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Herbstsemester 2015 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Badertscher | [email protected] 1

Flüssigchromatographie (liquid chromatography = LC)

flüssige mobile Phase feste stationäre Phase

Skript ab S57ff

Herbstsemester 2015 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Badertscher | [email protected]

Flüssigchromatographie (LC)

2

Die heute am häufigsten eingesetzte instrumentelle LC-Technik ist die

HPLC

high performance liquid chromatography

ursprünglich: high pressure liquid chromatography

•  Hochdruckpumpen zum Fördern der mobilen Phase (300–400 bar)

•  Dicht gepackte Säulen mit kleinen Partikeln (µm-Bereich) als stationäre Phase


LC: Einsatzbereich

3

Mittels Gaschromatographie (GC) lassen sich nur Analyten untersuchen, welche sich unzerstört verdampfen lassen (also v.a. kleine, unpolare, flüchtige Moleküle) Die Flüssigchromatographie (LC) hat ein viel breiteres Anwendungsfeld, da man mit ihr auch thermolabile und grosse Moleküle trennen kann:

z.B. kleine ungeladene Moleküle anorganische und organische Ionen Organometallkomplexe Polymere grosse (Bio-)Moleküle (z.B. Proteine) Die Analyten müssen nur ausreichend in der mobilen Phase löslich sein. Es existieren verschiedene Trennprinzipien, welche Moleküle nach verschiedenen Eigenschaften trennen (z.B. Polarität, Ionenladung, Grösse)


LC: Trennprinzipien

4

Trennmethode Trennprinzip

Normalphasen-HPLC Adsorption (und Verteilung)

Umkehrphasen-HPLC Verteilung (und Adsorption)

Grössenausschlusschromatographie Grössenausschluss

Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung

Affinitätschromatographie Bindungsaffinität (nicht-kovalent)

Chirale Chromatographie Enantiomerentrennung durch Bildung und Trennung von Diastereomeren


LC: Trennprinzipien

5

Trennmethode Trennung nach...

Normalphasen-HPLC Polarität (tR: polare > apolare Analyten)

Umkehrphasen-HPLC Polarität (tR: apolare > polare Analyten)

Grössenausschlusschromatographie Molekülgrösse

Ionenchromatographie Ladung und Grösse von Ionen

Polarität…….. Ladungsverschiebung à getrennte Ladungsschwerpunkte à Dipolmoment


Normalphasen- und Umkehrphasen-LC


Normalphasen- und Umkehrphasen-LC

7

Normalphasen- (NP) und Umkehrphasen(RP)-HPLC machen den Grossteil aller flüssigchromatographischen Trennungen aus. Die RP-HPLC deckt etwa 70% aller Anwendungen ab. Methode stationäre Phase mobile Phase Elutionsreihenfolge NP-HPLC polar apolar apolare vor polaren Analyten RP-HPLC apolar polar polare vor apolaren Analyten NP- und RP-HPLC trennen die Moleküle nach ihrer Polarität.


Normalphasenchromatographie

8

Stationäre Phase: polar (z.B. Kieselgel, Al2O3) Mobile Phase: apolar (z.B. Hexan, Pentan)

Polare Moleküle adsorbieren stark an die polare stationäre Phase und werden retendiert. Apolare Moleküle halten sich vor allem in der apolaren mobilen Phase auf und werden schnell eluiert.

Geeignet für Moleküle, die in apolaren Lösungsmitteln löslich sind.


Umkehrphasenchromatographie

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ODS = Octadecylsilan (C18 bzw. RP18)

Hydrophobisierung der Kieselgeloberfläche durch Reaktion mit Alkylchlorsilanen



10

Typische Umkehrphasen

Am weitesten verbreitet ist die Octadecyl-Phase (auch C18 oder RP18 genannt).



11

Stationäre Phase: apolar (z.B. RP18-Kieselgel) Mobile Phase: polar (z.B. Wasser, Methanol,

Acetonitril)

Die Verteilung der Moleküle zwischen chemisch gebundener stationärer und mobiler Phase liegt für apolare Moleküle auf der Seite der stationären Phase, weshalb apolare Moleküle stärker retendiert werden als polare.

Geeignet für Moleküle, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind (inkl. Wasser und wässrige Pufferlösungen).


Elutionsreihenfolge und elutrope Reihe


Elutionsreihenfolge

13

Normalphasenchromatographie: apolare Moleküle eluieren vor polaren Molekülen

n

......

R

O

O

ONH2

H

O O

OHOH

O

NH2

O

< < <

< < < ~ <

< <

gesättigteKohlenwasserstoffe

ungesättigteKohlenwasserstoffe

aromatischeKohlenwasserstoffe

Ether Ester Amine Aldehyde und Ketone

Alkohole Carbonsäuren Amide

NP-Elutionsreihen-folge nach aufsteigender Retentionszeit geordnet.

Umkehrphasenchromatographie: Elutionsreihenfolge dreht sich um


Elutionskraft

14

Die Elutionskraft bezeichnet die Fähigkeit eines Lösungsmittels, Analytenmoleküle von der stationären in die mobile Phase zu überführen. Erhöhung der Elutionskraft führt zu kleineren Retentionszeiten. Erhöhung der Elutionskraft führt zu kleineren Verteilungskonstanten. Die Elutionskraft eines Lösungsmittels ist dann hoch, wenn seine Polarität ähnlich der der stationären Phase ist. Analytenmoleküle mit ähnlicher Polarität wie die stationäre Phase adsorbieren stark und brauchen eine mobile Phase mit hoher Elutionskraft, um eluiert zu werden. Die elutrope Reihe ordnet Lösungsmittel nach aufsteigender Elutionskraft in der Normalphasenchromatographie.


Elutrope Reihe

15

Die elutrope Reihe ordnet Lösungsmittel nach aufsteigender Elutionskraft in der Normalphasenchromatographie.

<

Cl Cl

ClCl

Cl

OCl Cl

Cl

Cl Cl HO

N

H3C CN

OH

O

O

S

H3C

H3C

OO

OH H3C OH H N

O

HO

H

HO

H+

Ionen

n-Heptan n-Hexan n-Pentan

Cyclohexan Isooctan Tetrachlorkohlenstoff Toluen

Benzen Chlorbenzen Diethylether Chloroform

Dichlormethan 1-Butanol Pyridin Acetonitril

2-Propanol Ethylacetat Dimethylsulfoxid Aceton

Ethanol Methanol Dimethylformamid Wasser wässrigePuffer-lösungen

< <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

...

Fortsetzung è


Elutrope Reihe

16

<

Cl Cl

ClCl

Cl

OCl Cl

Cl

Cl Cl HO

N

H3C CN

OH

O

O

S

H3C

H3C

OO

OH H3C OH H N

O

HO

H

HO

H+

Ionen

n-Heptan n-Hexan n-Pentan

Cyclohexan Isooctan Tetrachlorkohlenstoff Toluen

Benzen Chlorbenzen Diethylether Chloroform

Dichlormethan 1-Butanol Pyridin Acetonitril

2-Propanol Ethylacetat Dimethylsulfoxid Aceton

Ethanol Methanol Dimethylformamid Wasser wässrigePuffer-lösungen

< <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

< < < <

In der Umkehrphasenchromatographie dreht sich die Reihenfolge der Lösungsmittel im Vergleich zur hier gezeigten um.

...


Gradientenelution: Fliessmittelgradienten

17

Eluent 1

geringe Elutionskraft

Eluent 2 hohe Elutionskraft

Gradient: Eluent 1 è Eluent 2 geringe è hohe Elutionskraft

Meistens wird der Gradient so gewählt, dass die Elutionskraft während der Trennung ansteigt.


Aufbau einer HPLC-Anlage



19

Oft modularer Aufbau mit Modulen zum/zur... •  Entgasen der Lösungsmittel

•  Mischen von Lösungsmittelgradienten

•  Pumpen der mobilen Phase

•  Probeninjektion

•  Trennung der Substanzen (Säule)

•  Detektion der getrennten Substanzen



20

Eluentenvorrat

Entgaser Gradientenmischer

Pumpe

Injektionsventil mit Probenschleife


HPLC-Injektionsventil

21



22

Eluentenvorrat

Entgaser Gradientenmischer

Pumpe

Injektionsventil mit Probenschleife

Vorsäule

Trennsäule Detektor

Abfallgefäss

Computer


Fortsetzung: LC - Trennprinzipien

23




(Dünnschichtchromatographie)





Skript S79ff


Dünnschichtchromatographie (DC / TLC)

24

Stationäre Phasen: Meist Normalphasen (z.B. Kieselgel) oder Umkehrphasen (z.B. C18) immobilisiert auf Trägermaterialien (z.B. Aluminiumfolie, Kunststofffolie oder Glasplatte) Mobile Phasen (Laufmittel): Lösungsmittel wie in der NP-HPLC und RP-HPLC

Räumliche Trennung der Analyten auf der DC-Platte Analyten eluieren hier nicht von der stationären Phase Vorteile: einfach, kostengünstig, schnell (mehrere Proben gleichzeitig)



25

Durchführung

Auftragen der Proben (meist mit dünnen Kapillaren)

Entwicklung



26

�

RF = sxsf

Detektion: •  Visuell

nur bei VIS-Absorbern (Farbstoffe)

•  Fluoreszenzdetektion

Anregung mittels UV-Lampe (254 oder 366 nm) Fluoreszierende Analyten è Autofluoreszenz UV-Absorber è Schwächung der Fluoreszenz

eines Indikators in der Platte

•  Chemische Anfärbemethoden

z.B. H2SO4 + Erhitzen è Schwarze, verkohlte Analytflecken

z.B. KMnO4 + Erhitzen è Flecken bei oxidierbaren Analyten

Auswertung:

Verzögerungsfaktor oder RF-Wert:

vgl. Retentionszeit LC bzw. GC !



27

Beispiel:

IOWA DIVISION OF CRIMINAL INVESTIGATION!CRIMINALISTICS LABORATORY / DRUG IDENTIFICATION SECTION!

Test verdächtiger Pflanzenproben auf Tetrahydrocannabinol (THC)

Standard


LC: Trennprinzipien

28




(Dünnschichtchromatographie) Ionenchromatographie Ionische Wechselwirkung





Ionenchromatographie (IC)

Ionenaustauschchromatographie (ion exchange chromatography = IEC)



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UV: 190 bis 400 nm

VIS: 400 (violett) bis 800 nm (rot)

+ +

+

+ + +

+

+

+ +

+

+

+ + + +

+

+

- -

-

- - -

-

-

- -

-

- - -

-

-

Typische Anwendung: Trennung kleiner anorganischer Ionen Stationäre Phase: Ionenaustauscher

(organisches Polymer mit geladenen Ankergruppen)

Kationentrennung: Kationenaustauscher Anionentrennung: Anionenaustauscher

Mobile Phase: Wässrige Salzlösung oder verd. Säure Detektor: oft Leitfähigkeitsdetektor

(aber auch alle anderen LC-Detektoren im Prinzip möglich)



31

UV: 190 bis 400 nm


Funktionelle Gruppen Eigenschaften Kationenaustauscher (negativ geladen) –COOH, –OPO3H2 schwach sauer

–SO3H stark sauer

Anionenaustauscher (positiv geladen) Primäre Amine –NH2 bzw. –NH3

+ OH– schwach basisch

Quarternäre Ammoniumsalze –NR3+ OH– stark basisch



32

Harz–SO3- Eluent+ + Analyt+ Harz–SO3

- Analyt+ + Eluent+

Harz–NR3+ Eluent- + Analyt- Harz–NR3

+ Analyt- + Eluent-

Mobile Phase: Kationentrennung: verdünnte Säuren (Eluent + = H+) Anionentrennung: z.B. NaHCO3-Lösung (Eluent – = HCO3

–) Prinzip: Gleichgewicht zwischen Analyt und Eluent. Menge und Stärke von Eluent

entscheidet dann über Zeitpunkt der Elution! Kationentrennung: Anionentrennung:

Trägermaterial



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Trennung gemäss: Bindungsstärke der Ionen an den Ionenaustauscher (Ladung, Grösse, Hydrathülle, Polarisierbarkeit)

Nicht immer leicht vorhersagbar, aber allgemein gilt:

Stärker geladene und kleine Ionen binden stärker.

Typische Elutionsreihenfolge (nach aufsteigender Retentionszeit geordnet): Kationentrennung Li+ < H+ < Na+ < NH4

+ < K+ < Rb+ < Cs+ < Mg2+ < Zn2+ < Ca2+ <Ba2+ Anionentrennung Fluorid F- < Hydroxid OH- < Acetat CH3COO- < Chlorid Cl- < Nitrit NO2

- < Bromid Br- < Nitrat NO3

- < Iodid I- < Oxalat (COO)22- < Sulfat SO4

2- < Citrat C6H5O73-



34

Beispiele

Anionen

Kationen



35

Detektion: oft Leitfähigkeitsdetektor universell, da alle Ionen die Leitfähigkeit beeinflussen/ändern (im Prinzip kann man aber auch alle anderen LC-Detektoren einsetzen) Problem: hohe Grundleitfähigkeit des Eluenten è Einsatz von Suppressorsäulen = entfernen von „Störionen“ vor dem Detektor

Trennsäule Suppressorsäule Kationenanalyse Kationenaustauscher Anionenaustauscher Anionenanalyse Anionenaustauscher Kationenaustauscher



36

Prinzip der Suppressorsäulen Anionentrennung (Beispiel: NaHCO3-Eluent, Analyten: NaCl und NaBr, Trennung von Cl– und Br–) Kationentrennung (Beispiel: HCl-Eluent, Analyten: NaBr und KBr, Trennung von Na+ und K+)

Erniedrigung der Grundleitfähigkeit und Erhöhung der Leitfähigkeit bei Anwesenheit

von Analyten

Harz–SO3H + Na+ + HCO3- Harz–SO3Na + H2CO3

Harz–SO3H + Na+ + Cl- Harz–SO3Na + H+ + Cl- Harz–SO3H + Na+ + Br- Harz–SO3Na + H+ + Br-

Harz–NR3OH + H+ + Cl- Harz–NR3Cl + H2O Harz–NR3OH + Na+ + Br- Harz–NR3Br + Na+ + OH- Harz–NR3OH + K+ + Br- Harz–NR3Br + K+ + OH-

Eluent:

Analyt 1:

Analyt 2:

Eluent:

Analyt 1:

Analyt 2:


LC: Trennprinzipien

37




(Dünnschichtchromatographie)






Grössenausschlusschromatographie (SEC)

38

UV: 190 bis 400 nm


Trennung von Molekülen nach ihrer Grösse Stationäre Phase: poröse Materialien mit definierter Porengrösse

(z.B. poröse Polymer– oder Kieselgelpartikel) Mobile Phase: Lösungsmittel ähnlicher Polarität wie stationäre Phase

(Nur Trennung nach Grösse, kein Einfluss der Polarität) Unterteilung von SEC (size exclusion chromatography): Gelpermeationschromatographie (GPC): für unpolare, hydrophobe Analyten

(apolare stationäre Phase und apolares Lösungsmittel)

Gelfiltration: für polare, wasserlösliche Analyten

(polare stationäre Phase, polares Lösungsmittel)



39

Kleine Moleküle können in Poren eindringen und werden zurückgehalten.

Elutionsreihenfolge: grosse vor kleinen Molekülen

Zu grosse Moleküle: Ausschlussgrenze Keine Diffusion in die Poren Keine Retention

Zu kleine Moleküle: Permeationsgrenze Alle Moleküle können vollständig in die Poren eindringen Keine Retentionsunterschiede



40

Mol

ekül

grös

se

(loga

rithm

isch

e A

chse

)

Retentionsvolumen (ml) V0 V0 + Vi

Retentionsvolumen VR V’: Volumenstrom (ml/min)

V0: freies Lösungsmittelvolumen Vi: Porenvolumen KC: Verteilungskonstante Alle Analyten verlassen zwischen V0 und V0 + Vi die Säule.

Aus

schl

ussg

renz

e

Per

mea

tions

gren

ze

�

VR = tR ⋅ ′ V

�

VR =V0 + KC ⋅Vi



41

Beispiele:

�

tR ∝1

log Molekulargewicht( )

Trennung einer homologen Reihe von Fettsäuren CH3(CH2)nCOOH

Trennung des Proteins Ovalbumin

in seine mono-, di- und tetramere Form


Wann, welche Technik? (aus: Zusammenfassung S24)

42

à  Worin lösen sich die Analyten?

à Polar/apolar/ionisch? à Molekulargewicht?


DETEKTOREN


Flüssigchromatographie (LC) Detektoren

Trennsäule

Detektor


1. UV/VIS-Detektor (ultraviolet/visible)

45

Signal: Extinktion von Eluent + Analyt

Grundlinie: Extinktion des Eluenten (oft automatisch abgezogen)

Prinzip: Messung der optischen Transmission (wie bei einem UV/VIS-Spektrometer)

UV: 190 bis 400 nm



UV/VIS-Detektor

46

d

I0

IProbe

Lichtintensität

Abstand

Lich

tinte

nsitä

t

�

A = lg I0I

= ε λ( ) c d

I = I010−ε λ( ) c d

I = I0e−µ d

Lambert-Beersches Gesetz

E

E .... Extinktion

ε .... Extinktionskoeffizient

c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

•  Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion

•  Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung (‘extra column effects’)


UV/VIS-Detektor

47

d

I0

IProbe

Lichtintensität

Abstand

Lich

tinte

nsitä

t

•  Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion

•  Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung (‘extra column effects’)


Varianten des UV/VIS-Detektor

48

•  Festwellenlängengeräte (z.B. Hg-Dampflampe mit λ = 254 nm)

•  Geräte mit variabler Wellenlängeneinstellung

•  Dioden array detektoren (DAD)


UV/VIS-Detektor

49

mit variabler Wellenlängeneinstellung

Lichtquellen: Deuteriumlampe (λ = 190-370 nm) und/oder Wolfram-Halogenlampe (λ = 370-800 nm)

Wellenlänge wählbar mittels eines Monochromators (z.B. Prisma + Spalt)


UV/VIS-Detektor

50

Diodenarraydetektor (DAD)

Polychromatische Anregung (Deuteriumlampe und/oder Wolfram-Halogenlampe) Zu jedem Zeitpunkt wird das ganze Spektrum von einem Diodenarray erfasst.


UV/VIS-Detektor

51

Der UV/VIS-Detektor erfasst nur Analyten, die ausreichend UV-Strahlung bzw. sichtbares Licht (VIS) absorbieren. Bei kleinen Wellenlängen um 200 nm absorbieren viele Substanzen, meist aber auch der Eluent. Das Absorbptionsmaximum des Analyten soll längerwellig als die Eluentabsorption sein. UV/VIS-aktiv: •  (polyzyklische) Aromaten, konjugierte Doppelbindungssysteme

•  Doppel- und Mehrfachbindungen

•  Carbonylgruppen C=O

•  –Br, –I

R R R

......


2. Brechungsindexdetektor (refractive index detector = RID)

52

Signal: Brechungsindex-Änderung im Vergleich zum Eluenten

Prinzip: Durchflussrefraktometer Messung der Änderung von Brechungswinkeln

- Vielseitig, da praktisch jeder Analyt den Brechungsindex ändert, aber unspezifisch

- Empfindlichkeit bei vielen Analyten um 2–3 Grössenordnungen schlechter als bei UV/VIS- Detektion. Nicht kompatibel mit Gradientenelution.

- Verwendung: Zuckerbestimmung in Wein


Verdampfungs-Lichtstreudetektor (evaporative light scattering detector = ELSD)

53

Signal: Intensität des an festen Analytpartikeln gestreuten Lichts

Prinzip: Eluent + Analyt werden fein vernebelt. Lösungsmittel verdampft

Das an den festen Analytpartikeln gestreute Laserlicht wird von einem Photodetektor erfasst

Universeller Detektor

Siedepunkt Eluent < Siedepunkt Analyten

Kompatibel mit Gradientenelution

Inkompatibel mit salzhaltigen Eluenten


Fluoreszenz-Detektor

54

�

I f ∝ I0 ⋅ Φ ⋅ ε λAnregung( ) ⋅ c ⋅ dIf .... Fluoreszenzintensität

Φ ... Quantenausbeute

ε .... Extinktionskoeffizient

c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

Im Gegensatz zu UV/VIS: Signal(Photodiode) = 0 bei c = 0 Signal ∝ I0

λEmission ≥ λAnregung (Rotverschiebung)


Fluoreszenz-Detektor

55

Signal: Fluoreszenzintensität

Prinzip: Anregung mit einer definierten Wellenlänge (Lichtfilter 1)

Detektion meist im 90°- Winkel der rot verschobenen (Lichtfilter 2) Fluoreszenzstrahlung

Sehr empfindlich (Faktor 100–1000 besser als UV/VIS)

Nicht universell – abhängig von der chemischen Natur der Analyten Nur fluoreszierende Analyten (z.B. polyzyklische Aromaten), alternativ: Derivatisierung


3.Massendetektoren

http://www.dgms-online.de/dgms1/Wissen/Das-ist-MS/massenspektrometer.php?navid=43

Um Analyten mit Massenspektrometern zu detektieren, muss man die Analytenmoleküle vorher ionisieren! = IONENQUELLE ESI = Electrospray ionization EI = Electron impact ionization CI = Chemical Ionisation MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (Selten an LC gekoppelt)


ESI produziert „Pseudo-

Molekülionen“ [M+H]+

•  Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt

•  Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions- zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)

•  Massenselektive Detektion (sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)

•  Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich

•  ESI: v.a. für Moleküle mit protonierbaren oder deprotonierbaren funktionellen Gruppen

LC-ESI-MS (ESI = electrospray ionization)

Ausgang der Trennsäule


LC-APCI-MS (APCI = atmospheric pressure chemical ionization)

58

•  Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt

•  Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions- zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)

•  Massenselektive Detektion (sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)

•  Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich

•  APCI: auch für kleine Moleküle ohne polare funktionelle Gruppen gut geeignet

Ausgang der Trennsäule


Vergleich: LC-Detektoren (HPLC oder LC)

59

Detektor Empfindlichkeit Linearbereich Analyten UV/VIS + +++ UV- und VIS-Absorber RID – – + universeller Detektor ELSD o ++ universeller Detektor Fluoreszenz +++ +++ Fluorophore Elektrochemisch ++ / +++ ++ reduzier- und oxidierbare

Analyten MS + / +++ + / ++ universeller Detektor

+ massenselektive Detektion + Massenspektren zur Strukturaufklärung

Ausführlichere Tabelle in: Cammann, Instrumentelle Analytische Chemie


Derivatisierung

60

Derivatisierung: � Wenn Analyten nicht oder mit ungenügender Empfindlichkeit durch einen bestimmten Detektor erfasst werden können. � Umsetzung z.B. mit Fluorophoren oder starken UV-Absorbern

NH3C CH3

SO O

Cl

H2N R+- HCl

NH3C CH3

SO O

HNR

Fluoreszenz z.B. primäre Amine

5-(N,N- Dimethylamino)-

naphthalin- 1-sulfonylchlorid

= Dansylchlorid

Blau-blaugrün fluoreszierende

Sulfonamide

NO2

NO2

NH

NH2

R1 R2

O+

- H2O

NO2

NO2

NH

N

R2

R1

UV/VIS z.B. Aldehyde und Ketone

2,4-Dinitrophenyl- hydrazin

= DNPH

DNP-Hydrazone

λmax ≈ 360 nm


Beispiele: HPLC-Trennungen


Anwendungsbeispiele HPLC

62

Trennung von Pestiziden Säule: C18 (RP) Eluenten: Wasser –

Acetonitril 55%:45%

Flussrate: 1 mL/min Detektor UV λ = 225 nm 1. Benfuresate 2. Dymron 3. Iprodione 4. Pyrazoxyfen 5. Tebufenozide 6. Iprodione Metabolite 7. Pencycuron

t (min)

O

CH3H3COS

O

O

H3C

NH

O

N

Cl



63

t

Trennung von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAHs) Säule: C18 (RP) Eluenten: (A) Wasser

(B) Acetonitril Gradient: 0–10 min 48% A, 52% B 16 min 20% A, 80% B 21 min 0% A, 100% B 28 min 0% A, 100% B 30 min 48% A, 52% B 30 min stop Flussrate: 1 ml/min Detektor UV λ = 260 nm

(Minuten)



64

HPLC-Trennung von Serotonin-Wiederaufnahmehemmern (Antidepressiva) Stationäre Phase: Cyanopropyl-Kieselgel Mobile Phase: Wasser (Phosphatpuffer,

pH 7) – Acetonitril 40%:60%

Flussrate: 1 ml/min Detektor: UV, λ = 230 nm

Uracil

Verunreinigung

Fluvoxamin

Sertralin

Fluoxetin

NH

NH

O

O

CF3

N

O

H2N O

HN

H3C

H

HCl

Cl

CF3

OHN

Schlechte Retention der teilweise protonierten Amine auf RP-18-Phase, gute Trennung auf Cyanopropyl-Phase


Vergleich: LC-Detektoren (HPLC oder LC)

65

Detektor Empfindlichkeit Analyten UV/VIS + UV- und VIS-Absorber Fluoreszenz +++ Fluorophore MS + / +++ universeller Detektor

massenselektive Detektion MSn (Fragmentierung) zur Strukturaufklärung

Fluorescein FITC fluorescin- Iso thiocyanate

Emission bei höherer

Wellenlänge!

Derivatisierung: Markieren von Analyten mit UV- oder fluoreszenzaktiven Molekülen:


UV Detektor … Detektoren sind selektiv

66

HPLC-Analyse von Olivenölproben. UV-Detektion bei zwei Wellenlängen. DAD = Diode Array Detektor


UV und RI Detektor

67

Untersuchung einer Bierprobe Kombination von 2 Detektoren (1) Brechungsindexdetektor (RI): universell: erfasst alle Analyten (2) UV/VIS-Detektor (280 nm): für einige Analyten empfindlicher als RI

J. Chromatograph. Sci. 39 (2001) 235

Peak 9: 5-Hydroxymethylfurfural Peak 8: Ethanol


Massendetektoren

http://www.dgms-online.de/dgms1/Wissen/Das-ist-MS/massenspektrometer.php?navid=43

Um Analyten mit Massenspektrometern analysieren zu können, muss man diese vorher ionisieren = IONENQUELLE ESI = Electrospray ionization EI = Electron impakt ionization CI = Chemical Ionization MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (selten mit Trenntechnik gekoppelt)


Massendetektoren „2 Spuren“

69

Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen

(CHO)

Säule: Porous Graphitized Carbon (PGC)

Eluenten: Wasser /

Acetonitril

Flussrate: 5 uL/min

Detektor ESI-MS

1. ATP (506) 2. ADP (426) 3. AMP (346)

All (M-H)-

"Chromatogram" TIC = total ion current

Massenspur

1

2

3

1 2

3


Massendetektoren „Analyten getrennt betrachtbar“

70

Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen

(CHO)

Säule: PGC

Eluenten: Wasser / Acetonitril

Flussrate: 5 µl/min

Detektor ESI-MS

1. ATP (506) 2. ADP (426) 3. AMP (346)

All (M-H)-

Chromatogram TIC = total ion current

1

2 3

1

2

3

SIM = single ion monitoring

m/z = 506

m/z = 426

m/z = 346



71

HPLC-MS-Trennung von Triglyceriden A) Gesamtionenstrom

(total ion current = TIC) B) Single ion monitoring = SIM

Masse 1 Masse 2 Masse 3

Masse 4

TIC



72

Analyse der Probe ohne vorhergehende Trenntechnik oft auch bei MS nicht möglich. Chromatographie trotz Massenselektiven Detektor meist notwendig/sinnvoll à  Zu viele Analyten mit den gleichen oder ähnlichen Massen (isobare Analyten) à  Schlechte Ionisierung durch Hintergrundsubstanzen der Probe (Salze, kleine polare Analyten....)

Hunderte Analyten in einem kleinem Massenbereich Identifizierung nicht mehr möglich



73

m/z = 342.2 m/z = 400.1 m/z = 404.0 m/z = 384.1 m/z = 331.0 m/z = 332.1 m/z = 706.4 m/z = 657.4

HPLC-ESI-MS-Trennung von Mykotoxinen (Giftstoffe aus Schimmelpilzen)

Säule: C18 (RP) Eluent: Wasser (+ NH4OAc)

+ Acetonitril

Aflatoxin B1

flüssigchromatographie (liquid chromatography = lc)€¦ · rp-hplc apolar polar polare vor...

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