunto. Kytke lauhduttimen jäähdytysveden tulo- ja poistoletkut sekä ilmaletku paikoilleen. Sulje jäähdytysvesiletkun venttiili nro 512.

Tarkista, että tarvittavissa kannen läpivienneissä on ehjät läpivientikalvot (valkoiset septumit). Tarkista, että kaulukset ovat hyvin paikoillaan ja että tulppien o-renkaat ovat kunnossa. Kierrä tulpat paikoilleen.

1. Säiliön varoventtiili

2. Lauhdeputki

3. Kaasun sisääntulo

4. Valotusikkuna

5. Tulpat (sokeat)

6. Tulpat (septumilla)

Sterilointi Steriloinnin käynnistäminen

Varmista, että kaikissa astian kannen ja kyljen läpivienneissä on niihin kuuluva laite tai ne on suljettu tulpalla ja että kyseiset laitteet / tulpat on kiristetty kunnolla kiinni. Tarkista, että elektrodit on kytketty kaapeleillaan säätöyksikköön. Tarkista, että tuloilman suodatin on “sterilization” asennossa. Tarkista, että vesivaipan paine on 0,5 bar. Tarkista mediumin vaahdon määrä. Jos vaahtoa on runsaasti, vaahdonestoainetta pitää lisätä.

Hanojen sterilointia varten täytä höyrynkehitin käänteisosmoosivedellä. Avaa korvauslimaventtiili ennen täyttöä! Laita keitin päälle. Kun paine on noussut lähelle 3 bar:ia, avaa venttiili, jolloin höyryn tulo alkaa.

1.

2.

3.

4.

5. 6.

www.edu.fi/biogeeni

8

Höyrynkehittimen päällä on kierrettävä ”kuristinruuvi”, jolla voi säädellä lähtevän höyryn määrää. Avaa fermentorin pohjaventtiilille menevän höyryn venttiili ja höyrytä hanoja 30 min.

Jos haluat steriloinnin aikaisen datan (lämpötila tms.) talteen, käynnistä batch MFCS/Win-ohjelmasta.

Sulje poistoilman lauhduttimen jäähdytysveden venttiili nro 512 ja kierrä ilmastuslinjan rotametri auki. Säädä paineilman syöttöpaineeksi 1,5 bar (paineenalennusventtiili fermentoriastian takana). Huom. säätönuppi täytyy nostaa ensin ylös, säätää ja painaa alas lukitusasentoon.

Paina sterilization nappia päästäksesi sterilointivalikkoon. Tarkista parametrit ja muuta niitä tarvittaessa.

Säädä ajaksi (stime) 30 min, sterilointilämpötilaksi (stemp) 121,5 °C ja (ftemp) käytettävä kasvatuslämpötila. Aloita sterilointi; siirrä kursori mode:startiin ja paina enter.

Fermentorin vesivaipan paine ei saa ylittää arvoa 3,5 bar! Jos näin tapahtuu, on sterilointi heti keskeytettävä. Jos painemittarin lukema heittelee paljon ja toistuvasti, on sterilointi lopetettava (ilmaa lämpövaipassa). Sterilointi voidaan keskeyttää sterilization -valikossa muuttamalla mode:start alter-näppäimellä mode:stopiksi ja hyväksymällä muutos enterillä.

Hätäpysäytys laitteen pääkytkimestä tai sulaketaulusta.

Steriloinnin ajaksi poistu huoneesta, sulje ovi ja kiinnitä varoituskyltti oveen. Jos fermentori ei tunnissa saavuta sterilointilämpötila, on astiassa todennäköisesti vuoto.

Laitetta ei saa jättää valvomatta, vaan sterilointia täytyy seurata esimerkiksi 10 minuutin välein.

pO2-elektrodin kalibrointi I (elektrodin nolla-piste)

Kun sterilointi on edennyt ster-vaiheen loppupuolelle, tehdään happielektrodin nollapisteen kalibrointi.

Paina calibration-nappia kahdesti päästäksesi pO2-kalibrointimenuun. Temp pitää olla auto. Kursori siirtyy nitr asemaan. Vahvista nitr:0.0% painamalla enter. Kursori siirtyy okhon. Mikäli nollavirta on sallitulla alueella, kursori siirtyy hetken kuluttua automaattisesti airiin.

Elektrodin nollavirran tulisi olla noin 0 nA (sallittu vaihteluväli 0 - 15 nA).

Steriloinnin päättyminen

Kun fermentori siirtyy cool2 -tilaan, avaa poistoilman lauhduttimen jäähdytysvesiventtiiliä nro 512.

Kun fermentori steriloinnin jälkeen on saavuttanut kasvatuslämpötilan, antaa säätöyksikkö äänimerkin ja ilmoituksen sterilization finished. Ilmoitus pitää kuitata painamalla enter. Steriloinnin päätyttyä pidä tuloilmansuodatin edelleen “sterilization”-asennossa ja anna ilman virrata sen läpi 10 l/min muutaman minuutin ajan, jonka jälkeen nosta ilmanvirtaus 30 l:aan/min. Anna ilman virrata suodattimien läpi vähintään puolen tunnin ajan niiden kuivaamiseksi.

Tyhjennä fermentorin takana oleva kondenssivesipullo viemäriin, pese tarpeen mukaan ja palauta letkun alle.

www.edu.fi/biogeeni

9

Fermentorin valmistaminen siirrostusta varten

Säätöyksikön pumppujen kalibrointi

Käytä kalibrointiin samanlaista letkua, kuin liuospulloissa käytetään. Pane letkun toinen pää vesiastiaan ja toinen mitta-astiaan. Aseta letku pumpunpesään. Pidä pumpun keinukytkin asennossa man, kunnes letku on täyttynyt vedellä. Vaihda tämän jälkeen keinukytkin asentoon auto.

Paina säätöyksiköstä calibration kunnes tulet haluamasi pumpun kohdalle. Siirrä kursori kohtaan mode:total. Paina alter, jolloin mode vaihtuu mode:calib:ksi, hyväksy enterillä. Kursori siirtyy strt:iin.

Paina enter aloittaaksesi kalibroinnin. Kun haluat pysäyttää pumpun, hyväksy stop painamalla enter. Kursori siirtyy tämän jälkeen automaattisesti totaliin. Mittaa pumpattu nestemäärä ja kirjoita lukuarvo totaliin. Vahvista enterillä. Mitä suuremman tilavuuden pumppaat, sitä tarkemman kalibroinnin saat.

Laite laskee automaattisesti virtausnopeuden ja ilmoittaa sen flowratessa. Vahvista enterillä. Tämän jälkeen laite siirtyy automaattisesti modeen ja calibsta totaliin.

Liuospullojen kytkeminen fermentoriin (happo, emäs, vaahdonesto, substraatti)

Autoklavoi käytettävät liuokset fermentorin pulloissa etukäteen. Pulloista tulevien letkujen tulee olla kiinni läpivientineulassa. Suositeltavaa on käyttää 1 M typpihappoa ja 1 M natriumhydroksidia.

Kierrä kannen läpiviennin suojatulppa irti. Ota läpivientineula, kierrä sen suojahylsy irti ja kuumenna neula liekissä. Lävistä membraani neulalla liekin suojassa ja kierrä se paikalleen.

Aseta letku vastaavan liuospumpun pesään. Käytä pumppua manuaalisesti, kunnes letku on täynnä liuosta, minkä jälkeen vaihda kytkin asentoon auto.

pO2-elektrodin kalibrointi II (100 % pO2)

Aseta tuloilmansuodatin “fermentation” asentoon. Säädä control loops -valikon kohdasta airfl ilman virtaukseksi 30 l/min. Jos medium vaahtoaa runsaasti, voidaan käyttää pienempää virtausta. Aseta astian lämpötilaksi aiottu kasvatuslämpötila ja sekoitusnopeudeksi 200 rpm.

Odota kunnes pO2-lukema on stabiloitunut.

Säätöyksikön näytön air: tulee olla 100%. Muuta se tarvittaessa. Vahvista arvo painamalla enter. Kursori siirtyy tämän jälkeen okhon ja laite monitoroi elektrodia. Mikäli mitattu signaali on välillä 25 - 200 nA, kursori siirtyy tämän jälkeen automaattisesti autoon. Tarkasta slope valikosta.

www.edu.fi/biogeeni

10

Siirrostaminen

Käynnistä batch MFCS/Win-ohjelmasta, mikäli et tehnyt sitä jo ennen sterilointia.

Aseta säätöyksiköstä lämpötila, sekoitus, pH ja pO2 haluttuihin arvoihin. Kytke vaahdonesto toimintaan. Lisää mediumista mahdollisesti puuttuvat komponentit septumin läpi ruiskulla ja neulalla. Käytä liekkiä suojana, kun pistät neulan läpi. Huom. Säädä ilmanvirtaus ensin arvoon 2 l/min, ettei fermentorissa ole liikaa ylipainetta.

Kun olosuhteet fermentorissa ovat vakiintuneet, voidaan se siirrostaa. Siirrostaminen tapahtuu samoin kuin edellä kuvattu mediumin komponenttien lisääminen. Jos siirrosteen tilavuus on kovin suuri, voidaan käyttää steriloitua pulloa, johon on liitetty letku ja läpivientineula.

Näytteenottoventtiilin sterilointi ja näytteenotto

Aseta laakea astia näytteenottoventtiilin alle. Tarkista, että pohjaventtiilille menevä höyrylinja on kiinni. Poista suojahylsy näytteenottoventtiilin päältä.

Avaa höyrynkehittimen venttiiliä ja säädä sillä höyryn virtaus sopivaksi. Kun venttiilistä ei enää tule lauhdetta (muutama tippa voi tulla), aseta suojahylsy paikoilleen. Käytä kuumalta suojaavia käsineitä. Höyrytä 30 minuuttia. Höyry kannattaa johtaa vesiastiaan. Poista vesiastia höyrytyksen jälkeen, koska muutoin jäähtymisestä johtuva alipaine imee vettä suojahylsyyn.

Anna venttiilin jäähtyä vähintään 30 min ennen näytteenottoa. Venttiilin jäähdyttyä irrota suojahylsy ja ota näyte.

Avaa höyry ja höyrytä, kunnes lauhdetta ei enää tule. Aseta suojahylsy paikalleen ja höyrytä 30 minuuttia. Venttiili pysyy steriilinä, jos suojahylsyä ei poisteta, joten sitä ei tarvitse höyryttää uudelleen ennen seuraavaa näytettä.

Kasvatuksen lopetus

Lopeta batch MFCS/Win-ohjelmasta erillisen ohjeen mukaan.

Sammuta säätöyksiköstä “control loops”eista kaikki säädöt.

Irrota varoventtiili reaktorin kannesta, jotta saat astiaan korvausilmaa. Tyhjennä medium/harvest reaktorista pohjaventtiilin kautta.

Reaktorin pesu tulee aloittaa välittömästi tyhjentämisen jälkeen.

www.edu.fi/biogeeni

11

Fermentorin pesu

Fermentoriastian pesu

Irrota pH- ja pO2-elektrodit adaptereineen sekä läpivientineula erillistä puhdistusta varten. Sulje niiden läpiviennit tulpilla. Sulje pohjaventtiili. Täytä fermentoriastia 15 litralla vettä ja steriloi 30 min 121 °C.

Kun fermentori on jäähtynyt, tyhjennä se ja avaa kansi. Huuhtele fermentori sisältä runsaalla määrällä vettä. Käytä harjaa, jos seinillä on pinttynyttä likaa. Lisää astiaan vettä niin paljon, että sen pinta ylittää kasvatuksenaikaisen pinnankorkeuden. Lisää 1 % Terg-A-Zymeä. Aseta kansi paikoilleen. Kytke sekoitus (200 rpm) ja lämpötilansäätö (50 °C) päälle. Päästä hiukan pesuaineliuosta kummankin venttiilin läpi. Anna astian puhdistua vähintään 1 h.

Sulje sekoitus ja lämmönsäätö ja tyhjennä reaktori molempien venttiilien kautta. Avaa kansi. Tarkista silmämääräisesti, että kasvatuksenaikainen debris on hävinnyt. Tarvittaessa harjaa astian seinät puhtaaksi ja toista Terg-A-Zyme käsittely.

Pesun jälkeen huuhdo fermentori runsaalla määrällä vettä – myös kansi ja sekoitinakseli. Huuhdo myös näytteenottoventtiili. Täytä fermentori huuhteluvedellä ja kytke sekoitus (300 rpm) ja lämmönsäätö (90 ºC) päälle 30 minuutiksi. Jäähdytä vesi alle 60 °C ja päästä viemäriin. Pura fermentorista näytteenotto- ja pohjaventtiili, tulpat ja kannen osat. Poista niistä o-renkaat vahingoittamatta (muista, mikä rengas on mistäkin). Voitele o-renkaat kevyesti silikonilla. Pese tulpat yms. ja laita o-renkaat paikoilleen. Jätä fermentori kuivumaan ilman kantta.

pH-elektrodin puhdistaminen ja säilytys kasvatusten välillä

Irrota adapteri elektrodista. Desinfioi adapteri 70-prosenttisella EtOH:lla. Adapteri pestään käsin o-renkaat irrotettuna (älä hukkaa niitä!). Laita o-renkaat paikoilleen.

Huuhdo elektrodi vedellä. Upota elektrodin pää pepsin/HCl-liuokseen ja pidä sitä liuoksessa useita tunteja tai yön yli kunnes se näyttää puhtaalta. Huuhdo elektrodi käsittelyn jälkeen vedellä.

Mikäli elektrodin diafragma on mustunut, upota elektrodi thiourea/HCl-liuokseen. Pidä elektrodia liuoksessa kunnes diafragma on jälleen valkoinen. Huuhdo elektrodi käsittelyn jälkeen vedellä.

Täytä elektrodin kärjen suojaksi tuleva “tutti” 3M KCl-liuoksella ja pane se paikalleen. Tarkista, että elektrodin pää on kokonaan liuoksessa (ei ilmakuplia).

pO2-elektrodin puhdistaminen ja säilytys kasvatusten välillä

Irrota adapteri elektrodista. Desinfioi adapteri ja elektrodin ulkopinta 70-prosenttisella EtOH:lla. Adapteri pestään käsin o-renkaat irrotettuna (älä hukkaa niitä!). Laita o-renkaat paikoilleen.

Huuhdo elektrodin kärki ja membraani vedellä. Pyyhi elektrodin kärjen teräksinen suojahylsy etanoliin kostutetulla paperipyyhkeellä, varo koskemasta kärjen membraaniin. Huuhtele lopuksi huolellisesti vedellä.

Elektrodin hylsyyn pitää vaihtaa elektrolyytti viiden sterilointikerran jälkeen. Mikäli elektrodin kalibroitumisessa tai toiminnassa on ongelmia, pitää membraanihylsy vaihtaa.

www.edu.fi/biogeeni

12

Säilytystä varten elektrodin kärki on suojattava muovikorkilla. Säilytettäessä elektrodia yli 6 kk, poistetaan elektrolyytti ja elektrodi säilytetään kuivana.

Tulosten käsittely

Siirrä tulokset tarvittaessa ohjelmistosta ja käsittele taulukkolaskentaohjelmassa.