ゲノム編集の医学への応⽤ - tokyo medical and dental...
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田中 光一
東京医科歯科大学・難治疾患研究所
ゲノム編集の医学への応⽤
ゲノム編集とは？
遺伝子の配列を自在に改変する技術
染色体とDNA
AとT、CとGがペア(相補性）
遺伝子から形質までの過程
標的遺伝子
非標的遺伝子
外来遺伝子
相同組み換えランダムな挿入
標的遺伝子の改変
外来遺伝子の分解
非標的遺伝子の改変
遺伝子の改変無し
ゲノム編集は、相同組換えを利用する
標的遺伝子
非標的遺伝子
外来遺伝子
相同組み換え (1000倍）
標的遺伝子の改変
DNAの２本鎖切断は、相同組換え効率を上げる
1本鎖切断
2本鎖切断
（1983年 Szostakがモデルを発表, 1994年 Jasinが証明）
ゲノム編集を効率化するには、
標的遺伝子部位にDNA2本鎖切断を起こさせる
どう やっ て標的部位にDNA二本鎖切断を 起こ すのか？
DNAを切断する酵素 (FokI)
DNA切断酵素を塩基配列の情報を基に、標的部位に近づける
標的部位を決める情報（塩基配列）
どう やっ て標的部位にDNA二本鎖切断を 起こ すのか？
特定の塩基配列を認識できる蛋白質がある
DNA切断酵素と標的部位の塩基配列を認識できる蛋白質を融合させた人工蛋白質を作成すればいい
どう やっ て標的部位にDNA二本鎖切断を 起こ すのか？
DNA切断酵素DNA認識蛋白質
DNA切断酵素 DNA認識蛋白質
ヒ ト のDNAの長さ ： 3 0 億塩基対 (3 x 10 9)
4 20 = 1012 20塩基を認識するDNA認識蛋白質が必要
(5’-AGTGGGCCTAATCGCGGGTA-3’の配列が存在する確率が1/1012)
ZFNやTALENによるゲノム編集
第一世代(1996年〜)
第二世代（2010年〜）
DNA結合ドメイン：植物病原細菌が持つ転写因子様蛋白質TALE
DNA結合ドメイン：ジンクフィンガー
第3世代のゲノム編集技術
CRISPR/Cas9システム（2012年〜）
標的部位の認識：蛋白質→RNADNA切断酵素 ：FokI →Cas9
CRISPR/Cas9システム
crRNA：標的の塩基配列と相補的な配列を持つRNA塩基対合相互作用により標的DNAと2重ラセン形成
Cas9 DNA分解酵素
細胞の標的DNA
crRNA
tracrRNA
クリスパー（CRISPR/Casシステム）
石野良純教授（現・九州大学）
中田篤男と石野良純が1987年に発見
細菌の抗ウイルスシステム？
リピート数とファージ感染への抵抗性が相関する
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated genes (Cas)
（クラスター化反復短回文配列リピート/クリスパー関連遺伝子）クリスパー
CRISPR スペーサー
CRISPR-Casシステムは細菌の免疫機構
Jennifer DoudnaEmmanuelle Charpentier
CRISPR/Casシステムを用いたゲノム編集技術の誕生経過
Cas9がRNA依存性DNA2本鎖切断酵素であることの発見により、２つの異なる研究分野が2012年に統合された
CRISPR研究（細菌の免疫）
ゲノム編集研究
クリスパーのゲノム編集への応用Science 2013より引用・改変
人工一本鎖ガイドRNA(sgRNA)
標的にCas9を誘導
ハサミ
Cas9
標的DNA
標的DNAの切断遺伝子欠損
精密に標的を狙い撃つ分子のハサミ
1. 非常に簡単2. 強力な作用3. どんな細胞や生物もOK
Dr. Feng Zhang (born 1982) is a PI at MIT and the Broad Institute
Dr. Virginijus Šikšnys is a Professor at Vilnius University
遺伝子から形質までの過程
CRISPR/Cas9システムの応用
• 疾患モデル動物・細胞の作成と創薬への応用• 遺伝子治療• 安全な移植臓器の作成• マラリア・デング熱・ジカ熱などの撲滅
疾患研究や医療への応用
• 品種改良に要する期間の短縮• 高い付加価値や新規形質を持つ品種の作出
食料生産への応用
• 微生物や植物の品種改良による有用物質の生産効率改善• 微生物や植物への新機能付加による有用物質の新規生産
資源生産への応用
• In vitroのゲノムワイドな遺伝子機能の解析(CRISPRsgRNA library)• In vivoの遺伝子機能の解析（様々な遺伝子改変生物）
基礎研究への応用
CRISPR/Cas9の疾患基礎研究への応用
緊急に克服すべき疾患：癌、糖尿病、認知症、う つ病
（多因子疾患： 遺伝子因子と環境因子の相互作用で発症）
万人の健康情報（ ゲノ ム情報・ 病歴・ 生活習慣） を 収集画期的な新薬開発を 目指す
プレ シジョ ン ・ メ ディ シン （ 精密医療）
疾患に関与する遺伝子異常を、 治療に結びつけるには、遺伝子の機能解析が必要である
疾患の遺伝子異常を再現したモデル動物が重要
遺伝子因子の方が確実な結果を期待できる
遺伝子解析
疾患の克服
遺伝子解析
疾患の克服
遺伝子解析
疾患の克服
ボトルネック
2013年クリスパー
2015年～改良型クリスパー
～2012年ES細胞
遺伝子欠損1塩基置換
長い遺伝子の挿入(遺伝子治療・ヒト化モデル）
改良型クリスパーは疾患の遺伝子解析を効率的に治療に結びつけ
CRISPR/Casシステムの開発により疾患モデル動物の作成が加速した
従来の作成方法(1~2年)
CRISPR/Cas システム(1ヶ月)
(Science 2012)
改変したい遺伝子標的配列
遺伝子欠損 1塩基置換 遺伝子挿入
遺伝子改変の種類
クリスパーの短所
従来の遺伝子治療の問題点
標的部位に正常な遺伝子を挿入することにより、副作用の少ない正確な遺伝子治療が可能
従来の遺伝子治療：正常な遺伝子を付加（染色体のランダムに位置に遺伝子が挿入）
↓癌遺伝子の活性化により白血病が相次ぎ、中止
ガン遺伝子の活性化
ガン化
ウイルス
治療する細胞
CRISPR/Cas9の医療への応用
1. 遺伝子治療
2.マラリアなどの感染症の撲滅
3. 移植臓器の作成
1. 遺伝子治療
HIV-1/AIDSの治療HIV-1がTリンパ球やマクロファージに感染し、
これら免疫細胞の機能を障害する
HIVウイルスの感染にはCCR5遺伝子が必須
ゲノム編集でCCR5を破壊
HIVウイルスHIVウイルス
HIVウイルスは細胞に感染できない
Tリンパ球の採取AIDS患者
CCR５の破壊
CCR5欠損Tリンパ球を患者に戻す CRISPR/Casシステム
AIDS患者の遺伝子治療の概略
CAR-T (Chimeric antigen receptor T-cell)療法
癌の免疫療法の効率化
Clinicaltrial.govに登録されているゲノム編集を用いた臨床試験
ヒト受精卵の遺伝子治療
（変異遺伝子を正常に修復）
遺伝子異常の種類と治療法
置換した塩基を正常に戻す
正常な遺伝子を挿入
ヒト受精卵にゲノム編集を応用した最初の例(中国 2015年）
つの精子を受精した受精卵を用い、-globin geneを標的にしたゲノム編集
オフターゲットの遺伝子改変
ヒト受精卵におけるHBB遺伝子の改変効率
ゲノム編集のオフターゲット
オフターゲット：標的以外の場所を切断
オンターゲット
オフターゲット
オンターゲット
オフ タ ーゲッ ト
オフターゲット
米国の国際幹細胞研究協会は、
「潜在的リスクの広範な科学分析が行われ、それと並行して社会的・倫理的な影響に関する広範な一般討論を行う間、
ヒトの臨床的なゲノム編集を試みることは中止すべき」
英国の「ヒト受精・発生学委員会」は、
ヒト受精卵の正常な発達に必要な遺伝子を調べる目的で、ヒト受精卵のゲノム編集をすることを認めた
受精後7日以内の受精卵に改変を加え、その影響を解析し、改変された受精卵は14日以内に廃棄する
ヒト3PN受精卵にゲノム編集を応用した2例目(中国 2016年）
正常なヒト受精卵にゲノム編集を応用した最初の例（中国 2017年）
正常なヒト受精卵にゲノム編集を応用した2番目の例（米国 2017年）
（肥大型心筋症）
２. マラリアなどの感染症の撲滅
マラリアにより年間70万人以上が死亡
遺伝子ドライブ通常の遺伝子挿入
抗マラリア遺伝子 Cas9 ガイドRNA
受精卵に注入
抗マラリア遺伝子 Cas9
ガイドRNA Cas9 ガイドRNA
受精卵に注入
通常の遺伝子挿入
雄 雌
遺伝子ドライブ
遺伝子ドライブ
３. 移植臓器の作成
豚からの臓器移植問題点1. ウイルス感染 (porcine endogenous retrovirus)2. 免疫拒絶
豚からの臓器移植
豚のゲノ ムにある 62 個のレ ト ロ ウイ ルス全てをCRISPR/Cas9技術で欠損し た細胞株を 作成
Genome-wide inactivation of porcine endogenous retrovirusesYang L, et al., Science 350:1101, 2015
eGenesis
中内啓光教授
ゲノム編集の倫理的問題
1. ヒト受精卵の遺伝子改変
2. ゲノム編集した農産物の販売
3. ジーンドライブによる生態系への影響