저 시-비 리-동 조건 경허락 2.0 한민

는 아래 조건 르는 경 에 한하여 게

l 저 물 복제, 포, 전송, 전시, 공연 송할 수 습니다.

l 차적 저 물 성할 수 습니다.

다 과 같 조건 라야 합니다:

l 하는, 저 물 나 포 경 , 저 물에 적 허락조건 확하게 나타내어야 합니다.

l 저 터 허가를 러한 조건들 적 지 않습니다.

저 에 른 리는 내 에 하여 향 지 않습니다.

것 허락규약(Legal Code) 해하 쉽게 약한 것 니다.

Disclaimer

저 시. 하는 원저 를 시하여야 합니다.

비 리. 하는 저 물 리 적 할 수 없습니다.

동 조건 경허락. 하가 저 물 개 , 형 또는 가공했 경에는, 저 물과 동 한 허락조건하에서만 포할 수 습니다.

학 사 학 논

암 포주에 시스플라틴 내

지 자 분

Gene expressions as resistant markers

to cisplatin in bladder cancer cell lines

2013 2 월

울 학 학원

학과 사과

이 우

A thesis of the Master’s degree

Gene expressions as resistant

markers to cisplatin in bladder

cancer cell lines

암 포주에 시스플라틴

내 지 자 분

February 2013

The Department of Urology,

Seoul National University

College of Medicine

Jeong Woo Lee

암 포주에 시스플라틴

내 지 자 분

지도 이 식

이 논 학 사 학 논 출함

2012 10 월

울 학 학원

학과 뇨 과학 공

이 우

이 우 학 사 학 논 인 함

2012 12 월

원 장 재 원 (인)

부 원장 이 식 (인)

원 변 (인)

학 논 원 공 스에 한 동

본인 학 논 에 하여 울 학 가 아래 같이 학 논

공하는 것에 동 합니다.

1. 동 사항

① 본인 논 보존이나 인 등 통한 라인 스 목

복 할 경우 작 내용 변경하지 않는 범 내에 복 를

허용합니다.

② 본인 논 지 하여 인 등 보통신망 통한 논 일부

또는 부 복 ․ 포 송 시 료 공하는 것에 동 합니다.

2. 개인( 작자)

본 논 작권 타인에게 양도하거나 또는 출 허락하는 등 동

내용 변경하고자 할 는 소속 학(원)에 공개 보 또는 해지를 즉시

통보하겠습니다.

3. 울 학

① 울 학 는 본 논 외부에 공할 경우 작권 보 장 (DRM)를

사용하여야 합니다.

② 울 학 는 본 논 에 한 공개 보나 해지 신청 시 즉시

처리해야 합니다.

논 목 : 암 포주에 시스플라틴 내 인자 자

변 분

학 구분: 사 ■ · 사 □

학 과: 학과

학 번: 2007-23318

연 락 처:

작 자: 이 우 (인)

출 일: 2012 10 월 25 일

울 학 장 귀하

i

: Cisplatin 진행 암 료에 있어 가장 효과 인

항암 학요법 이나, 다양한 자 또는 억 를 통해 약

내 이 생한다. 라 cisplatin에 한 약 내 극복

료 향상 해 매우 요하다. 본 연구에 는 암

포주 cisplatin 내 암 포주 자

분 하여 cisplatin 내 에 여하는 자를 인하고 약 내

규명하는데 공하고자 하 다.

법: 미국 ATCC에 도입한 인체 암 포주 (T24)

cisplatin 농도 2.0 μg/ml에 내 보이는 포주 (T24R2)를

이용하여 mRNA expression analysis (cDNA microarray)를 통해

T24 T24R2 자 차이를 구하 다. 이

자 (fold change ≥2, p-value <0.05)를 실시간 합효소

연쇄 통해 인하 다.

ii

결과: cDNA microarray 분 결과 과 자

3가지 암 경 ( 포고사, p53 신 경 , 포주 )

PRKAR2A, PRKAR2B, CYCS, Bcl-2, BIRC3, DFFB, CASP6,

CDK6, CCNE1, STEAP3, MCM7, ORC2, ORC5, ANAPC1,

ANAPC7, CDC7, CDC27, SKP1 등 18개 자가 실시간

합효소 연쇄 에 2 이상 차이를 보 다. 특히,

MCM7, Bcl-2, CYCS, PRKAR2B는 cDNA microarray 또는

실시간 합효소 연쇄 에 4 이상 (fold change ≥4) 이

증가 었다.

결 : T24 포주 하여 T24R2 포주에 과

18개 자는 암 cisplatin에 한 내 생과

이 있 것 생각한다.

----------------------------------------------------------------------------------------------

주요어: 암, cisplatin, 약 내 , cDNA microarray, 실시간

합효소 연쇄

학 번: 2007 – 23318

iii

목 차

.............................................................................. i

목차............................................................................ iii

그림 목 .......................................................... iv

.............................................................................1

실험재료 법 .........................................................3

결과.............................................................................9

고찰...........................................................................20

참고 헌 ....................................................................28

( ) ...............................................................39

iv

그림 목

1 List of primers. .................................................11

그림 1 Up-regulated genes related to apoptosis.

(A) 7 significant up-regulated genes with symbol,

name, function, and fold change between T24 and

T24R2. (B) Gene expression analysis by

quantitative real-time PCR. ......................................13

그림 2 Up-regulated genes related to p53

signaling pathway. (A) 4 significant up-regulated

genes with symbol, name, function, and fold change

between T24 and T24R2. (B) Gene expression

analysis by quantitative real-time PCR. ...................15

그림 3 Up-regulated genes related to cell cycle.

v

(A) 10 significant up-regulated genes with symbol,

name, function, and fold change between T24 and

T24R2. (B) Gene expression analysis by

quantitative real-time PCR. ......................................16

1

암 계 체 암 남 에 생 도가 5 ,

여 에 7 에 이르고, 미국과 럽 경우 매 50,000-

70,000여명에 생한다 (1-3). 암 진단시 30%가

침 이며, 장 에 국한 침 암 경우 근

출 이 료 이나, 이 20-50%는 원격 이

진행하거나 5-15%에 국소 재 한다 (4). 이 경우 cisplatin

본 한 MVAC (methotrexate, vinblastine, adriamycin,

cisplatin), 또는 GC (gemcitabine, cisplatin) 병합요법이

항암 학요법 이용 나, 약 30%에 에 실 하고,

부분 1 내에 cisplatin에 한 내 에 재 한다 (5-6).

그러나 1차 항암 학요법에 실 하거나 재 할 경우 재 립

효과 인 2차 항암 학요법 가 없는 실 이다. 라

cisplatin에 한 암 내 극복하는 것 진행 암

료 향상 해 매우 요하다.

근 항암 학요법 에 한 암 내 생에 특

자들 역할이 지면 여러 종 암 료 략에

분자생 학 연구들이 주목 고 있다. 암 경우도

cisplatin에 한 내 생 히 는 여러 연구들이

진행 어 포 내 cisplatin 축 감소시키는 약 달 변

(changes in drug transport), 손상 DNA 회복 (DNA repair)

또는 DNA 손상 항 (DNA damage tolerance mechanism)

변 , 포고사 경 변 (changes in the apoptotic cell death)

2

등 여러가지 가 들 시하고 있 나, 아직 실히 립 어 실

임상에 용 고 있는 것 없는 실 이다 (7-17).

cDNA microarray는 자 칩 이용해 개에 만개

자 동시에 분 할 있는 특징 에 여러 암

연구에 많이 이용 고 있다. 특히 항암 학요법 작용 내

생에 있어 자 연구에 히 이용 고 있다. 암

포에 cisplatin 작용 특 한 능 DNA 므

cisplatin 내 암 포에 자 분 연구는 그 내

뿐만 아니라 cisplatin 내 암에 한 새 운 료

개 에도 도움이 것이다 (18-19).

본 연구에 는 mRNA expression analysis (cDNA

microarray)를 이용하여 T24 암 포주 cisplatin 내

암 포주 (T24R2) 자 분 하고, 실시간

합효소 연쇄 통해 cisplatin 내 암 포주 독특한

자 특징 알아냄 써, 암에 cisplatin 내

자들 알아보고자 하 다.

3

실험 재료 법

1. 암 포주 양 (cell lines and culture)

암 포주는 미국 ATCC (American Type Culture

Collection, Rockville, MD)에 도입한 인체 암 포주 T24를

사용하 다. Cisplatin 내 포주는 T24 포주를 cisplatin 0.5

μg/ml부 2 μg/ml 지 단계 노출 후 양하면 포 생존

인한 후 립한 T24R2를 실험에 사용하 다 (20-22).

포주는 10mM HEPES-buffer (Gibco Laboratories, Grand

Island, NY), 100 units/ml penicilline과 100 μg/ml

streptomycin (penicillin-streptomycin solution, Gibco

Laboratories, Grand Island, NY), 56oC에 30분간 등 시킨

10% fetal bovine serum (Gibco Laboratories, Grand Island,

NY) 첨가한 RPMI 1640 양액 (Gibco Laboratories, Grand

Island, NY) 사용하여 37oC 5% CO2-95% air 항 항습 에

양하 고, 단 포 부착하게 하여 장시 다.

2. RNA 추출과 cDNA 합 (RNA extraction and

4

cDNA synthesis)

체 RNA는 T24 T24R2 포주 부 mirVanaTM microRNA

isolation kit (Ambion)를 이용하여 조사 사용 법에 라

추출하 다. RIN9 이상 농도 도 A260/A280에

1.8~2.1 범 에 있는 RNAs는 cDNA 합 해 사용하 다.

cDNA 증폭 이 틴 지 amplified RNA (aRNA)를

해 는 GeneChip® IVP Express kit (Affymetrix)를 이용하 다.

이 틴 지 aRNA 생 한 Affymetrix GeneChip®

kit 사용 차는 조사 사용 법에 라 in vitro transcription,

hybridization과 워싱 스캐닝하여 행하 다.

3. 자 프 일 한 microarray 분

(Microarray analysis for gene expression profiles)

지 aRNA는 효소, 염, unincorporated 뉴클 타이드

거를 해 하 며, 약 15μg aRNA는 5x Array

Fragmentation Buffer를 이용하여 94oC에 35분 동안

학 단편 하 다. 지 단편 aRNA는 45oC에

16시간동안 GeneChip® kit에 합 (hybridize)하 다. 합

probe array는 Fluidics Station 450 (Affymetrix)를 이용하여

5

염색과 척 행하 다. 염색 GeneChip probe array는

GeneChip® Scanner 3000+ 7G (Affymetrix) 를 이용하여

570 nm에 하 다.

4. Microarray 데이 규 분 (Microarray

data normalization and analysis)

CEL 일 데이 분 해 GenPlexTM 소프트웨어 버 3.0

(ISTECH Inc., Goyang, Korea) 사용하 다. MAS5 알고리즘

자 요약과 54,120 probe 트를 포함한 MicroDBTM

Data Mining Tool 소프트웨어 (Affymetrix, Santa Clara, CA)에

해 분 GeneChip® Human Genome HG-U133 Plus 2.0

array 데이 신 계산 (signaling calculation) 해

사용하 다. U133 plus 2.0 chip 38,573개 자 클러스 를

나타내는 54,120 probe 트를 포함한 특징 가지고 있다. 시료

자 Affymetrix사 를 통해 분 하 다.

T24 T24R2 포주 사이 자 평균차, 변 (fold

change)는 Data Mining Tool 소프트웨어 (Affymetrix, Santa

Clara, CA)를 이용하여 인하 다. 자 clustering 분

GENECLUSTER 1.0 (MIT, Cambridge, MA)를 이용하여

6

행하 다. 변 보이는 자들 Onto-Express를

이용하여 그들 생 학 능에 고 분 하 다. 또한

자 데이 를 나타내 해 GenMAPP 소프트웨어를

사용하 다 (http://www.genmapp.org). 쉽게 분 지 않

자들 능 clustering 분 에 하 다.

5. RNA 추출과 자 에 한 실시간 합효소

연쇄 분 (RNA extraction and real time-PCR

analysis of gene expression)

Cisplatin 내 인간 암 포주 (T24R2)를 하여 RNeasy

Mini kit (Qiagen)를 이용하여 체 RNA를 분리하 다. cDNA는

oligo(dT) 프라이 Omniscript reverse transcriptase enzyme

(Qiagen)를 이용하여 조사 사용 법에 라 생산하 다. cDNA

microarray 부 얻 자들과 GAPDH mRNA real time-

PCR ABI 7500 detection system (Applied Biosystems)과

SYBR Green I (Roche) 이용하여 행하 다. 시 체

(primer)는 PCR 생산 이 200bp 미만이 도 계하 다.

PCR 처 95oC에 10분 동안 변 과 거 다 , 다시

95oC에 10 , 복원냉각 도 (annealing temperature)에

7

10 , 그리고 72oC에 10 동안 extention하여 40회

사이클 행하 다. 실시간 합효소 연쇄 에 한 특이

시 체 probe는 1에 나타낸 것 사용하 다.

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)

beta-actin normalization 한 reference 자

사용하 며 mRNA threshold cycle 법

이용하여 량 하 다. Fold change는 comparative CT (2-

ΔΔCT) 법에 해 계산하 다. 모든 어도 2회 이상

행하 다.

6. 통계처리

데이 는 편차 평균값 나타내었다. 실시간 합효소

연쇄 에 해 얻어진 two variables numerical values 사이

계는 Mann-Whitney U test를 이용하여 분 하 다. Three

variables 사이 계는 Bonferroni adjusted Mann-Whitney U

test를 이용하여 분 하 다. Expert statview® 분 소프트웨어

(Version 4; SAS Institute Inc., CARY, NC, USA)는 경우 모

사용하 다. 차이가 있게 자들 fold change (cutoff

=2.0) Welch’s t-test (p-value ≤0.05)를

8

분 하 다. 모든 실험 3회 행하 다.

9

결 과

mRNA expression analysis (cDNA microarray)를 이용하여

Welch’s test 결과 (p-value ≤0.05) fold change

(cutoff=2.0) 법 동시에 용하여 T24 포주 T24R2 포주

간 차이가 나는 448개 자들 별하 다.

별 자들 Self-organizing map analysis (SOM)

군집 분 법 이용하여 조사하 고, 그 에 라

자들 군집 하 다 (23). 또한 Onto-Express software를

이용하여 포고사 (apoptosis), p53 신 경 (signaling

pathway), 포주 (cell cycle) 등 생 학 능에 라 군집

하 다 (그림 1, 2, and 3).

cDNA microarray 데이 를 자 신 값 규

(scaling normalization), 복 실험 재 인 (correlation

scatter plot, correlation matrix plot) 등 데이 처리 후

T24 포주 T24R2 포주에 차이가 나는 1,163개

자 (up-regulated genes), 905개 GO (gene ontology)

10

보, 327개 pathway 보를 인하 다. 그 Welch’s T-

test 결과 p-value ≤0.05인 432개 GO 보 (294 biological

process, 67 cellular component, 71 molecular function)

72개 pathway 보를 인하 다. GSEA (Gene Set

Enrichment Analysis) 법 이용하여 자들이 일

보이는 curated gene sets를 별하 다 (p-value <0.05).

실 분 에 는 GSEA 페이지

(http://www.broadinstitute.org/gsea/)에 속하여 분

행하 며, Kolmogorov-Smirnov statistic 이용하여 자

일 스트하여, 57개 후보 gene sets

추출하 다.

T24 포주 T24R2 포주 간 양상 차이를 regression

normalization 후 n-fold method statistical p-value

용하 , T24R2에 2 이상 많이 자는

448개 다. 이 가지 주요 암 경 (cancer-related

pathways) 하여 포고사는 7개, p53 신 경 4개,

포주 10개, 18개 자를 별하 다 (그림 1A, 2A,

11

and 3A).

cDNA microarray에 차이를 보인 18개 자

2개 housekeeping genes (GAPDH, beta-actin)를 이용하여

실시간 합효소 연쇄 분 하 다. 18개 자에 한

실시간 합효소 연쇄 결과는 cDNA microarray 결과

하게 부합하 다 (그림 1B, 2B, and 3B). 가지 분 법

간에 에 있어 fold change가 하게 일 하지는 않았지만,

자 사한 변 가 실시간 합효소 연쇄 에

찰 었다. 즉, 암 포주 cisplatin에 한 내 생

프 스에 과 18개 자가 연 이 있 뒷 침한다.

cDNA microarray 실시간 합효소 연쇄 결과, T24

포주 T24R2 포주에 3가지 암 경 하여

PRKAR2A, PRKAR2B, CYCS, Bcl-2, BIRC3, DFFB, CASP6,

CDK6, CCNE1, STEAP3, MCM7, ORC2, ORC5, ANAPC1,

ANAPC7, CDC7, CDC27, SKP1 등 18개 자

찰 었고, 이 MCM7, Bcl-2, CYCS, PRKAR2B는 cDNA

microarray 또는 실시간 합효소 연쇄 에 4 이상 (fold

change ≥4) 이 증가 어 cisplatin에 한 내 생과 이

12

있 것 생각 다 (그림 1, 2, and 3).

13

14

1. List of primers.

15

(A)

(B)

그림 1. Up-regulated genes related to apoptosis. (A) 7

significant up-regulated genes with symbol, name, function, and

fold change between T24 and T24R2. (B) Gene expression

16

analysis by quantitative real-time PCR.

17

(A)

(B)

그림 2. Up-regulated genes related to p53 signaling pathway.

(A) 4 significant up-regulated genes with symbol, name,

function, and fold change between T24 and T24R2. (B) Gene

expression analysis by quantitative real-time PCR.

* denotes up-regulated gene overlapped with other cancer-related pathways

18

(A)

(B)

19

그림 3. Up-regulated genes related to cell cycle. (A) 10

significant up-regulated genes with symbol, name, function, and

fold change between T24 and T24R2. (B) Gene expression

analysis by quantitative real-time PCR.

* denotes up-regulated gene overlapped with other cancer-related pathways

20

고 찰

재 진행 암에 있어 cisplatin 본 한 병합요법이

항암 학요법 이용 다. 그러나 이에 한 에

실 하거나 재 할 경우 효과 인 항암 학요법 가 없는 실 이다.

근 5-fluorouracil, docetaxel, ifosfamide, paclitaxel,

vinblastine 등 이용하여 단독 또는 병합요법 여러

임상시험들이 진행 었 나, 생존 증가를 보여주지 못했고, 후

또한 실망스럽다 (24-28). 라 cisplatin에 한 내

극복하고 새 운 약 를 개 하는 것 암 료 향상

해 매우 시 하다.

동시에 많 자들 분 할 있는 특징 에

cDNA microarray는 암 연구에 많이 이용 고 있다. 근

뇨 계 암에 도 다양한 항암 학요법 cDNA microarray를

이용한 자 에 한 연구들이 보고 고 있다 (29-32).

재 cisplatin 본 한 여러가지 병합요법 이 또는 국소

재 암 뿐만 아니라 여러 다른 암 료에 이

21

용 고 있다. 많 연구들이 cisplatin에 한 내 생 과 새

운 료 개 해 분자생 학 연구 법 (molecular

biology) 통한 자 연구들 시도해 나, 진행

암에 cisplatin에 한 내 생과 자 (gene

expression profile)과 그 (mechanism)에 해 는 거 알

진 것이 없는 실 이다 (33-36).

본 연구에 는 암 포주 (T24) cisplatin 내 암

포주 (T24R2)에 자 분 하 해 이미 알 진

22,245개 자를 포함하는 high-throughput microarray를 이

용하여, cisplatin에 한 포분자학 (cellular and

molecular responses)이 다양한 조 경 (regulatory pathways)

를 통해 이루어진다는 자 연구 (genome-wide analysis)

를 하고자 하 다. 암 포에 cisplatin에 한 신

달 (signal transduction), 포분 (cell proliferation), 포주

조 (cell cycle control), 사 번역 조 (transcriptional and

translational regulation), 단 질 분해 (protein degradation),

포고사 (apoptosis), 종양 억 (tumor suppression) 뿐만 아니라

22

포 사 (cellular metabolism)에 특 한 능 가지고 있

는 자들 (induction) 억 (inhibition) 다.

이는 cisplatin에 한 내 생이 특 자들에 해 획득

조 고, 진행 암 재 또는 이 연 어 있 보여

다. 암에 cisplatin에 한 내 생 여러 가지 들

과 며, 이는 cisplatin이 암에 DNA를 하고

있다는 에 고 있다. 첫째, cisplatin 동 산

입 (influx mechanism of passive diffusion)과 하여 내

포 (resistant cells)들 축 (accumulation) 감소시킨다.

째 , cisplatin에 한 내 내 포 내 glutathione과 하

여 cisplatin 포내 포착 (intracellular tapping) 증가에 인

하여 생한다. 째, 손상 DNA 회복 (repair) 또는 DNA 손상

항 (tolerance)이 증가하고, 마지막 cisplatin 내 포

는 항 사 질 (antimetabolite)에 한 차 항 (cross-

resistance)과 당과 아미노산 감소 같 복합 다면

(complex pleiotropic phenotype) 나타낸다 (18-

19). 다른 입증 는 DNA topoisomerase I 증가

23

(37), thioredoxin 증가 (38), 포고사 감소 Bcl-2,

Bcl-XL, Bax family 단 변 (39-40), cisplatin에 한

Bcl-XL sensitized cells down-regulation (41) 등 이다.

본 연구에 는 생 학 프 스 능 (biological process

function) 하여 자들 분 하 고, 그 이미 잘

알 진 포고사, p53 신 경 , 포주 등 3가지 주요 암

경 를 택하 다. 포고사 경 는 내인 (mitochondrial)과

외인 (cytoplasmic) 경 를 가지며 (42-43), 이들

포고사에 종 구조 조 질들 (final regulatory structural

molecules) 분리하는 하나 caspase 공통 경

(caspase-related common pathway) 병합한다 (44). 포주

경 는 cisplatin 주요 작용 이 DNA이 에 택하 다.

p53 신 경 는 포주 지 (cell cycle arrest), DNA 회복

(DNA repair), 포사 (cell death) 에 사인자

(transcription factor) 요한 역할 하며, p53 능 상실

(loss of p53) 포고사 억 , 포주 조 자

불안 야 한다 (45).

24

T24 포주 하여 T24R2 포주에 택 3가지 경

18개 자가 과 하 고, 특히, MCM7, Bcl-2,

CYCS, PRKAR2B는 fold change 4.0 이상 과 하 다. 이는

암 포에 cisplatin에 한 내 생과 이 있 것

추 다.

cDNA microarray 결과 포고사 경 7개 자

(PRKAR2A, PRKAR2B, CYCS, Bcl-2, BIRC3, DFFB, CASP6)가

fold change 2.0 이상이었다. DFFB는 액 신경계암

(hematologic or neurologic cancer) 등 다른 종 암 포고

사 과 에 caspase-3에 한 질 (substrate) 역할 하고

DNA fragmentation 진 (trigger)한다 (46-47). PRKAR2A

PRKAR2B는 엔도솜 (endosome) 부 골지체 (Golgi

apparatus), 나아가 소포체 (endoplasmic reticulum) 단 질

송 (protein transport) 조 하는 cAMP-dependent,

regulatory, type II alpha protein kinase이다. BIRC3, DFFB,

CASP6 자는 포고사 마지막 조 과 (regulatory

process)에 caspase에 해 조 는 것 알 있다. Bcl-

25

2 CYCS는 많 암에 포고사 한 이 있는 것

잘 알 있고 (42, 48), 특히 Bcl-2 자는 포고사 억 를

조 하고, 항암 학요법이나 사 료에 내 생시 과 는

것 알 있다 (49-50).

p53 신 경 자는 CYCS, CDK6, CCNE1,

STEAP3 다. CDK6는 특히 포 증식 (cell proliferation)과

포주 진행 (cell cycle progression)에 요한 역할 담당하

는 D-type cyclins cyclin-dependent kinase 하나이

다 (51-52). CCNE1 또한 암과 어 있는 것 잘

알 있다 (53). Metalloreductase인 STEAP3는 특히 DNA

ATP 합 (DNA and ATP synthesis)에 포 생존과 번식

(cellular proliferation and survival) 지를 한 철분 커

니즘 (iron-related mechanism) 핵심 인 역할 하며, 철분 부

족 상태 (hypoferric condition)에 철 장 (iron storage)과

른 종양 증식 지한다 (54).

포주 경 어 과 자는 MCM7, ORC2,

ORC5, CDK6, CCNE1, ANAPC1, ANAPC7, CDC7, CDC27, SKP1

26

이었다. MCM7 포증식 (cell proliferation)에 요한 역할

하고 (55-56), ORC5는 많 암에 cell transcriptional

proliferation mechanism에 이 연 어 있다 (57). SKP1

SCF complexes 한 구 요소 단 분해 (degradation)를

(targeting)하는 ubiquitinating proteins과 하여 포 증

식 (cell proliferation) 포주 진행 (cell cycle progression)

조 에 여한다 (58-59). ANAPC1 ubiquitinating proteins

에 해 포주 (metaphase)에 후 (anaphase)

진행 (progression) 조 하는 anaphase-promoting complex

subunit이고, ANAPC7는 anaphase like ANAPC1 gene promoting

complex/cyclosome (APC/C) 구 요소 퀴틴

(ubiquitination) 포증식 (promoted cell

proliferation) 통해 많 포주 조 인자들 (cell cycle

regulators) (targeting)함 써 포주 진행 조 한

다 (60).

이 연구 외에 cisplatin에 한 내 생과 하여

포고사 내인 (intrinsic)과 외인 (extrinsic) 경 인

27

NFKB, ubiquitin/proteasome system, PI3K 같 경 들이 많

연구에 다 (44-45). 이 연구는 이러한 경 들과

자들 다루지는 않았지만, 나 지 64 biological

pathways 에 몇몇 이 존재할 있다고 생각한다.

Cisplatin 내 암에 이러한 자들 역할 립하

해 는 단 질 능 면과 본 연구에 는 포주에

국한하여 연구를 행하 지만 in vivo 연구 등 좀 심도있는

연구가 필요하다. 불어 내 생 과 연 인자들간

상 작용 내 한 추가 연구가 필요할 것 단한다.

결 T24 포주 하여 T24R2 포주에

포고사, p53 신 경 , 포주 등 3 가지 주요 암 경

(cancer-related pathways) 18개 자가

과 었다. 이 자들 암 cisplatin에

한 내 생과 이 있 것 생각한다.

28

참 고 헌

1. Siegel R, Desantis C, Virgo K, et al. Cancer treatment and

survivorship statistics, 2012. CA Cancer J Clin.

2012;62:220-41.

2. Forman D, Stockton D, Moller H, et al. Cancer prevalence in

the UK: results from the EUROPREVAL study. Ann Oncol.

2003;14:648-54.

3. Gloeckler Ries LA, Reichman ME, Lewis DR, et al. Cancer

survival and incidence from the Surveillance, Epidemiology,

and End Results (SEER) program. Oncologist. 2003;8:541-

52.

4. Quek ML, Stein JP, Clark PE, et al. Natural history of

surgically treated bladder carcinoma with extravesical

tumor extension. Cancer. 2003;98:955-61.

5. Fossa SD, Aass N, Ous S, et al. Survival after curative

treatment of muscle-invasive bladder cancer. Acta oncol.

1996;35 Supple 8:59-65.

6. Saxman SB, Propert KJ, Einhorn LH, et al. Long-term

follow-up of a phase III intergroup study of cisplatin alone

29

or in combination with methotrexate, vinblastine, and

doxorubicin in patients with metastatic urothelial carcinoma:

a cooperative group study. J Clin Oncol. 1997;15:2564-9.

7. Griffith OW, Meister A. Glutathione. Interorgan

translocation, turnover, and metabolism. Proc Natl Acad Sci.

1979;76:5606-10.

8. Meister A. Selective modification of glutathione metabolism.

Science. 1983;220:472-7.

9. Batist G, Tulpule A, Sinha BK, et al. Overexpression of a

novel anionic glutathione transferase in multidrug resistant

breast cancer cells. J Biol Chem. 1986;261:15544-9.

10. Eastman A, Schute N. Enhanced DNA repair as a

mechanism of resistance to cis-diamminedichloroplatinum

(II). Biochemistry. 1988;27:4730-4.

11. Hospers GA, Meijer C, De Leij J, et al. A study of human

small-cell lung carcinoma (hSCLC) cell lines with different

sensitivities to detect relevant mechanisms of cisplatin

(CDDP) resistance. Int J Cancer. 1990;46:138-44.

12. Waxman DJ. Glutathione S-transferases. Role in alkylating

30

agent resistance and possible target for modulation

chemotherapy – a review. Cancer Res. 1990;50:6449-54.

13. Mestdagh N, Pommery N, Saucier JM, et al.

Chemoresistance to doxorubicin and cisplatin in a murine

cell line. Analysis of P-glycoprotein, topoisomerase II

activity, glutathione and related enzymes. Anticancer Res.

1994;14(3A):869-74.

14. Yasuno T, Matsumura T, Shikata T, et al. Establishment and

characterization of a cisplatin-resistant human

neuroblastoma cell line. Anticancer Res.

1999;19(5B):4049-57.

15. Koga H, Kotoh S, Nakashima M, et al. Accumulation of

intracellular platinum is correlated with intrinsic cisplatin

resistance in human bladder cancer cell lines. Int J Oncol.

2000;16:1003-7.

16. Kartalou M, Essigmann JM. Mechanisms of resistance to

cisplatin. Mutat Res. 2001;478:23-43.

17. Rabik CA, Dolan ME. Molecular mechanisms of resistance

and toxicity associated with platinating agents. Cancer

31

Treat Rev. 2007;33:9-23.

18. Borst P, Rottenberg S, Jonker J. How do real tumors

become resistant to cisplatin?. Cell Cycle. 2008;7:1353-9.

19. Kim JK, Kim KD, Lee E, et al. Up-regulation of Bfl-1/A1

via NF-kappaB activation in cisplatin-resistant human

bladder cancer cell line. Cancer lett. 2004;212:61-70.

20. Lee E, Kim SW, Lee HW, et al. Change of chemosensitivity

and cellular characteristics of cisplatinum resistant human

bladder cancer cells induced by long-term cisplatinum

treatment. Korean J Urol. 1998;39:305-10.

21. Cho HJ, Kim JK, Kim KD, et al. Upregulation of Bcl-2 is

associated with cisplatin-resistance via inhibition of Bax

translocation in human bladder cancer cells. Cancer lett.

2006;237:56-66.

22. Yoon CY, Park MJ, Lee JS, et al. The histone deacetylase

inhibitor trichostatin A synergistically resensitizes a

cisplatin resistant human bladder cancer cell line. J Urol.

2011;185:1102-11.

23. Tamayo P, Slonim D, Mesirov J, et al. Interpreting patterns

32

of gene expression with self-organizing maps: methods and

application to hematopoietic differentiation. Proc Natl Acad

Sci U S A. 1999;96:2907-12.

24. Krege S, Rembrink V, Borgermann C, et al. Docetaxel and

ifosfamide as second line treatment for patients with

advanced or metastatic urothelial cancer after failure of

platinum chemotherapy: a phase 2 study. J Urol.

2001;165:67-71.

25. Carles J, Esteban E, Climent M, et al; Spanish Oncology

Genito Urinary Group Study Group. Gemcitabine and

oxaliplatin combination: a multicenter phase II trial in unfit

patients with locally advanced or metastatic urothelial

cancer. Ann Oncol. 2007;18:1359-62.

26. Kanai K, Kikuchi E, Ohigashi T, et al. Gembitabine and

paclitaxel chemotherapy for advanced urothelial carcinoma

in patients who have received prior cisplatin-based

chemotherapy. Int J Clin Oncol. 2008;13:510-4.

27. Bellmunt J, Theodore C, Demkov T, et al. Phase III trial of

vinflunine plus best supportive care compared with best

33

supportive care alone after a platinum-containing regimen

in patients with advanced transitional cell carcinoma of the

urothelial tract. J Clin Oncol. 2009;27:4454-61.

28. Yafi FA, North S, Kassouf W. First- and second-line

therapy for metastatic urothelial carcinoma of the bladder.

Curr Oncol. 2011;18:e25-34.

29. Chen W, Wang GM. Gene expression profiling of cancer

stem cells in the DU145 prostate cancer cell line. Oncol lett.

2012;3:791-6.

30. Talaat S, Somji S, Toni C, et al. Kindlin-2 expression in

arsenite- and cadmium-transformed bladder cancer cell

lines and in archival specimens of human bladder cancer.

Urol. 2011;77:1507.

31. Desarnaud F, Geck P, Parkin C, et al. Gene expression

profiling of the androgen independent prostate cancer cells

demonstrates complex mechanisms mediating resistance to

decetaxel. Cancer Biol Ther. 2011;11:204-12.

32. Shiota M, Tsunoda T, Song Y, et al. Enhanced S100

calcium-binding protein P expression sensitizes human

34

bladder cancer cells to cisplatin. BJU Int. 2011;107:1148-

53.

33. Choi MK, Kim DD. Platinum transporters and drug

resistance. Arch Pharm Res. 2006;29:1067-76.

34. Galluzzi L, Senovilla L, Vitale I, et al. Molecular mechanisms

of cisplatin resistance. Oncogene. 2012;31:1869-86.

35. Gosland M, Lum B, Schimmelpfennig J, et al. Insights into

mechanisms of cisplatin resistance and potential for its

clinical reversal. Pharmacotherapy. 1996;16:16-39.

36. Piulats JM, Jimenez L, Garcia del Muro X, et al. Molecular

mechanisms behind the resistance of cisplatin in germ cell

tumours. Clin Transl Oncol. 2009;11:780-6.

37. Saleem A, Ibrahim N, Patel M, et al. Mechanisms of

resistance in a human cell line exposed to sequential

topoisomerase poisoning. Cancer Res. 1997;57:5100-6.

38. Sasada T, Iwata S, Sato N, et al. Redox control of

resistance to cis-diamminedichloroplatinum (II) (CDDP):

protective effect of human thioredoxin against CDDP-

induced cytotoxicity. J Clin Invest. 1996;97:2268-76.

35

39. Miyake H, Hanada N, Nakamura H, et al. Overexpression of

Bcl-2 in bladder cancer cells inhibits apoptosis induced by

cisplatin and adenoviral-mediated p53 gene transfer.

Oncogene. 1998;16:933-43.

40. Cheng Q, Lee HH, Li Y, et al. Upregulation of Bcl-x and

Bfl-1 as a potential mechanism of chemoresistance, which

can be overcome by NF-kappaB inhibition. Oncogene.

2000;19:4936-40.

41. Taylor JK, Zhang QQ, Monia BP, et al. Inhibition of Bcl-xL

expression sensitizes normal human keratinocytes and

epithelial cells to apoptotic stimuli. Oncogene.

1999;18:4495-504.

42. Hockenbery D, Nunez G, Milliman C, et al. Bcl-2 is an inner

mitochondrial membrane protein that blocks programmed

cell death. Nature. 1990;348:334-6.

43. Kaufmann SH, Hengartner MO. Programmed cell death:

alive and well in the new millennium. Trends Cell Biol.

2001;11:526-34.

44. Thornberry NA, Lazebnik Y. Caspases: enemies within.

36

Science. 1998;281:1312-6.

45. Benchimol S. p53-dependent pathways of apoptosis. Cell

Death Differ. 2001;8:1049-51.

46. Hanus J, Kalinowska-Herok M, Widlak P. Identification of

novel putative regulators of the major apoptotic nuclease

DNA Fragmentation Factor. Acta Biochim Pol.

2010;57:521-7.

47. Ninios YP, Sekeri-Pataryas KE, Sourlingas TG. Histone H1

subtype preferences of DFF40 and possible nuclear

localization of DFF40/45 in normal and trichostatin A-

treated NB4 leukemic cells. Apoptosis. 2010;15:128-38.

48. Cramer Borde E, Ouzegdouh Y, Ledgerwood EC, et al.

Congenital thrombocytopenia and cytochrome C mutation: a

matter of birth and death. Semin Thromb Hemost.

2011;37:664-72.

49. Meyn RE, Stephens LC, Milas L. Programmed cell death and

radioresistance. Cancer Metastasis Rev. 1996;15:119-31.

50. Miyashita T, Reed JC. Bcl-2 oncoprotein blocks

chemotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell

37

line. Blood. 1993;81:151-7.

51. Kozar K, Sicinski P. Cell cycle progression without cyclin

D-CDK4 and cyclin D-CDK6 complexes. Cell Cycle.

2005;4:388-91.

52. Santamaria D, Ortega S. Cyclins and CDKS in development

and cancer: lessons from genetically modified mice. Front

Biosci. 2006;11:1164-88.

53. Golka K, Selinski S, Lehmann ML, et al. Genetic variants in

urinary bladder cancer: collective power of the ”wimp

SNPs”. Arch Toxicol. 2011;85:539-54.

54. Isobe T, Baba E, Arita S, et al. Human STEAP3 maintains

tumor growth under hypoferric condition. Exp Cell Res.

2011;17:2582-91.

55. Nowinska K, Dziegiel P. The role of MCM proteins in cell

proliferation and tumorigenesis. Postepy Hig Med Dosw

(Online). 2010;64:627-35.

56. Shigehara K, Sasagawa T, Kawaguchi S, et al. Etiologic role

of human papillomavirus infection in bladder carcinoma.

Cancer. 2011;117:2067-76.

38

57. Frohling S, Nakabayashi K, Scherer SW, et al. Mutation

analysis of the origin recognition complex subunit 5

(ORC5L) gene in adult patients with myeloid leukemiaa

exhibiting deletions of chromosome band 7q22. Hum Genet.

2001;108:304-9.

58. D’Angiolella V, Donato V, Forrester FM, et al. Cyclin F-

mediated degradation of ribonucleotide reductase M2

controls genome integrity and DNA repair. Cell.

2012;149:1023-34.

59. Zhang L, Zhou F, Li Y, et al. Fas-associated Factor 1 Is a

Scaffold Protein That Promotes beta-Transducin Repeat-

containing Protein (beta-TrCP)-mediated beta-Catenin

Ubiquitination and Degradation. J Biol Chem.

2012;287:30701-10.

60. Park KH, Choi SE, Eom M, et al. Down regulation of the

anaphase-promoting complex (APC)7 in invasive ductal

carcinomas of the breast and its clinicopathologic

relationships. Breast Cancer Res. 2005;7:R238-47.

39

Abstract

Introduction: The resistance mechanism to the cisplatin during

treatment of bladder cancer is one of the most investigated

subjects in clinical fields. In order to understand the resistance

mechanism, bladder cancer cell lines were used in a

combination of cDNA microarray and real-time PCR profiling to

investigate the expression of possible genes related to cisplatin

resistance.

Methods: The human bladder cancer cell line (T24) and the

preformed bladder cancer resistant cell line at 2.0μg/ml of

cisplatin (T24R2) were used for the cDNA microarray analysis

to define the different expressions of significant genes resistant

to cisplatin. Those significant genes were confirmed by real-

time PCR in T24R2. A fold change ≥2.0 with p-value <0.05 of

statistics was considered significant.

Results: A total of 18 significantly up-regulated genes were

detected from three selected cancer-related pathways

(apoptosis, p53 signaling pathway, cell cycle) in both the cDNA

microarray and the real-time PCR with fold change ≥2.0. They

are PRKAR2A, PRKAR2B, CYCS, Bcl-2, BIRC3, DFFB, CASP6,

40

CDK6, CCNE1, STEAP3, MCM7, ORC2, ORC5, ANAPC1,

ANAPC7, CDC7, CDC27, and SKP1 genes. Especially, the fold

changes of MCM7, Bcl-2, CYCS, and PRKAR2B were greater

than 4.0, suggesting high correlation with cisplatin resistance.

Conclusions: The total 18 gene expression profiles might be

proposed to play one of the key roles and candidates in the

resistance mechanism to cisplatin for bladder cancer.

--------------------------------------------------

Keywords: bladder cancer, cisplatin, drug resistance, cDNA

microarray, real time-PCR

Student number: 2007 – 23318