fundamentos. espectrofotometrÍa/ -...

Cátedra de Física-FFYB-UBA [1]

FUNDAMENTOS. ESPECTROFOTOMETRIA 4. 0 / M4 / FISICA

FUNDAMENTOS. ESPECTROFOTOMETRÍA/

Versión 4.0/

MODULO 4/

CÁTEDRA DE FÍSICA/

FFYB/

UBA/



Para profundizar los contenidos teóricos que se abordan en ésta guía es aconsejable que

consulten la Bibliografía indicada en el campus.

Dentro de la misma y también en el campus, se encuentran los Anexos sobre

Espectrofotometría y Espectrometría UV, visible e IR. Ambas guías complementan la

información descripta a continuación.

El término espectrofotometría hace referencia a una serie de técnicas analíticas que se fundamentan en la

espectroscopía atómica y molecular. Permiten obtener información a partir del análisis de las distintas

interacciones de las radiaciones electromagnéticas con la materia.

En la química analítica, una manera práctica y precisa de conocer la concentración de una solución consiste

en medir el efecto que dicha concentración tiene sobre la intensidad de un haz de luz luminoso que incide

sobre ella.

Para comprender que ocurre en el seno de una solución cuando un haz de luz la atraviesa, consideremos

una cubeta de material transparente y no absorbente que contiene la solución con el analito cuya

concentración se desea conocer. Si se ilumina la solución con luz monocromática (luz de una sola longitud de

onda) ocurrirá que parte de la intensidad de esa luz (Io) será absorbida por las moléculas que están en dicha

solución (Ia), parte se reflejará (Ir) y parte será transmitida (It).

Podemos representarlo esquemáticamente como se muestra en la figura 1:

Figura 1: Luz que incide sobre un tubo conteniendo una solución coloreada

Para que se cumpla el principio de conservación de la energía, la suma de éstas tres últimas será igual a Io:

Io = Ir + Ia + It Ecuación 1

Ir

Ir

Ir

http://virtual.ffyb.uba.ar/mod/resource/view.php?id=4147

http://virtual.ffyb.uba.ar/mod/page/view.php?id=4114




Si la incidencia del haz de luz es normal a la pared del tubo que contiene la solución, la luz reflejada será

despreciable y la ecuación se reduce a:

Io = Ia + It Ecuación 2

Si se divide esta expresión por Io, y se llama absorción ( S ) a la relación Ia / Io y transmitancia ( T ) a la

relación It / Io, se obtiene la expresión:

1 = S + T Ecuación 3

Esta es la expresión matemática de la ley de Grotthus - Draper.

¿Cómo resultará la intensidad transmitida con respecto a la incidente si aumenta o disminuye la intensidad

de la fuente? ¿Y si se aumenta o disminuye el espesor de la cubeta que contiene a la solución?

La expresión matemática que involucra a estos parámetros es la siguiente:

dI dI

- = k. l reordenando: = - k. l Ecuación 4 I I Lo que significa que la variación (disminución) de la intensidad es directamente proporcional al espesor del

material interpuesto ( l ) y a una constante k propia de cada material, llamada coeficiente de absorción.

Si procedemos a integrar la ecuación anterior entre ciertos límites se obtiene:

It dI l

= - k dl Ecuación 5 I0 I 0

Resolviendo

It It

ln = - k . l Ecuación 6 = e- ( k . l )

Ecuación 7

I0 Io Despejando It

It = Io . e - ( k . l )

Ecuación 8 Esta fórmula es una expresión matemática de la ley de Lambert, que dice que la intensidad de la luz

monocromática transmitida decrece en forma geométrica cuando el espesor del medio absorbente crece en

forma aritmética.

¿Qué ocurre si manteniéndose constante la intensidad incidente y el espesor, se aumenta o disminuye la

concentración de la solución atravesada por la luz?



Un desarrollo matemático análogo, sustituyendo a dl por dc (variación de la concentración), lleva a la

siguiente expresión matemática:

It = Io . e - ( k . c )

Ecuación 9

La intensidad de luz monocromática transmitida por la solución de una sustancia determinada decrece en

forma geométrica cuando su concentración aumenta en forma aritmética.

Si se repite la experiencia variando a la vez el espesor bajo el cual se observa y la concentración de la

solución, cambiando además la base e a base decimal, se llega a la siguiente expresión:

Esta expresión se conoce con el nombre de Ley de Lambert - Beer, donde a es una constante denominada

absortividad. Esta ley se cumple trabajando a bajas concentraciones y en presencia de luz monocromática.

Reordenando y reemplazando obtenemos una relación entre transmitancia ( T ) y concentración ( c ):

It T = = 10

- a . c . l Ecuación 11

Io

Según la ecuación no existe una relación lineal entre ambas, sino que se observa que la transmitancia decae

en forma exponencial con la concentración. La misma relación se mantiene para T% (que es la T expresada

en porcentaje) y concentración según se muestra abajo, en el gráfico de la figura2.

Figura 2: T% en función de la concentración

Ecuación 10 It = Io . 10 - a . c . l



Recordando que a es una constante, la misma es propia de cada sustancia y depende de la longitud de onda,

la temperatura y el solvente con que se trabaje. Para comprender mejor su significado, a partir de la ley de

Lambert – Beer (ecuación 10) aplicando logaritmos y reordenando a queda expresada como:

- log It / I0 - log T

a = = Ecuación 12

l . c l . c

A partir de la ecuación 12 surge un nuevo parámetro: la absorbancia (Abs) que es – logaritmo T (o bien,-

log It /I0 ).

Entonces, reordenando y reemplazando:

- log It / I0 = Abs = a . c . l Ecuación 13

Reordenando la ecuación anterior la absortividad (a) se puede definir como la absorbancia (Abs) que

presenta una solución de concentración unitaria de una sustancia, observada bajo un espesor unitario.

a = Abs / ( l . c ) Ecuación 14

El valor numérico de a depende de las unidades de concentración empleadas. Si c se expresa en g/mL, se

obtiene la absortividad específica (ao) y a = mL . (gr . cm)-1

. Si c se expresa en moles por litro, se obtiene

absortividad molar o coeficiente de extinción molar , y sus unidades serán L . (mol . cm)-1

. Notar además

que Abs es una magnitud adimensional.

Relacionando las ecuaciones anteriores se obtienen:

y

Según la Ecuación 15, si se representa gráficamente Abs = f ( c ) en teoría, el gráfico mostrará una relación

lineal entre las dos variables, siempre que se trabaje con luz monocromática y a bajas concentraciones. Esto

sin embargo, puede cumplirse para algunas sustancias pero no para otras. Si se trabaja con una sustancia

determinada y midiendo la absorbancia de distintas concentraciones de la misma se obtiene una

representación lineal entre las absorbancias medidas y las correspondientes concentraciones, entonces “esa

sustancia“ cumple la Ley de Lambert Beer en el rango de concentraciones usadas.

Abs = a . l . c = - log T = - log It / I0

T = 10-Abs

Ecuación 16

Ecuación 15



Es importante recalcar que la variable física “real” es la transmitancia y no la Absorbancia. El instrumento de

medida, que es el espectrofotómetro, determina Transmitancia a partir de la medida de Intensidad

transmitida comparándola con la intensidad Incidente. El parámetro Absorbancia es creado a partir de una

relación matemática para simplificar el tratamiento. Como vimos ésta, a diferencia de la transmitancia,

presentará una relación directamente proporcional con la concentración de una sustancia que cumpla con la

ley.

Valores límites de absorbancia y transmitancia:

Analizando las ecuaciones anteriores podemos establecer los límites de estos parámetros:

El espectrofotómetro posee dos tipos de tipos de escalas: la escala de transmitancia %, que es lineal y

abarca de 0 a 100% y la escala de absorbancia que es logarítmica y abarca de 0 a . Si bien en los

espectrofotómetros analógicos éstas se pueden visualizar, en nuestros instrumentos de medida como el

display es digital, muestra directamente el valor de T% ó de Abs, según se seleccione. Ver más en anexo

de espectrofotometría.

Antes de introducirnos en la instrumentación, es importante recordar que a partir de la ley de Lambert-Beer

se pueden estudiar sustancias coloreadas en el visible aportando mucha información acerca de ellas

(también se pueden estudiar compuestos que absorban en el UV y en el IR). Para esto una de las primeras

herramientas es la realización de un barrido espectral. El mismo se obtiene trabajando con una misma

solución coloreada (de concentración constante) y midiendo los valores de Absorbancias correspondientes

a distintas longitudes de onda seleccionadas dentro de un determinado rango de trabajo. El gráfico de

Absorbancia en función de longitud de onda constituye el espectro de absorción de la sustancia y es

característico de cada sustancia. En general cuando no se sabe nada de la sustancia coloreada en estudio se

realiza un barrido a lo largo de todo el visible es decir de 400 a 700 nm.

Si no hay absorción It = Io, entonces T = 1 y Abs = 0

Si hay absorción total It = 0, entonces T = 0 y Abs =

T varía entre 0 y 1 T % varía entre 0 y 100 %.

Abs varía entre 0 e .

Ir





Dicho espectro podrá presentar uno o varios picos de máxima absorción, propios de cada sustancia en

particular. En el TP lo analizarán por ejemplo, con el azul de Metileno y el Paranitrofenol. El espectro de una

sustancia puede utilizarse también como criterio de identificación. Para ello se debe disponer de antemano

de un espectro de la “supuesta” sustancia con el cual se pueda comparar el barrido espectral realizado con

sustancia en estudio. Además, como nos permite visualizar la variación de la Abs y de la absortividad (dado

que la concentración es constante) con la longitud de onda, ello puede ser aplicado para decidir una

longitud óptima de trabajo en el caso que por ejemplo, se quiera realizar la cuantificación de una sustancia.

(Ver más adelante en Elección de la longitud óptima de trabajo).

Otra aplicación consiste en utilizar un barrido espectral de una sustancia en particular, para evaluar el

comportamiento de parte del instrumental. En este caso se debe conocer previamente el espectro de la

sustancia elegida y en el mismo deben aparecer picos bien definidos de máxima absorbancia.

Específicamente lo trabajarán en el TP cuando realicen el control de centro de banda que se verá en el

apartado de controles espectrofotométricos.

Instrumentación

Para comprender el funcionamiento del espectrofotómetro se puede analizar el siguiente esquema básico:

Figura 3: Esquema de un espectrofotómetro

La fuente de luz proporciona un haz policromático que es colimado al atravesar la ranura de entrada.

Este haz llega a un sistema de monocromación y después con el selector de longitud de onda, se aísla un

haz monocromático de la longitud de onda deseada. Luego, el rayo de luz monocromático incide

perpendicularmente sobre la pared de la cubeta, la cual contiene la muestra. El haz de luz transmitido al salir

de la muestra impacta sobre el detector, donde la intensidad luminosa se convierte en intensidad eléctrica,

mediante un proceso electrónico. Luego, dicha señal se transforma en una lectura de transmitancia

porcentual o absorbancia que aparece en el display.

Detector Cubeta con

muestra

Ranura de salida

Sistema de monocromación/

selector de λ

Ranura de entrada

Fuente de luz

Ir

Ir



El espectrofotómetro es una herramienta importante del laboratorio y de su buen funcionamiento depende

la calidad de los resultados que se obtienen. Para informar un resultado confiable es necesario estar seguros

de que el equipo utilizado funcione correctamente, por ello se realizan los controles espectrofotométricos.

Éstos permiten controlar y analizar determinados parámetros y verificar si se encuentran dentro de los

rangos de aceptabilidad establecidos, o bien en caso contrario, proceder a calibrar o a reparar. A su vez, la

realización de los controles espectrofotométricos deben efectuarse con cierta periodicidad que dependerá

de cada control en particular.

A- CONTROLES ESPECTROFOTOMÉTRICOS

1. Control de luz espuria accidental

La luz espuria accidental o errática es toda luz que llega al detector sin haber atravesado la muestra cuya

absorbancia se quiere medir, pudiendo ser de la misma o de diferente longitud de onda que la seleccionada.

Se puede ver esquemáticamente en figura 4.

Observando la figura, la luz que llega al detector puede provenir de reflexiones internas dentro del tubo o

cubeta (1). En otros casos puede “pasar por arriba del menisco” de la solución a medir (2), por ejemplo

cuando se trabaja con un volumen inferior al volumen mínimo. También puede pasar por los costados del

tubo o cubeta por afuera (3), cuando el espesor del tubo o cubeta es menor al que le corresponde de

acuerdo al portatubo o portacubetas del instrumento. Otra situación donde hay luz espuria accidental,

ocurre cuando hay un inapropiado cierre del compartimento donde se ubica el tubo con la muestra.

También puede deberse a la presencia de “goteras” en el del aparato (orificios en la carcasa del aparato por

donde entra luz) que pueden detectarse iluminando el instrumento desde el exterior con una linterna,

cuando el mismo está siendo usado en la zona del visible. La “gotera” puede corregirse tapándola con cinta

negra. Otra causa de producción de luz espuria accidental puede ser el mal alineamiento de la cubeta o del

sistema porta cubeta o de la fuente de luz.

Figura 4: Luz espuria. 1: reflexiones internas, dentro del tubo; 2: luz que pasa por “arriba del menisco” de la solución; 3: luz que llega por los costados del tubo sin atravesar la muestra



La luz espuria se mide en porcentaje de transmitancia y es importante que dicho porcentaje sea bajo. De lo

contrario, se pueden producir desviaciones de la linealidad instrumental, dado que llega al detector más luz

de la que debería. El porcentaje máximo aceptado de luz espuria es del 1 %.

Los métodos para detectar la luz espuria accidental incluyen filtros o soluciones que son “opacos” en los

rangos habituales de trabajo. Así se puede utilizar una cubeta de obstrucción de paso de luz (que es una

cubeta pintada de negro o sea un cuerpo negro) o bien una solución hiperconcentrada de colorante. En

todos los casos se leerá la transmitancia contra una cubeta con agua, a la seleccionada dentro del visible. El

valor leído representa directamente el % de luz espuria accidental.

Además de la luz espuria accidental existe la luz espuria parásita, que es la radiación electromagnética de

longitud de onda distinta a la seleccionada con el selector de que llega al detector, pasando o no por la

muestra. Es decir es luz de “distinta ” (luz de distinto color) que la nominal. Como consecuencia de ello,

hay un aumento no deseado de transmitancia (o, una disminución de la absorbancia), dado que la luz

espuria parásita no es absorbida por la solución en la misma proporción que la nominal. Como este

fenómeno es más frecuente en los extremos del espectro visible, es común utilizar para su detección

paranitrofenol, que es un colorante que tiene su pico de absorción en uno del los extremos del visible (405

nm) donde se supone que la luz parásita se observa en mayor proporción. Este control de luz parásita debe

hacerse con una solución hiperconcentrada en una zona de máxima sensibilidad y el detector debe recibir

luz, o sea que la solución contenida en el tubo debe permitir el pasaje de luz. Por ello no puede emplearse

un cuerpo opaco (cubeta negra) pues obstruiría el pasaje de luz al detector de cualquier tipo de luz espuria

(parásita o accidental). La luz parásita está relacionada con fallas en el sistema de monocromación,

especialmente cuando se utilizan redes de difracción donde la calidad de la misma puede variar según su

construcción (ver redes de difracción en anexo espectrofotometría)

Este control debe realizarse trimestralmente.

2. Control de volumen mínimo

Se considera como volumen mínimo, al mínimo volumen contenido en una cubeta a partir del cual la lectura

se estabiliza y no varía con el agregado de más líquido. Dicho control nos asegura que toda la luz pase por la

solución y no pase “por arriba” o por el menisco, lo que produciría resultados erróneos.

Este control es importante también desde el punto de vista económico, pues cuanto menor sea el volumen

mínimo, más economía se puede lograr en el uso de reactivos. Es fundamental realizarlo cuando se lo utiliza

por primera vez y sobre todo cuando el aparato es nuevo pues muchas veces el fabricante indica un valor

mínimo inferior al real, lo que puede acarrear serios errores en las determinaciones.

Ir




Ahora en la práctica, no se coloca en la cubeta un volumen igual al volumen mínimo, sino que se utiliza un

volumen superior a éste en un 20% que se denomina volumen de trabajo. Esto se hace pues muchas veces

al realizar el trasvasado desde el tubo primario (donde por ejemplo, se realiza la reacción colorimétrica) a la

cubeta de lectura, puede que quede una pequeña porción del volumen en el tubo de reacción. Como

consecuencia si el volumen en el tubo primario corresponde al volumen mínimo calculado, el volumen que

llegue a la cubeta de lectura puede que sea menor a éste. Por esta razón, al usar el volumen de trabajo nos

asegurarnos que en la cubeta de lectura, el volumen siga siendo apropiado para leer correctamente.

3. Control de cubetas

Se realiza para comprobar las cualidades ópticas y de construcción de las cubetas de medida. Se mide la T %

de las cubetas llenas de agua o solución diluida de colorante, tomando una de las cubetas cargadas como

referencia y verificando las desviaciones de las demás. Para poder usarlas entre la cubeta de referencia y

cada una de testeadas no debería existir una variación superior al 1% de T, que se deberá corregir como

error sistemático, siempre que la diferencia sea pequeña.

La finalidad de tener varias cubetas de iguales características es agilizar el proceso de medida, sobre todo

cuando son varias las muestras a analizar. Para trabajar la idea es conseguir al menos dos o tres cubetas que

cumplan con el control. En el caso de no conseguir cubetas que reúnan esta condición se deberá trabajar

siempre con la misma cubeta y manteniéndola en la misma posición de lectura.

Este control se debe realizar cada vez que se usen las cubetas.

4. Control de centro de banda:

Este control tiene como finalidad verificar la concordancia entre la longitud de onda fijada con el selector del

instrumento (la leída en el display) y la real que es la que llega efectivamente a la muestra, en aparatos de

rango continuo.

Para realizar este control debe hacerse un barrido espectral con una sustancia conocida tomada como

referencia y de espectro conocido. Estas sustancias deben presentar en su espectro uno o más picos de

absorción que deben ser estrechos y estar bien definidos. Esto implica que deben conocerse las longitudes

de onda máxima, que son las longitudes de onda correspondientes al valor de máxima absorción de cada

uno de los picos, con un alto grado de confianza. Además, los picos deben estar

distribuidos dentro de todo el intervalo espectral del instrumento (recordar que abarcan las zonas del visible

y parte del UV e IR). Así son ideales los filtros de cristales de holmio que presentan varios picos

característicos a: 333, 418, 453, 536 y 636 nm. También los filtros de didimio y las soluciones de dicromato



de potasio cumplen con estos requisitos. Sin embargo, muchas veces por una cuestión económica o de

complejidad en la preparación, no se dispone de sustancias de referencia que abarquen todo el rango

espectral, entonces puede recurrirse a sustancias que abarquen un rango más estrecho y que serán útiles

para un determinado rango de trabajo. Supongamos que se realiza el barrido espectral con una sustancia de

referencia que presenta un solo pico en el visible y del cual se conoce su correspondiente longitud de onda

máxima. Si luego de haber realizado la medición el valor de la longitud de onda correspondiente al valor de

máxima absorbancia leído, coincide con el valor de longitud de onda de referencia de dicho pico, podremos

asegurar que en esa zona el aparato trabaja a las longitudes de onda indicadas por el selector pudiendo

trabajar con confianza en ese intervalo. Ahora bien, esto no asegura que en otros rangos de longitud de

onda exista igual correlación, por ello se utilizan otras sustancias con máximos en otras zonas para poder

complementar el control.

Otro método de control de centro de banda es el método del punto isosbéstico. El punto isosbéstico se

define como la longitud de onda a la cual las formas ácida y básica de una misma sustancia, en

concentraciones equivalentes, tienen igual absorbancia. Las sustancias que cumplen esta condición son

algunos indicadores colorimétricos de pH como el rojo congo, rojo fenol, azul de bromofenol, entre otros. La

importancia del método radica en que el punto isosbéstico es independiente de la concentración de la

sustancia y de la temperatura entre 4º y 45º C. Se deben realizar los espectros de absorción de alguna de las

sustancias mencionadas en sus formas ácida y alcalina en igual concentración, y a partir de ellos determinar

gráficamente el punto isosbéstico (ver figura 5). Obsérvese que también es un control zonal.

Figura 5. Espectros de un colorante en sus formas ácida y básica

para determinar el punto isosbéstico

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

400 450 500 550 600

Longitu de onda (nm)

Ab

so

rba

nc

ia

S. Alcalina

S. Ácida

Punto Isosbéstico



Luego de realizado el control, el resultado puede indicar que la λ real y la leída coincidan o bien puede haber

una diferencia entre ambas. Esa diferencia se la conoce como desplazamiento o corrimiento de la longitud

de onda y se mide en nm. Si ésta es pequeña y entra dentro del rango de aceptabilidad estipulado se la pude

considerar como error sistemático y corregir. En caso contrario de debe realizar un ajuste de la escala de

longitudes de onda por parte del servicio técnico.

El control de centro de banda debe realizarse al instalar o reinstalar el aparato, al cambiarlo de ubicación, al

cambiar la lámpara y por lo menos semestralmente.

Por último, hay que tener presente que en muchas de las determinaciones colorimétricas utilizadas en la

práctica profesional, se conoce de antemano la longitud de onda óptima de trabajo (ver apartado más

adelante), como Uds. lo verán en el TP en la determinación de proteínas por el método de Biuret. Esto es útil

pues conociendo dicho valor, se evita realizar un barrido espectral y se ahorra tiempo. Teniendo en cuenta

que la longitud de onda óptima de trabajo seleccionada se corresponde con un máximo de absorción del

cromógeno en la mayoría de los casos, si ésta por corrimiento del selector, no coincide con la estipulada, lo

más probable es que se pierda sensibilidad al realizar las medidas. Si además, el pico es muy estrecho, la

bajada de absorbancia alrededor de dicha longitud óptima será muy abrupta y al variarse mínimamente la

longitud de onda con el selector se producirá un error muy significativo en el valor de la lectura (ver el

apartado desviaciones de la ley en Anexo de Espectrofotometría). En otros casos, para calcular la actividad

de una enzima, la técnica directamente incluye el uso de “un factor” a aplicar a las lecturas para conocer

directamente dicha actividad. Si la longitud de onda no es la correcta el resultado no será válido, pues

estaríamos cometiendo error en la medida de absorbancia al trabajar a otra longitud de onda.

5. Control de linealidad fotométrica:

Indica la linealidad de respuesta del sistema de detección, y por ende el rango de utilidad de medida del

instrumento. En espectrofotómetros de alta calidad se obtienen respuestas lineales hasta valores cercanos a

2,000 de absorbancia.

Para este control se debe trabajar por ejemplo con algún colorante en solución, que se sabe que cumple con

la Ley de Lambert-Beer, es decir que presenta un comportamiento lineal entre absorbancia y concentración

en el rango de trabajo utilizado.

Para realizarlo, se deberán medir las absorbancias de soluciones de concentraciones crecientes del colorante

utilizado y contrastar dichos valores con las absorbancias de referencia certificadas (que figuran en el inserto

que viene con las soluciones o en el rótulo de los envases de las soluciones de referencia). Si el equipo

Ir

Ir

Ir




cumple con el control, el gráfico de absorbancia experimental en función de absorbancia de referencia será

lineal hasta el último valor de absorbancia experimental y éste último valor será “el máximo valor de

absorbancia aceptable” para cualquier otra medida. En el caso de que el equipo testeado no presente

linealidad en todo el rango, se deberá informar hasta que valor de absorbancia experimental hay linealidad.

Para realizar este control, cuando no se dispone de los valores de referencia de absorbancias y sí se conocen

las concentraciones de las soluciones a medir, se puede realizar un gráfico de absorbancia en función de

concentración a partir del cual también se podrá evaluar la linealidad fotométrica. Por cualquiera de los dos

procedimientos empleados, el valor máximo de absorbancia obtenido si bien es medido a una determinada

, será también el máximo valor aceptable a cualquier otra del espectro visible.

La baja linealidad puede ser debida a problemas electrónicos, presencia elevada de luz espuria (mayor al 1%

de T) entre otros factores y debe ser corregida por el servicio técnico del equipo. Este control se debe

realizar trimestralmente.

Por otra parte, es importante no confundir linealidad fotométrica, que es la que se verifica con este control,

con el cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer por parte de una sustancia dentro de un determinado rango

de concentraciones. Con este control se ve si efectivamente “el instrumento responde linealmente”. Por

esto es que se debe elegir una sustancia que sepamos de antemano que cumple con Lambert-Beer en los

rangos de concentración utilizados.

Supongamos ahora que disponemos de un instrumento que responde correctamente al control de linealidad

fotométrica en todo el rango de trabajo medido y que con él queremos estudiar una sustancia cuyo

comportamiento es desconocido. Si luego de realizadas las medidas de absorbancia correspondientes a

distintas concentraciones de la sustancia, el resultado indica que la relación no es lineal, esto nos permitirá

afirmar con seguridad el no cumplimiento de Lambert-Beer por parte de esta sustancia, aseveración que no

podríamos mantener si nuestro aparato no hubiese respondido linealmente.

6. Control de veracidad fotométrica:

A través de éste control se verifica la concordancia entre la absorbancia de referencia, obtenida con una

solución estándar de referencia certificada medida en un equipo calibrado, y la absorbancia de la misma

solución medida en el equipo que se está controlando. Por lo tanto el control permite analizar la veracidad

de los resultados obtenidos con el equipo controlado.

La veracidad fotométrica se calcula mediante el cálculo del error fotométrico porcentual (EF%) según la

siguiente expresión

(Abs exp – Abs ref) . 100 EF % = +/-

Abs ref

Ecuación 17



Donde la Abs exp corresponde al promedio de la serie de medidas realizadas de la solución de referencia con

el instrumento a controlar.

En la práctica el valor leído de absorbancia no debe variar significativamente del valor de referencia, pues a

partir de una absorbancia leída se puede determinar, como comentamos anteriormente, la concentración un

analito o una actividad enzimática. En ésta última muchas veces aplicando solo un factor de cálculo y de

acuerdo a los valores informados a veces implica cambiar el rumbo en una investigación o en otros casos,

una toma de decisión por parte del médico en cuanto a resolver un diagnóstico, medicar o suprimir la

medicación del paciente. De allí la importancia de este control en los aparatos de medida. Luego, ese valor

será confiable solo en el caso de que haya veracidad fotométrica.

Estos controles deben realizarse con estándares que cumplan ciertos requisitos tales como tener un valor de

absorbancia estable a la longitud de onda de trabajo, presentar un pico ancho de absorción, un alto

coeficiente de extinción molar, ser mínimamente sensible a las variaciones de geometría del haz de luz,

como así también a la variación del coeficiente de extinción con la temperatura. Se utilizan como patrones

filtros de vidrio neutros que poseen absorbancia conocidas a distintas longitud de onda, también soluciones

de dicromato de potasio en medio ácido para UV, y soluciones como la cianmetahemoglobina, sales de

cobalto o de cobre, en medio ácido.

Algunas de las fallas por las que el instrumento pueda no cumplir satisfactoriamente con este control

pueden ser: el envejecimiento de la lámpara, el agotamiento del fototubo, un defecto en la calibración de la

longitud de onda, el compartimento de muestra mal centrado con respecto al sistema óptico del

instrumento, una elevada absorción por parte de las cubetas, si no están hechas del material adecuado (por

ejemplo, en UV se trabaja con cubetas de cuarzo pues el vidrio absorbe significativamente).

Este control se debe realizar mensualmente.

7. Control de la precisión fotométrica

Este control tiene como finalidad evaluar la repetitibilidad de una serie de medidas de Absorbancia

obtenidas al realizar varias medidas de una misma solución. A mayor repetitibilidad en la serie de datos,

habrá mayor precisión o bien menor dispersión.

El resultado del control se expresa a través de una medida de la dispersión mediante el cálculo del

coeficiente de variación porcentual (CV%), que relaciona la desviación estándar (S) con la media de la serie

de medidas (Abs exp) expresada en forma porcentual según indica la ecuación:

S . 100 CV% = Absexp

Ecuación 18



Para realizar el control se puede utilizar una solución coloreada cuyo requisito básico es que su valor de

absorbancia sea estable a través del tiempo. Se utilizan por ejemplo, soluciones de sulfato cúprico o cloruro

de cobalto en medio ácido. No es necesario emplear una solución de referencia certificada.

Algunas consideraciones generales para tener en cuenta en el trabajo espectrofotométrico:

Rango óptimo de lectura en las medidas de transmitancia y absorbancia:

Cuando realizamos medidas de absorbancia o de transmitancia existe un rango de medidas recomendable.

Éste es el comprendido entre 0.100 y 1.000 para Abs y su equivalente en T, que es entre el 80% y 10%

respectivamente. Esto es así ya que en esta región es donde el error espectrofotométrico debido a la

medida de T es menor (Ver el apartado Errores analíticos en la medida de Transmitancia y Absorbancia en

Anexo de Espectrofotometría).

Elección de longitud de onda óptima de trabajo:

Si disponemos de una sustancia de la cual ya conocemos su espectro y queremos trabajar con ella a una

determinada longitud de onda para ver si cumple con la ley de Lambert-Beer o realizar una cuantificación, la

pregunta que surge es ¿cuál será la longitud de onda adecuada para trabajar? La respuesta tendrá que ver

con el análisis del espectro obtenido. (Ver el apartado desviaciones de la ley en Anexo de

Espectrofotometría). Este podrá presentar distintos picos de máxima absorción que podremos identificar,

además de individualizar las correspondientes longitudes de onda máxima para cada uno de ellos. También

podremos encontrar zonas de absorbancias estables dentro de un rango de longitudes de onda más ó menos

amplio. Para elegir “la longitud de onda óptima de trabajo” se utilizarán los siguientes criterios:

Se prefiere un máximo de absorbancia, dado que así se obtiene mayor sensibilidad en las lecturas,

siempre que éste se encuentre dentro del rango de absorbancias recomendadas en el apartado anterior.

Hay que evitar en lo posible, trabajar en regiones del espectro donde hay cambios bruscos de

absorbancia, ya que un pequeño desplazamiento en la longitud de onda puede causar un error grande

en la correspondiente lectura.

Muestra, Testigo y Blanco:

En el trabajo práctico se realizará una reacción colorimétrica para determinar la concentración de proteínas

totales presentes en una muestra (o solución incógnita), midiendo su absorbancia y la de soluciones

Ir

Ir





Testigos, siendo el testigo una solución que contiene el mismo analito a dosar en la muestra y cuya

concentración es conocida.

Para determinar la concentración de un analito en una muestra, el valor de absorbancia de la misma debe

ser la correspondiente exclusivamente a dicho analito. En la práctica cuando el analito no es coloreado se

usa una reacción química, donde el color generado se debe a la reacción del analito (contenido en la

muestra) con el reactivo (tal es el caso para proteínas con la reacción del Biuret). Si en un tubo, al que

llamaremos el tubo de muestra, colocamos la muestra y el reactivo (estando éste último en exceso) al

reaccionar generarán color dando como resultado un valor de absorbancia. La absorbancia medida se

deberá a la contribución de todos los componentes presentes. Es decir a la muestra y al exceso de reactivo,

en el caso de que este último absorba. En el caso del Biuret el reactivo presenta color a simple vista y

absorberá a la longitud de onda elegida para medir la absorbancia debida a la reacción colorimétrica. En

otros casos la presencia de un solvente o sustancias presentes en la muestra que no sean específicamente el

analito pueden absorber a la longitud de onda de trabajo y por lo tanto contribuir a la absorbancia leída de

dicho tubo. Por ello se deben preparar otros tubos que contengan a éstos para descontar dicha/s

absorbancia/s ya que no corresponde/n al analito que se quiere medir. Estos tubos adicionales pueden ser:

Tubo de referencia o blanco de solvente: este tubo puede contener agua o el solvente que se utilice en la

reacción y que estará presente en todos los tubos. Contra este tubo se leerán todos los demás tubos, es

decir con él se llevará a cero de absorbancia y será la referencia.

Tubo de blanco de reactivo: este tubo se denomina así pues contiene todos los reactivos necesarios para

que se realice la reacción, pero no contiene a la muestra o al testigo. Por lo tanto la medida de absorbancia

de éste será descontada a la del tubo de muestra y a la del tubo de testigo para obtener por diferencia el

valor de la absorbancia debida solamente a la muestra o al testigo, según corresponda.

Tubo de blanco de muestra: este tubo contiene a la muestra pero no al reactivo. Se utiliza para medir la

contribución de otros analitos o sustancias interferentes que estén presentes en la muestra y que no son el

“analito a procesar” y que pueden absorber a la longitud de onda de trabajo y por lo tanto contribuir a la

absorbancia final del tubo de medida. La medida de absorbancia de este tubo también será descontada del

tubo de muestra.

Tubo de blanco de testigo: contiene al testigo pero no al reactivo y tiene la misma finalidad y tratamiento

que el blanco de muestra pero se utiliza el testigo en vez de la muestra y su absorbancia será descontado al

tubo testigo.

En todos los casos se reemplaza el volumen de reactivo, muestra o testigo, por un volumen igual de solvente

en el tubo según corresponda.



B- DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR UN MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO

Una de las tantas aplicaciones que tiene la espectrofotometría es la detección y cuantificación de sustancias

detectables mediante una reacción colorimétrica. Como comentamos, en el trabajo práctico determinarán la

concentración de proteínas totales presentes en una solución utilizando la técnica del Biuret.

El reactivo de Biuret contiene sulfato de cobre en medio alcalino y permite la cuantificación de proteínas por

la formación de un complejo coloreado. Esto se debe a que los enlaces peptídicos de las proteínas

reaccionan con el ión cúprico, en medio alcalino y dan un complejo coloreado con un máximo de absorción a

540 nm. La absorbancia de esta solución coloreada es proporcional a la concentración de proteínas totales

presentes en la muestra, en un rango comprendido entre 0,1 y 100,0 g de proteína por L de solución.

Para determinar el valor de las proteínas en una muestra desconocida mediante esta técnica, además de

procesarla según indica el protocolo (ver guía de TP), se debe realizar una curva de calibración. Para esto una

serie de testigos de distintas concentraciones, se procesarán de la misma forma que la muestra. Luego de

registrar sus absorbancias se graficarán dichos valores en función de sus correspondientes concentraciones,

obteniendo así el gráfico de calibración. Esta relación deberá ser lineal, pues las concentraciones de los

testigos utilizados, están comprendidos dentro del rango de validez de la ley. Si luego el valor de absorbancia

correspondiente a la muestra se encuentra dentro de dicho rango se podrá obtener desde la ecuación de

calibración, el valor de la concentración la muestra.

Importante: recordar que las absorbancias de las soluciones incógnita y testigo serán las calculadas luego de

descontar las contribuciones de los blancos correspondientes y deberán estar comprendidas dentro del

rango de linealidad de la reacción.

La curva de calibración se puede realizar con testigos certificados (de origen comercial) que se denominan

calibradores y que presentan un bajo rango de incertidumbre.

Otras veces, cuando por ejemplo se deben procesar muchas muestras en un mismo día y se dispone de la

curva de calibración realizada con anterioridad pueden surgir las siguientes preguntas ¿se debe volver a

calibrar de para determinar la concentración de proteínas de cada muestra? o ¿se puede seguir utilizando la

ecuación provista por la calibración? Para responderlas, además de procesar las muestras se debe procesar

siempre uno o más testigos que funcionen “testeando” el proceso de medida en ese momento. Estos

testigos se conocen como controles de calidad y son también certificados como los calibradores aunque más

económicos, lo que permite utilizarlos en cada medición (si bien presentan un rango un poco mayor de

incertidumbre que los calibradores, esto no va en detrimento de su función). Entonces, si luego de procesar

este control, utilizando la ecuación de calibración, se obtiene un valor de concentración dentro de un rango

http://es.wikipedia.org/wiki/Sulfato_de_cobre

http://es.wikipedia.org/wiki/Alcalino



aceptable (según los valores indicados por el proveedor), entonces será válido mantener la calibración y

obtener los resultados de las muestras a partir de ella. En caso contrario, se deberá volver a calibrar

nuevamente para obtener el resultado de cada muestra.

fundamentos. espectrofotometrÍa/ -...

Documents