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ニワトリの発生
熊本大学・発生医学研究所
嶋村 健児
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なぜニワトリ?
• 卵生(観察、実験操作上の利点)
• 進化の観点(羊膜類:陸上生活に完全適応)
• 実験材料としての利便性、低コスト
• 極初期胚の体制がヒト胚に類似
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ヒトの初期発生(円盤状の胚盤)
「ヒト発生の3次元アトラス」より
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マウスの初期発生(円筒状の胚盤)
From “Manipulating the Moue Embryo”
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ニワトリ卵(産卵時)
卵殻
胚盤胞
卵黄気室
カラザ
卵殻膜
卵白
ビテリン膜(卵黄膜)
From “The Atlas of Chick Development”
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ニワトリの卵形成
From “The Atlas of Chick Development”
卵管漏斗
卵巣
卵子
卵白分泌部峡部(卵殻膜形成)
卵殻形成部
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ニワトリ胚の盤状卵割
「カラーアトラス動物発生学」より
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体軸(前後軸)決定と胚盤葉下層(hypoblast)の形成
「カラーアトラス動物発生学」より
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体軸形成の基本原理~放射相称から左右相称へ~
円周上の一点を決めるSpecify a single point along the margin
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ニワトリ胚の原腸陥入(三胚葉形成)
HH stage 2
HH stage 3
HH stage 4
HH stage 6
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ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH5)
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「カラーアトラス動物発生学」より
ニワトリ胚の原腸陥入(体軸伸長と細胞のふるまい)
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ニワトリ胚の原腸陥入(内胚葉形成)
From “The Atlas of Chick Development”
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ニワトリ胚の原腸陥入体軸伸長とヘンセン結節(ノード)の後退
「カラーアトラス動物発生学」よりFrom “The Atlas of Chick Development”
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ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11)
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1日胚(HH5)
ヘンセン結節
原条
暗域
明域
・明域がひょうたん型になり、ヘンセン結節、原条がみとめられる。
・ヘンセン結節の前方に脊索、脊索前板が伸びている。
・原腸陥入を経て生じた中胚葉が胚盤葉上層、外胚葉の下に潜り込んでいる。
・前縁部の中胚葉が後の心臓原基となる。
・基本的に平たんではあるが、頭部神経版(脳原基)が形成されつつある。
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・神経管が閉じ、先端部から前脳、中脳、後脳の脳胞が認められる。前脳の両側から眼胞が突出し、後脳には菱脳分節(ロンボメアー)が認められる。
・耳胞は外胚葉が肥厚した耳プラコードから形成される。
・心臓原基は対になって出現し、正中線で融合する。このステージではすでに拍動している。
・胴部神経管の両側に体節が規則正しく形成される。
2日胚(HH12)
前脳
中脳
後脳(菱脳)
耳胞
眼胞
体節神経管
心臓
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胚を形成する。
・前脳は終脳と間脳に分かれる。
・鰓弓がみとめられる。
・肢芽の出現が認められる。
・体節が尾部に達している。体節からは、のちに椎骨、肋骨、真皮、筋肉が形成される。
3日胚(HH18)
鰓弓
心臓
耳胞 後脳・眼胞の近位側はくびれて眼
中脳
間脳
終脳
眼胞
前肢芽
後肢芽体節
脊髄
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5日胚(HH25)
・終脳は左右に分かれて膨らみ、後の大脳半球の原基となる。
・後脳の蓋板はひし形に薄く広がり、後脳前部は小脳原基、後部は延髄原基となる。
・眼の色素上皮が分化し、黒化がみとめられる。
・体節から筋芽細胞が遊離し始める。
・両肢芽は遠位に伸長する共に、特有の形状を呈し始める。
・尿嚢が膨らんでくる。
鰓弓
眼胞
レンズ
小脳原基
終脳
尿嚢
心臓
前肢芽
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7日胚(HH32)
・中脳の背側部は左右一対の視蓋に分化している。
・眼胞は大きく発達し、黒化が進む。
・手足のアポトーシスが進み、指の間の領域がわかるようになる。
・手足で軟骨がみとめられる。
・各器官で組織構築が進んでいる。
視蓋
前肢
後肢
眼胞
終脳
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神経系、眼胞、耳胞
頭部の神経管は、複数の脳胞に分節されている眼胞は前脳の外側壁からふくれ出て、発生が進むと眼杯を形成する耳プラコードは外胚葉の肥厚として現れ、やがて耳胞を形成するようになる
3 日胚
眼杯
鯉弓
心臓
体節
後脳
間脳
耳胞
終脳
前肢芽
後肢芽
。
。
中脳
前脳
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頭部の形成(in ovo観察、HH12~HH25)
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神経板
眼胞
体節
神経管
前脳
中脳
後脳心臓
耳胞
神経管形成
2日胚
神経溝
神経摺
神経管
脊索
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内臓板中胚葉からの心臓形成
Endocardium心内膜
1 2
34
Myocardium心筋
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心臓の形成
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心臓原基は両側性である
ニワトリ胚 ゼブラフィッシュ胚
二叉心臓(Cardia bifia)
野生型
milesapart
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心臓はループを形成する
発生の途中で心房と心室の位置が逆転している
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心房と心室の形成
R
ニワトリ胚 マウス胚
L心房
心室
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胚体外膜~陸上生活への完全適応~
・胚は羊膜に包まれている。・尿嚢は窒素廃棄物をためるだけでなく、血管網を使ったガス交換を行う。・卵黄嚢の栄養は卵黄血管網に取り込まれて胚へと供給される。
(尿嚢)
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胚体外膜の役割
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2日胚 3日胚
胚膜の発生
Developmental Biologyより
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5日胚 9日胚
胚膜の発生
Developmental Biologyより
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漿膜と羊膜
漿膜と羊膜は外胚葉と中胚葉由来である
哺乳類では、漿膜(と尿嚢)が胎盤を作る
鳥類、爬虫類、哺乳類の胚は羊膜の中の羊水に保護される
羊膜
漿膜
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卵黄嚢と尿嚢
尿嚢 と 卵黄嚢 は中胚葉と内胚葉由来である
尿嚢は排出物を蓄積する。哺乳類の尿嚢のサイズは種によって異なり、ヒトでは痕跡器官である。
鳥類と爬虫類の卵黄嚢 は胚に栄養を供給する。
尿嚢
卵黄嚢
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ニワトリ胚の全胚培養New’s culture
胚盤
ガラスリング
New, DAT, 1955
ビテリン膜(卵黄膜)
卵白
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ニワトリ胚の全胚培養ペーパーリングによる改良型Newカルチャー法
1.ディッシュに卵をあける。胚が卵黄の上部に来るように。
2.胚のサイズ穴のろ紙リングを貼り付け、ろ紙の輪郭に沿って切り出す。
3.ろ紙をもち、胚を裏返して卵白ゲル上に静置する。泡が入らないよう注意。
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エレクトロポレーション(電気穿孔)法による生体への遺伝子導入
エレクトロポレーションの原理と要点
・細胞膜(脂質二重層)は絶縁体。
・一定の電気パルスがかかると細胞膜に無数の小さな穴が生じる。
・この穴を通って極性分子(DNA、RNA、ペプチド、タンパク質など)が電気泳動によって細胞内に流入する。
・この穴は一過的であり、ほどなく修復する。
・電気パルスは直流パルス(矩形波)で、角がシャープであるほど良い。
・標的に対して効率よく電圧をかけられる電極の形状、設置方法を検討する。
・パルスの電圧、長さ、間隔、回数を、対象によって最適化する必要がある。
電気パルス付加
⊖ ⊕
DNA,タンパクなど
電圧
時間
細胞膜(脂質二重層)
細胞シート
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エレクトロポレーション法による脳胞への遺伝子導入(HH10~12)
Funahashi et al., 1999
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脳の領域化と形態形成Regionalization and Morphogenesis of Brain
July 19, 2019
熊本大学・発生医学研究所脳発生分野嶋村 健児
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Contents
・神経組織における領域化の意味
Significance of regionalization in the CNS
・脳の原基(神経板・神経管)の領域化のしくみ
Patterning of the CNS primordium
・領域性研究の現在と残された課題
Issues remained in the field
・我々の研究内容
Our research projects
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脳には“地図”がある
大脳知覚、記憶、判断、運動の命令、感情など
小脳運動や姿勢の調節
脳幹呼吸、循環機能の調整など
視床下部ホルモンの調節
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神経組織の領域性とは?What is the regionality of the CNS?
・場所による機能分担(機能のユニット化)Allocation of distinct functional units
・場所による組織形態の違い(神経核と皮質)Distinct histologenesis among the regions
・特定形質をもつニューロンの部位特異的な配置Site-specific generation of neurons with specific properties
・ニューロンの位置情報Positional information of individual neurons
![Page 43: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/43.jpg)
視蓋(皮質)
被蓋(神経核)
脳は領域によってその内部構造が異なっている
ニワトリ中脳のニッスル染色
![Page 44: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/44.jpg)
Case 1: 大脳新皮質における領野の構成The neocortical areas in mice and humans
視覚野Visual
体性感覚野Somatosensory
運動野Motor
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Case 2: 「匂い地図」によって嗅覚は処理されるOlfaction is processed by the “oder maps”
Modifeid from Nagao et al., 2002
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E10.5
apical
basal
神経上皮細胞:中枢神経系の幹細胞Neuroepithelium: embryonic CNS
stem cell
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ventricle
pia
neuroepitelia
ニューロンに個性を与える二つのしくみGeneration of neuronal diversity by two distinct mechanisms
neuron
neural stem cell
neuron
neural stem cell
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神経上皮細胞(神経幹細胞)の領域化Regional specification of neuroepithelium (embryonic neural
stem cell)
• 細胞系譜に基づく位置情報の確立
Cell lineage-dependent positional specification
•シグナル分子による二次元的パターン形成Two-dimensional pattern formation mediated by
diffusible factors
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ニワトリ胚を用いた脳の領域化の研究
前脳
中脳
後脳
HH8 HH10 HH12
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脳胞を部分移植して領域性の変化を調べる
?
?
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Fujimori, T., Dev. Growth Differ. 52, 253-262, 2010
発生生物学における細胞の運命決定に関する概念Fate specification in Developmental Biology
調整プログラムRegulative programs
正常プログラムNormal programs
+
正常プログラムNormal programs
実験操作
正常発生(操作なし)
単離
異所移植
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切り出し 完成
ニワトリ胚の脳組織片移植
ステージ11(孵卵2日目)
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脳移植片の運命変化
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Martinez et al., 1991
中脳後脳境界はオーガナイザーとして機能する
En2:中脳後脳境界と中脳後部のマーカー
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Martinez et al., 1991
中脳後脳境界は間脳を中脳に運命転換する
ウズラ(ドナー)の中脳後脳境界がニワトリ(ホスト)の間脳を中脳にした。
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領域性形成から投射地図の形成へ(網膜視蓋投射の場合)
![Page 57: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/57.jpg)
Itasaki et al., 1991
中脳における極性形成
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Crossley et al., 1996
Fgf8は中脳後脳境界からのシグナルである
![Page 59: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/59.jpg)
ニワトリーウズラキメラ法による神経板予定運命地図の作製
Cobos et al., 2001
![Page 60: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/60.jpg)
Lumsden and Keynes, 1989
神経上皮の区画化
Rhombomere(菱脳分節)
![Page 61: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/61.jpg)
Fraser et al., 1990
ロンボメアーは“コンパートメント”である
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脊髄における背腹軸パターン形成
神経板
脊索
移植された脊索
脊索
神経管
「脊髄の発生」脳科学辞典より
脊索の除去
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遺伝子発現でみる脳原基の領域化
Shimamura et al., 1995
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転写因子:ゲノム上の特定の遺伝子の発現を調節して、その細胞の性質を決める。
分泌因子:細胞の外部に放出されて、受け取った細胞の性質を決める。
領域性を決める主要なプレーヤー(遺伝子産物)
![Page 65: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/65.jpg)
エレクトロポーレーションによるニワトリ胚への遺伝子導入
![Page 66: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/66.jpg)
エレクトロポレーションによる脳の局所的な遺伝子導入
終脳
間脳
中脳
後脳
EP@HH8→HH20
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頭部神経板におけるパターン形成Patterning of the head neural plate (brain primordium)
anterior neural ridge
isthmus
前脳forebrain
中脳midbrain
菱脳hindbrain
Fgf8
Shh
Nkx2.1
Foxg1
En2
dopaminergic neuron serotonergic neuron
competent region
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Otx2
Gbx2
Six3
Fezf1,2
Irx1
Irx3
Pax6
Pax2
En1
anterior
posterior
初期神経板における領域性形成
Kobayashi et al., Development, 2002
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脳の領域性研究の現在と残された課題
1.より詳細で網羅的な遺伝子発現マップの作成
2.Morphogenの濃度勾配がどう解読されるか?
3.転写因子の組合せのあと
4.神経上皮の領域性と異なる組織構築のリンク
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視蓋(皮質)
被蓋(神経核)
脳は領域によってその内部構造が異なっている
ニワトリ中脳のニッスル染色
![Page 71: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/71.jpg)
Irx3 EP, HH39
Kobayashi et al., Development 2002
領域性を変えると組織形態が変化する
![Page 72: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/72.jpg)
脳組織構築の基本原理:増殖、自己複製、分化、移動
共通の基本原理からどうやって異なる組織形態がつくられるか?
基本原理を支えるしくみの量的・時間的な違いが、構造の大きな違いに至るのではないか?
P
NP
PP
N N
P
P
P P
P
P: progenitor
N: neuron
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脳の形は動物によって大きく違う
胚の脳
ウサギ
ヒト
カメキンギョ
トリ
ハリモグラ
![Page 74: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/74.jpg)
哺乳類における脳の多様性
DeFelipe J. 2011 Front. Neuroanat.,16
どうやって脳が拡大したか?
どうやって脳にシワができたか?
![Page 75: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/75.jpg)
霊長類の脳はどうやって拡大したか?
Comparative Mammalian Brain Collection
The Multi-Dimensional Human Embryo (NICHD)
胚 成体
マウス
ヒト
E9.5
E28
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1. ラジアルグリアが長期間にわたって増殖する。2. 中間前駆細胞(IP)が何度も分裂する。3. oRGが著しく増加している。
ラジアルグリア
中間前駆細胞 中間前駆細胞
outer Radial Glia
マウス ヒト
脳室 脳室
pia
ヒトとマウスの大脳皮質発生
ニューロン
pia
ニューロン
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霊長類では脈絡叢が発達している
Human-Rat comparisons The Laboratory of Developmental Neurobiology, Inc
Rat Human
Rat E18 Human E63
脈絡叢・脳脊髄液の種間差が脳のサイズに関与するか?
Human GW11Mouse E13
Horizontal section
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E55 E13
イメージ
種特異的な脈絡叢因子の探索
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多くの哺乳類の脳にシワが見られる
humanchimpanzeelion
rabbit
cat
mouse
bat
脳のシワ(脳回・脳溝)はどうやってできるか?
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Lui et al., Cell 146, 2011
OSVZ細胞の増加によって大脳皮質の表面積が拡大した
![Page 81: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/81.jpg)
脳溝の多くは、ニューロン産生が終了後、グリアの分化や軸索の発達が起こっている妊娠後期に形成される
高等哺乳類における脳回・脳溝(シワ)の形成
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E45 AdultP33P3
E75 (P3) AdultP33E59 P9
モルモット(Guinea pig)におけるシワ形成
E28
Hatakeyama, Sato, & Shimamura, Dev Growth Differ 2017
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子宮内エレクトロポレーションによるモルモット胎児脳への遺伝子導入
Hatakeyama, Sato, & Shimamura, Dev Growth Diff, 2017
![Page 84: ニワトリの発生 - Yamaguchi U...2019/08/05 · From “The Atlas of Chick Development ” ニワトリ胚の原腸陥入(HH2~HH11) 1日胚(HH5) ヘンセン結節](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022060207/5f03e7ae7e708231d40b58bb/html5/thumbnails/84.jpg)
EP@E31 →E53
GFPBrn2DAPI
Hatakeyama, Sato, & Shimamura, Dev Growth Differ 2017
子宮内エレクトロポレーションによるモルモット胎児脳への遺伝子導入
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・研究に大切なのは独創性。
・人とは違う視点で、人のやらない研究を。
・見て感じたことを大切に(出発点として)。
さいごに
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