fibrochondrocyt aggregaten: effect van lage zuurstofspanning...
TRANSCRIPT
Fibrochondrocyt aggregaten: effect van
lage zuurstofspanning en TGF-β
Charlot PHILIPS
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Maria Cornelissen
Begeleider: Elke Berneel
Vakgroep: Medische Basiswetenschappen
Academiejaar 2013-2014
Fibrochondrocyt aggregaten: effect van
lage zuurstofspanning en TGF-β
Charlot PHILIPS
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor: Prof. Dr. Maria Cornelissen
Begeleider: Elke Berneel
Vakgroep: Medische Basiswetenschappen
Academiejaar 2013-2014
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk
ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder
met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het
aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum Charlot Philips Prof. Dr. Maria Cornelissen
Voorwoord
Doorheen het voorbije jaar zijn verschillende mensen betrokken geweest bij het tot stand
komen van deze masterproef. Zonder hen was het niet mogelijk geweest deze opdracht tot een
goed einde te brengen. Via deze weg wil ik hen dan ook bedanken voor hun bijdrage.
Als eerste zou ik graag Prof. Dr. Maria Cornelissen bedanken die mij de mogelijkheid gaf om
in haar labo vertrouwd te geraken met het wetenschappelijk onderzoek. Ook voor het nalezen
van mijn masterproef ben ik haar zeer dankbaar.
Als tweede gaat mijn dank uit naar Elke Berneel die mij het volledige jaar heeft begeleid.
Bedankt om mij mee te laten werken aan dit interessante onderzoek en kennis te laten maken
met heel wat verschillende technieken. Ook de vele verbeteringen die je aan mijn masterproef
hebt aangebracht, heb ik enorm geapprecieerd.
Daarnaast wil ik ook Leen Pieters bedanken om haar uitgebreide histologische kennis met mij
te delen. Bedankt om altijd beschikbaar te zijn voor vragen en te helpen met kleuringen indien
nodig.
Ook bedankt aan Johanna en Greet om mij op weg te helpen in de steriele kamer en in het
moleculair labo.
Dikke merci ook aan Annelies die altijd klaar stond met tips en tricks en in het bijzonder
ervoor gezorgd heeft dat de GAG bepaling succesvol kon uitgevoerd worden.
Verder wil ik ook Sebastian, Annelot, Julie, Elien, Pamela, Karolien, Toke, Heidi en Sylvia
bedanken voor de aangename sfeer in het labo en de leuke middagpauzes.
Mijn laatste woord van dank gaat uit naar mijn ouders, vrienden en familie die mij altijd zijn
blijven steunen. In het bijzonder wil ik ook mijn vriend Jonas bedanken, die er altijd stond op
de drukke momenten en onvoorwaardelijk in mij geloofde gedurende dit ganse jaar.
Charlot
Inhoudsopgave
Afkortingenlijst .......................................................................................................................
Samenvatting ..........................................................................................................................1
Summary ................................................................................................................................2
1 Inleiding ..........................................................................................................................3
1.1 De meniscus .............................................................................................................3
1.1.1 Anatomie...........................................................................................................3
1.1.2 Histologie ..........................................................................................................3
1.1.3 Biomechanische eigenschappen .........................................................................4
1.2 Huidige behandelingen voor meniscusletsels ............................................................5
1.2.1 Meniscus allogreffe ...........................................................................................6
1.2.2 Synthetische implantaten ...................................................................................7
1.3 Tissue engineering van fibrocartilago .......................................................................8
1.3.1 Cellen voor meniscus tissue engineering............................................................9
1.3.2 Biochemische en mechanische stimuli ............................................................. 10
1.3.3 Scaffolds ......................................................................................................... 11
1.3.4 Top-down versus bottom-up tissue engineering ............................................... 13
1.4 Doel van de masterproef ......................................................................................... 14
2 Materiaal en methoden .................................................................................................. 15
2.1 Isolatie meniscus en fibrochondrocyten .................................................................. 15
2.2 Monolayer expansie ............................................................................................... 15
2.3 Micro-aggregaten ................................................................................................... 16
2.3.1 Vorming .......................................................................................................... 16
2.3.2 Cultuuromstandigheden ................................................................................... 16
2.4 Evaluatie ................................................................................................................ 17
2.4.1 Viabiliteitstest ................................................................................................. 18
2.4.2 Biochemische analyse ..................................................................................... 18
2.4.3 Histologische analyse ...................................................................................... 19
2.4.4 Genexpressie ................................................................................................... 22
2.5 Inkapselen van micro-aggregaten............................................................................ 24
2.6 Statistische analyse ................................................................................................. 25
3 Resultaten...................................................................................................................... 26
3.1 Monolayer expansie ............................................................................................... 26
3.1.1 Cel morfologie ................................................................................................ 26
3.1.2 Gen expressie profiel van primaire en gesplitste fibrochondrocyten ................. 26
3.2 Fibrochondrocyten gecultiveerd in microchips........................................................ 27
3.2.1 Morfologische evolutie micro-aggregaten ........................................................ 27
3.2.2 Viabiliteit ........................................................................................................ 30
3.2.3 Gen expressie profiel ....................................................................................... 32
3.2.4 Immunohistochemie en histochemie ................................................................ 32
3.2.5 GAG/DNA bepaling ........................................................................................ 37
3.3 Micro-aggregaten ingekapseld in een collageen I hydrogel ..................................... 37
3.3.1 Morfologische evolutie .................................................................................... 37
3.3.2 Viabiliteit ........................................................................................................ 38
3.3.3 Gen expressie profiel ....................................................................................... 39
4 Discussie ....................................................................................................................... 40
4.1 Monolayer expansie van fibrochondrocyten ............................................................ 40
4.2 Fibrochondrocyten gecultiveerd in microchips........................................................ 40
4.3 Micro-aggregaten ingekapseld in een collageen I hydrogel ..................................... 44
5 Conclusie ...................................................................................................................... 45
6 Referenties .................................................................................................................... 46
7 Addendum ....................................................................................................................... I
Bijlage I: Samenstelling Ringer .......................................................................................... I
Bijlage II: Samenstelling FC medium ................................................................................. I
Bijlage III: Protocol Maken van microchips ........................................................................ I
Bijlage IV: Samenstelling PBS .......................................................................................... II
Bijlage V: Samenstelling neutraal gebufferde formol ......................................................... II
Afkortingenlijst
ADSCs Adipose-derived stem cells
bFGF basic Fibroblast Growth Factor
BMPs Bone Morphogenetic Proteins
BMSCs Bone marrow-derived stem cells
BSA Bovine Serum Albumine
CaPI kleuring Calceïne-AM Propidiumiodide kleuring
CMI Collagen Meniscus Implant
CTGF Connective Tissue Growth Factor
DAB 3,3'-diaminobenzidine
DMEM/F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
ECM Extracellulaire matrix
FC medium Fibrochondrocyten medium
FGF2 Fibroblast Growth Factor 2
FKS Foetaal kalf serum
GAGs Glycosaminoglycanen
HIF-1α Hypoxia Inducible Factor 1α
IGF-I Insuline-like Growth Factor I
ITS Insuline-transferrine-selenium
NGF Neutraal gebufferde formol
NRS Normal Rabbit Serum
P1 Passage 1
P/S antibioticum Penicilline/streptomycine antibioticum
PBS Phosphate buffered saline
PCL Polycaprolacton
PDGF Platelet Derived Growth Factor
PG Proteoglycanen
PLGA Poly(lactide-co-glycolide)
RAM Rabbit anti-mouse
RPM Roads per minute
TGF-β1 Transforming Growth Factor β1
1
Samenvatting
De meniscus is een onmisbare structuur tussen de femur en de tibia die zorgt voor stabiliteit
van het kniegewricht en het opvangen en herverdelen van verschillende krachten. Aangezien
letsels aan de meniscus vrij frequent zijn, is het van belang om deze op een adequate manier
te kunnen behandelen. De huidige behandelingen, meniscectomie en transplantatie van een
allogreffe, zijn nog niet optimaal waardoor op termijn problemen zoals osteoartritis kunnen
ontstaan. De laatste decennia is er een groeiende interesse in de mogelijkheid van tissue
engineering waarbij op basis van cellen, scaffolds en groeifactoren nieuwe constructen
gevormd worden die de defecten kunnen opvullen.
In deze masterproef werden fibrochondrocyten eerst in monolayer geëxpandeerd en werden
vervolgens aan de hand van agarose microchips micro-aggregaten gevormd. Er werden vier
verschillende cultuurcondities uitgetest, namelijk een medium met of zonder TGF-β1 en lage
of hoge zuurstofspanning. Op dag 4, 14 en 21 werden de micro-aggregaten geëvalueerd via
een viabiliteitstest, RT-qPCR, histologische analyse en GAG/DNA bepaling. In een tweede
luik werden micro-aggregaten na vier dagen ingekapseld in een collageen I hydrogel en in een
chondrogeen medium bij 5% O2 in cultuur gehouden. Opnieuw werd op dag 7, 14 en 21 een
viabiliteitstest uitgevoerd, alsook evaluatie aan de hand van RT-qPCR.
Analyse met behulp van RT-qPCR toonde aan dat de expressie van collageen I, collageen II,
aggrecan en Sox-9 verhoogd was in de micro-aggregaten gecultiveerd in aanwezigheid van
TGF-β1. Dit werd bevestigd door een verhoogde GAG productie, alsook door een
toenemende intensiteit bij de immunohistochemische kleuringen. Deze effecten werden nog
versterkt door een lage zuurstofspanning. Ook de micro-aggregaten die ingekapseld werden in
een hydrogel vertoonden een verhoogde expressie van collageen II, aggrecan en Sox-9.
Uit dit onderzoek kunnen we besluiten dat de high throughput vorming van uniforme micro-
aggregaten mogelijkheden biedt voor redifferentiatie van fibrochondrocyten. Toevoegen van
TGF-β1 aan het medium en een lage zuurstofspanning blijken positief te zijn om stabiele
micro-aggregaten met een correct fenotype te bekomen. De micro-aggregaten konden hun
functionaliteit behouden wanneer ze ingekapseld werden in een hydrogel. Dit resultaat opent
perspectieven om in de toekomst grotere constructen te vormen door middel van bioplotting.
2
Summary
The meniscus is an important structure in the knee joint and is frequently injured in elderly as
well as in younger people. Due to the lack of regenerative capacity, lesions of the meniscus
can’t heal themselves, possibly leading to osteoarthritis in the long term. Recent studies are
focusing on the area of tissue engineering to meet the demand of new treatment strategies. In
this research, micro-aggregates of fibrochondrocytes were formed and cultured under four
different conditions for 21 days. RT-qPCR, histology and GAG/DNA assay were used to
determine the role of TGF-β1 and low oxygen tension on the redifferentiation capacity of
fibrochondrocytes. Micro-aggregates were also encapsulated in a hydrogel and evaluated
through RT-qPCR. In general, micro-aggregates cultured under hypoxia and in chondrogenic
medium showed the highest increase in gene expression of collagen I, collagen II, aggrecan
and Sox-9. They also produced more GAGs compared to micro-aggregates cultured under
normoxia. These results were supported by the immunohistochemical staining. Micro-
aggregates encapsulated in a hydrogel showed similar results, expressing higher levels of
collagen II, aggrecan and Sox-9 and producing more GAGs over time. Taken together, these
results show evidence for the use of high throughput micro-aggregates in redifferentiation
studies of fibrochondrocytes. They are also suitable for the use in 3D environments, offering
possibilities to create larger constructs in the future by bioplotting.
3
1 Inleiding
1.1 De meniscus
1.1.1 Anatomie
Het kniegewricht vormt met zijn complexe structuur de overgang tussen de femur en de tibia.
Een zeer belangrijk onderdeel van dit gewricht is de meniscus die zorgt voor een
contactoppervlak tussen beide botstructuren (Figuur 1). Zonder de meniscus zou er door de
incongruentie van de condylus van de femur en het tibiaplateau heel wat wrijving ontstaan.
De wrijvingen worden opgevangen door zowel de mediale als laterale component van de
meniscus. Beide componenten hebben een halvemaanvormige structuur en worden
ondersteund door verschillende ligamenten, met als voornaamste het mediale en laterale
collaterale ligament, de voorste en achterste kruisband en het transvers ligament (Figuur 1) [1].
Figuur 1: Anatomie van het kniegewricht [1]
1.1.2 Histologie
In de meniscus kunnen op basis van histologie 3 verschillende celtypes onderscheiden worden,
verspreid over verschillende zones (Figuur 2) [1-3]. Allereerst is er de perifere zone waar in
beperkte mate bloedvaten en zenuwen worden teruggevonden. De cellen in deze zone noemt
men fibroblastachtige cellen. Net zoals fibroblasten synthetiseren ze collageen type I, maar
door hun ovale vorm onderscheiden ze zich van de meer uitgestrekte fibroblasten [1]. Na een
4
overgangszone met daarin een mengeling van celtypes, kan men in het binnenste deel van de
meniscus fibrochondrocyten vinden. Deze cellen hebben een ronde vorm en worden omgeven
door een extracellulaire matrix (ECM) die zowel uit collageen type I als collageen type II
bestaat [1]. Over de exacte verhouding van beide types collageen bestaat er niet veel data,
maar volgens Cheung et al. zou er 60% collageen II aanwezig zijn tegenover 40% collageen I
[4]. Als laatste zijn er ook nog de spoelvormige cellen van de superficiële zone die zich
verspreid over het oppervlak bevinden. De rol van deze cellen is nog niet helemaal duidelijk,
maar mogelijks zijn dit progenitor cellen die van belang kunnen zijn bij regeneratie van de
meniscus [1].
Figuur 2: Overzicht verschillende celtypes in de meniscus [1]
1.1.3 Biomechanische eigenschappen
Dankzij zijn unieke opbouw zorgt de meniscus voor het opvangen en herverdelen van
verschillende krachten zoals wrijving, spanning en druk, alsook voor de stabiliteit van het
kniegewricht en de soepele werking ervan [1, 5]. De weerstand tegen spanningskrachten
wordt voornamelijk bepaald door de oriëntatie van de collageenvezels. De vezels zijn
hoofdzakelijk circumferentieel georiënteerd, waardoor ze spanningen tot 110 MPa aankunnen
[6]. Daarnaast zijn ook een aantal vezels radiaal georiënteerd die ervoor zorgen dat de
circumferentieel geordende collageenvezels samengehouden worden. Het opvangen van
schokken wordt dan weer bepaald door de aanwezigheid van proteoglycanen zoals aggrecan.
Deze moleculen zijn in staat om grote hoeveelheden water te absorberen waardoor een
hydrostatische druk ontstaat die bestand is tegen zware belasting [6].
5
1.2 Huidige behandelingen voor meniscusletsels
Doordat de meniscus onderhevig is aan heel wat druk en spanning zorgt dit ervoor dat
frequent letsels kunnen optreden. In de Verenigde Staten krijgen maar liefst 66 mensen per
100 000 inwoners te maken met enige vorm van schade aan de meniscus [1]. Ook in het
Verenigd Koninkrijk blijkt een gescheurde meniscus de meest frequente oorzaak van letsels
van zacht weefsel te zijn met een incidentie van 23.8 per 100 000 per jaar [7]. Bij oudere
patiënten gaat het vooral om slijtage die doorheen de jaren opgebouwd wordt. Jongeren
daarentegen zullen eerder letsels oplopen door een verkeerde beweging tijdens het sporten.
De behandeling van meniscusletsels hangt voornamelijk af van de locatie en omvang van de
scheur. Wanneer de scheur zich in de perifere, vasculaire zone bevindt, kan men opteren om
deze vanzelf te laten regenereren of door middel van hechtingen het herstel te bevorderen [1,
8]. In de avasculaire zone is herstel van een scheur echter heel wat complexer en veel minder
succesvol. Tot op heden blijft de meest courante behandeling partiële meniscectomie waarbij
het beschadigde deel van de meniscus wordt weggenomen [1].
Door het wegnemen van een deel van de meniscus kunnen op langere termijn diverse
problemen ontstaan. Het opvangen van schokken en de weerstand tegen druk en spanning zal
minder efficiënt verlopen, alsook kunnen er plaatsen ontstaan waar het onderliggend
kraakbeen niet meer beschermd is met osteoartritis tot gevolg [9-11]. Om deze problemen te
vermijden is men op zoek naar behandelingen die ervoor zorgen dat het defect opgevuld
wordt met nieuw weefsel, al dan niet van de patiënt, om zo de meniscus in zijn functie te
herstellen.
De laatste decennia werden een drietal strategieën uitvoerig bestudeerd, meer bepaald het
transplanteren van een meniscus allogreffe, het gebruik van synthetische implantaten en de
mogelijkheid van tissue engineering. Ondanks de vooruitgang die werd geboekt, is er nog
steeds geen ideale oplossing en blijft herstel van de meniscus een uitdaging voor de medische
wereld.
6
1.2.1 Meniscus allogreffe
Wanneer de mediale of laterale component van de meniscus op zijn geheel moet worden
weggenomen of onherstelbaar beschadigd is, kan men een allogreffe transplanteren. Deze
greffes zorgen voor verlichting van de pijn, voorkomen degeneratie van het kraakbeen en
verbeteren de mechanische eigenschappen van het kniegewricht [12, 13]. In eerste instantie
zijn de greffes acellulair, maar in de loop van de tijd treedt kolonisatie op door gastheercellen
wellicht afkomstig van het synovium en het gewrichtskapsel (Figuur 3) [12].
Figuur 3: Kolonisatie van meniscus greffes (*) door gastheercellen, wellicht afkomstig van het synovium
en het gewrichtskapsel (**) [12]
De eerste transplantaties werden uitgevoerd door Wirth et al. in een studie van 23 patiënten in
1984 [14]. Uit dit onderzoek bleek dat diepgevroren greffes betere resultaten opleverden dan
gevriesdroogde greffes. In de huidige praktijk bestaan er verschillende methoden voor de
verwerking, sterilisatie en bewaring van meniscus greffes. Zo kan men kiezen voor het
gebruik van viabele greffes, gecryopreserveerde greffes of versgevroren greffes [13]. Door de
positieve resultaten in de meerderheid van de patiënten, is de transplantatie van allogreffes de
standaard behandeling geworden na een totale meniscectomie, zeker bij jonge mensen [6].
Een groot nadeel van deze techniek is echter dat ze niet geschikt is voor het vervangen van
een gedeelte van de meniscus zoals nodig is na een partiële meniscectomie. Daarnaast is ook
het aantal donoren beperkt, is er een risico op overdracht van infectieuze ziekten, bestaat er
een zekere incongruentie tussen donor en acceptor en blijft de kans op afstoting reëel [15].
7
1.2.2 Synthetische implantaten
Een tweede mogelijkheid om de meniscus in zijn functie te herstellen is het gebruik van
synthetische implantaten. Deze hebben het grote voordeel dat men niet meer afhankelijk is
van donoren zoals bij de meniscus allograft. De implantaten kunnen op grote schaal en met
een hoge reproduceerbaarheid vervaardigd worden waardoor deze onmiddellijk beschikbaar
zijn. Tot op heden zijn er twee types commercieel beschikbaar, namelijk de collagen meniscus
implant (CMI®) en een poreuze polyurethaan scaffold (Actifit™) [16, 17].
1.2.2.1 Collagen meniscus implant (CMI®)
Stone et al. slaagden er in een implantaat te construeren op basis van collageen type I vezels
van runderen gecombineerd met hyaluronzuur en chondroïtine sulfaat (Figuur 4) [18]. Na heel
wat in vitro en in vivo studies bij dieren werd aangetoond dat het implantaat niet toxisch is en
de ingroei van fibrochondrocyten met de vorming van ECM gestimuleerd kan worden [19,
20].
Vervolgens werd een eerste klinische trial uitgevoerd om de resultaten te bevestigen in de
mens [18]. Uit deze kleinschalige studie bleek dat het implantaat ook veilig is voor humaan
gebruik en opnieuw leidt tot vorming van nieuw weefsel. Uiteindelijk volgde dan een
grootschalige studie waarbij de CMI® vergeleken werd met partiële meniscectomie [16]. De
auteurs concludeerden dat patiënten die leden aan een chronisch letsel van de meniscus een
duidelijk voordeel ondervonden van de CMI®, terwijl er in het geval van acute letsels geen
verbetering kon waargenomen worden. Deze conclusie wordt echter betwist aangezien ze
gebaseerd is op de positieve uitkomst van slechts één test waarvan de klinische relevantie in
vraag gesteld wordt [21]. Daarnaast worden ook nog andere negatieve aspecten van de CMI®
aangehaald door Verdonk et al. [22]. Zo is de CMI® afkomstig van dierlijk materiaal,
Figuur 4: Collagen meniscus implant [16]
Links: macroscopisch overzicht. Rechts: scanning elektronen microscopie van dwarsdoorsnede
8
waardoor er een kans op infectie bestaat. Verder blijkt ook dat de scaffold in grootte afneemt
wanneer deze aan natte omstandigheden blootgesteld wordt, wat nefast kan zijn voor de
implantatie.
1.2.2.2 Polyurethaan scaffold (Actifit™)
Meer recent werd een polyurethaan scaffold ontworpen die tracht de tekortkomingen van de
CMI® te verbeteren. De preklinische studies in honden leverden al meteen veelbelovende
resultaten op. Zo bleek er een snelle infiltratie op te treden van fibrovasculair weefsel met
vorming van een ECM rijk aan collageen I en werd ook amper een immunologische reactie
vastgesteld. De duur van de studie was echter te kort om het beschermende effect op
kraakbeen aan te tonen [23].
Verdere klinische studies bevestigden de ingroei van nieuw weefsel en toonden duidelijke
voordelen voor de behandelde patiënten aan, met name een vermindering van de pijn en een
verbetering van de functie van het kniegewricht [17, 22]. In de studie werd echter geen
controlegroep opgenomen, waardoor de meerwaarde ten opzichte van patiënten die enkel een
partiële meniscectomie ondergingen niet bepaald kan worden [21]. Daarnaast is het ook
afwachten of de resultaten bevestigd worden op lange termijn en moet men nagaan of de
degradatietijd van de scaffold voldoet aan de vereisten.
1.3 Tissue engineering van fibrocartilago
De mens heeft altijd al een interesse gehad in het verlies van weefsel en het zoeken naar
oplossingen hiervoor. Sinds eind jaren ’80 wordt het onderzoeksdomein dat zich met deze
vragen bezighoudt aangeduid als ‘tissue engineering’ en werd het als volgt gedefinieerd:
“ ‘Tissue Engineering’ is the application of principles and methods of engineering and life
sciences toward fundamental understanding of structure-function relationships in normal and
pathological mammalian tissues and the development of biological substitutes to restore,
maintain, or improve tissue function.” [24]
Tissue engineering is dus een interdisciplinair domein waarbij de kennis uit onder andere de
biologie en de ingenieurswetenschappen gecombineerd wordt om zo de structurele en
biomechanische eigenschappen van een bepaald weefsel in vitro te kunnen nabootsen.
9
In de orthopedie is men door de hoge incidentie aan meniscusletsels en het gebrek aan
donormateriaal ook tissue engineering als een optie gaan beschouwen naast de reeds
bestaande methoden van meniscectomie en allografts. Om tot een in vitro construct te komen
dat in staat is om het defect in de meniscus te vervangen, moet gezocht worden naar de juiste
combinatie van scaffolds, cellen en groeifactoren [1, 25, 26]. Daarnaast kunnen ook
biochemische en mechanische stimuli een belangrijke rol spelen [1, 25].
1.3.1 Cellen voor meniscus tissue engineering
Bij de keuze voor een bepaald celtype moeten een aantal afwegingen gemaakt worden. Zo
moet rekening gehouden worden met de beschikbaarheid van de cellen, hoe gemakkelijk de
cellen geïsoleerd kunnen worden, hun mogelijkheid om het gewenste fenotype te expresseren
en het gemak waarmee ze in cultuur geëxpandeerd kunnen worden.
1.3.1.1 Autologe fibrochondrocyten
Voor de zoektocht naar de perfecte replica van de natieve meniscus zijn fibrochondrocyten
afkomstig van de patiënt zelf de meest voor de hand liggende celbron. Deze cellen
synthetiseren reeds een ECM rijk aan collageen I en collageen II die ook voldoet aan de
biomechanische vereisten. Het gebruik van autoloog materiaal brengt echter ook een aantal
nadelen met zich mee. Zo is er voor de isolatie van fibrochondrocyten een voorafgaande
chirurgische ingreep vereist en kan deze procedure leiden tot morbiditeit op de plaats van
donatie [1, 25]. Daarnaast is de kwaliteit van de cellen soms niet meer optimaal door
eventuele traumata, ziekte of degeneratie van de meniscus [1, 25, 26].
Vaak zullen via een biopsie ook niet voldoende cellen voor tissue engineering geïsoleerd
kunnen worden, waardoor expansie van de fibrochondrocyten via monolayer cultuur
noodzakelijk is. In de praktijk leidt dit echter, zoals bij chondrocyten, tot dedifferentiatie
waarbij de expressie van collageen II sterk neergereguleerd wordt en er een toename is van
collageen I [27, 28]. Verschillende pogingen werden reeds ondernomen om
fibrochondrocyten in cultuur te redifferentiëren. Door modificaties aan te brengen aan het
oppervlak waarop de cellen expanderen, kan de genexpressie beïnvloed worden. Zo leidden
een collageen I en aggrecan coating tot neerregulatie van collageen I en opregulatie van
cartilage oligomeric matrix protein (COMP) [27]. Een andere onderzoeksgroep stelde vast dat
collageen II expressie verhoogd was na expansie op een oppervlak bestaande uit meerdere
lagen collageen I/II en chondroïtine-6-sulfaat [29].
10
1.3.1.2 Stamcellen
Om het probleem van onvoldoende cellen te omzeilen, kan men ook gebruik maken van
stamcellen. Zowel voor mesenchymale stamcellen uit het beenmerg (bone marrow-derived
stem cells – BMSCs) als stamcellen afkomstig van vetweefsel (adipose-derived stem cells –
ADSCs) werd reeds aangetoond dat deze een chondrogene capaciteit bezitten [30-32]. Door
hun overvloedige aanwezigheid in het lichaam, gemakkelijke isolatie en snelle proliferatie
zijn BMSCs en ADSCs een aantrekkelijk alternatief voor autologe fibrochondrocyten.
Ondanks deze voordelen zijn er ook een aantal beperkingen gekoppeld aan het gebruik van
stamcellen voor tissue engineering. Zo blijkt het niet evident om een homogene differentiatie
te bekomen in een populatie van stamcellen. Door transportgradiënten kunnen regionale
verschillen ontstaan in de ECM waardoor de mechanische eigenschappen inferieur zijn en de
cellen minder geschikt zijn voor verdere toepassingen [33]. Daarnaast moet ook gestreefd
worden naar de optimale combinatie van groeifactoren om de chondrogenese op een
reproduceerbare manier te induceren en hypertrofie van de cellen te voorkomen [34].
In een aantal studies werd ook de combinatie van mesenchymale stamcellen en
fibrochondrocyten onderzocht. Deze co-cultuur leverde enkele interessante resultaten op.
Door beide celtypes samen in cultuur te brengen, werd er minder hypertrofie en een
verhoogde matrix vorming vastgesteld [35, 36]. Op deze manier zijn er minder
fibrochondrocyten nodig voor de vorming van constructen, verkrijgen de stamcellen meer een
meniscus fenotype en worden constructen bekomen met voldoende sterke mechanische
eigenschappen.
1.3.2 Biochemische en mechanische stimuli
Eén van de belangrijkste stimuli in tissue engineering zijn groeifactoren. Deze
signaalmoleculen hebben door hun binding op specifieke receptoren een invloed op
verschillende cellulaire processen. Door hun positief effect op proliferatie, differentiatie en
synthese van ECM zijn groeifactoren onmisbaar geworden in de cultivatie van
fibrochondrocyten [1, 26]. De voornaamste groeifactoren die in meniscus tissue engineering
gebruikt worden, zijn Transforming Growth Factor β (TGF-β), Insuline-like Growth Factor I
(IGF-I), Platelet Derived Growth Factor (PDGF), Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2), Bone
Morphogenetic Proteins (BMPs) en basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) [12, 37, 38].
11
De eigenschappen van de ECM kunnen nog verder beïnvloed worden door mechanische
stimulatie. Heel wat mogelijkheden werden reeds onderzocht met als belangrijkste
hydrostatische druk [39, 40] en directe compressie [41, 42]. Daarnaast werden ook nog hoge
en lage wrijving, vloeistofperfusie en ultrasound bestudeerd. Deze stimuli kunnen onder
andere leiden tot verhoogde synthese van collageen en GAGs, verhoogde proliferatie en
hogere compressieve eigenschappen. Het uiteindelijke effect van de mechanische stimulatie is
afhankelijk van verschillende parameters (methode, tijdstip van toepassing, magnitude, duur
en frequentie) wat het vinden van een optimale combinatie sterk bemoeilijkt [1, 25].
Als laatste wordt de kwaliteit van meniscus constructen mogelijks ook beïnvloed door de
toegepaste zuurstofspanning. Verschillende studies onderzochten reeds het effect van een lage
zuurstofspanning (2-5% O2) op de chondrogene capaciteit van cellen en constructen in
vergelijking met een normale zuurstofspanning (21% O2) [29, 33, 37, 43, 44]. Over het
algemeen werden positieve resultaten bekomen wanneer een lage zuurstofspanning toegepast
wordt. In de studie van Croutze et al. [44] werd dit echter niet vastgesteld, waardoor verder
onderzoek naar de rol van hoge en lage zuurstofspanning in tissue engineering van de
meniscus vereist is.
1.3.3 Scaffolds
Een belangrijke component in tissue engineering is de scaffold. Deze structuur zorgt voor
ondersteuning van het weefsel in de eerste fase na implantatie en stimuleert de cellen om
ECM te synthetiseren. Er zijn heel wat vereisten waaraan voldaan moet worden, waardoor er
nog steeds gezocht wordt naar de ideale scaffold. De voornaamste criteria zijn de porositeit,
ondersteuning van celviabiliteit, proliferatie, differentiatie en ECM productie, fixatie en
integratie met gastheerweefsel, mechanische ondersteuning en biodegradeerbaarheid.
Daarnaast mag de resorptie van een scaffold ook niet leiden tot vorming van toxische
bijproducten [25].
Het degradatieprofiel van een scaffold is van uitermate belang, omdat de snelheid van
degradatie afgestemd moet zijn op de vorming van nieuw weefsel om constructen met goede
biomechanische eigenschappen te bekomen (Figuur 5) [12, 26]. Wanneer de scaffold te snel
degradeert, zal het nieuwe weefsel dat zich aan het vormen is onvoldoende ondersteund
worden met falen van het construct als gevolg.
12
Figuur 5: Kinetiek van resorbeerbare scaffolds en herstellend weefsel [12]
(A) Ideale resorptie van de scaffold met vorming van nieuw, voldoende stevig weefsel (B) Falen van het construct door te snelle resorptie van de scaffold of te traag herstel van het weefsel
1.3.3.1 Synthetische polymeren
Een eerste soort scaffolds zijn de synthetische polymeren. De meest courant gebruikte zijn
polyurethaan, polycaprolacton (PCL), polylactide, polyglycolide en poly(lactide-co-glycolide)
(PLGA) [1]. Het voordeel van synthetische scaffolds is dat ze gemakkelijk te manipuleren
zijn waardoor porositeit, mechanische eigenschappen, geometrie, vezelgrootte en
degradatietijd naar wens aangepast kunnen worden [1, 26]. Synthetische polymeren hebben
echter ook een groot nadeel, ze hebben namelijk weinig biomimetische en bioactieve
eigenschappen [1]. Hierdoor is synthese van ECM en integratie van constructen in het
gastheerweefsel niet evident.
Om de biomimetische eigenschappen van synthetische scaffolds te verbeteren, kunnen
verschillende modificaties aan de scaffolds aangebracht worden. Men kan onder andere
moleculen uit de ECM laten integreren met de scaffold. Zo maakten Tan et al. gebruik van
een PLGA scaffold met een coating van collageen I/II en chondroïtine-6-sulfaat [29]. Het
aanbrengen van gelatine en fibronectine op een PCL scaffold blijkt ook een positief effect te
hebben op celadhesie, proliferatie en kolonisatie van de scaffold [45].
1.3.3.2 ECM componenten
Scaffolds kunnen ook opgebouwd zijn uit componenten van de natieve matrix zoals collageen,
hyaluronzuur en GAGs [1, 25]. Verschillende moleculen kunnen samengevoegd worden tot
op maat gemaakte scaffolds met een optimale driedimensionale architectuur [26]. Dankzij hun
natuurlijke oorsprong bezitten de scaffolds ook intrinsieke biomimetische eigenschappen wat
zorgt voor een goede micro-omgeving voor de cellen [46]. Anderzijds bestaat er bij het
13
gebruik van natuurlijke materialen steeds een risico op immuunreactie door de gastheer na
implantatie. Door processing van de scaffold kan deze reactie echter tot een minimum beperkt
worden [46].
Het meest onderzochte natuurlijke polymeer is wellicht collageen I. Door de overvloedige
aanwezigheid in het lichaam vinden scaffolds op basis van collageen I hun toepassing in
tissue engineering van heel wat weefsels [47]. Ook voor de vorming van meniscus
constructen lijken collageen I scaffolds geschikt. Zo toonden Gruber et al. aan dat
meniscuscellen goed op de scaffold adhereren en daarnaast gestimuleerd worden tot vorming
van ECM [48].
1.3.3.3 Hydrogels
Een speciale vorm van scaffolds zijn de hydrogels. Deze waterabsorberende structuren
kunnen synthetisch zijn zoals polyvinyl en poly(N-isopropylacrylamide) of natuurlijk zoals
collageen I, alginaat en fibrine [1]. Hydrogels hebben de unieke eigenschap om afhankelijk
van de omgevingstemperatuur in vloeibare toestand of als gel voor te komen. Hierdoor
kunnen ze geïnjecteerd worden in het kniegewricht waarna in situ een gel gevormd wordt.
Puetzer et al. onderzochten reeds het gebruik van collageen I hydrogels voor meniscus tissue
engineering [49]. Uit hun studie bleek dat deze hydrogels op vlak van biomechanische
eigenschappen beter scoorden dan alginaat, maar nog steeds niet dezelfde mechanische sterkte
vertonen als de natieve meniscus.
1.3.4 Top-down versus bottom-up tissue engineering
Om uiteindelijk in vitro constructen te vormen, kan men ofwel kiezen voor de klassieke top-
down approach ofwel voor de meer recente bottom-up approach. Deze beide benaderingen
worden schematisch weergegeven in Figuur 6. In de klassieke top-down approach gaat men
een weefsel trachten na te bootsen door welbepaalde celtypes uit te zaaien op scaffolds in
combinatie met de juiste groeifactoren. In de bottom-up approach daarentegen worden eerst
modulaire weefsels opgebouwd zonder het gebruik van biomaterialen of scaffolds en worden
deze vervolgens als bouwstenen gebruikt voor de vorming van grotere weefsels [50].
14
Figuur 6: Bottom-up en top-down tissue engineering [50] In de klassieke top-down approach worden cellen uitgezaaid op scaffolds waardoor na vorming van ECM,
proliferatie van de cellen en degradatie van de scaffold uiteindelijk nieuw weefsel gevormd wordt. In de bottom-
up approach zal men eerst microweefsels vormen die verder geassembleerd kunnen worden tot macroweefsel.
1.4 Doel van de masterproef
Voor tissue engineering van de meniscus is een voldoende aantal cellen met het juiste
fenotype van cruciaal belang om constructen met goede biochemische en mechanische
eigenschappen te bekomen. In deze masterproef zal daarom nagegaan worden of
fibrochondrocyten, eens ze gededifferentieerd zijn, nog in staat zijn om redifferentiatie te
ondergaan met vorming van stabiele micro-aggregaten die een correct fenotype bezitten. Deze
redifferentiatie zal geïnduceerd worden door toevoegen van een chondrogene stimulus in de
vorm van TGF-β1 en door het toepassen van een lage zuurstofspanning. In een tweede fase
zal ook bepaald worden of deze aggregaten na inkapseling in een collageen I hydrogel hun
viabiliteit en functionaliteit kunnen behouden.
15
2 Materiaal en methoden
2.1 Isolatie meniscus en fibrochondrocyten
Tijdens deze masterproef werd gebruik gemaakt van menisci van varkens verkregen via het
slachthuis. Aangezien varkensmenisci dezelfde complexe structuur vertonen als deze van de
mens, in grootte gelijkaardig zijn en gemakkelijk te verkrijgen zijn, vormen deze een
betrouwbaar alternatief voor humane menisci.
Protocol isolatie meniscus
Met behulp van scalpel meniscus uit kniegewricht snijden
Meniscus 10 seconden in 70% alcohol dompelen
10 seconden in Ringer (samenstelling zie Bijlage I) met penicilline/streptomycine (PS)
antibioticum (Life Technologies™; Cat No. 15140-122)
Bewaring overnacht bij 4°C in fibrochondrocyten medium (FC medium)
(samenstelling zie Bijlage II)
Protocol isolatie fibrochondrocyten
Verwijder buitenste 2/3 van de meniscus
Binnenste 1/3 mechanisch versnijden in stukjes van maximaal 1 mm³
Toevoegen 3 mg/ml pronase (Sigma-Aldrich; P5147) gedurende 3 uur
Toevoegen 2 mg/ml collagenase II (Sigma-Aldrich; C6885) gedurende 3,5 uur
Reactie stoppen door toevoegen 5 ml foetaal kalf serum (FKS) (Life Technologies™;
Cat No. 10270-106)
Suspensie filteren met behulp van cell strainer (BD Falcon™; REF 352350)
Centrifugeren: 10 minuten aan 1000 RPM
3x wassen met FC medium
Cellen tellen via trypaan blauw en een Bürker telkamer
2.2 Monolayer expansie
Voor monolayer expansie werden fibrochondrocyten in T175 cultuurflessen (BD FalconTM
)
uitgezaaid aan een densiteit van 2x104 cellen per cm
2. Wanneer 80% confluentie werd bereikt,
volgde een enzymatische behandeling met trypsine (Life Technologies™; Cat No. 25300-062)
en werden de cellen opnieuw aan de initiële densiteit uitgezaaid. Deze cellen vormden dan
passage 1 (P1) en werden verder geëxpandeerd tot P3 werd bereikt met verversen van het
medium om de 2 à 3 dagen.
16
2.3 Micro-aggregaten
2.3.1 Vorming
De fibrochondrocyten van P3 werden gebruikt voor de vorming van micro-aggregaten.
Hiervoor werden de cellen uitgezaaid op agarose microchips die in het labo aangemaakt
werden op basis van UltrapureTM
Agarose (Invitrogen™) (protocol zie Bijlage III). Een
overzicht van de verschillende stappen wordt weergegeven in Figuur 7. Door gebruik te
maken van een PDMS mould kunnen agarose gels met daarin 2865 microwells gevormd
worden. Met behulp van een puncher kan de grootte van de microchip aangepast worden
zodat deze past in de bodem van een 12-well plaat. Door 500 000 cellen per microchip uit te
zaaien, worden uiteindelijk aggregaten van ongeveer 175 cellen gevormd. Deze techniek laat
high throughput vorming van micro-aggregaten met uniforme afmetingen toe.
Figuur 7: Schematisch overzicht van de aanmaak van agarose microchips
Vloeibare agarose wordt aangebracht op een PDMS mould die 2865 microwells bevat. Na harder worden, bevat
de agarose gel eveneens 2865 microwells waar vervolgens cellen in uitgezaaid kunnen worden.
2.3.2 Cultuuromstandigheden
Om het effect van een lage zuurstofspanning en de invloed van een chondrogene stimulus te
bestuderen, werden de micro-aggregaten gedurende 21 dagen onder 4 verschillende
omstandigheden in cultuur gehouden (Tabel 1).
17
Tabel 1: Overzicht cultuuromstandigheden micro-aggregaten
Zuurstofgehalte Medium
Situatie 1 21% O2 Chondrogeen medium
Situatie 2 21% O2 FC medium
Situatie 3 5% O2 Chondrogeen medium
Situatie 4 5% O2 FC medium
In situatie 1 en 3 werd gebruik gemaakt van een chondrogeen medium dat de groeifactor
Transforming Growth Factor β1 (TGF-β1) bevat om de invloed ervan op de morfologie en
genexpressie van de micro-aggregaten na te gaan. Ter controle werd in situatie 2 en 4 een
expansiemedium (FC medium) gebruikt.
Samenstelling chondrogeen medium
Basismedium
o 8 ml DMEM/F12
o 80 µl Natrium pyruvaat (Life Technologies™; Cat No. 11360-039)
o 8 µl PS antibioticum
o 40 µl insuline-transferrine-selenium (ITS) (Sigma-Aldrich; I3146)
Chondrogeen medium
o 4 ml basismedium
o 80 µl ascorbinezuur (Sigma-Aldrich; A8960)
o 4 µl dexamethasone (Sigma-Aldrich; D2916)
o 2 µl TGF-β1 (R&D Systems; Cat No. 240-B-002)
2.4 Evaluatie
Evaluatie van de micro-aggregaten gebeurde op dag 4/7, 14 en 21. Voor elk tijdstip werden
een viabiliteitstest, biochemische analyse, verschillende (immuno)histochemische kleuringen
en een analyse van de genexpressie via RT-qPCR uitgevoerd. Vooraleer de micro-aggregaten
geëvalueerd konden worden, werden ze uit de microchips gehaald. Hiervoor werd het medium
op en neer gepipetteerd en vervolgens werd de celsuspensie overgebracht naar een 15 ml
conische tube (Greiner Bio-One). Na centrifugatie (5 minuten aan 1000 RPM) werd het
supernatans verwijderd en werd de celpellet gespoeld met phosphate buffered saline (PBS,
samenstelling zie Bijlage IV). Deze pellet kon vervolgens gebruikt worden voor verdere
analyse.
18
2.4.1 Viabiliteitstest
Om de viabiliteit van cellen na te gaan, kan een Calceïne-AM Propidiumiodide kleuring
(CaPI kleuring) uitgevoerd worden. Levende cellen bevatten actieve esterasen die in staat zijn
om de acetomethoxygroep van calceïne te verwijderen waardoor het calceïne de cel niet meer
kan verlaten. De aanwezigheid van deze molecule zorgt ervoor dat viabele cellen groen
kleuren. Dode cellen daarentegen bevatten geen actieve esterasen, maar zijn wel permeabel
voor propidiumiodide dat door binding aan DNA zorgt voor een rode fluorescentie.
Protocol CaPI kleuring
Voeg 1 ml Ringer (samenstelling zie Addendum), 2 µl calceïne-AM (AnaSpec; 89201)
en 2 µl propidiumiodide (Sigma-Aldrich; P4170) toe aan de celpellet
Breng de oplossing over naar een 12-well plaat
Laat 10 minuten incuberen in het donker op kamertemperatuur
Visualiseer met fluorescentiemicroscoop (Olympus IX 81)
2.4.2 Biochemische analyse
De aanmaak van een ECM kan in de tijd gevolgd worden door de hoeveelheid GAGs,
genormaliseerd ten opzichte van de hoeveelheid DNA, te bepalen. Om de GAGs vrij te stellen
werd gebruik gemaakt van het enzym papaïne dat peptidebindingen op een weinig specifieke
manier knipt. Vervolgens werden de Blyscan™ Glycosaminoglycan Assay (Biocolor) en
Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Reagent and Kits (Invitrogen™) gebruikt.
Protocol GAG bepaling
Voeg 0.5 ml van een 125 µg/ml papaïne oplossing toe aan celpellet
o 0.2 M Natriumfosfaatbuffer op pH 6.4 brengen
+ 400 mg Natriumacetaat
+ 200 mg EDTA (Sigma-Aldrich; E5134)
+ 40 mg Cysteïne HCl (Sigma-Aldrich; C1276)
o Papaïne (Sigma-Aldrich; P4762) oplossen in buffer
Laat overnacht incuberen op 60°C
Na digestie, centrifugeer gedurende 10 min aan 10 000 g
Breng 200 µl van het supernatans (= papaïne digest) over naar een eppendorf
Voeg 1 ml Blyscan reagens toe en laat 30 minuten incuberen met regelmatig schudden
Centrifugeren: 10 minuten aan 12 000 RPM
Verwijder supernatans
Voeg 0.5 ml dissociatie reagens toe
Gedurende 10 minuten vortexen
Centrifugeren: 5 minuten aan 12 000 RPM
Pipetteer 200 µl in een 96-well plaat
Meet absorbantie bij 656 nm (Paradigm™ Detection Platform; Beckman Coulter)
19
Protocol DNA bepaling
Breng 200 µl van het papaïne digest over naar een eppendorf
Voeg 800 µl TE buffer toe
Voeg 1 ml Quant-it toe
Laat 2 tot 5 minuten incuberen
Meet excitatie bij 480 nm en emissie bij 520 nm (Paradigm™ Detection Platform;
Beckman Coulter)
2.4.3 Histologische analyse
Via (immuno)histochemie kunnen verschillende onderdelen van de cel en de omgevende
matrix gevisualiseerd worden met de lichtmicroscoop. Weefsels of cellen, in deze masterproef
micro-aggregaten, worden hiervoor eerst gefixeerd en vervolgens ingebed in paraffine.
Daarna worden coupes gemaakt van 5 µm dikte waarop kleuringen uitgevoerd kunnen worden.
Protocol Fixatie en inbedding
Voeg 1,5 ml van 4% neutraal gebufferde formol (NGF) (samenstelling zie Bijlage V)
toe aan de celpellet
Bewaar overnacht bij 4°C
Breng celpellet over in 30% Disolol® (Chem-lab; CL00.1807.2500) gedurende 1 uur
Breng celpellet over in 50% Disolol® gedurende 1 uur
Breng celpellet over in 70% Disolol® gedurende 1 uur
Breng celpellet over in 96% Disolol® gedurende 1 uur
Breng celpellet over in isopropyl alcohol (Chem-lab; CL00.0901.5000) gedurende 1
uur
Breng celpellet over in isopropyl alcohol / toluol (1:1) (Chem-lab; CL00.0901.5000/
CL00.2001.5000) gedurende 1 uur
Breng celpellet over in toluol gedurende 30 minuten
Breng celpellet over in paraffine op 60°C
Bewaar overnacht op 60°C
Immunohistochemie maakt gebruik van specifieke antilichamen waardoor na binding van een
tweede antilichaam en streptavidine-peroxidase, een chromogeensubstraat geoxideerd kan
worden met vorming van een gekleurde neerslag. Hierdoor is visualisatie van de gewenste
molecule mogelijk. De samenstelling van de ECM kan op deze manier nagegaan worden door
targetting van collageen I, collageen II en aggrecan.
20
Protocol Collageen I kleuring
Coupes deparaffineren
Afgrenzen met toluolstift
Voorbehandeling met pepsine (Sigma-Aldrich; P6887 ) (1 mg/ml Trisbuffer pH=2)
gedurende 1 uur op 37°C (enzyme en preparaat voorverwarmen op 37°C)
5x wassen met PBS: telkens 2 min
Voorbehandeling met 3% H2O2 in AD gedurende 10 min
Blokkingsserum: 30 min
AL1 (Abcam; 6308) 1/400 verdund met verdunningsbuffer: 2 uur
2x wassen met PBS: telkens 5 min
AL2 (RAM, rabbit anti-mouse biotine) 1/200 verdund met verdunningsbuffer: 30 min
2x wassen met PBS: telkens 5 min
Streptavidine-peroxidase (1/200): 30 min
2x wassen met PBS: telkens 5 min
Wassen met trisbuffer: 5 min
Chromogeensubstraat: 10 min
Wassen met stromend leidingswater: 10 min
Tegenkleuring: haematoxyline: 1 sec
Dehydrateren
Monteren met mounting medium
Protocol Collageen II kleuring
Coupes deparaffineren
Afgrenzen met toluolstift
Wassen met PBS gedurende 15 min op 37°C
Voorbehandeling met pepsine (1 mg/ml Trisbuffer pH=2) gedurende 10 min op 37°C
(enzyme voorverwarmen op 37°C)
5x wassen met PBS: telkens 2 min
Voorbehandeling met 3% H2O2 in AD: 10 min
Blokkingsserum: 30 min
AL1 (Acris; AMOO 618 PUN) 1/100 verdund met verdunningsbuffer: 2 uur
2x wassen met PBS: telkens 5 min
AL2 (RAM, rabbit anti-mouse biotine) 1/200 verdund met verdunningsbuffer: 30 min
2x wassen met PBS: telkens 5 min
Streptavidine-peroxidase (1/200): 30 min
2x wassen met PBS: telkens 5 min
Wassen met trisbuffer: 5 min
Chromogeensubstraat: 10 min
Wassen met stromend leidingswater: 10 min
Tegenkleuring met haematoxyline: 1 sec
Dehydrateren
Monteren met mounting medium
21
Tabel 2: Samenstelling blokkingsserum, verdunningsbuffer en chromogeensubstraat (Col I en II kleuring)
Product Samenstelling
Blokkingsserum 0.25 ml NRS (normal rabbit serum voor monoclonaal AL)
50 mg BSA (bovine serum albumine)
5 ml PBS
100 µl Tween 20
Verdunningsbuffer 1 ml blokkingsserum
9 ml PBS
Chromogeensubstraat 5 ml trisbuffer
0.003 g DAB (3,3'-diaminobenzidine) (Sigma-Aldrich; D5637)
5 µl H2O2 (30 %)
Protocol Aggrecan kleuring
Coupes deparaffineren
Coupes afgrenzen met toluolstift
2x wassen met PBS: 15 min op 37°C
Voorbehandeling met chondroitinase ABC 0.2U/ml (Sigma; C3667): 1 uur op 37°C
3x wassen met PBS: telkens 5 min op kamertemperatuur
Voorbehandeling met 3% H2O2
3x wassen met PBS: telkens 5 min
CAS BLOCK (Invitrogen): 15 min
AL1 (AbD Serotec; MCA4722) 1/250 verdunnen in PBS + 0,3% Tween20: 1 uur
3x wassen met PBS: telkens 5 min
AL2 (anti-muis IgG, Vector kit): 30 min
3x wassen met PBS: telkens 5 min
DAB Impact (Vector kit): 5 min
Wassen met stromend water: 10 min
Tegenkleuring met haematoxyline (onverdund): 1 seconde
Wassen met leidingwater: 1 min
Dehydrateren
Monteren met mounting medium
Voor de samenstelling van de ECM kan ook gebruik gemaakt worden van histochemische
kleuringen. De aanwezigheid van glycosaminoglycanen (GAGs) kan aangetoond worden door
een alciaanblauw of toluïdineblauw kleuring. Alciaanblauw is een kationische kleurstof die
via elektrostatische krachten zal binden aan de negatief geladen GAGs. Door de binding is
een felblauwe kleur waarneembaar. Toluïdineblauw is eveneens een kationische kleurstof die
bij binding aan de sulfaatgroepen van GAGs een kleuromslag vertoont van blauw naar rood-
paars. Dit fenomeen wordt ook wel metachromasie genoemd en komt tot stand door vorming
van dimeren of polymeren ten gevolge van een hoge densiteit aan kleurstofmoleculen. De
22
aanwezigheid van proteoglycanen (PG) kan aangetoond worden met een Safranine-O kleuring.
De intensiteit van de kleuring is evenredig met de hoeveelheid PG aanwezig in de ECM.
Protocol Alciaanblauw kleuring
Coupes deparaffineren
30 minuten alciaanblauw 1% in 3% ijsazijn
Spoelen met gedestilleerd water
Dehydrateren
Monteren met mounting medium
Protocol Toluïdineblauw kleuring
Coupes deparaffineren
5 minuten in toluïdineblauw 0,5% in 1% ijsazijn
20 seconden spoelen in gedestilleerd water
Dehydrateren
Monteren met mounting medium
Protocol Safranin-O kleuring
Coupes deparaffineren
15 seconden in haematoxyline (1/4 verdund)
5 minuten onder stromend leidingswater
5 minuten in fastgreen
10 seconden in 1% ijsazijn
5 minuten in Safranine-O (0,1 g in 100 ml gedestilleerd water)
Kort spoelen met gedestilleerd water
Dehydrateren
Monteren met mounting medium
2.4.4 Genexpressie
2.4.4.1 RNA isolatie
Om het genexpressie profiel van cellen te kunnen bepalen, moet het RNA eerst vrijgesteld
worden. Door toevoegen van Tri reagent® (Sigma-Aldrich; T9424) zullen cellen lyseren
waarna de nucleïnezuren van de eiwitten gescheiden kunnen worden met behulp van
chloroform (Sigma-Aldrich; C2432). Vervolgens kan men het RNA laten precipiteren door
toevoegen van 2-propanol (Sigma-Aldrich; I9516). Om contaminatie met DNA te vermijden,
wordt als laatste ook nog een DNAse behandeling uitgevoerd. Hiervoor werd de DNase I,
Amplification Grade (Invitrogen™; REF 18068-015) gebruikt.
23
Protocol RNA isolatie
Resuspendeer celpellet in 1 ml Tri reagent® en pipetteer goed op en neer
Voeg 200 µl chloroform toe, goed vortexen en 3 minuten laten incuberen
Centrifugeer 15 minuten aan 12 000 g bij 4°C
Breng de bovenste kleurloze fase met RNA over naar een nieuw 1,5 ml eppendorf
Voeg 500 µl 2-propanol toe
Vortex op gematigde snelheid gedurende 10 seconden en laat 10 minuten incuberen
Centrifugeer 8 minuten aan 12 000 g bij 4°C
Verwijder het supernatans
Was de pellet met 75% koude ethanol
Vortex zachtjes, tot de pellet los komt van de bodem
Centrifugeer 5 minuten aan 7500 g bij 4°C
Zuig het supernatans grondig af
Laat 3-5 minuten drogen aan de lucht
Los de pellet op in 8 µl nuclease-vrij water
Voer DNAse behandeling uit
o 1 µl 10x buffer en 1µl DNAse toevoegen
o Short spin en laat 15 minuten incuberen
o Voeg 1 µl EDTA toe
o Plaats in de heating block voor inactivatie: 15 minuten op 65°C
Leng aan met nuclease-vrij water tot 20 µl
2.4.4.2 RNA bepaling via spectrofotometrie
Na isolatie wordt de concentratie en de zuiverheid van het RNA bepaald met behulp van de
NanoDrop ND-1000 spectrofotometer (Thermo Scientific). Door belichting met een UV-
straal van 260 nm golflengte, kan de absorptie door het RNA gemeten worden en finaal
omgezet worden in een RNA concentratie. Als blanco wordt de absorptie door 2 µl nuclease-
vrij water gemeten, vervolgens wordt 2 µl van het staal op het toestel aangebracht.
2.4.4.3 Omzetten van RNA naar cDNA
Via reverse transcriptie kan RNA omgezet worden naar cDNA. Hiervoor werd 16 µl van het
RNA staal samengevoegd met 24 µl van een mix en vervolgens kon met behulp van de 2720
Thermal Cycler van Applied Biosystems de reactie doorgaan. Voor het maken van de mix
werd gebruik gemaakt van de Reverse Transcription Core Kit van Eurogentec.
Samenstelling mix (voor 1 staal)
10x buffer 4 µl
25 mM MgCl2 8 µl
dNTPs 8 µl
random nonameren 2 µl
RNAse inhibitor 0,8 µl
24
Euroscript RT 1 µl
RNAse vrij water 0,2 µl
2.4.4.4 RT-qPCR
Via RT-qPCR kan de expressie van verschillende genen bepaald worden. In deze masterproef
werd de expressie van de fibreuze merker collageen I en van de chondrogene merkers
collageen II, aggrecan en Sox-9 bepaald ten opzichte van de huishoudgenen HPRT1 en RPL4.
Via de 2-ΔCT
methode en de 2-ΔΔCT
methode konden dan respectievelijk de relatieve expressie
en de fold change berekend worden [29].
Protocol PCR
Aanmaken mix (voor 1 reactie) (qPCR Core Kit for SYBR®Green van Eurogentec)
o 2x mastermix 12,5 µl
o forward primer 0,75 µl
o reverse primer 0,75 µl
o SYBR®Green 0,75 µl
o nuclease-vrij water 8,25 µl
Voeg aan elke well van de Optical Reaction Plate 23 µl mix en 2 µl cDNA toe
Dek de plaat af met een Optical Adhesive Cover
Centrifugeer de plaat gedurende 30 seconden aan 1000 RPM
Plaats de plaat in het toestel (AB 7500 Fast Real-Time PCR)
2.5 Inkapselen van micro-aggregaten
Een deel van de micro-aggregaten werd op dag 4 ingekapseld in een collageen I hydrogel. De
gels werden vervolgens gedurende 21 dagen in een chondrogeen medium en bij 5% O2 in
cultuur gehouden. Op dag 7, 14 en 21 werd de gen expressie van de micro-aggregaten in de
gels bepaald zoals beschreven in hoofdstuk 2.4.4.
Protocol Inkapselen van micro-aggregaten
Haal de micro-aggregaten uit de microchips door het medium op en neer te pipetteren
Breng de celsuspensie over naar een 15 ml conische tube
Centrifugeer gedurende 5 minuten aan 1000 RPM
Verwijder het supernatans
Resuspendeer de micro-aggregaten in een klein volume medium
Voeg 1 ml PureCol EZ Gel (Sigma-Aldrich; Cat No. 5074) toe per 2 500 000 cellen
Verdeel de oplossing over een 48-well plaat (200 µl oplossing per well)
Laat de gel 90 minuten hard worden op 37°C
Voeg 0,5 ml chondrogeen medium toe
25
2.6 Statistische analyse
Alle data worden weergegeven als gemiddelde ± standaard deviatie. Via het programma
SigmaPlot werd de statistische significantie van de data berekend. Voor de vergelijking van
twee groepen (21% O2 ten opzichte van 5% O2) werd gebruik gemaakt van de Student’s t-test.
Wanneer meerdere groepen werden vergeleken, werd de one-way analysis of variance (one-
way ANOVA) gevolgd door de post-hoc Tukey test gebruikt. Een waarde van p < 0,05 werd
als significant beschouwd.
26
3 Resultaten
3.1 Monolayer expansie
3.1.1 Cel morfologie
Gedurende monolayer expansie van de fibrochondrocyten kon een duidelijke verandering in
morfologie waargenomen worden. Op Figuur 8 is te zien dat de primaire cellen (P0) een
ronde of polygonale vorm hebben. Na passage (P1 en P2) nemen de cellen een meer
uitgestrekte, fibroblastachtige vorm aan.
Figuur 8: Morfologie van fibrochondrocyten tijdens monolayer expansie. Schaal = 200 µm
3.1.2 Gen expressie profiel van primaire en gesplitste fibrochondrocyten
Via RT-qPCR werd de expressie van zowel de fibreuze merker collageen I als de
kraakbeenmerkers collageen II, aggrecan en Sox-9 in primaire en gesplitste fibrochondrocyten
bepaald. De relatieve expressie van de verschillende merkers werd genormaliseerd ten
opzichte van de huishoudgenen RPL4 en HPRT1. In Figuur 9 is te zien dat de primaire
fibrochondrocyten een hoge relatieve expressie van collageen I en collageen II hebben met
waarden van 5,45 en 3,65 respectievelijk. Ook aggrecan en Sox-9 zijn aanwezig, zij het in
mindere mate met waarden van 1,83 en 0,68 respectievelijk. Reeds na eerste passage neemt de
relatieve expressie van de kraakbeenmerkers sterk af, terwijl de expressie van collageen I
hoog blijft. Ook na tweede en derde passage is er zo goed als geen expressie van collageen II,
aggrecan en Sox-9 meer waar te nemen, terwijl de expressie van collageen I min of meer
gelijk blijft.
27
Figuur 9: Gen expressie profiel van primaire en gesplitste fibrochondrocyten via RT-qPCR
Relatieve expressie van collageen I, collageen II, aggrecan en Sox-9 genormaliseerd ten opzichte van de
huishoudgenen RPL4 en HPRT1 voor VG (vers geïsoleerd, primaire fibrochondrocyten), P1 (passage 1), P2 (passage 2) en P3 (passage 3) (n=3).
3.2 Fibrochondrocyten gecultiveerd in microchips
3.2.1 Morfologische evolutie micro-aggregaten
Gedurende 21 dagen werd de morfologische evolutie van de micro-aggregaten gevolgd. Op
Figuur 10 ziet men dat de fibrochondrocyten reeds na één dag een sterke compactie vertonen.
Deze trend zet zich verder waardoor op dag 4, ongeacht de conditie, aggregaten bekomen
worden die mooi afgelijnd zijn en waar geen individuele cellen meer te zien zijn (Figuur 11).
Op Figuur 12 is te zien dat de aggregaten die in een expansiemedium gecultiveerd werden
reeds op dag 7 uiteen beginnen te vallen, onafhankelijk van de zuurstofspanning. De
aggregaten die in een chondrogeen medium gecultiveerd werden, behouden daarentegen hun
afgeronde vorm en dit tot op dag 21 (Figuur 13).
Figuur 10: Morfologie van de micro-aggregaten op dag 0 (links) en dag 1 (rechts). Schaal = 200 µm.
0
2
4
6
8
10
12
Col 1 Col 2 ACAN SOX9
Re
lati
eve
exp
ress
ie (
1+E)
-DCT
Primaire en gesplitste fibrochondrocyten
VG
P1
P2
P3
28
Figuur 11: Morfologie van de micro-aggregaten op dag 4
(A) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten gecultiveerd in
chondrogeen medium bij 5% O2 (C) Micro-aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 21% O2 (D) Micro-
aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 5% O2. Schaal = 200 µm.
Figuur 12: Morfologie van de micro-aggregaten op dag 7 (A) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten gecultiveerd in
chondrogeen medium bij 5% O2 (C) Micro-aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 21% O2 (D) Micro-
aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 5% O2. Schaal = 200 µm.
29
Figuur 13: Morfologie van de micro-aggregaten op dag 21 (A) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten gecultiveerd in
chondrogeen medium bij 5% O2 (C) Micro-aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 21% O2 (D) Micro-
aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 5% O2. Schaal = 200 µm.
Om de 3 à 4 dagen werd ook de circulariteit van de micro-aggregaten bepaald. Dit werd enkel
gedaan voor de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium, omdat de aggregaten
in expansiemedium vanaf dag 7 uiteen begonnen te vallen. Op Figuur 14 is te zien dat reeds
na 4 dagen stabiele aggregaten met een hoge circulariteit bekomen worden. Na dag 4 neemt
de circulariteit nog licht toe met waarden die schommelen tussen 0,90 en 0,95.
Figuur 14: Circulariteit van de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium
0,7
0,75
0,8
0,85
0,9
0,95
1
Dag 1 Dag 4 Dag 7 Dag 11 Dag 14 Dag 18 Dag 21
Circulariteit
21% O2
5% O2
30
Naast de circulariteit werd ook de oppervlakte van de micro-aggregaten om de 3 à 4 dagen
berekend op basis van de perimeter en de diameter. Dit werd eveneens enkel voor de micro-
aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium gedaan. Op Figuur 15 is te zien dat er tussen
dag 1 en dag 4 een sterke afname in oppervlakte plaatsvindt, zowel bij hoge als lage
zuurstofspanning. Op de daaropvolgende tijdstippen ligt de gemiddelde oppervlakte van de
micro-aggregaten gecultiveerd bij 5% O2 significant (p < 0,01) hoger dan die van de micro-
aggregaten gecultiveerd bij 21% O2, met een gemiddelde waarde van 0,0100 mm2 en 0.0067
mm2 respectievelijk.
Figuur 15: Oppervlakte van de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium
3.2.2 Viabiliteit
Op verschillende tijdstippen werd de viabiliteit van de micro-aggregaten bepaald aan de hand
van een CaPI kleuring. Op dag 7 is voor alle condities een hoge viabiliteit waarneembaar
(Figuur 16). Hier en daar zijn een aantal cellen losgekomen die rood aankleuren. Op Figuur
17 is te zien dat een aantal aggregaten op dag 21 reeds afgestorven zijn. De aggregaten
gecultiveerd in chondrogeen medium en bij 5% O2 behouden echter een vrij hoge viabiliteit.
0
0,002
0,004
0,006
0,008
0,01
0,012
0,014
0,016
0,018
0,02
Dag 1 Dag 4 Dag 7 Dag 11 Dag 14 Dag 18 Dag 21
Op
pe
rvla
kte
(mm
2 )
Oppervlakte micro-aggregaten
21% O2
5% O2
31
Figuur 16: CaPI kleuring van de micro-aggregaten op dag 7
(A) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 5% O2 (C) Micro-aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 21% O2 (D) Micro-
aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 5% O2.
Figuur 17: CaPI kleuring van de micro-aggregaten op dag 21
(A) Micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten gecultiveerd in
chondrogeen medium bij 5% O2 (C) Micro-aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 21% O2 (D) Micro-
aggregaten gecultiveerd in expansiemedium bij 5% O2. Schaal = 200 µm
32
3.2.3 Gen expressie profiel
Via RT-qPCR werd de expressie van de genen collageen I, collageen II, aggrecan en Sox-9 in
de micro-aggregaten bepaald en genormaliseerd ten opzichte van de huishoudgenen RPL4 en
HPRT1. Vervolgens werd de expressie via de ΔΔCT-methode uitgedrukt als een fold change
ten opzichte van de monolayer controle (P3). Waarden hoger dan 1 wijzen op een opregulatie
van het bestudeerde gen, terwijl waarden lager dan 1 wijzen op een neerregulatie. Op Figuur
18 is te zien dat er voor elk van de vier genen een significante (p < 0,05) toename is van de
expressie op dag 14 en dag 21, zowel bij hoge als lage zuurstofspanning. Voor de
kraakbeenmerkers collageen II, aggrecan en Sox-9 is deze toename het meest uitgesproken bij
een lage zuurstofspanning.
Figuur 18: Gen expressie profiel van de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium
Verschil in expressie (fold change) ten opzichte van de monolayer controle (P3) voor collageen I, collageen II,
aggrecan en Sox-9 op dag 4, 14 en 21 bij hoge en lage zuurstofspanning (n=3).
3.2.4 Immunohistochemie en histochemie
Via een haematoxyline-eosine kleuring werd een gedetailleerd beeld van de micro-aggregaten
bekomen. Op Figuur 19 is te zien dat de structuur in alle condities en op elk van de drie
0
1
2
3
4
5
+TGFb 21% +TGFb 5%
Fo
ld c
ha
ng
e (
tov
P3
)
Collageen I
Dag 4
Dag 14
Dag 21
0
50
100
150
+TGFb 21% +TGFb 5%
Fo
ld c
ha
ng
e (
tov
P3
)Collageen II
Dag 4
Dag 14
Dag 21
0
2
4
6
8
10
12
+TGFb 21% +TGFb 5%
Fo
ld c
ha
ng
e (
tov
P3
)
Aggrecan
Dag 4
Dag 14
Dag 21
0
1
2
3
4
+TGFb 21% +TGFb 5%
Fo
ld c
ha
ng
e (
tov
P3
)
Sox-9
Dag 4
Dag 14
Dag 21
33
tijdstippen gelijkaardig is. Er zijn duidelijk verschillende, paars gekleurde kernen waar te
nemen met daar rond cytoplasma. De grootte van de micro-aggregaten varieert licht, maar
over het algemeen zijn er uniforme, duidelijk afgelijnde aggregaten te zien.
Dag 4 Dag 14 Dag 21
A
B
Figuur 19: Haematoxyline-eosine kleuring van de micro-aggregaten op dag 4, 14 en 21
(A) Micro-aggregaten in chondrogeen medium bij 21% O2 (B) Micro-aggregaten in chondrogeen medium bij 5%
O2. Schaal = 20 µm
De samenstelling van de ECM werd op verschillende tijdstippen bepaald aan de hand van
immunohistochemische kleuringen voor collageen I, collageen II en aggrecan. Naarmate de
molecule meer aanwezig is in het micro-aggregaat zal de hoeveelheid neergeslagen
chromogeensubstraat toenemen met een sterkere bruine kleur tot gevolg. Een overzicht van de
drie kleuringen wordt weergegeven in Figuur 20. Op dag 4 was er zowel bij hoge als lage
zuurstofspanning slechts een heel lichte aankleuring van collageen I (Figuur 20A en 20D). De
intensiteit van deze kleuring was daarentegen een heel stuk sterker op dag 14 en dag 21
(Figuur 20B-C en 20E-F). De collageen II kleuring leverde enkel bij de micro-aggregaten bij
lage zuurstofspanning op dag 14 een matige aankleuring op (Figuur 20H). Op de andere
tijdstippen alsook bij hoge zuurstofspanning kon geen kleuring waargenomen worden (Figuur
20G en 20I-L). De aggrecan kleuring tenslotte evolueerde bij een lage zuurstofspanning van
een lichte aankleuring op dag 4 (Figuur 20M) naar een sterke aankleuring op dag 14 en 21
(Figuur 20N-O). Bij een hoge zuurstofspanning was er zo goed als geen aankleuring op dag 4
en dag 14 (Figuur 20P-Q) terwijl deze op dag 21 vrij sterk was (Figuur 20R).
34
Dag 4 Dag 14 Dag 21
A B C
D E F
G H I
J K L
M N O
P R Q
35
Figuur 20: Immunohistochemische kleuringen van micro-aggregaten in chondrogeen medium
(A-C) Collageen I kleuring; 5% O2 (D-F) Collageen I kleuring; 21% O2 (G-I) Collageen II kleuring; 5% O2 (J-L)
Collageen II kleuring; 21% O2 (M-O) Aggrecan kleuring; 5% O2 (P-R) Aggrecan kleuring; 21% O2.
Schaal = 20 µm
Aan de hand van de histochemische kleuringen alciaanblauw, Safranine-O en toluïdineblauw
werd de omvang van de ECM nog verder in beeld gebracht. Opnieuw is de intensiteit van de
kleuring gecorreleerd met de hoeveelheid ECM aanwezig in het micro-aggregaat. Figuur 21
geeft een overzicht van de drie kleuringen uitgevoerd op de micro-aggregaten gecultiveerd in
chondrogeen medium en bij 21% O2. De alciaanblauw kleuring evolueerde van een matige
intensiteit op dag 4 en dag 14 (Figuur 21A-B) naar een sterke kleuring op dag 21 (Figuur
21C). Na kleuring met Safranine-O kon op geen enkel tijdstip een aankleuring terug gevonden
worden (Figuur 21D-F). De toluïdineblauw kleuring tenslotte leidde tot een metachromasie op
dag 21 (Figuur 21I).
Dag 4 Dag 14 Dag 21
Figuur 21: Histochemische kleuringen van de micro-aggregaten in chondrogeen medium bij 21% O2. (A-C) Alciaanblauw kleuring (D-F) Safranine-O kleuring (G-I) Toluïdineblauw kleuring. Schaal = 20µm
A C
I
B
D
H G
E F
36
Op Figuur 22 worden de drie histochemische kleuringen weergegeven die uitgevoerd werden
op de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium en bij 5% O2. De alciaanblauw
kleuring evolueerde van een zeer lichte kleuring op dag 4 (Figuur 22A) naar een sterke
kleuring op dag 14 en dag 21 (Figuur 22B-C). Na Safranine-O kleuring was er amper
aankleuring te zien op dag 4 (Figuur 22D). Op dag 14 daarentegen was de aankleuring vrij
sterk (Figuur 22E). Dit was niet meer het geval op dag 21 waar er nog slechts een lichte
aankleuring kon waargenomen worden (Figuur 22F). De toluïdineblauw kleuring tenslotte
leidde reeds op dag 14 tot metachromasie (Figuur 22H), wat ook nog het geval was op dag 21
(Figuur 22I).
Dag 4 Dag 14 Dag 21
Figuur 22: Histochemische kleuringen van de micro-aggregaten in chondrogeen medium bij 5% O2.
(A-C) Alciaanblauw kleuring (D-F) Safranine-O kleuring (G-I) Toluïdineblauw kleuring. Schaal = 20 µm
A
H G
F E D
C B
I
37
3.2.5 GAG/DNA bepaling
Om na te gaan of er een toename is in ECM, werd de GAG productie van de micro-
aggregaten bepaald. Deze werd genormaliseerd ten opzichte van de hoeveelheid DNA om
eventuele verschillen in celaantal op te vangen. Op Figuur 23 is te zien dat de GAG/DNA
verhouding bij de micro-aggregaten in chondrogeen medium en bij 21% O2 stabiel blijft
tussen dag 4 en dag 14, terwijl er op dag 21 een significante (p = 0,0337) toename waar te
nemen is. Bij de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium en 5% O2
daarentegen is er reeds op dag 14 een significante (p = 0,00602) verhoging in GAG/DNA
verhouding. Op dag 21 is er een lichte terugval, maar is er nog steeds een hogere GAG/DNA
verhouding ten opzichte van dag 21 bij de micro-aggregaten gecultiveerd bij 21% O2.
Figuur 23: GAG/DNA verhouding van de micro-aggregaten gecultiveerd in chondrogeen medium (n=3)
3.3 Micro-aggregaten ingekapseld in een collageen I hydrogel
3.3.1 Morfologische evolutie
De micro-aggregaten die op dag 4 gevormd waren, werden in een collageen I hydrogel
ingekapseld en vervolgens gedurende 21 dagen in een chondrogeen medium en bij 5% O2 in
cultuur gehouden. Op Figuur 24 is te zien dat er cytoplasmatische uitlopers gevormd worden
die in lengte toenemen naarmate de aggregaten langer in de hydrogel verblijven. Over het
algemeen behouden de micro-aggregaten hun sferische vorm en is er geen toename in de
omvang van de aggregaten.
0
10
20
30
40
50
60
+TGFb 21% O2 +TGFb 5% O2
GA
G(µ
g)/D
NA
(µg)
GAG/DNA verhouding
Dag 4
Dag 14
Dag 21
38
Figuur 24: Morfologie van micro-aggregaten in een collageen I hydrogel
(A) Dag 1 (B) Dag 4 (C) Dag 7 (D) Dag 21. Schaal = 200 µm
3.3.2 Viabiliteit
De viabiliteit van de micro-aggregaten in de collageen I hydrogel werd bepaald door een CaPI
kleuring en dit op dag 7, dag 14 en dag 21. Op Figuur 25 is te zien dat op elk tijdstip een
aantal aggregaten rood aankleuren en dus niet meer viabel zijn. In het grootste deel van de
aggregaten zijn slechts een aantal losse cellen rood gekleurd en is er een goede viabiliteit.
Figuur 25: CaPI kleuring van micro-aggregaten in een collageen I hydrogel op dag 7, dag 14 en dag 21.
Schaal = 200 µm
39
3.3.3 Gen expressie profiel
Via RT-qPCR werd opnieuw de expressie van de genen collageen I, collageen II, aggrecan en
Sox-9 bepaald. Deze werden eveneens genormaliseerd ten opzichte van de huishoudgenen
RPL4 en HPRT1 en vervolgens via de DDCT-methode uitgedrukt als een fold change ten
opzichte van de monolayer controle (P3). Op Figuur 26 is te zien dat de expressie van
collageen I min of meer constant blijft ten opzichte van P3 op dag 7 en dag 14 met een fold
change van 1,39 en 0,99 respectievelijk. Op dag 21 is er een significante (p < 0,001) toename
van de expressie met een fold change van 1,92. De expressie van collageen II is reeds op dag
7 sterk verhoogd ten opzichte van P3 (9,5 fold). Na een terugval op dag 14 is er op dag 21
opnieuw een sterke toename naar een waarde die significant (p = 0,002) hoger ligt dan op dag
7 (13,88 fold). Ook bij de expressie van aggrecan wordt deze trend waargenomen. De hoge
expressie op dag 7 kent een terugval op dag 14 om dan op dag 21 opnieuw te stijgen. Voor
Sox-9 is er een graduele toename in expressie beschouwd over de drie tijdstippen.
Figuur 26: Gen expressie profiel van de micro-aggregaten ingekapseld in een collageen I hydrogel Verschil in expressie (fold change) ten opzichte van de monolayer controle (P3) voor de genen collageen I,
collageen II, aggrecan en Sox-9 op dag 7, 14 en 21 (n=3).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Col 1 Col 2 ACAN SOX9
Fold
ch
ange
(to
v P
3)
Micro-aggregaten in hydrogel
Dag 7
Dag 14
Dag 21
40
4 Discussie
Meniscus tissue engineering steunt op het gebruik van gedifferentieerde fibrochondrocyten
voor de vorming van functionele constructen. In deze masterproef werd daarom onderzocht of
cultivatie van fibrochondrocyten in de vorm van micro-aggregaten kan leiden tot herstel van
het fenotype nadat dedifferentiatie is opgetreden door monolayer expansie. Daarbovenop
werd bestudeerd of de groeifactor TGF-β1 en een lage zuurstofspanning een bijkomend
positief effect kunnen bewerkstelligen.
4.1 Monolayer expansie van fibrochondrocyten
In een eerste fase van het onderzoek werden primaire fibrochondrocyten gedurende drie
passages in standaard cultuurflessen gecultiveerd om het aantal cellen te verhogen. Door deze
tweedimensionale expansie treedt echter dedifferentiatie van de fibrochondrocyten op.
Verschillende studies toonden reeds aan dat de expressie van collageen II snel afneemt,
terwijl de expressie van collageen I toeneemt tijdens monolayer expansie [27, 29]. Door
analyse met behulp van RT-qPCR kon deze trend ook in dit experiment waargenomen worden.
De expressie van de kraakbeenmerkers collageen II, aggrecan en Sox-9 was reeds na één
passage bijna onbestaande. De expressie van collageen I fluctueerde gedurende de
verschillende passages, maar bleef wel hoog gedurende het volledige experiment. Ook op
morfologisch vlak kon dedifferentiatie waargenomen worden aangezien de fibrochondrocyten
evolueerden van ronde en polygonale cellen naar meer uitgestrekte, fibroblastachtige cellen.
4.2 Fibrochondrocyten gecultiveerd in microchips
De gededifferentieerde fibrochondrocyten van P3 werden in een tweede fase van het
onderzoek uitgezaaid op agarose microchips. Het feit dat agarose niet-celinteractief is, maakt
dit materiaal geschikt voor gebruik in een 3D cultuur. Door stimulatie van cel-celinteractie
tussen de fibrochondrocyten kunnen op deze manier micro-aggregaten gevormd worden. De
eerste dag na uitzaaien van de fibrochondrocyten was er reeds een sterke compactie waar te
nemen. Dit zette zich verder tot dag 4 met uiteindelijk vorming van mooi afgelijnde
aggregaten in alle condities. Via een haematoxyline-eosine kleuring kon deze morfologie
bevestigd worden.
41
Vanaf dag 7 was er een duidelijk verschil in morfologie tussen de micro-aggregaten in
chondrogeen medium en deze in expansiemedium. In afwezigheid van TGF-β1 begonnen de
micro-aggregaten uiteen te vallen wat het belang van deze groeifactor in het behoud van een
gecondenseerde toestand suggereert. Een gelijkaardig fenomeen van condensatie vindt men
ook terug tijdens de endochondrale botvorming. Eén van de eerste stappen in dit proces is de
condensatie van mesenchymale cellen. Deze stap is essentieel voor verdere differentiatie tot
chondrocyten en staat onder controle van onder andere Connective Tissue Growth Factor
(CTGF). Deze groeifactor wordt op zijn beurt opgereguleerd door stimulatie met TGF-β1 [51,
52].
Gedurende de volledige periode in cultuur werd de grootte van de micro-aggregaten gevolgd.
Op basis van de perimeter en de diameter kon vervolgens de oppervlakte berekend worden.
Hieruit bleek dat de micro-aggregaten gecultiveerd onder een lage zuurstofspanning een
significant (p < 0,05) grotere oppervlakte hadden vergeleken met deze onder een normale
zuurstofspanning. Op basis van de GAG bepaling is dit verschil in grootte wellicht te wijten
aan een verhoogde aanmaak van ECM. Terwijl de GAG productie van de micro-aggregaten
bij 21% O2 min of meer constant bleef gedurende drie weken, nam de GAG productie van de
micro-aggregaten bij 5% O2 significant toe op dag 14 en dag 21. Deze resultaten zijn
consistent met de studie van Babur et al. [53]. De onderzoeksgroep vergeleek de
redifferentiatie van chondrocyten die ofwel in macropellets ofwel in micropellets gecultiveerd
werden en dit bij hoge en lage zuurstofspanning. Ook hier werden grotere aggregaten en een
hogere GAG productie vastgesteld voor de micropellets en de macropellets die bij 2% O2
gecultiveerd werden.
Via RT-qPCR kon de gen expressie in de micro-aggregaten bepaald worden om zo na te gaan
of redifferentiatie plaatsvond. De expressie van collageen I, collageen II, aggrecan en Sox-9
werd uitgedrukt als een fold change ten opzichte van de gededifferentieerde cellen uit P3
waardoor een opregulatie of neerregulatie snel duidelijk wordt. Volgens de verwachtingen
was er bij de micro-aggregaten in chondrogeen medium een toename van de
kraakbeenmerkers collageen II, aggrecan en Sox-9 op dag 14 en dag 21. De vorming van
micro-aggregaten en de aanwezigheid van TGF-β1 heeft dus een positief effect gehad op de
redifferentiatie capaciteit van de fibrochondrocyten. Deze resultaten komen overeen met de
studie van Moreira Teixeira et al. waar chondrocyten in aggregaten van verschillende
afmetingen gecultiveerd werden [54]. Wanneer micro-aggregaten van 50 of 100 cellen
gevormd werden en vervolgens gestimuleerd werden met TGF-β3, trad een significante
42
toename van collageen II en aggrecan op. Dit werd eveneens vastgesteld door de studie van
Babur et al. [53]. De expressie van aggrecan en collageen II was hier hoger bij de
chondrocyten gecultiveerd in micropellets in vergelijking met deze in de macropellets.
Het effect op redifferentiatie werd in de studie van Babur et al. nog versterkt door een lage
zuurstofspanning. Zowel collageen II als aggrecan expressie was significant verhoogd in de
micropellets gecultiveerd bij 2% O2 ten opzichte van de andere condities [53]. Ook de
onderzoeksgroep van Adesida et al. constateerde eenzelfde versterkend effect [37]. In hun
studie werden humane meniscuscellen eerst in monolayer geëxpandeerd, al dan niet in
aanwezigheid van FGF2. Vervolgens werden macropellets gevormd die in een chondrogeen
medium en bij 5% of 20% O2 gecultiveerd werden. Voor alle condities werd een opregulatie
van collageen II vastgesteld op zowel gen als eiwitniveau. Deze opregulatie was nog meer
uitgesproken voor de pellets gecultiveerd onder hypoxie en ging gepaard met een stijging in
de expressie van Sox-9. De exacte manier waarop hypoxie een invloed heeft op differentiatie
naar een meer chondrogeen fenotype is nog niet volledig duidelijk. Wel werd al meermaals
aangetoond dat een lage zuurstofspanning kan leiden tot accumulatie van hypoxia inducible
factor 1 alfa (HIF-1α) met daaropvolgend activatie van Sox-9 [55, 56]. Verschillende
downstream genen van Sox-9, zoals aggrecan en collageen II, kunnen hierdoor opgereguleerd
worden. Naast dit mechanisme zijn ongetwijfeld nog een hele reeks andere
transcriptiefactoren in de chondrogene pathway betrokken, zoals gesuggereerd door Lafont et
al. [57]. Overeenkomstig met bovengenoemde studies werd ook in onze experimenten een
positief effect op redifferentiatie door een lage zuurstofspanning teruggevonden. Zowel
collageen II, aggrecan als Sox-9 expressie liggen hoger bij de micro-aggregaten gecultiveerd
bij 5% O2 in vergelijking met deze bij 21% O2. Dit resultaat bevestigt de correlatie tussen de
expressie van Sox-9 en zijn target genen aggrecan en collageen II. De zeer uitgesproken
verhoogde expressie van collageen II (124-fold) doet echter vermoeden dat er nog
bijkomstige mechanismen zijn die hierop een invloed hebben. Verder onderzoek naar de
invloed van hypoxie op de expressie van collageen II kan bijgevolg waardevolle informatie
opleveren omtrent de vereiste cultuuromstandigheden die nodig zijn om fibrochondrocyten in
vitro te laten differentiëren.
In redifferentiatie studies met chondrocyten gaat een opregulatie van collageen II meestal
gepaard met een neerregulatie van collageen I [58, 59]. In tegenstelling hiermee nam de
expressie van collageen I in de micro-aggregaten echter toe, zowel bij hoge als lage
zuurstofspanning. Deze trend is mogelijks te verklaren doordat de ECM van articulair
43
kraakbeen bijna uitsluitend uit collageen II bestaat, terwijl er in de natieve meniscus zowel
collageen I als collageen II aanwezig is [29]. In dat opzicht is het logisch dat een verhoogde
aanmaak van ECM in deze studie gepaard gaat met een verhoging in de expressie van zowel
collageen I als collageen II. Voorgaande studies met fibrochondrocyten waar eveneens een
hogere expressie van collageen I werd vastgesteld tijdens de redifferentiatiefase ondersteunen
deze verklaring [29, 56].
Aan de hand van immunohistochemische kleuringen werd nagegaan of de expressie van
collageen I, collageen II en aggrecan ook weerspiegeld werd op eiwitniveau. Voor collageen I
en aggrecan kon een toenemende intensiteit bij de immuunkleuring waargenomen worden,
overeenkomstig met de resultaten bekomen via RT-qPCR en dit zowel voor de micro-
aggregaten gecultiveerd bij hoge als bij lage zuurstofspanning. In het geval van collageen II
was er echter weinig overeenkomst tussen het resultaat van de immuunkleuring en de
expressie op genniveau. Hoewel er op dag 14 en dag 21 een verhoogde gen expressie
vastgesteld werd bij de micro-aggregaten gecultiveerd bij 21% O2, uitte dit zich niet in een
toename van intensiteit bij de immuunkleuring. Ook bij de micro-aggregaten gecultiveerd bij
5% O2 kon de sterke toename in collageen II expressie op dag 21 niet aangetoond worden via
immunohistochemie. Er zijn een aantal verklaringen mogelijk voor deze discrepantie tussen
de expressie op genniveau en eiwitniveau. Zo kan dit veroorzaakt worden door
posttranscriptionele regulatie van het mRNA. Ook een verschil in de turnover rate tussen het
eiwit en het mRNA kan hier aan de basis liggen [60]. Daarnaast moet ook opgemerkt worden
dat, hoewel de expressie van collageen II een sterke toename vertoonde op dag 21 (124-fold),
deze verhoging slechts relatief is aangezien de uitgangswaarde van collageen II expressie in
de fibrochondrocyten van P3 zeer laag is. Het is mogelijk dat de hoeveelheid collageen II die
geëxpresseerd wordt onder de detectielimiet valt van het gevolgde immunohistochemisch
protocol.
De histochemische kleuringen waarmee de GAGs in de ECM gevisualiseerd kunnen worden,
geven een goed beeld van de evolutie van de ECM tijdens de 21 dagen cultuurperiode. Voor
de alciaanblauw kleuring is er een goede overeenkomst met de GAG bepaling. Zo is er een
toename in intensiteit van de kleuring op dag 14 en dag 21 voor de micro-aggregaten
gecultiveerd bij 5% O2 en op dag 21 voor deze bij 21% O2. De toluïdineblauw kleuring
resulteert eveneens op deze tijdstippen in metachromasie, wat wijst op een dense stapeling
van de GAGs. De toenemende aanwezigheid van GAGs in de micro-aggregaten en bijgevolg
ook de verhoging in ECM suggereert een positieve evolutie in de richting van redifferentiatie.
44
4.3 Micro-aggregaten ingekapseld in een collageen I hydrogel
In een derde fase van het onderzoek werden micro-aggregaten, die na vier dagen in de agarose
microchips gevormd waren, ingekapseld in een collageen I hydrogel om het effect hiervan op
viabiliteit en functionaliteit te bestuderen. Door het gebruik van een hydrogel wordt een
driedimensionale omgeving nagebootst, waardoor veronderstelt kan worden dat dit een
positief effect zal hebben op het fenotype van de micro-aggregaten. Opnieuw werden de
micro-aggregaten gedurende 21 dagen in cultuur gehouden. Aangezien in de tweede fase van
het onderzoek een cultuur in chondrogeen medium en bij 5% O2 het beste effect op
redifferentiatie had, werden deze condities geselecteerd voor cultuur van de micro-aggregaten
in de hydrogel.
Via RT-qPCR werd opnieuw de expressie van collageen I, collageen II, aggrecan en Sox-9
bepaald en uitgedrukt als een fold change ten opzichte van de monolayer controle (P3). De
expressie van de kraakbeenmerkers collageen II, aggrecan en Sox-9 nam significante toe in de
loop van de tijd met de hoogste expressie op dag 21. Dit resultaat is consistent met de studie
van Moreira Teixeira et al. waar micro-aggregaten van chondrocyten ingekapseld werden in
een hydrogel op basis van dextraan [54]. In tegenstelling tot de micro-aggregaten in de
microchips, is de expressie van collageen I in de micro-aggregaten in de hydrogel niet
verhoogd op dag 7 en dag 14. Dit is mogelijks te verklaren door een verzadigingseffect zoals
ook beschreven in de studie van Gunja et al.[27]. In hun onderzoek werd bestudeerd of een
oppervlak met daarop een collageen I coating een positief effect had op de redifferentiatie van
fibrochondrocyten. Er werd vastgesteld dat de expressie van collageen I tijdens cultuur op de
collageen I coating niet toenam. Dit werd toegeschreven aan de aanwezigheid van integrines
op het oppervlak van de fibrochondrocyten die collageen I in de omgeving kunnen aanvoelen.
De integrines kunnen vervolgens een signaal naar de nucleus sturen om de expressie van
collageen I neer te reguleren. Doordat de micro-aggregaten in onze experimenten ingekapseld
werden in een collageen I hydrogel, is het aannemelijk dat eenzelfde mechanisme geactiveerd
werd met een lage expressie van collageen I tot gevolg.
45
5 Conclusie
Uit dit onderzoek kan afgeleid worden dat fibrochondrocyten na monolayer expansie hun
capaciteit tot redifferentiatie niet verliezen. Wanneer gededifferentieerde fibrochondrocyten
gecultiveerd worden in de vorm van micro-aggregaten kunnen de eigenschappen positief
beïnvloed worden. Door gebruik te maken van agarose microchips kunnen bovendien op een
zeer reproduceerbare manier en in high throughput micro-aggregaten met een hoge
uniformiteit bekomen worden.
De condities waaronder redifferentiatie geïnduceerd wordt, hebben een belangrijke invloed op
de finale uitkomst. Wanneer alle resultaten naast elkaar gelegd worden, kan in eerste instantie
gesteld worden dat TGF-β1 noodzakelijk is voor de vorming van stabiele aggregaten. Verdere
analyse van deze micro-aggregaten wijst op een positief effect van een lage zuurstofspanning.
De micro-aggregaten gecultiveerd bij 5% O2 zijn niet alleen groter, ze vertonen ook een
hogere GAG productie en een verhoogde expressie van de kraakbeenmerkers collageen II,
aggrecan en Sox-9 die grotendeels bevestigd werd door de immunohistochemische kleuringen.
De inkapseling van de micro-aggregaten in een collageen I hydrogel leidde eveneens tot een
verhoogde expressie van collageen II, aggrecan en Sox-9 wat erop wijst dat redifferentiatie
onder deze condities mogelijk is. Verdere analyse aan de hand van immunohistochemie en
bepaling van de GAG productie is noodzakelijk om dit resultaat te kunnen bevestigen. Door
tijdsgebrek kon dit echter niet tijdens het verloop van deze masterproef uitgevoerd worden.
Voor tissue engineering van de meniscus is nu eenmaal een hoog celaantal vereist, waardoor
de eerste stap waarin fibrochondrocyten in monolayer geëxpandeerd worden onoverkomelijk
is. Uit de experimenten uitgevoerd tijdens deze masterproef kan echter afgeleid worden dat de
vorming van micro-aggregaten mogelijkheden biedt om als intermediaire stap tussen
monolayer expansie en hydrogel inkapseling te dienen. Indien redifferentiatie in een hydrogel
succesvol blijkt, kan het gebruik van een hydrogel in combinatie met een hoog aantal
uniforme micro-aggregaten perspectieven bieden voor de vorming van grotere constructen
door middel van bioplotting. Hierdoor zou een volgende stap in het onderzoek gezet kunnen
worden richting een modulaire opbouw van meniscus constructen.
46
6 Referenties
1. Makris EA, Hadidi P, Athanasiou KA (2011). The knee meniscus: Structure–function, pathophysiology,
current repair techniques, and prospects for regeneration. Biomaterials 32: 7411-7431.
2. Nakata K, Shino K, Hamada M, Mae T, Miyama T, Shinjo H, Horibe S, Tada K, Ochi T, Yoshikawa H
(2001). Human meniscus cell: characterization of the primary culture and use for tissue engineering.
Clinical orthopaedics and related research: S208-218.
3. Sanchez-Adams J, Athanasiou KA (2009). The Knee Meniscus: A Complex Tissue of Diverse Cells. Cell
Mol Bioeng 2: 332-340.
4. Cheung HS (1987). Distribution of type I, II, III and V in the pepsin solubilized collagens in bovine
menisci. Connective tissue research 16: 343-356.
5. Verdonk PCM, Forsyth RG, Wang J, Almqvist KF, Verdonk R, Veys EM, Verbruggen G (2005).
Characterisation of human knee meniscus cell phenotype. Osteoarthritis and Cartilage 13: 548-560.
6. Beaufils P (2010). The Meniscus: Springer; 407 p.
7. Clayton RA, Court-Brown CM (2008). The epidemiology of musculoskeletal tendinous and ligamentous
injuries. Injury 39: 1338-1344.
8. DeHaven KE (1999). Meniscus repair. The American journal of sports medicine 27: 242-250.
9. Berthiaume MJ, Raynauld JP, Martel-Pelletier J, Labonte F, Beaudoin G, Bloch DA, Choquette D, Haraoui
B, Altman RD, Hochberg M, Meyer JM, Cline GA, Pelletier JP (2005). Meniscal tear and extrusion are
strongly associated with progression of symptomatic knee osteoarthritis as assessed by quantitative
magnetic resonance imaging. Annals of the rheumatic diseases 64: 556-563.
10. Roos H, Lauren M, Adalberth T, Roos EM, Jonsson K, Lohmander LS (1998). Knee osteoarthritis after meniscectomy: prevalence of radiographic changes after twenty-one years, compared with matched
controls. Arthritis and rheumatism 41: 687-693.
11. Pengas IP, Assiotis A, Nash W, Hatcher J, Banks J, McNicholas MJ (2012). Total meniscectomy in
adolescents: a 40-year follow-up. The Journal of bone and joint surgery British volume 94: 1649-1654.
12. Van der Bracht H, Verdonk R, Verbruggen G, Elewaut D, Verdonk P (2007). Cell-based meniscus tissue
engineering. Topics in Tissue Engineering 3.
13. McDermott ID (2010). What tissue bankers should know about the use of allograft meniscus in
orthopaedics. Cell and tissue banking 11: 75-85.
14. Wirth CJ, Peters G, Milachowski KA, Weismeier KG, Kohn D (2002). Long-term results of meniscal
allograft transplantation. The American journal of sports medicine 30: 174-181.
15. Tucker B, Khan W, Al-Rashid M, Al-Khateeb H (2012). Tissue engineering for the meniscus: a review of
the literature. The open orthopaedics journal 6: 348-351.
16. Rodkey WG, DeHaven KE, Montgomery WH, 3rd, Baker CL, Jr., Beck CL, Jr., Hormel SE, Steadman JR,
Cole BJ, Briggs KK (2008). Comparison of the collagen meniscus implant with partial meniscectomy. A
prospective randomized trial. The Journal of bone and joint surgery American volume 90: 1413-1426.
17. Verdonk P, Beaufils P, Bellemans J, Djian P, Heinrichs EL, Huysse W, Laprell H, Siebold R, Verdonk R
(2012). Successful treatment of painful irreparable partial meniscal defects with a polyurethane scaffold:
two-year safety and clinical outcomes. The American journal of sports medicine 40: 844-853.
47
18. Stone KR, Steadman JR, Rodkey WG, Li ST (1997). Regeneration of meniscal cartilage with use of a
collagen scaffold. Analysis of preliminary data. The Journal of bone and joint surgery American volume 79:
1770-1777.
19. Stone KR, Rodkey WG, Webber RJ, McKinney L, Steadman JR (1990). Future directions. Collagen-based
prostheses for meniscal regeneration. Clinical orthopaedics and related research: 129-135.
20. Stone KR, Rodkey WG, Webber R, McKinney L, Steadman JR (1992). Meniscal regeneration with
copolymeric collagen scaffolds. In vitro and in vivo studies evaluated clinically, histologically, and biochemically. The American journal of sports medicine 20: 104-111.
21. Vrancken AC, Buma P, van Tienen TG (2013). Synthetic meniscus replacement: a review. International
orthopaedics 37: 291-299.
22. Verdonk R, Verdonk P, Huysse W, Forsyth R, Heinrichs EL (2011). Tissue ingrowth after implantation of
a novel, biodegradable polyurethane scaffold for treatment of partial meniscal lesions. The American
journal of sports medicine 39: 774-782.
23. Tienen TG, Heijkants RG, de Groot JH, Pennings AJ, Schouten AJ, Veth RP, Buma P (2006). Replacement
of the knee meniscus by a porous polymer implant: a study in dogs. The American journal of sports medicine 34: 64-71.
24. Viola J, Lal B, Grad O. The Emergence of Tissue Engineering as a Research Field. The National Science
Foundation, 2003.
25. Kock L, van Donkelaar CC, Ito K (2012). Tissue engineering of functional articular cartilage: the current
status. Cell Tissue Res 347: 613-627.
26. Buma P, Ramrattan NN, van Tienen TG, Veth RP (2004). Tissue engineering of the meniscus. Biomaterials
25: 1523-1532.
27. Gunja NJ, Athanasiou KA (2007). Passage and reversal effects on gene expression of bovine meniscal
fibrochondrocytes. Arthritis research & therapy 9: R93.
28. Darling EM, Athanasiou KA (2005). Rapid phenotypic changes in passaged articular chondrocyte
subpopulations. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society
23: 425-432.
29. Tan GK, Dinnes DL, Myers PT, Cooper-White JJ (2011). Effects of biomimetic surfaces and oxygen
tension on redifferentiation of passaged human fibrochondrocytes in 2D and 3D cultures. Biomaterials 32:
5600-5614.
30. Yoo JU, Barthel TS, Nishimura K, Solchaga L, Caplan AI, Goldberg VM, Johnstone B (1998). The chondrogenic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells. The Journal of bone
and joint surgery American volume 80: 1745-1757.
31. Boeuf S, Richter W (2010). Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing
factors. Stem cell research & therapy 1: 31.
32. Estes BT, Guilak F (2011). Three-dimensional culture systems to induce chondrogenesis of adipose-derived
stem cells. Methods in molecular biology 702: 201-217.
33. Markway BD, Tan GK, Brooke G, Hudson JE, Cooper-White JJ, Doran MR (2010). Enhanced
Chondrogenic Differentiation of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Low Oxygen Environment Micropellet Cultures. Cell Transplant 19: 29-42.
34. Puetzer JL, Petitte JN, Loboa EG (2010). Comparative Review of Growth Factors for Induction of Three-
Dimensional In Vitro Chondrogenesis in Human Mesenchymal Stem Cells Isolated from Bone Marrow and
Adipose Tissue. Tissue Eng Part B-Rev 16: 435-444.
48
35. Cui X, Hasegawa A, Lotz M, D'Lima D (2012). Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal
stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnology and
bioengineering 109: 2369-2380.
36. Saliken DJ, Mulet-Sierra A, Jomha NM, Adesida AB (2012). Decreased hypertrophic differentiation
accompanies enhanced matrix formation in co-cultures of outer meniscus cells with bone marrow
mesenchymal stromal cells. Arthritis research & therapy 14: R153.
37. Adesida AB, Grady LM, Khan WS, Hardingham TE (2006). The matrix-forming phenotype of cultured human meniscus cells is enhanced after culture with fibroblast growth factor 2 and is further stimulated by
hypoxia. Arthritis research & therapy 8: R61.
38. Stewart K, Pabbruwe M, Dickinson S, Sims T, Hollander AP, Chaudhuri JB (2007). The effect of growth
factor treatment on meniscal chondrocyte proliferation and differentiation on polyglycolic acid scaffolds.
Tissue engineering 13: 271-280.
39. Natsu-Ume T, Majima T, Reno C, Shrive NG, Frank CB, Hart DA (2005). Menisci of the rabbit knee
require mechanical loading to maintain homeostasis: cyclic hydrostatic compression in vitro prevents
derepression of catabolic genes. Journal of orthopaedic science : official journal of the Japanese
Orthopaedic Association 10: 396-405.
40. Gunja NJ, Athanasiou KA (2010). Effects of hydrostatic pressure on leporine meniscus cell-seeded PLLA
scaffolds. Journal of biomedical materials research Part A 92: 896-905.
41. Puetzer JL, Ballyns JJ, Bonassar LJ (2012). The effect of the duration of mechanical stimulation and post-
stimulation culture on the structure and properties of dynamically compressed tissue-engineered menisci.
Tissue engineering Part A 18: 1365-1375.
42. Aufderheide AC, Athanasiou KA (2006). A direct compression stimulator for articular cartilage and
meniscal explants. Annals of biomedical engineering 34: 1463-1474.
43. Adesida AB, Mulet-Sierra A, Laouar L, Jomha NM (2012). Oxygen tension is a determinant of the matrix-forming phenotype of cultured human meniscal fibrochondrocytes. PloS one 7: e39339.
44. Croutze R, Jomha N, Uludag H, Adesida A (2013). Matrix forming characteristics of inner and outer
human meniscus cells on 3D collagen scaffolds under normal and low oxygen tensions. BMC
musculoskeletal disorders 14: 353.
45. Berneel E, Desmet T, Declercq H, Dubruel P, Cornelissen M (2012). Double protein-coated poly-epsilon-
caprolactone scaffolds: successful 2D to 3D transfer. Journal of biomedical materials research Part A 100:
1783-1791.
46. Rowland CR, Little D, Guilak F (2012). Factors influencing the long-term behavior of extracellular matrix-
derived scaffolds for musculoskeletal soft tissue repair. Journal of long-term effects of medical implants 22: 181-193.
47. Parenteau-Bareil R, Gauvin R, Berthod F (2010). Collagen-Based Biomaterials for Tissue Engineering
Applications. Materials 3: 1863-1887.
48. Gruber HE, Mauerhan D, Chow Y, Ingram JA, Norton HJ, Hanley EN, Jr., Sun Y (2008). Three-
dimensional culture of human meniscal cells: extracellular matrix and proteoglycan production. BMC
biotechnology 8: 54.
49. Puetzer JL, Bonassar LJ (2013). High density type I collagen gels for tissue engineering of whole menisci.
Acta Biomater 9: 7787-7795.
50. Nichol JW, Khademhosseini A (2009). Modular tissue engineering: engineering biological tissues from the
bottom up. Soft Matter 5: 1312-1319.
49
51. Song JJ, Aswad R, Kanaan RA, Rico MC, Owen TA, Barbe MF, Safadi FF, Popoff SN (2007). Connective
tissue growth factor (CTGF) acts as a downstream mediator of TGF-beta1 to induce mesenchymal cell
condensation. Journal of cellular physiology 210: 398-410.
52. Arnott JA, Lambi AG, Mundy C, Hendesi H, Pixley RA, Owen TA, Safadi FF, Popoff SN (2011). The role
of connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) in skeletogenesis. Critical reviews in eukaryotic gene
expression 21: 43-69.
53. Babur BK, Ghanavi P, Levett P, Lott WB, Klein T, Cooper-White JJ, Crawford R, Doran MR (2013). The interplay between chondrocyte redifferentiation pellet size and oxygen concentration. PloS one 8: e58865.
54. Moreira Teixeira LS, Leijten JC, Sobral J, Jin R, van Apeldoorn AA, Feijen J, van Blitterswijk C, Dijkstra
PJ, Karperien M (2012). High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage
formation in vitro and in vivo. European cells & materials 23: 387-399.
55. Robins JC, Akeno N, Mukherjee A, Dalal RR, Aronow BJ, Koopman P, Clemens TL (2005). Hypoxia
induces chondrocyte-specific gene expression in mesenchymal cells in association with transcriptional
activation of Sox9. Bone 37: 313-322.
56. Adesida AB, Grady LM, Khan WS, Millward-Sadler SJ, Salter DM, Hardingham TE (2007). Human meniscus cells express hypoxia inducible factor-1alpha and increased SOX9 in response to low oxygen
tension in cell aggregate culture. Arthritis research & therapy 9: R69.
57. Lafont JE, Talma S, Hopfgarten C, Murphy CL (2008). Hypoxia promotes the differentiated human
articular chondrocyte phenotype through SOX9-dependent and -independent pathways. The Journal of
biological chemistry 283: 4778-4786.
58. Kurz B, Domm C, Jin M, Sellckau R, Schunke M (2004). Tissue engineering of articular cartilage under the
influence of collagen I/III membranes and low oxygen tension. Tissue engineering 10: 1277-1286.
59. Grigolo B, Lisignoli G, Piacentini A, Fiorini M, Gobbi P, Mazzotti G, Duca M, Pavesio A, Facchini A (2002). Evidence for redifferentiation of human chondrocytes grown on a hyaluronan-based biomaterial
(HYAff 11): molecular, immunohistochemical and ultrastructural analysis. Biomaterials 23: 1187-1195.
60. Caron MM, Emans PJ, Coolsen MM, Voss L, Surtel DA, Cremers A, van Rhijn LW, Welting TJ (2012).
Redifferentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes: comparison of 2D and 3D cultures.
Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society 20: 1170-1178.
I
7 Addendum
Bijlage I: Samenstelling Ringer
1 liter gedestilleerd water
9 g NaCL
0,42 g CaCl2
0,24 g KCl
Bijlage II: Samenstelling FC medium
DMEM/F12 medium (Gibco® by Life Technologies; Cat No. 31330-038)
10 % FKS (Life Technologies; Cat No. 10270-106)
1% PS (Life Technologies; Cat No. 15140-122)
1% L-glutamine (Life Technologies; Cat No. 25030-024)
Bijlage III: Protocol Maken van microchips
Breng de moulds over van de 50 ml buis met ethanol naar de 2 middelste wells van
een 6-well plaat
Laat de moulds drogen aan de lucht zodat alle ethanol kan verdampen
Weeg 3 g agarose af
Voeg 97 ml PBS toe en laat opkoken tot een heldere vloeistof bekomen wordt
Voeg 7 à 8 ml agarose oplossing toe aan elke well waarin zich een mould bevindt
Centrifugeer de plaat gedurende 1 minuut aan 3000 RPM
Laat de plaat minstens 10 minuten afkoelen op 4°C
Verwijder de chips uit de wells met behulp van een steriel pincet
Doe steriele handschoenen aan
Verwijder de moulds uit de chips en breng ze over naar de 50 ml buis met ethanol
Punch de chip met behulp van de puncher
Breng de microchips over naar een 12-well plaat
Voeg aan elke microchip 1 ml PBS toe
Centrifugeer de plaat gedurende 1 minuut aan 2000 RPM
Bewaar de plaat bij 4°C tot verder gebruik
II
Bijlage IV: Samenstelling PBS
2 liter gedestilleerd water
3,56g Na2HPO4
0,84 g KH2P04
14,4 g NaCL
Oplossing op pH 7,2 brengen
Bijlage V: Samenstelling neutraal gebufferde formol
100 ml formaldehyde 35% (VWR®; UN.2209)
1,78 g Na2HPO4 (VWR®; 1.06580)
0,42 g KH2PO4 (VWR®; 1.04873)
KH2PO4 toevoegen tot pH 6,9