ヒ ト内在 性 レ トロウ イル スの 検 出

ヒ トゲ ノムDNA中 の リスザル レ トロウイル ス

関連遺伝子の検 出

岡 山大 学 医学 部癌 源研 究 施 設生化 学部 門 (指導:小 田琢 三 教授)

阿 曽 沼　 裕 彦

(平成 元年2月15日 受稿)

Keywords:ヒ トDNA,内 在性 レ トロ ウイル ス,リ スザ ル レ トロ ウイル ス,

サザ ンハ イブ 弓ダイゼー シ ョン

緒 言

ヒ トを含 め た様 々 な脊 椎動 物 に広 く分 布 す る

レ トロウイル スは逆 転 写 酵素 を有 す るRNA型 の

ウ イル スで あ り,動 物 に癌 を引 き起 こす こ とに

よ りRINA腫 瘍 ウイ ルス とも呼 ば れて い る1).レ

トロウ ィル スは宿 主 細胞 に感 染 した の ち,ゲ ノ

ムのRNAを 逆 転写 酵 素に よ りDNAに して,宿

主染 色 体 に組 込 まれ プ ロウ イル ス となる2).最近

ヒ トを籍主 とす る数 種 の レ トロウ イルスが 発見

され,病 気 との関 連 で注 目され てい る. HTLV

-Iは 成 人T細 胞 白血病や 痙 性 脊 椎麻 痺 の一 種

で あ るHTLV-1-associated myelopathy

(HAM） の 病 因 ウ イ ルス であ るこ とが確 定 し

た3)-5). HTLV-Ⅱ は有 毛細 胞 白血病 患 者か ら分

離 され た6).またHIV-Ⅰ や-Ⅱ1は ヒ ト後天 性 免疫

不全症 候 群 の癌 因 ウ イル スで あ るこ とが判 明 し

た7)-9).これ らの レ トロ ウイル スは個 体 間で水 平

伝 播 す る こ とよ り,外 来性 レ トロウ イルス と呼

ばれ て い る.

一方 レ トロ ウイル スが生 殖 細 胞に感 染 しプ ロ

ウ イル スの形 で染 色体 に緩 込 まれた場 合,宿 主

の 通常 の遺 伝 子 と同様 に メンデ ルの法 則 に従 い

安 定 な形で子 孫へ 垂 直伝播 す る10).この徳 主染 色

体上 に 存在 す る ウイ ル スは内在 性 レ トロウ イル

ス と呼 ばれ て い る.内 在性 レ トロウ イル スはほ

とんどすべての脊 椎動 物のDNA上 に多数 存在 し

てお り10),特にマ ウスや トリでか な り詳 し く研 究

され て い る11).ヒ トに おいて も既 知の動 物 レ トロ

ウ イル ス をプ ロ-ブ と した研 究 に よ り,そ れに

相 同性 の ある内在 性 レ トロウイ ルスが存 在 す る

こ とが確 かめ られ,さ らにい くつか の もの が分

子 クロー ニ ン グされ てい る12)-15).その生 物学 的

意義 は い まだ不 明で あ るが,細 胞の分 化 や発 生

との 関連16),17)や癌 や 自己免 疫疾 患等 の病 気 との

関連181鋤 を示 唆 す る報 告 もあ る。

Odaら は先 に ヒ トリンパ芽球 様株 化細 胞 の一

種(HLB細 胞)よ り産生 され る レ トロ ウ イルス

を見 出 し20) 21),そ のcDNAと 細 胞DNAに 組込

まれ た完全 なプ ロウ イル スゲ ノム を分 子 クロー

ニ ング した22),23).そ の全塩 基 配列 を決定 した と

こ ろ,一 部 の塩 基配 列の みが報 告 され て い る リ

スザ ル レ トロ ウ イル ス(SMRV)24)-26)の それ と

高 い相 同性 を示 す こ とが わか り,本 レ トロ ウイ

ルス をSMRVHLB(SMRV-Hと 略 記)と 命 名 し

た23). SMRVは 薪世 界ザ ル であ る リスザ ル の内

往性 レ トロウ イル スであ り,ヒ トや イヌの細 胞

に感染 しD型 の ウ イル ス粒 子 を形成す る27)-30).

SMRV-Hの 全遺伝 芋 構造 の決定 に よ り,同 ウイ

ル スが レ トロ ウイル ス全体 で よ く保 存 され た一

部の 領域 を除 い てA型, B型 やC型 の レ トロウ

イル スとは異 な り,ま た同 じD型 レ トロ ウイル

ス で あ るMason-Pfizer monkey virusや

SAIDS retravirus-1お よび-2と もか な り異 なっ

た塩 基 配列 を もつ こ とがわ か った23).特にLTR

の配列 は他 の レ トロ ウイ ル スとほ とん ど相 同性

はな い23).

本研 究 はSMRVに 関連 した ヒ ト内在性 レ トロ

ウイル ス を検索 す る こ とを 弓的 として,分 子 ク

ロー ニ ン グ したSMRV-Hの 遺 伝子 断 片 をプ ロ

423

424　 河 曽 沼 裕 彦

-ブ として 用 い,弱 いハ イブ リダ イゼ ー シ ョン

の条件 下 で ヒ トの ゲノム 中に存在す るSMRVと

相 同性 のあ る遺 伝子 の検 出 を行 った.現 在 まで

に報告 され た ヒ ト内在 性 レ トロウ イル スは動物

のA型,B型 お よびC型 レ トRウ イルス の遺伝

子 をプ ロー ブ として検 出された ものであ り12)-15),

D型 レ トロ ウイ ル スに関 す る ものは ない.本 研

究の 結果,ヒ トゲ ノム中 にD型 レ トロ ウ イルス

SMRVに 関連 した ヒ ト遺伝 子 が存在 す るこ とが

明か とな っ た.

材 料 と 方 法

1. DNA

ヒ トDNAは 正常 ヒ ト胎 盤 及び正 常 ヒ ト末 梢血

白血 球 よ り抽 出 した.ま た リスザルDNAは リス

ザ ル肺 組織(山 之 内 製薬,鈴 木照雄 博 士 よ り恵

与)よ り,ア フ リカ ミ ドリザ ルDNAは ア フ リカ

ミドリザル 腎臓由 来培 養CV-1(ATCC, CCL 70)

よ リ,イ ヌDNAは イ ヌ胎児 胸 腺由 来培 養 細 胞

Cf2Th (ATCC, CRL 1430)よ り,マウスDNA

はC3H/Heマ ウス肝 臓 よ り,ト リDNAは ふ化

後1過 間 目の ホワ イ トレグホ ン種 の全 血球 細胞

よ り,そ れ ぞれ抽 出 した.サ ケDNAはSigma

社 のサ ケ精 子由 来DNA(TypeⅢ)を 使 用 した.

図1　 SMRV-Hの 遺 伝 子 構 造 とハ イ ブ リダ イゼ ー シ ョン に用 い た プ ロー ブ の領 域

SMRV-Hの 劉 限酵 素 地 露 と遺 伝 子.構造 はOdaら の 結 果23)に 従 っ て作 成 した.プ ロー ブa～hは □ で囲 ん

だ領 域 を含 ん で い る。す な わ ちプ ロー ブaはLTR中 のSma I部 位 か らRの 終 りま での0.28kb,プ ロー

ブbは2.3kb EcoR l-BamHI断 片,プ ロー ブcは2.1kb Bam H I断 片,プ ロー ブdは2.9kb BamH

I断 片,プ ロー ブeは1.0kb Bg1Ⅱ-Sac I断 片,プ ロー ブ 貿 ま0.71kb Sac I-BamHⅡ 断 片,プ ロー プ

gは1.3kb PvuⅡ-HindⅢ 断片,プ ロー ブhは0.61kb Hind Ⅲ-BamH I断 片 で あ る.図 中 の鯵 限 酵素 の

略 一号は 以 下 の とお りで あ る, B: BamH I, BgI: Bgl I, BgⅡ: BglⅡ, E: BcoR I, H: Hind Ⅲ,

K: Kpn I, P: Pst I, Pv: Pvu Ⅱ, S: Sac I, Sm: Sma I, X: Xba I

2. 高分 子DNAの 抽 出

各組織 からの高 分 子DNAの 抽 出はほほ清 水の

方法31)に従 って行 っ た.胎盤,肺,肝 臓組 織か ら

抽 出す る場 合は まずハサ ミで組織 を細切 した後,

10mM Tris-HCl(pH 7.5)と10mM EDTAを

含 む緩衝 液(TE緩 衝 液)中 でテ フ ロン ホモゲ ナ

イザ ー を用 いて組 織 を破砕 した,ヒ ト末梢 血 白

血球 よ り抽 出す る場 合 はヘ パ リン採 血 を行 い デ

キ ス トラ ン(半 井化 学 薬 最株 式会 社, M. W. 180,

000)を 用 い て 白血 球分 画 を集 め た後, TE緩 衝

ヒ ト内在 性 レ トロウ イル スの検 出　 425

液 に 懸濁 した.ト リ全 血球 細 胞か ら抽 出 す る場

合 は心 臓 か らヘ パ りン採血 し一 度 リン酸 食塩緩

衝 水(PBS)で 洗浄 した後, TE緩 衝液 に 懸濁 し

た.培 養 細胞 か ら抽 出 す る場合 はPBSで 細 胞 を

洗浄 した後 テフ ロ ン製 の ヘ ラで 細胞 をシ ャー レ

か らは が し,TE緩 衝 液 に懸 濁 した.各 組 織 細

胞 の懸濁 液 にプ ロテ イナ ーゼK(Merck社)と

ラウ リル硫 酸 ナ トリウム(SDS)を 最終 濃 度が

それぞれ100μg/mlと0.5%に なるように加 え, 50℃

で3時 間 反 応 させ た. NaClを 最 終 濃度 が0.15M

にな る よ うに加 え,等 量の フ ェ ノー ル,フ ェ ノ

ー ルークロ ロホ ルムーイソア ミル アル コー ル(25:

24:1)混 液,お よび クロロ ホル ムーイ ソア ミル

コー ル(24:1)混 液 で順 次DNAを 抽 出 した.

2倍 量のエ タノール を加 え線 維 状の高分 子DNA

をガラ ス棒 に ま き と り, 10mM Tris-HCl(PH

7.5)と1mM EDTAを 含 む溶 液 に溶か した.

3. プ ロー ブ の調整 と標識

図1に 示 し た プ ロ ー ブaはSMRV-Hの

cDNAを もつ プ ラ ス ミ ドpHVQ22)か ら,プ ロー

ブb～hはSMRV-Hの 会プ ロ ウイル スゲ ノムを

もつ プ ラ ス ミ ドpSMH23)か ら調整 した.そ れ ぞ

れの プ ラ ス ミ ドを図1に 示 す制 限酵素(東 洋紡

績株 式会 社 お よび 宝酒 造株 武会 社 よ り購 入)に

よ り切晒 し, TAE緩 衝 液(0.04M Tlris, 0.02

M酢 酸, 0.001M EDTAを 含 む)32)を 馬 いて作

成 したア ガ ロー スゲ ル(Bio-Rad社, Low-Mr)

で電 気泳 動 し姦DNA断 片 を分 離 した.プ ローブ

とす るDNA断 片 を含 むアガ ロースゲル を切 り出

し,飽 和 のNal溶 液 中 で ゲル を溶解 した後,ガ

ラス ビー ズ(BIO 101社, GLASSMILKTM)を

用 いてDNA断 片 を 回収,精 製 した.

表1　 本研究 で用いたハイブ リダイゼーシ ョンの条

件

a) ハ イプ リダイゼーションのstringencyに 関与す る条

件のみ を記載 した.

b) 洗浄はこ用 いた最 も低 いSSC濃 度の みを記載 した.

プ ロ ー ブ の 標 識 はAmersham社 の ニ ッ ク トラ

ン ス レー シ ョ ン キ ッ ト(N. 5000)を 用 い て[α

-32p]-dCTP(ICN社, 3000Ci/mmo1)を 放 射

性 基 質 と して 行 っ た.酢 酸 ア ン モ ニ ウ ム を 周 い

た エ タ ノー ル 沈 澱 に よ り未 反 応 の放 射 性 基 質 を

除 去 し て,ブ ロ ー ブDNAを 精 製 した.標 識 比 活

性 は1～2×108cpm/μgDNAで あ っ た.

4. サ ザ ン プ ロ ッ テ ィ ン グ

各 種 動 物 よ り摘 出 し た 高 分子DNAを 制 限 酵

素 で 切 断 した 後, TBE緩 衝 液(0.089M Tris,

0.089Mホ ウ 酸, 0.002M EDTAを 含 む)32)を

用 い て作 成 し た0.8%ア ガ ロー ス ゲ ル で,小 型 電

気 泳 動 装 置(ア ドバ ン ス社,ミ ュー ピ ッ ドー2)

を 用 い て10Vで 約20時 間 泳 動 した,サ イ ズ マ ー

カ ー と し て λ フ ァー ジDNAをHind Ⅲ で 切 断

した も の を 用 い た.ゲ ル を0.5μg/mlの エ チ ジ ウ

ム プ ロ ミ ドを含 むTBE緩 衝 液 に ひ た し, DNA

を染 色 し た 後,写 真 撮 影 した.ゲ ル を 変 性 溶 液

(0.5M NaOHと1.5M NaClを 含 む)中 で1

時 間 振 と う し た 後,ブ ロ ッ テ ィ ン グ溶 液(0.25

M NaOHと1.5M NaClを 含 む)を 用 い てDNA

を 毛 細 管 法 で ナ イ ロ ン フ ィ ル ター(Amersham

社, Hybond-N)に 移 し た33).約16時 間 プ ロ ッ

テ ィ ン グ を行 っ た 後 フ ィ ル タ ー を2×SSC(1×

SSCは0.15MNaClと0.015Mク エ ン 酸 ナ ト リ

ウ ム を 含 む)で 軽 く洗 浄 し,風 乾 後 デ シ ケ ー タ

ー 内 で 保 存 しハ イ ブ リダ イゼ ー シ ョン に 贋 い た.

5. ハ イ ブ リダ ィゼ ー シ ョン

ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン は 表1にTし た3種

類 の 条 件 で 行 っ た. High stringentな 条 件 の 場

合 は,フ ィル ター を50%ホ ル ム ア ミF(ホ ル ム

ア ミ ドはBio-Rad社 のAG501-X8イ オ ン 交 換 樹

脂, 20-50メ ッ シ ュ,で 脱 イ オ ン して 使 用 し た),

4×SSC, 10×Denhardt溶 液[1×Denhardt

溶 液 は0.02%フ ィ コー ル(Sigma社Type400),

0.02%牛 血 清 ア ル ブ ミン(Armour杜, F-V),

0.02%ポ リ ビ ニ ル ピ ロ リ ドン(片 山 化 学 工 業 株

式 会 社, K-90)を 含 む], 0.5%SDSと0.1mg/ml

変 性 サ ケ 精 子DNAか ら成 るハ イブ リダ イゼー シ

ョ ン緩 衝 液H中 で42℃ 約16時 間 加 温 した 後,32P

426　 阿 曽 沼 裕 彦

で標識 した変 性 プ ロー ブDNA(約2×106cpm/

mDを 加 えたハ イブ リダイゼー シ ョン緩衝 液H

中で ハ イブ リダ イゼー シ ョン を42℃,約24時 間

行 った.フ ィル ター をそれ ぞれ0.1%SDSを 含

む6×SSCで1回,　 1×SSCで1回,　 0.1×SSC

中 で3回,順 次50℃, 20分 間 づ つ 洗 浄 し た.

　 Middle stringentな 条件 の場 合 は,フ ィル ター

を35%ホ ルム ア ミ ド, 6×SSC, 10×Denhardt

溶液, 0.5%SDSと0.1mg/ml変 性 サケ精 子DNA

か らな るハ イブ リダ イゼー シ ョン緩衝 液M中 で

37℃,約16時 間加 温 した後, 32Pで 標 識 した変 性

プ ロー ブ(約2×106cpm/ml)を 加 え たハ イブ リ

ダ イゼ ー シ ョン緩 衝 液M中 でハ イブ リダ イゼー

シ ョン を37℃,約48時 間行 っ た.フ ィル ター を

それ ぞれ0.1%SDSを 含 む, 6×SSCで1回,

3×SSCで1回, 1×SSC中 で3回,順 次50℃,

20分 間つ つ 洗浄 した. Low stringentな 条件 の場

合 は フ ィル ター を20%ホ ルム ア ミ ド, 6×SSC,

10×Denhardt溶 液, 0.5%SDSと0.1㎎/ml変 性

サ ケ精子DNAか らなるハ イプ リダイゼー シ ョン

緩衝 液L中 で37℃,約16時 間加 温 した後, 32Pで

標 識 した変 性 ブ ロー ブ(約2×106cpm/ml)を 加

えたハ イブ リダ イゼー シ ョン緩衝 液L中 でハ イ

ブ リダ イゼー ショ ンを37℃,約48時 間 行 った.

フィルター をそれ ぞれ0.1%SDSを 含む6×SSC

で1回, 3×SSCで4回,順 次50℃, 20分 間づ

つ 洗浄 した.

図2　 リスザ ルDNA中 のSMRVの 存 在様 式

a. リスザ ルDNA中 のSMRVの 制 限酵 素 切 断 パ ター ン.リ スザ ルDNA(各5μg)を 制 限 酵素EcoR I

とPst Iで 切 断後,そ の ま ま(レ ー ンI)あ るい は,さ らにBamH I(レ ー ン2), Bgl I(レ ー ン

3), Bgl Ⅱ(レ ー ン4), EcoRV(レ ー ン5), Hindm(レ ー ン6), Xba I(レ ー ン7), Kpn I

(レ ー ン8)で それ ぞれ切 断 し, pSMHを プ ロー ブ と してサ ザ ンハ イブ リダ イゼ ー シ ョン を行 った.

b.リ ス ザ ルDNA中 のSMRVの コピー 数.り スザ ルDNA(5μg)をEcoR IとBamH Iで 切 断 し

た(レ ー ン1). pSMHを リス ザ ルDNAハ プ ロ イ ド(3×10gbp)当 り1コ ピー(レ ー ン2), 5コ

ピー(レ ー ン3), 10コ ピー(レ ー ン4)に 相 当す る量 を加 えた5μgの イヌDNAをEcoR IとBamH

Iで 切 断 し,コ ピー数 の 標 準 と した.そ れ ぞれ のDNAを サ ザ ン プ ロ ッ トし,ブ ロー ブbを 用 いて ハ

イブ リダ イゼ ー シ ョ ン を行 っ た.

6. オ ー トラ ジ オ グ ラ フ ィ ー

洗 浄 した フ ィ ル ター は 風 乾 後 サ ラ ン ラ ップ に

包 み,増 感 紙(DuPont社, Lightning-Plus)を

ヒ ト内在 性 レ トロウ イル スの 検 出　 427

用 い て フ ジRX医 療 用X-線 フ ィ ル ム(フ ジ写 真

フ ィル ム 株 式 会 社)に-60℃ で16～72時 間 露 出

し,オ ー トラ ジ オ グ ラ フ ィー を 行 っ た.現 像 は

フ ジ レ ン ドー ル を,定 着 は ス ー パ ー フ ジ フ ィ ッ

ク ス を そ れ ぞ れ 用 い て 行 っ た.

結 果

1. リ スザ ルDNA中 のSMRVの 存 在 様 式

リス ザ ルDNA中 に 組 込 まれ たSMRVの プ ロ

ウ イ ル ス ゲ ノム の 存 在 様 式 をサ ザ ン ハ イ ブ リダ

イ ゼ ー シ ョ ン で 調 べ た.様 々 な 制 限 酵 素 で リス

ザ ルDNAを 切 断 し, SMRV-Hの 全 プ ロ ウ イ ル

ス ゲ ノ ム を もつpSMHを プ ロ ー ブ と してhigh

stringentな 条 件 で ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン を行

っ た(図2a). EcoR IとPst Iで 切 断 し た リ

ス ザ ルDNAを そ の ま ま(レ ー ン1)あ るい は さ

ら にBamH I(レ ー ン2), Bgl I(レ ー ン3),

Bgl II(レ ー ン4), EcoR V(レ ー ン5)Hind

III(レ ー ン6), Xba I(レ ー ン7)お よ びKpn

I(レ ー ン8)で 切 断 しハ イブ リダ イゼ ー シ ョ

ン を行 っ た と こ ろ,そ れ ぞ れ7.0kb(kilo base

pair)(レ ー ン1), 2, 7, 2.3と2.1kb(レ ー ン2),

4.3と1ー5kb(レ ー ン3), 6.4, 3.9と2.5kb(レ

ー ン4), 7.0kb(レ ー ン5), 4.3と1.8kb(レ ー

ン6), 6.7kb(レ ー ン7)お よ び6.3kb(レ ー ン

8)の バ ン ドが 検 出 さ れ た.こ れ らの 結 果 は ク

ロー ン化 さ れ たSMRV24)お よ びSMRV-H23)の

制 限 酵 素 地 図 とほ ぼ 一 致 し た.し か し主 な バ ン

ドの 他 に 薄 い バ ン ド もい くつ か 検 出 さ れ た.プ

ロー ブbを 用 い た 場 合,ま た 単 一 の 制 限 酵 素 で

切 断 し た 場 合 も 同 様 な 結 論 を与 え る結 果 を得 た

(デ ー ター は 示 さ な い).

リスザ ルDNA中 に 組 込 まれ たSMRVプ ロ ウ

イ ル ス の コ ピー 数 を 調 べ た. EcoR IとBamH

Iで 切 断 した リスザ ルDNAと コ ピー 数 の 標 準 と

してEcoR IとBamH Iで 切 断 したpSMHを

同 時 に サ ザ ン プ ロ ッ ト し,プ ロ ー ブbを 用 い て

high stringentな 条 件 で ハ イプ リダ イゼ ー シ ョン

を行 っ た(図2b). 2.3kbの バ ン ドの 濃 さ を 比

べ る と,リ スザ ルDNA(レ ー ン1)は10コ ピ ー

の 標 準(レ ー ン4)よ り3～4倍 濃 い.従 っ て

リス ザ ルDNA中 に は30～40コ ピー のSMRVプ

ロ ウ イ ル ス が 存 在 す る こ とが わ か っ た.

図3　 SMRV関 連 遺伝 子 検 出 のため のハ イプ リダイ

ゼ ー シ ョンの 条 件 の検 討

ヒ ト胎 盤 由 来DNA2μgをBamH Iで 切

断 し,プ ロー ブaを 用 い てハ イブ リダ イゼー

シ ョ ンを行 った.ハ イ ブ リダ イゼー シ ョ ンの

条 件 は表1お よ び材 料 と方 法 に 示 し たlow

stringency(レ ー ン1), middle stringency(レ

ー ン2) ,お よびhigh stringency(レ ー ン3)

を用 い た.

2. ヒ トDNA中 のSMRV関 連 遺 伝 子 の 検 出

ヒ トゲ ノムDNA中 のSMRV関 連 遺 伝 子 を検

出 す る ため に,ま ず プ ロー ブaと 正 常 ヒ ト胎 盤

由 来DNAを 用 い て ハ イ ブ リダ イゼ ー シ ョン の 条

件 を 検 討 し た.表1に 示 し た3種 類 の 条 件 で

BamHIで 切 断 したDNAと ハ イ ブ リダ イセー

シ ョ ン を行 っ た(図3). Low stringentな 条 件

(レ ー ン1)で は 全 体 が ス メア ー と な り明 瞭 な

バ ン ドは 検 出 さ れ な か っ た . High stringentな

条 件(レ ー ン3)で は ま っ た くバ ン ドは 検 出 さ

れ な か っ た.し か しmiddle stringentな 条 件 で

は 約3.0kbの 所 に 明 瞭 な バ ン ドが 形 成 さ れ た(レ

ー ン2).ま た 高 分 子 領 域 の ス メア ー 中 に も数 本

の バ ン ドを確 認 す る こ とが で き た.従 っ て 以 下

の 関 連 遺 伝 子 を検 索 す る ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ

ン の 実 験 はmiddle stringentな 条 件 を 用 い て 行

う こ とに し た.

次 にSMRV-Hの 様 々 な領 域 を 含 むa～hを 用

428　 阿 曽 沼 裕 彦

いて正常 ヒ ト胎 盤DNAと ハ イブ リダイゼー ショ

ン を行 っ た(図4) .gagを 含む プ ロー ブb, prt.

-pol(前 半)を 含 む プ ロー ブC, pol(後 半)-env

を含 む プ ロー ブdの 場合 ス メアー のみ が検 出 さ

れ明 瞭 なバ ン ドはみ え なか っ た.し か しプ ロー

プa,プ ロー ブbを さ らに細分 したプロー ブeと

ブ ロー ブf,お よび ブ ロー ブdを 細分 したプ ロー

ブgと プ ロー ブhに お いて 比較 的 明瞭 なバ ン ド

が検 出 され た.他 の制 限酵素EcoR Iお よびSac

Iで 切 断 したDNAを 用 いた場 合 も検 出 され るバ

ン ドの分 子 量 は異 な るが ほぼ 同様 の結果 が え ら

れ た(デ ー ター は示 さな い).

さらにプ ロー ブaお よびe～hで 検 出 され たバ

ン ドが個 々の ヒ トの間 で共 通 で あ るか どうか を

確 め るため に, 5人 の ヒ トに おけ るそれ らのバ

ン ドの個 体 差 をサ ザ ンハ イブ リダ イゼ ー シ ョン

で調 べ た(図5).正 常 ヒ ト胎盤DNA(レ ー ン

1)の 他 に4人 の正 常 ヒ ト末 梢 血 白血 球DNA(レ

ー ン2～5)をBamH Iで 切 断 し各 ブ ロー ブを

用 いて ハ イブ リダ イゼー シ ョンを行 った ところ,

すべ て の ヒ トに共 通 なバ ン ドが検 出 され個体 差

は認 め られなか った.ま たEcoR Iお よびSac I

で切 断 したDNAに つ いて も同様 に個体 差 は認め

られ なか った(デ ー ター は示 さな い).

3. 種 々の動 物 におけ るSMRV LTR関 連 遺 伝

子の検 出

ヒ ト以外 の動物 にSMRVのLTRに 関連 した

遺伝 子 が存 在す るか ど うか に つ いて検 討す るた

め に,プ ロー ブaを 用 い てBamH Iで 切 断 した

種 々の動 物のDNAと ハ イブ リダイゼー ションを

行 った(図6).そ の結 果マ ウス(レ ー ン2),

サ ケ(レ ー ン6)お よび イ ヌ(レ ー ン7)のDNA

とは ほ とん どハ イブ リダ イゼー シ ョン を起 こさ

なか った.し か し ト-1のDNA(レ ー ン3)で は

数 本の 明瞭 なバ ン ドが検 出 さ れた.ア フ リカ ミ

ドリザ ルのDNA(レ ー ン4)で はバ ン ドとス メ

アーが 検 出 された.リ スザ ルのDNA(レ ー ン8)

では 多数 のバ ン ドが重 な って ス メアー状 に検 出

され た.

図4　 ヒ トDNA中 のSMRV関 連 遺 伝 子 の検 出

ヒ ト胎 盤 由 来DNA 2μ9をBamH Iで 切 断 し,プ ロー ブa～hを 用 い てmiddle stringentな 条 件 で ハ

イブ リダ イゼ ー シ ョン を行 った.各 レー ンの文 字 はプ ロー ブ名 に 対 応す る.

考 察

SMRVは リスザルの内 在性 レ トロウイル スで

あ り,リ スザ ルに おい て垂 直伝 播 され,リ スザ

ルの個 体 のすべ ての臓器のDNA中 にプロウイル

ス の形 で 存 在す る29). SMRVの プ ロ ウ イル ス

DNAは ウイルス感染 イヌ細 胞 中の環 状 ブロウイ

ル スDNAよ り24),またSMRV-Hの プロウ イル

スDNAは レ トロウイルス産 生 ヒ トリンパ系細 胞

(HLB)DNA中 に組 込 まれたブロウイルスDNA

よ り23)すで に分子 クローニ ングされて いるが,リ

ヒ ト内在性 レ トロウイ ル スの検 出　 429

スザ ルの ゲ ノム 中で の存 在様 式 につ いて はあ ま

り詳 し く解 析 されて い ない. Odaら に よ り分子

クロー ニ ング され全 遺伝 子構 造 が決 定 されて い

るSMRV-Hの クロー ン23), Chiuら に よって分

子 クロー ニ ン グされ たSMRVの クロー ン(制 限

酵 素地 図 と塩 基配 列 のみが決定 されている)24)-26)

と リスザ ル ゲ ノム中に 存在 す る内在 性 レ トロ ウ

イル ス遺 伝子 の関係 を調べ るために, SMRV-H

図5　 SMRV関 連 ヒ ト遺 伝 子 の 個 体差

ヒ ト由 来DNA(レ ー ン1)お よ び4人 の 正常 ヒ ト末 梢 血 白血 球 由 来DNA(レ ー ン2～5)を そ れ ぞれ

2μgBamH Iで 切 断 し,サ ザ ンプ ロ ッ トした.そ れ ぞれ の レー ン の上 に記 したプ ロー プ を用 いてmiddle

stringentな 条 件 で ハ イ プ リダ イゼ ー シ ョン を行 った.

430　 阿 曽 沼 裕 彦

全 体 お よびブ ロー ブbを 用 いてサ ザ ンハ イブ リ

ダイゼ ー シ ョン を行 っ た.種 々 の制 限酵素 に よ

る切 断 を行 っ てSMRVやSMRV-Hの 制 酵 素

地 図 と比 較 した とこ ろ,主 なバ ン ドは分 子 クロ

ー ニ ン グ され た両 クロー ン とBglⅡ 以 外 の調べ

た制 限酵素 の範 囲 内 ですべ て一 致 した. Bgl Ⅱの

切 断部 位 はSMRVとSMRV-Hで 異 な るが23),

リスザ ル ゲ ノム 中で は両 クロー ン とそれ ぞれ同

じBglII部 位 をもつ プ ロウ イル スが混在 してい

るこ とが わか っ た.さ らにすべ ての制 限酵素 切

断 で両 クロー ン とは まった く分 子 量の 異 な る薄

いバ ン ドもい くつ か検 出 され た.従 って大 部分

の 内在 性 レ トロウ イル ス遺伝 子 は ウイル ス粒子

を形 成 す ることのできるSMRVやSMRV-Hと

同 じ構 造 を持 ち,構 造 の 異 な った遺伝 子 が一部

存在 す るこ とが示 され た.全 体 では1ゲ ノム 当

リ30～40の コピーの 内在 性 レ トロ ウイル ス遺伝

子 が存 在 す る こ とが わか った.

現在 まで に ヒ ト内在 性 レ トロ ウイル ス として,

マ ウス乳 癌 ウ イル ス347-36),マウス 白血 病 ウイル

ス12). 37), 38),ハ ム ス ターIAP13)(lntracisternal A

-Particle) ,サ ル 肉腫 ウ イル ス39),ヒ ヒ内在 性 レ

トロウ イル ス48),チンパ ンジー 内在性 レ トロウ イ

ルス14), 41)等の現 存の ウイル ス遺伝 子 をプ ロー ブ

として用 いそ の ウ イル スに関連 した遺伝 子 と し

て検 出 され た もの,ま た レ トロウ イルス遺 伝 子

内に 存在 し逆転 写 反応 に関 与 してい るブ ラ イマ

ーtRNAの 結 合部 位 を指 標に して分 子 クロー ニ

ン グされ た もの42), 43),さ らに他 の遺 伝 子 の解析

中に偶 然見 出 され た もの44), 45)が報告 され ている.

SMRVは 代 表 的 なD型 レ トロ ウ イ ル ス で あ

り27), 28), 30),長 い間 リスザル の ゲ ノム 中でプ ロ ウ

イル スの形 で安 定 に垂 直伝 播 され て きた こと29),

また リスザ ル は新 世 界ザ ル に分 類 され進 化 的に

約5千 万年 前に 旧世 界ザル と別 れ てい るこ と30),

SMRV-Hは ヒ トの細 胞に感染 す ることができ21),

特 に リンパ球 系 の細 胞 で強 い転写 活性 を示 す こ

と46)等よ り,ヒ トゲ ノム中 にSMRVに 関連 した

内在 性 レ トロ ウイル スが 存在 す るか どうか を調

べ る こ とは興 味深 い.

図6　 種 々 の動 物 に お け るSMRVのLTRに 関 連 した遺 伝 子 の検 出

ヒ ト(レ ー ン1と5),マ ウス(レ ー ン2),ニ ワ ト リ(レ ー ン3),ア フ リカ ミ ドリザ ル(レ ー ン4),サ

ケ(レ ー ン6),イ ヌ(レ ー ン7),お よび リス.ザル(レ ー ン8)由 来DNA2μgをBamH Iで 切 断 し

た.哺 乳 動 物 の ハ プ ロイ ド(3×109bp)当 り1コ ピー に相 当 す る量のpSMHプ ラ ス ミ ドを コ ピー数 の 標

準 と して用 い た(レ ー ン9).ブ ロー ブaを 用 いてmiddle stringentな 条件 でハ イプ リダ イゼ ー シ ョン を

行 っ た.

本 研究 ではまずSMRV関 連 遺伝 子 を検 出する

ため のハ イブ リダ イゼ ー シ ョンの条 件 を表1に

ヒ ト内在性 レ トRウ イル スの検 出　 431

Tし た3種 類 の 条群 を用 いて検 討 した.そ の う

ち最 も弱 い条 件(low stringency)の 場 合 で も,

高いGC含 量に よる非特 異的 なハイブ リダイゼー

ショ ンは起 こ さず,約35%の 塩 基 対 ミスマ ッチ

を許容 す る47). SMRVのLTRを ブR一 プ と し

た ヒ トDNAに 対 す るハ イブ リダイゼーシ ョンの

場合, middle stringentな 条件 で特 異的 な 明瞭

なバン ドを検 出 するこ とができた. High stringent

な条 件 では まった くバ ン ドは検 出 されず,ま た

low stringentな 条件 では 明瞭 なバ ン ドは検 出 さ

れ なか っ た.

SMRVの 様 々 な領 域 をもつプ ローブを作 成 し(図

1),正 常 ヒ トDNAと ハ イブ リダ イゼー シ ョン

を行 った.そ の うちLTR(プ ロー ブa), gagの

一部(ブ ロー ブeお よびf), envの 一部(プ ロ

ー ブgお よびh)を 常 いた場 合 に明瞭 なバ ン ドが

検 出 され た.プ ロー ブb, cお よびdを 用 い た場

合 には,明 瞭 なバ ン ドは見 出 され なか った.明

瞭 なバ ン ドを得 るため には,限 局 され た領 域 を

含 む比較 的 短 いブ ロー ブ を用 い る必要 が あ る.

プ ロー ブaお よびe～hで 検 出 されたバ ン ドは5

人 の ヒ トに お いて個 体 差 は見 られ なか った.従

って これ らのバ ン ドは外 来性 レ トロウ イル スの

感染 に よる もの では な く,ヒ トの間 に共通 して

存在 す る遺 伝子 で あ る. SMRVのLTRやgag

の塙 基 配列 は他 の レ トロ ウイル ス と比 べ て独特

であ るこ とよ り23),プ ロー ブaお よびe, fで 検

出 され たバ ン ドはSMRV関 連 ヒ ト遺 伝 子 である

と考 え られ る.し か しSMRVのenvは 他 の レ ト

ロウ イル ス と一 部梢 間性の 高 い領 域 を もち,特

に免疫 抑制 ペ プチ ド48)をコー ドす る領域 は非常 に

よ く保 存 されて い るの で23),プ ロー ブgとhで

検 出され た バ ン ドのい くつ か はす でに 報告 され

て い るヒ ト内在性 レ トロウ イル スの もの であ る

可能性 が あ る.LTR(プ ロー ブa)で 検 出 され

た約3.0kbの バ ン ドはそのバ ン ドの濃 さよ リ1ゲ

ノム 当 り数 コ ピー存在 す る もの と考 えられ る(D

6,レ ー ン5と9).

SMRV LTRに 関 連 した配 列 が ヒ ト以 外 の動

物 にお い て存 在す るか どうか 調べ た,ア フ リカ

ミ ドリザ ルや,予 期 しなか った こ とで あ るがニ

ワ トリのDNAの 場 合 にはバ ン ドや スメアー が見

られ た.し か しサ ケや マ ウス,イ ヌのDNAに は

反応 しな か った.従 って,今 回調べ た霊 長 類の

DNAは すべ てSMRV LTRと 反 応 しバ ン ドや

ス メアー を形 成 した.ニ ワ トリでみ られ たバ ン

ドが既 知 のニ ワ トリ内在性 レ トロ ウイル スで あ

るか どうかは 不 明で あ る.さ らに詳 しく様 々 な

動 物 につ いて この ような研 究 を行 うこ とに よ り,

その動物 の進 化}内 在 性 レ トロウイルス として組

込 まれた時 期,お よび 内在性 レ ドロウイル スの進

化 につ いての知 見が得 られ る もの と考 え られ る.

本 研 究に よ りヒトのゲ ノム 中にSMRV関 連遺

伝 子が存 在 す るこ とが明 らか に された.こ れ ら

が ヒ ト内在性 レ トロウ イル スで あるか ど うか を

確か め る ために は,そ れ らの遺 伝子 を骨 子 クロ

ー ニ ング し構 造解析 を行 う必要 が あ る.ま たそ

れ らの遺 伝 子の発 現 を調べ るこ とに よ りヒ ト細

胞 におけ る内在性 レ トロウ イル スの役 割 や病 気

との 関連 が得 られ る もの と考 え られ る.

結 論

リスザ ル レ トロウ イル ス(SMRV)は こ関連 し

た ヒ ト内在性 レ トロウイルス を検 索す るため に,

SMRV-Hの 様々 なプ ローブ を用いたサザ ンハイ

ブ リダ イゼー シ ョン を行 い以下 の結論 を得 た.

1. リスザ ルゲ ノムDNA中 はこ存在す るSMRV

の存在 様 式 を調 べ た とこ ろ,す でに分 子 クロー

ニ ングされているSMRVやSMRV-Hの 制 限酵

素 地 図 とほぼ一 致 した.し か し一 致 しない少数

の遺伝 子 も存在 した.リ スザ ル の1ゲ ノム 当 り

約30～40コ ピー のSMRVが 存 在す ることがわか

った.

2. ヒ トゲ ノム 中の 内在 性 レ トロ ウイ ルス を検

出す るた めのサ ザ ンハ イブ リダイゼー シ ョンの

条 件 を決定 した.

3. SMRV-Hの ゲ ノムDNAの 様 々な領 域のブ

ロー ブ を作 成 し,正 常 ヒ トDNAと ハ イブ リダイ

ゼ ー シ ョン を行 った とこ ろ, LTR, gagの 一部

お よびenvの 一部 をブ ロー ブに用 いた場 合 に明

瞭 なバ ン ドが検 出 され た.そ れ らのバ ン ドは5

人の ヒ トの間 で個体 差 は認め られ なか った.以

上 の結果 よ リヒ トゲ ノム中にSMRVに 関連 した

ヒ ト遺伝 子 が存 在す るこ とが 判 明 した.

4. 種 々の動 物DNA中 のSMRV LTR関 連遺

伝 子 を検 索 した とこ ろ,ア フ リカ ミ ドリザ ルお

432　 阿 曽 沼 裕 彦

よびニ ワ トリに バ ン ドや ス メアー が検 出 され た

が,サ ケ,マ ウ ス,イ ヌのDNAと は反 応 しなか

った.

本研究 を遂行す るにあた り,終 始御指導 と御校 閲を

賜 りま した恩師,小 田琢童教授 に深 く感謝の意を捧

げます.さ らに,実 験遂行 にあたh,終 始快 く御協

力 くださいました地田正五助手をは じめ術 究室の皆

様 に心か ら御礼申 し上 げます.ま た リスザ ル組織 を

恵与 していただいた山之 内製薬株式会社安全性研究

所実験動物施設,鈴 木照雄博士はこ感謝いた します.

文 献

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ヒ ト内在 性 レ トロ ウ イルスの 検 出　 435

Detection of human sequence related to the squirrel

monkey retrovirus

Hirohiko ASONUMA

Department of Biochemistry, Cancer Institute,

Okayama University Medical School,

Okayama 700, Japan

(Director: Prof. T. Oda)

Squirrel monkey retrovirus (SMRV) is an endogenous type D retrovirus of the squirrel

monkey, a New World primate. Southern hybridization with cloned SMRV-H revealed that

30-40 copies of SMRV proviral DNA are present in the squirrel monkey genome and the

majority have almost the same physical map as that of the cloned SMRV-H. SMRV-related

sequences in the human genome were sought using the same method with various cloned

SMRV-H DNA fragments under conditions of relaxed stringency. The discrete restriction

fragments were frequently detected in the DNA from normal humans with the LTR and parts

of gag and env as probes. Since SMRV LTR has very little homology with the LTRs of other

retroviruses, the fragments detected with the LTR probe were characterized as SMRV-related

human sequences. SMRV LTR-related sequences were also detected in the African green

monkey and chicken, but not in the salmon, mouse, or dog. In conclusion, SMRV-related

sequences are present in human DNA, and some of them might represent endogenous

retroviral sequences of human DNA.