ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

ความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทรวบรวมจากจงหวดสพรรณบรและพนทใกลเคยงโดยใช

เครองหมายโมเลกลชนด SRAP

Genetic Diversity of Moringa oleifera Lam. Collected from Suphan Buri Province Using Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP) Marker s

โดย

นางสาวกาญจณา อรรคบตร

ควบคมและอนมตโดย

วนท............เดอน........................พ.ศ………... (ดร.บบผา คงสมย) วนท............เดอน........................พ.ศ………... (ดร.อญมณ อาวชานนท)

ความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทรวบรวมจากจงหวดสพรรณบรและพนทใกลเคยง

โดยใชเครองหมายโมเลกลชนด SRAP

นางสาวกาญจณา อรรคบตร

บทคดยอ

เพอศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมซงรวบรวมจากพนทจงหวดสพรรณบร ราชบร อางทอง สระบร และนครราชสมา เปรยบเทยบกบตวอยางมะรมทรวบรวมจากอนเดย และบาหล ประเทศอนโดนเซย รวมจ านวน 22 ตวอยาง โดยใชเครองหมายโมลกล Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP) โดยอาศยเทคนค PCR พบวา จาก 25 คไพรเมอร ม 13 คไพรเมอร ทใหความแตกตางของแถบของดเอนเอได 52 แถบ จากทงหมด 114 แถบ (เฉลย 8 แถบ/ไพรเมอร) แตเปนแถบของดเอนเอทมความแตกตางกน 52 แถบ (45.6 %) เมอศกษาความสมพนธทางพนธกรรม โดยใชวธ Unweighted pair group method with arithmetic averages (UPGMA) พบวา มความใกลชดทางพนธกรรมอยระหวาง 0.77- 0.94 ซงสามารถจดกลมตวอยางมะรมได 4 กลม คอ กลมท 1 คอ ตวอยางมะรมทรวบรวมจากจงหวดนครราชสมา สพรรณบร และสระบร กลมท 2 คอ ตวอยางมะรมทรวบรวมจากจงหวดสระบร ราชบร สพรรณบร และมะรมอนเดย กลมท 3 คอ ตวอยางมะรมทรวบรวมจากอนโดนเซย กลมท 4 คอตวอยางมะรมทรวบรวมจากจงหวดสพรรณบร และกลมทกระจายนอกกลมตวอยางมะรมอน ๆ (out group) คอ มะรมทรวบรวมจากจงหวดอางทอง และมะรมจากอนเดย โดยทกลมท 2 จากจงหวดราชบร และสพรรณบร มคาดชนความเหมอนกนมากทสด คอมคาเทากบ 0.94 ค าส าคญ : มะรม, ความหลากหลายทางพนธกรรม, SRAP ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา : ดร. บบผา คงสมย, ดร. อญมณ อาวชานนท ปทพมพ : 2555 จ านวนหนา : 24

Genetic Diversity of Moringa oleifera Lam. Collected from Suphan Buri Province and Neighboring Area Using Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP) Markers

Miss Kanchana Ackabut

Abstract

The genetic diversity among 22 samples of Moringa oleifera Lam. collected from Suphan Buri, Ang Thong, Ratchaburi, Saraburi, Nakhon Ratchasima province compared with those collected from India and Indonesia was investigated using SRAP-PCR technique. It was found that only 13 out of 25 primers produced 52 polymorphic bands (45.6%) from total of 114 bands (averaged 8 bands / primars). According to the genetic relationship among Moringa samples and cluster analysis using UPGMA, the similarity coefficient ranged from 0.77 to 0.94. It produced four groups with similarity coefficients of 0.83. The first group was the samples collected from Nakhon Ratchasima, Suphan Buri and Saraburi province. The second group was those collected from Ratchaburi, Saraburi, Suphan Buri province and India. The third group was those collected from Indonesia. The last group was those collected from Suphan Buri province. Clustering pattern revealed closely genetic relationship among Moringa of Suphan Buri and neighboring areas. However, the second groups from Ratchaburi and Suphan Buri tends to have the lowest genetic distance (0.94).

Key words : Drumstick, Moringa oleifera Lam., genetic diversity, SRAP Degree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture at Kamphaeng Sean, Kasetsart University Advisor : Buppa Kongsamai, Ph.D., Anyamanee Arvuchanon, Ph.D. Year : 2011 Page : 24

กตตกรรมประกาศ

ขอขอบพระคณทานอาจารย บบผา คงสมย อาจารยทปรกษาปญหาพเศษหลก และอาจารย อญมณ อาวชานนท อาจารยทปรกษาปญหาพเศษรวม เปนอยางยงทกรณาใหความร ค าปรกษา การคนควาวจย ตรวจเอกสาร ตลอดจนค าแนะน าในการเขยนรปเลมและแกไขจนส าเรจเปนรปเลมทสมบรณ รวมถงใหโอกาสและการสนบสนนดวยดตลอดมา และขอกราบขอบพระคณคณาจารยทไดอบรมใหความรตลอดมา ขอขอบคณ หองปฏบตการปรบปรงพนธพชและเทคโนโลยชวภาพ ภาควชาพชสวน คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทใหสถานทและอปกรณตางในการท าการทดลองในครงน ขอขอบคณ สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพเกษตรทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสนมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทสนบสนนเงนทนในการท าปญหาพเศษในครงน ขอขอบพระคณคณพอ คณแม นองชาย เพอนๆทคอยใหก าลงใจตลอดมา และผมสวนเกยวของทกทานทเปนแรงผลกดนใหปญหาพเศษส าเรจลลวงดวยดจนปญหาพเศษเลมนเสรจเปนรปเลมทสมบรณ กาญจณา อรรคบตร มนาคม 2555

สารบญ

หนา

สารบญ -1- สารบญตาราง -2-

สารบญภาพ -3-

ค าน า 1

วตถประสงค 2

ตรวจเอกสาร 3

อปกรณและวธการ 9

ผลการทดลอง 16

วจารณผลการทดลอง 19

สรปผลการทดลอง 20

เอกสารอางอง 21

สารบญตาราง

ตารางท หนา

1 ตวอยางมะรมทใชในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรม 9

จ านวน 22 ตวอยาง 2 ความเขมขน และปรมาณสารทใชในปฏกรยาพซอาร 12 3 ขนตอนของปฏกรยาพซอาร 12 4 แสดงไพรเมอร SRAP ทใชในการท าปฏกรยาพซอาร 13 5 จ านวนและขนาดแถบดเอนเอทไดจากการตรวจสอบลายพมพดเอน 17

เอมะรมดวยเทคนค SRAP โดยใช 13 คไพรเมอร

สารบญภาพ

ภาพท หนา

1 Dendrogram ของมะรม 22 ตวอยาง ทไดจากเทคนค SRAP ทมคา 18

Dice similarity coefficient เทากบ 0.83 แบงกลมมะรมออกเปน 4

กลม และม out group 2 กลม

ค าน า

มะรม (Moringa oleifera Lam.) จดอยในวงศ Moringaceae พบปลกทวไปในเขตรอน

และเขตกงรอนของโลก มถนก าเนดอยในบรเวณประเทศอนเดย ปากสถาน บงกลาเทศ และอฟกานสถาน และกระจายพนธไปยงภมภาคตาง ๆ ของโลก เชน ฟลปปนส กมพชา ทวปอเมรกา หมเกาะคารบเบยน รวมทงไทย ซงมการปลกไวในบรเวณบาน และพบไดทกภาคในประเทศไทย เนองจากมะรมเปนพชทสามารถใชประโยชนไดทงเปนอาหารและยา (Makkar and Becker, 1997; Foidl et al., 2001) สวนใบ ผล (ฝก) ดอก และผลออนของมะรมไดรบการจดใหเปนผกทมคณคาทางอาหารสง ปจจบนไดรบความนยมอยางสงในการน ามารบประทานเปนอาหารตานโรค หรอเปนผลตภณฑอาหารเสรม และมผลตภณฑใบมะรมจ าหนายอยางแพรหลายในรปแคปซล หรอชาชง เปนตน นอกจากนมะรมยงเปนไมยนตน โตเรว ทนแลง ปลกงายในเขตรอน ขยายพนธ ดวยการเพาะเมลดหรอการปกช ากง แตการปลกมะรมในเชงพาณชยในประเทศไทย รวมทงขาดขอมลเกยวกบพนธและความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมทปลกในประเทศยงมนอยมาก เครองหมายโมเลกลชนด SRAP (sequence related amplified polymorphism) ไดน ามาใชศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของพชหลายชนดอยางมประสทธภาพ เชน Pinus koraiensis (Feng et al., 2009) ลนจและล าไย (Jia et al., 2011) สบด า (Shen et al., 2010) พท แนคทารน (Riaz et al., 2004) และ ทบทม (Zhang et al. 2008) เปนตน

ดงนนในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมครงน จงเลอกใช เครองหมายโมเลกลชนด SRAP เนองจากเปนเทคนคทท าไดงาย สะดวก รวดเรว เพอใชเปนขอมลพนฐานทางพนธกรรมส าหรบการปรบปรงพนธมะรมในประเทศไทยตอไป

วตถประสงค

1. เพอศกษาความหลากหลายทางพนธกรรม (genetic diversity) ของมะรม โดยใชเครองหมายโมเลกลชนด SRAP

2. สรางลายพมพดเอนเอเพอศกษาและตรวจสอบพนธมะรมในกลมจงหวดสพรรณบร เปรยบเทยบ

กบจงหวดใกลเคยง และมะรมทรวบรวมจากประเทศอนเดย และประเทศอนโดนเซย โดยใชเครองหมายโมเลกลชนด SRAP

สถานทท าการทดลอง

1. แปลงทดลองภาควชาพชไรนา คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

2. หองปฏบตการปรบปรงพนธพชและเทคโนโลยชวภาพ ภาควชาพชสวน คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาท าการทดลอง

ระหวางเดอนตลาคม 2553 – เดอนสงหาคม 2554

ตรวจเอกสาร

ขอมลทวไปของมะรม (Horse radish tree)

มะรม (Moringa oleifera Lam.) จดอยในวงศ Moringaceae (สถาบนการแพทยแผนไทย

กรมการแพทย, 2542; Fahey, 2005) มชอพนเมองแตกตางกนไปตามภมภาคของประเทศไทย เชน ผกอ

ฮม ผกอฮม มะคอนกอม ผกเนอไก กาแนงเดง เสซอยะ บกอฮม มกรม รม และ บาคอนกอม (เตม, 2523)

มะรมเปนไมยนตนขนาดกลาง มถนก าเนดอยในบรเวณของประเทศอนเดย ปากสถาน บงกลาเทศ และ

อฟกานสถาน และแพรกระจายพนธไปยงเขตเอเชยตะวนเฉยงใต (ไทย ฟลปปนส กมพชา) ทวปอมรกา

หมเกาะคารบเบยน และหมเกาะแปซฟก (Mughul et al., 1999; Fahey, 2005)

มะรม เปนไมยนตนขนาดกลางเรอนยอดกลมและโปรง สามารถใชประโยชนทงทางดานอาหาร

และยา เปนไมยนตนทโตเรว ทนแลง ปลกงายในเขตรอน เจรญเตบโตไดดในดนทกประเภท ตองการน า

และความชนในปรมาณปานกลาง อาจมความสงตน 5-10 เมตร และออกดอก ตดฝก ภายในปแรกหลง

ปลก ใบเปนใบประกอบแบบขนนก แตกใบยอย 3 ชน ยาว 20 – 40 เซนตเมตร ออกเรยงแบบสลบ ใบยอย

ยาว 1 – 3 เซนตเมตร รปไข ปลายใบ และฐานใบมน ผวใบดานลางมสออนกวา และมขนเลกนอยขณะท

ใบยงออน ใบมรสหวานมน ออกดอกในฤดหนาว บางพนธออกดอกหลายครงในรอบป ดอกเปนดอกชอ ส

ขาว กลบดอกม 5 กลบแยกกน ดอกมรสขม หวาน มนเลกนอย ผลเปนฝกยาว เปลอกสเขยวมสวนคอด

และสวนมน เปนระยะตามยาวของฝก ฝกยาว 20 – 50 เซนตเมตร ฝกมรสหวาน เมลดเปนรปสามเหลยม

มปกบางหม 3 ปก เสนผานศนยกลางของเมลดประมาณ 1 ซม. (สถาบนการแพทยแผนไทย กรมการ

แพทย, 2542)

คณคาทางอาหารและพฤกษเคม

มรายงานการคนควาและวจยทางชวเคมและทางการแพทย พบวาทกสวนของตนมะรมสามารถ

น ามาใชเปนยาไดในการรกษาสขภาพได เชน ใชรกษาโรคขาดอาหารในเดกแรกเกด สารอาหารส าคญจะ

ผานเขาสทารกโดยการดมน านมมารดาทรบประทานมะรมสม าเสมอ และชวยเพมแคลเซยมใหมารดา

อยางด ใบมะรมอดมไปดวย วตามนและแรธาต เชน Carotenoids (beta carotene หรอ Provitamin A)

Ascorbic acid (vitamin C), α-tocopherol, flavonoids, phenolics แคลเซยม เหลก โพแทสเซยม และ

โปรตน (Makkar and Becker, 1996; Fahey, 2005) บรโภคใบไดทงในรปใบสด ปรงเปนอาหาร หรอผง

แหง เพอใชรกษาโรคลกปดลกเปด และโรคเยอเมอกอกเสบ ใบต าเปนยาพอกแผลได ระยะใบกอนออก

ดอก จะให Carotenoids และ Ascorbic acid สงกวาระยะการเจรญเตบโตอน ๆ

ดอกเปนยาบ ารงขบน าตาลและขบปสสาวะ เมลดมรสขมใชเปนยาแกไข น ามนจากเมลดทาแก

โรคปวดตามขอ เมลดเมอน ามาบบจะใหน ามน ทมชอทางการคาวา Ben หรอ Behenoil ใชเปนอาหาร จด

ตะเกยง ใชในเครองส าอาง กากทเหลอใชท าป ย เปลอกรากมสารอลคาลอยด 2 ชนดคอ meringine และ

meringinine ซง meringinine มฤทธท าใหความดนสง หวใจเตนแรง น าคนจากใบมฤทธฆาเชอ

Micrococcus pyogenes var. aureus, Escherichia coli, Bacillus เปนตน (กรมวชาการเกษตร, 2548;

Fahey, 2005

มะรมเปนพชมหศจรรย มคณคาทางโภชนาการสงสด กลาวถงในคมภรใบเบลวาเปนพชทรกษา

ทกโรค ใบมะรมมโปรตนสงกวานมสด 2 เทา การกนใบมะรมตามชนบทของประเทศก าลงพฒนาและ

ประเทศโลกท 3 เปนการเพมโปรตนคณภาพสงราคาถกใหกบอาหารพนบาน นอกจากน มะรมมธาต

อาหารปรมาณสงเปนพเศษทชวยปองกนโรค นนคอวตามนเอ บ ารงสายตามมากกวาแครอท 3 เทา

วตามนซ ชวยปองกนหวด 7 เทาของสม แคลเซยม บ ารงกระดกเกน 3 เทาของนมสด โพแทสเซยม บ ารง

สมองและระบบประสาท 3 เทาของกลวย ใยอาหารและพลงงาน ไมสงมากเหมาะกบผ ทควบคมน าหนก

อกดวย น ามนสกดจากเมลดมะรมมองคประกอบคลายน ามนมะกอกดตอสขภาพอยาง ยง (สธาทพ,

2550)

มะรม มสารพฤกษเคม (phytochemistry) หลายชนด เชน glucosinolates, isothiocyanates,

alkaloids (moringine และ moringinine), flavonoids (kaemferol, rhamnetin, isoquercitrin และ

kaempferitrin), -sitosterol ซงสารเหลานลวนมฤทธทางชวภาพทนาสนใจ เชน ลดความดน

(antihypertensive) ลดไขมนในเสนเลอด แกปวดเกรงในชองทอง รกษาแผลในทางเดนอาหาร ปองกนตบ

ตานแบคทเรยและรา ตานเนองอก ตานมะเรง เปนตน

นอกจากน Jansakul et al., 199 รายงานการคนพบสาร Nitrile, mustard oil glycosides และ

thiocarbamate glycosides ซงสกดแยกไดจากใบมะรม มฤทธลดระดบความดนโลหต ซงสารทพบใน

กลมนทงหมดเปนสารในกลม glycosides ทผานปฏกรยา acetylation และพบปรมาณนอยในธรรมชาต

แตมความส าคญทางเภสชวทยา และเมอท าการสกดใบมะรมดวยตวท าละลาย ethanol และแยก

สารส าคญ จากสารสกดดงกลาว พบวา ไดสารบรสทธ 4 ชนด ไดแก niazinin A, niazinin B, niazimicin

และ niazinin A+B ซงทงหมดแสดงฤทธลดความดนโลหตในหนทดลอง

การศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมดวยเครองหมายโมเลกล (DNA markers)

การตรวจสอบโพลมอรฟซมของดเอนเอ ท าไดโดยการหาล าดบเบสในโมเลกลของดเอนเอ (DNA sequencing) หรอตรวจสอบโดยใชเครองหมายดเอนเอ การใชดเอนเอเปนเครองหมายบงบอกความแตกตางของสงมชวต มทมาจากการตรวจลายพมพดเอนเอ (DNA fingerprinting) ซงเปนวธการทท าใหเกดลายพมพหรอแบบแผนของดเอนเอทจ าเพาะ สามารถตรวจสอบรปแบบความแตกตางหรอโพลมอรฟซมได วธศกษาเครองหมายดเอนเอทใชตรวจสอบความหลากหลายทางพนธกรรม ไดแก วธไฮบรไดเซชน (hybridization) และวธเพมปรมาณดเอนเอโดยเทคนคพซอาร (polymerase chain reaction; PCR) (สรนทร, 2552)

การตรวจลายพมพดเอนเอโดย วธไฮบรไดเซชน คอ การน าดเอนเอทสกดจากเซลลมาตดดวยเอนไซมตดจ าเพาะ แลวแยกขนาดดเอนเอดวยวธอเลกโทรโฟรซส จากนนยายดเอนเอลงสแผนฟลเตอร แลวไฮบรไดซกบโพรบทตดฉลากดวยสารกมมนตรงสหรอสารปลอดรงส ตรวจสอบผลทเกดขน โดยจะปรากฏแถบทมลกษณะเฉพาะในแตละพนธ (วารน, 2545) เชน เทคนค RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

การตรวจลายพมพดเอนเอโดยวธ PCR (PCR-base DNA fingerprinting) เปนวธเพมปรมาณดเอนเอโดยเทคนคพซอาร เปนการเพมปรมาณดเอนเอเปาหมายใหไดปรมาณมากขนเปนหลายเทาในเวลาอนรวดเรว เปนเทคนคทคนพบโดย Saiki et al. (1985) ทประยกตวธการมาจากการเพมปรมาณดเอนเอในสงมชวต (DNA replication) โดยอาศยการท างานของเอนไซมดเอนเอโพลเมอรเรส (DNA polymerase) ชนดททนความรอนสงได ประกอบดวยการปฏกรยา PCR ในแตละรอบจะประกอบดวย 3 ขนตอน ไดแก denaturing ท าใหดเอนเอสายคแยกเปนสายเดยว โดยเกดทอณหภมสงประมาณ 90 –95 องศาเซลเซยส annealing ไพรเมอร 2 สาย เขาไปจบกบคสมบนดเอนเอสายเดยวทเปนตนแบบ เกดท

อณหภม 35 - 60 องศาเซลเซยส และ extension การตอล าดบนวคลโอไทปเขาทปลาย 3'OH ของไพรเมอรโดยใชเอนไซม Taq DNA polymerase ซงตองการอณหภมพอเหมาะท 72 องศาเซลเซยส เมอท าซจ านวนหลายรอบท าใหมการเพมดเอนเอจากเดมไดอยางทวคณแบบ exponentialโดยมจ านวน PCR product ไดเทากบ 2 n (n = จ านวนรอบ) ซงวธ PCR มหลายเทคนคโดยดดแปลงใหเหมาะสมกบความตองการ (วนตชาญ, 2540; วารน, 2545) ดเอนเอเครองหมายทอาศยเทคนค PCR ไดแก เทคนค RAPD (random amplified polymorphic DNA), SSR (simple seguence repeat) หรอ microsatellite, ISSR ( Inter-simple sequence repeat), AFLP (amplified fragment length polymorphism) และ SRAP (sequence related amplified polymorphism)

Muluvi et al. (1999) จากการใชเทคนค AFLP marker (amplified fragment length polymorphism) วเคราะหลกษณะทางพนธกรรมของ 7 ประชากร และจากเทคนค AFLP marker (Pst I/MseI) พบวาม 4 คไพรเมอรจากทงหมด 236 Amplification ซงคดเปน 157 หรอ 66.5 เปอรเซนต มาวเคราะหความแปรปรวนในระดบโมเลกลพบวา ใหความแตกตางกนระหวางประชากรหรอภายในประชากร ถงแมวาจะมการผสมขามสายพนธแตกเปนไมยนตนทคาดวานาจะรกษารปแบบไวไดมากทสดภายในประชากร

SRAP เปนเครองหมายโมเลกลทพฒนาขนโดย Li and Quiros (2001) โดยออกแบบไพรเมอร 2 ชนด ชนด forward มขนาด 17 เบส ทประกอบดวยล าดบเบสแกน (core sequence) ทเหมอนกนยาว 14 เบส เปนสวนของล าดบเบสทไมมอะไรพเศษเรยกวา filler ยาว 10 เบส ตอดวยเบส CCGG เพอใหจบไดกบสวน exon หรอ ORF ซงมกเปนบรเวณทมองคประกอบของเบสเปน GC สง (GC rich) ตรงปลาย 3’ ของไพรเมอรเปนเบสคดเลอก (selective base) อก 3 เบส ทเปลยนแปลงได โดยอาศยหลกการเดยวกบไพรเมอรของเครองหมายเอเอฟแอลพ สวน reverse มขนาด 18 เบส ประกอบดวยล าดบเบสแกนทเหมอนกนยาว 15 เบส เปนสวน filler ยาว 11 เบส ตอดวยเบส AATT เพอใหจบไดกบดเอนเอในจโนมบรเวณ AT สง ซงมกพบในสวน intron และโพรโมเตอรของยนตรงปลาย 3’ ของไพรเมอรเปนเบสคดเลอกทเปลยนแปลงไดอก 3 เบส การเพมปรมาณดเอนเอตวอยางใชวธ step up PCR คอ ใชอณหภม annealing ต าท 35 องศาเซลเซยส 5 รอบเพอใหไพรเมอรจบกบดเอนเอเปาหมายไดดแลวจงเพมอณหภมใหสงขนตามปกตอก 30-35 รอบ เพอใหเกดการเพมปรมาณดเอนเอเฉพาะสวนทมาจาก 5 รอบแรกเทานน ท าใหผลทไดมความคงทหลงจากนนตรวจสอบผลดวยเจลพอลอะครลาไมด ผลทไดจะพบวาสามารถเพมปรมาณดเอนเอไดหลายต าแหนงพรอมกน โดยการปรากฏหรอไมปรากฏแถบดเอนเอ (สรนทร, 2552)

วารน (2545) ท าการตรวจสอบลายพมพดเอนเอของยางกราด ยางพลวง และลกผสมดวยเทคนค SRAP รวมกบการศกษาสณฐานวทยา พบวา สามารถแบงตวอยางออกเปน 3 กลม ไดแก กลมยางกราด กลมยางพลวง และกลมยางทคาดวาเปนลกผสม ซงทง 3 กลม มความแตกตางทางพนธกรรมกนอยางชดเจน จงคาดวายางทง 3 กลมเปนคนละชนดกน นฤมล (2547) ใชเทคนค SRAP ในการสรางลายพมพดเอนเอของ ยคาลปตสคามาลดเลนซส (Eucalyptus camaldulensis) ยคาลปตสเทเรทคอรนส (E. tereticarnis) และยคาลปตสลกผสมระหวางสปชสทงสอง พบวาเทคนคนสามารถสรางลายพมพดเอนเอทจ าเพาะตอ ยคาลปตสไดทกตวอยาง และแถบดเอนเอทแตกตางกนน ยงสามารถใชในการตรวจสอบลกผสมระหวาง สปชสได Li and Quiros (2001) ไดท าการเปรยบเทยบระหวางเทคนค SRAP marker และ AFLP marker ในการท าแผนทยนเพอตดตามยน GLS-ALK และหาล าดบเบสในลกผสมระหวางสายพนธดงเดมและสายพนธทเปน double haploidของ Brassica oleracea L. พบวา SRAP marker จะครอบคลมสวนตางๆของยโนมไดกวางและท าการทดลองซ าไดผลคงเดม เมอน ามาท าการหาแผนทยนจะพบวา 20% ของแถบทเกดขนเปนแบบ co-dominant ซงเปนขอไดเปรยบ AFLP marker จากนนท าการคดเลอกแถบดเอนเอไปหาล าดบเบสพบวา 60% ของล าดบเบสทหาไดจะมความคลายคลงกบล าดบเบสของยนใน Genebank Ferriol et al. (2003) น าตวอยางของ Cucurbita pepo จ านวน 69 ตวอยาง ทมความหลากหลายทาพนธกรรมและสณฐานวทยา มาทดสอบโดยใชเทคนค SRAP และ AFLP พบวา สามารถแยกตวอยางทตางชนดยอยกนไดทง 2 เทคนค และพบวาความสมพนธทางพนธกรรมทไดจากเทคนค SRAP ความสอดคลองกบลกษณะทางสณฐานวทยามากกวาเทคนค AFLP Budak et al. (2004) ใชเทคนค SRAP ในการศกษาความหลากหลายของหญาbuffalograss ในอเมรกาเหนอจ านวน 53 accession พบวาเปนเทคนคทมประสทธภาพในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมและจดกลมของหญา buffalograss ได 4 กลม ซงเปนไปตามระดบของยโนม Ferriol et al. (2004) จากการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมจ านวน 250 ตวอยาง ของ Cucurbita moschata ทมถนก าเนดตางกน 4 แหง โดยใชเทคนค SRAP และ AFLP พบวา ทงสอง

เทคนคสามารถจดกลมตวอยางจากความสมพนธทางพนธกรรมไดสอดคลองกบถนก าเนดของตวอยางทน ามาศกษา โดยเทคนค SRAP สามารถแยกความแตกตางไดชดเจนกวาเทคนค AFLP Kaur et al. (2004) ใชเทคนค SRAP ในการวเคราะหความหลากหลายทางพนธกรรมของBrassica rapa จ านวน 19 พนธ ซงมความทนทานตอธาตโบรอนแตกตางกน โบรอนเปนธาตอาหารรอง (micro nutrient) ทจ าเปนส าหรบการเจรญเตบโตของพช แตถามมากเกนพอจะเปนพษตอพชได จากการศกษา B. rapa พนธทมความทนทานตอธาตโบรอน พบวามกลไกการก าจดธาตโบรอนสวนเกนออกจากราก สวนพนธทไมตานทานไมสามารถก าจดธาตโบรอนไดหรอก าจดไดนอย เมอศกษาความแตกตางทางพนธกรรมโดยใชเทคนค SRAP พบวาจากการเพมปรมาณดเอนเอโดยใชไพรเมอร 15 ค มไพรเมอร 14 คทใหความแตกตางของแถบดเอนเอทงหมด 128 แถบเมอน าขอมลมาสราง phylogenetic tree สามารถแบงกลม B. rapa พนธทมความตานทานและไมตานทานตอธาตโบรอนออกจากกนได ท าใหสามารถคดเลอกคผสมของพอแม เพอสรางประชากรทใชส าหรบท าแผนทยนทตานทานตอธาตโบรอนตอไป

อปกรณและวธการ

อปกรณ

1. ตวอยางมะรมทใชในการทดลอง

ตวอยางมะรมทน ามาใชในการทดลองมทงหมด 22 ตวอยาง จากจงหวดอางทอง สระบร นครราชสมา ราชบร สพรรณบร ตวอยางมะรมจากอนเดย และ อนโดนเซย โดยก าหนดชอตวอยางทรวบรวมเปนชอจงหวดและหมายเลขล าดบการเกบ ดงแสดงในตารางท 1 ตารางท1 ตวอยางมะรมทใชในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรม จ านวน 22 ตวอยาง แหลงทมา จ านวน รหสตวอยาง นครราชสมา 1 MR 004 อางทอง 1 MR 095 สระบร 2 MR 008, MR 009 ราชบร 4 MR 068, MR 071, MR 072,MR 080 สพรรณบร 9 MR 040, MR 043, MR 045, MR 085,MR 086,

MR091,MR 094, MR 096, MR 098 มะรมอนเดย 3 MR 002, MR 103, MR 106

มะรมอนโดนเซย 2 MR 104, MR 105

รวม 22

วธการ

1. การเกบตวอยางใบมะรมเพอสกดดเอนเอ น าเมลดพนธมะรมทงหมด 22 ตวอยาง ปลกทดสอบเพอศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมโดยใช SRAP marker โดยรดน า ใสป ย ก าจดวชพช และฉดพนสารเคมปองกนโรคและแมลงตามความเหมาะสม ปลกระยะเวลา 3-4 เดอน เกบตวอยางใบมะรมบนสดของตน เนองจากเปนใบออนท าใหไดด

เอนเอปรมาณมากและคณภาพสง สามารถบดดวยไนโตรเจนเหลวไดงาย รบน าใสในถงพลาสตก แชในน าแขงทนท แลวน าไปสกดดเอนเอหากยงไมสกดใหเกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส

2. การสกดดเอนเอ

เตรยมดเอนเอจากใบออนมะรม โดยตดใบมะรม แลวน ามาสกดดเอนเอทนท ดงน น าใบออน 2-3 กรม ตดเปนชนเลก ๆ ใสลงในโกรง เตมไนโตรเจนเหลวใหทวม และบดในไนโตรเจนเหลวใหละเอยดจนเปนผงแปง น าตวอยางทบดแลวใสลงในหลอดเซนตรฟวจขนาด 1.5 มลลลตร ทม (2X CTAB buffer 600 ไมโครลตร และ 2-mercaptoethanol 200 ไมโครลตร) ปรมาตร 600 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยเขยาแรงๆ น าไปบมทอณหภม 60 องศาเซลเซยส นาน 60 นาท เขยาโดยกลบหลอดไปมา 2-3 ครงทกๆ 10 นาท บมทอณหภมหอง นาน 5 นาท เตม chloroform: isoamyl alcohol (24 : 1) 600 ไมโครลตร ผสมใหเขากน โดยกลบหลอดไปมาเบาๆ 2-3 ครง ปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท ดดของเหลวใสสวนบนปรมาตร 450 ไมโครลตรใสในหลอดเซนตรฟวจใหมทเตม NaCl 5 ไมโครลตร และเตม isopropanol ปรมาณ 450 ไมโครลตร หรอ 2 ใน 3 เทาของปรมาณของเหลวทมอยผสมใหเขากนเบาๆ บมทอณหภม -20 องศาเซลเซยส นาน 30 นาท ปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน 10 นาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส เทสารละลายใสสวนบนทง ปลอยตะกอนใหแหงในอากาศทอณหภมหองนาน 10 นาท ละลายตะกอนใน RNaseA 300 ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส ขามคน เตม phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) ปรมาณ 500 ไมโครลตร เขยาเบาๆแลวน าไปปนเหวยงทอณหภม 4 องศาเซลเซยสแรงเหวยง 13,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท ดดสวนใสดานบน ปรมาตร 450 ไมโครลตร ใสในหลอดเซนตรฟวจหลอดใหม สกดดวย chloroform: isoamyl alcohol (24 : 1) 450 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน15 นาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส ดดสารละลายใส ปรมาตร 300 ไมโครลตร ใสในหลอดใหมทเตม CH3COONa และ absolute ethanol ปรมาณ 600 ไมโครลตร หรอ 2 เทาของปรมาณของเหลวทมอย และบมทอณหภม -20 องศาเซลเซยส นาน 30-60 นาท ปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท อณหภม 4 องศาเซลเซยส ลางตะกอนดวยเอธานอล 70 เปอรเซนต ปรมาตร 300 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เทสวนใสทง ปลอยใหแหงในอากาศ ละลายตะกอนดวย TE buffer ปรมาตร 60 ไมโครลตร เกบดเอนเอทอณหภม -20 องศาเซลเซยสจนกวาจะใชตอไป

3. การตรวจสอบคณภาพดเอนเอ

1.1 การวดปรมาณและคณภาพของสารละลายดเอนเอ วดจากคาการดดกลนแสง

1.1.1 น าสารละลายดเอนเอทละลายอยใน TE buffer 2 ไมโครลตร เจอจางในน า dH2O 98 ไมโครลตร โดยใช dH2O เปนมาตรฐาน (blank)

1.1.2 วดคาการดดกลนแสงของสารละลายดเอนเอทเจอจางแลวทความยาวคลน 260 นาโน

เมตร และ 280 นาโนเมตร น าผลทไดมาค านวณความเขมขนของสารละลายดเอนเอจากสตรดงน

ความเขมขนของดเอนเอ (µg/ml) = A260 x 50 x (50 µl)

1.1.3 ตรวจสอบคณภาพโดยดอตราสวนของคา A260/A280 คาทไดมคาระหวาง 1.8-2.0 แสดงวาดเอนเอทสกดไดนนเปนดเอนเอเกลยวคบรสทธ ถาไดคานอยกวา 1.8 แสดงวามโปรตนปะปนอยในสารละลาย ถาคาทค านวณไดมากกวา 2.0 แสดงวาในสารละลายดเอนเอมอารเอนเอปน

1.2 การวเคราะห และแยกขนาดดเอนเอโดยวธอะกาโรสเจลอเลคโทรโฟรซส ชงผงอะกาโรส 1 กรม ใสลงในบฟเฟอร 1XTBE 100 มลลลตร ละลายผงอะกาโรสดวยความรอนใหละลาย เทลงในพมพใหเจลหนาประมาณ 3-5 มลลเมตร ปลอยใหอะกาโรสเยนลงจนแขงตวทอณหภมหอง โดยใชเวลาประมาณ 30 นาท ผสมสารละลายดเอนเอกบ 6x loading buffer ปรมาตร 1 ไมโครลตร ใชสารละลาบดเอนเอ 3 ไมโครลตร และน า 2 ไมโครลตร แลวหยอดลงในชองเจลทเตรยมไว ปดฝาเครองและเปดกระแสไฟฟาใหวงผานขวลบไปขวบวก โดยใชกระแสไฟฟา 100 โวลต ประมาณ 30 นาท เมอสโหลดเคลอนทไปไดในระยะทางทเหมาะสมจงปดกระแส ไฟฟา น าแผนเจลไปยอมในสารละลายเอธเดยมโบรไมด นาน 10-15 นาท ลางแผนเจลดวยน าเปลา 5 นาท น าแผนเจลไปสองดภายใตแสงอลตราไวโอเลตบนทกภาพ

4. การสรางลายพมพดเอนเอโดยวธ SRAP

ในการศกษาลายพมพดเอนเอดวยเทคนค SRAP โดยการเพมปรมาณดเอนเอมะรมตวอยางดวยวธพซอาร (PCR) ซงมสวนประกอบ คอ ตารางท2 ความเขมขนและปรมาณสารทใชในปฏกรยาพซอาร

สารทใช ปรมาณ (µl)

DNA template (50ng/µl) 2 10x PCR buffer 2 forward primer (5 pmole) 1 reverse primer (5 pmole) 1 dNTP (2 mM) 2 MgCl2 (25 mM) 1 Taq polymerase 0.2 น า(dH2O) 10.8

รวม 20

ตารางท3 ขนตอนของปฏกรยาพซอาร

ขนตอน อณหภม (oซ) เวลา (นาท)

Pre – denaturation 94 3

Denaturation 94 1

Annealing 47 1

Extension 72 1

final extension 72 5

ตารางท4 แสดงไพรเมอร SRAP ทใชในการท าปฏกรยาพซอาร

รหส Forward primers รหส Reverse primers

Me1 5´-TGAGTCCAAACCGGATA-3´ Em1 5´-GACTGCGTACGAATTAAT-3´ Me2 5´-TGAGTCCAAACCGGAGC-3´ Em2 5´-GACTGCGTACGAATTTGC-3´ Me3 5´-TGAGTCCAAACCGGAAT-3´ Em3 5´-GACTGCGTACGAATTGAC-3´ Me4 5´-TGAGTCCAAACCGGACC-3´ Em4 5´-GACTGCGTACGAATTTGA-3´ Me5 5´-TGAGTCCAAACCGGAAG-3´ Em5 5´-GACTGCGTACGAATTGCA-3´

5. ตรวจสอบดเอนเอดวย denaturing polyacrylamide gel electrophoresis

a. การเตรยมกระจกส าหรบเทเจล

น าแผนกระจกส าหรบเตรยมเจลมาลางใหสะอาด แลวเชดดวยเอธานอล 95 เปอรเซนตใหสะอาดทง 2 แผน กระจกแผนหนา ทมลกษณะเปนหกระตายเชดดวย clear view ใหทวเพอไมใหเจลเกาะตดกระจก ปลอยใหแหงประมาณ 5-10 นาท เชดกระจกแผนหลงดวย Glass bond (Adherent coating)เพอใหเจลตดกบกระจก น ากระจกทง 2 แผนมาประกอบเขาชดโดยวาง spacer ไวทงสองขาง เพอใหเกดชองวางระหวางกระจกทงสองโดยหนดานททา bind silane และ repel silane เขาหากน ใชกระดาษกาวตดดานขางใหแนน ใชคลปหนบยดใหอยคงท

b. เตรยมเจลโพลอะครลาไมด เตรยมเจลโพลอะครลาไมดปรมาตร 30 มลลลตร ดงน ชงยเรย 13.5 กรม ใสน ากลน 8.5

มลลลตร และ 5xTBE buffer 6 มลลลตร ผสมสารละลายในบกเกอรคอยๆ เขยาใหยเรยละลายหมดท

อณหภม 60 องศาเซลเซยส หรอน าไปอน 10 วนาท แลวเตมอะครลาไมด 30 เปอรเซนต 4.5 มลลลตร

10% APS (ammonium persulfate) ปรมาตร 400 ไมโครลตร และ N,N,N´,N´-tetramethylenediamine

(TEMED) ปรมาตร 20 ไมโครลตร ผสมใหเขากนอยางรวดเรว เทเจลลงในชองระหวางกระจกจนเตมระวง

อยาใหเกดฟองอากาศแลวใสหวเขาดานบนปลอยใหเจล แขงตวประมาณ 2 ชวโมง

c. การท าอเลคโทรโฟรซส น าสารละลายดเอนเอในมา 5 ไมโครลตร น ามาเตม AFLP loading buffer จ านวน 3 ไมโครลตร น าไปบม ทอณหภม 90 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท แลวแชในน าแขงทนทพรอมส าหรบท าอเลคโทรโฟรซส เมอเจลเขงตวแลวใชน าประปาลางดานนอก ดงหวออก ประกอบกระจกเขากบเครองอเลคโทรโฟรซส แลวเตม 1X TBE buffer ลงในชองดานบนและดานลาง ตอสายไฟเขากบเครองอเลคโทรโฟรซส เปดกระแสไฟฟา 295 โวลต ท า prerun เปนเวลา 30 นาท หลงจากนนปดเครอง ใชเขมฉดยาดดบฟเฟอรมาลางยเรยทอยในชองหวแตละชองออกใหหมด หยอดตวอยางดเอนเอทเตรยมไวลงในแตละชองจากนนเปดเครองอเลคโทรโฟรซสโดยใชแรงเคลอนไฟฟา 295 โวลต เปนเวลา 2-3 ชวโมง หรอจนกวาส xylene cyanol (สบน) จะเคลอนทลงมา 2 ใน 3 สวนของเจล เมอครบเวลาปดเครอง ดดบฟเฟอรจากชองดานบนออก น ากระจกออกจากเครอง แยกกระจกทง 2 แผนออกจากกนเจลจะตดอยกบกระจกแผนหลงทเปนสเหลยมตรง น าเจลไปยอมดวยสารละลายซลเวอรไนเตรท

d. การตรวจสอบลายพมพดเอนเอดวยสารละลายซลเวอรไนเตรท น าแผนกระจกทมเจลตดอยมาลางในน า(dH2O) เปนเวลา 5 นาท พรอมกบเขยาเบาๆ น าไปแชในสารละลาย CTAB ความเขมขน 0.1 เปอรเซนต (CTAB 0.25 กรม,dH2O 250 มลลลตร) เปนเวลา 30 นาท พรอมเขยาเบาๆอยางตอเนอง แลวแชแผนเจลในสารละลายแอมโมเนยความเขมขน 0.3 เปอรเซนต(0.3% ammonium 750 ไมโครลตร, dH2O 250 มลลลตร) เปนเวลา 15 นาท โดยเขยาตลอดเวลา หลงจากนนแชแผนเจลในสารละลายซลเวอรทเตรยมใหมๆ เปนเวลา 20 นาท โดยเขยาอยางสม าเสมอ (ชงซลเวอรไนเตรท 0.4 กรม เตมน า (dH2O) 250 มลลลตร และโซเดยม ไฮดรอกไซดความเขมขน 1 โมลาร 1 มลลลตร ปนใหละลายจะไดสารละลายขนสน าตาลคอยๆ เตมสารละลายแอมโมเนยเขมขน 25 เปอรเซนต 1500 ไมโครลตร โดยคอยๆ เตมทละหยดจนสารละลายใสจงเพมอก 2 หยด) แลวน าแผนเจลออกมาลางน า(dH2O) 200 มลลลตร 2 ครง อยางรวดเรวแลวน าแผนเจลมาใสในสารละลาย developer ทเตรยมใหมๆ และแชเยนทอณหภม 10 องศาเซลเซยส เขยาสม า เสมอจนกวาจะเหนแถบดเอนเอชดเจน (สารละลาย developer ประกอบดวย sodium carbonate 2 เปอรเซนต 5 กรม, dH2O 250 มลลลตร ปนใหละลายแลวน าไปแชเยน และ เตม formaldehyde 0.02 เปอรเซนต 50 ไมโครลตร หลงจากน าออกมาจากแชเยนแลว) จากนนน าแผนเจลมาลางในน า (dH2O) เพอหยดปฏกรยา ผงใหแหงในอากาศ

e. การวเคราะหผลดวยโปรแกรมคอมพวเตอร จากลายพมพดเอนเอของมะรมทงหมด 22 ตวอยางทไดจากการตรวจสอบโดยเทคนค Specific- PCR SRAP น าขอมลมาวเคราะหความสมพนธทางพนธกรรม โดยเปรยบเทยบแถบดเอนเอทต าแหนงเดยวกนของมะรมทกตวอยาง ถามแถบดเอนเอใหสญลกษณ 1 ถาไมมแถบดเอนเอใหสญลกษณ 0 แลวน าขอมลทไดมาวเคราะหคาดชนความเหมอน (Dice similarity coefficient) จดกลมตวอยาง ดวยโปรแกรม NTSYS – pc รน 2.01e และสรางแผนภาพความสมพนธทางพนธกรรม ดวยวธ UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average) แสดงผลในรปแบบของphylogenetic tree

ผลการทดลอง

การวเคราะหลายพมพดเอนเอดวยเทคนค SRAP จากการท าปฏกรยา PCR ท าการตรวจหาลายพมพดเอนเอของมะรมจากจงหวดสพรรณบร เปรยบเทยบกบจงหวดใกลเคยง และมะรมทรวบรวมจากประเทศอนเดย และประเทศอนโดนเซย จ านวน 22 ตวอยาง โดยการเพมปรมาณดเอนเอมะรมดวยเทคนค SRAP โดยใชไพรเมอร 25 คไพรเมอร พบวามเพยง 13 คไพรเมอร ไดแก S1, S2, S3, S4, S8, S9, S10, S15, S16, S17, S19, S21 และ S22 ทสามารถเพมปรมาณชนสวนดเอนเอและแสดงแถบโพลมอรฟซมของมะรมไดเปนจ านวนมาก ซงสามารถตรวจสอบแถบดเอนเอทใหความแตกตางในประชากร (polymorphic band) ได 52 แถบ จากทงหมด 114 แถบ เฉลย 8 แถบตอหนงคไพรเมอร และมคา polymorphic band เทากบ 45.6 เปอรเซนต ทใหแถบดเอนเอแตกตางกนตงแต 2- 6 แถบ ซงจากคา polymorphic primer จ านวน 13 ค มคาเทากบ 52 เปอรเซนต แสดงใหเหนวาขอมลทไดจากการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมโดยเครองหมาย SRAP นนอยในระดบปานกลาง โดยคไพรเมอรทใหแถบดเอนเอทแตกตางจ านวนมากทสด คอ S3 มจ านวน 6 แถบ และแถบดเอนเอทแตกตางจ านวนนอยทสด คอ S10, S16, S21 มจ านวน 2 แถบ (ตารางท 4 )

เมอน าขอมลทไดจากการเปรยบเทยบวา ถามแถบแบนดเอนเอทต าแหนงเดยวกนของมะรมทกตวอยาง ก าหนดเปน “1” ถาไมมแถบดเอนเอก าหนดเปน “0” แลวน าขอมลทไดมาวเคราะหความสมพนธในรปของดชนความเหมอน (Dice similarity coefficient) ดวยโปรแกรม NTSYS – pc รน 2.01e โดยวธ unweighted pair group method using arithmetic average (UPGMA) แสดงผลในรปแบบของphylogenetic tree พบวา ความสมพนธของมะรม 22 ตวอยาง มคา similarity coefficient เทากบ 0.83 ซงสามารถแบงมะรมออกเปน 4 กลม และม out group 2 ตวอยาง คอ กลมท 1 คอตวอยางมะรมทรวบรวมจากจงหวดนครราชสมา สพรรณบร และสระบร (MR 004, MR 043, MR 008) กลมท 2 คอตวอยางมะรมทรวบรวมจากจงหวดสระบร ราชบร สพรรณบร และมะรมอนเดย (MR 009, MR 071, MR 098, MR 072, MR 080, MR 040, MR 086, MR 068, MR 085, MR 091, MR 094, MR 0103 และ MR 002) โดยตวอยางมะรม MR 071 และ MR 098 มคาดชนความเหมอนสงถง 0.94 อาจเปนไปไดวาตวอยางมะรมสองตวอยางนอาจจะเปนพนธเดยวกนหรอมบรรพบรษรวมกนมากอน โดยอาจน าไปปลกยงพนททอยใกลเคยง กลมท 3 คอตวอยางมะรมทรวบรวมจากอนโดนเซย (Bali) (MR 104 และ MR 105) กลมท 4 คอตวอยางมะรมทรวบรวมจากจงหวดสพรรณบร (MR 045 และ MR 096) และตวอยางมะรมทถกจดออกมาเปน out group คอ มะรมทรวบรวมจากจงหวดอางทอง และมะรมจากอนเดย (MR 095

และ MR 106) (ภาพท 1) แสดงใหเหนวา มะรมอนเดยและมะรมอนโดนเซยมฐานพนธกรรมแตกตางจากมะรมของไทย ขณะทมะรมของไทยมฐานพนธกรรมแคบ เมอพจารณาจากคาสมประสทธความเหมอนและ phylogenetic tree (ภาพท 1) ตารางท4 จ านวนและขนาดแถบดเอนเอทไดจากการตรวจสอบลายพมพดเอนเอมะรมดวย เทคนค SRAP โดยใช 13 คไพรเมอร

รหส คไพรเมอร จ านวนแถบดเอนเอ ทงหมด (แถบ)

จ านวนแถบดเอนเอ ทแตกตาง (แถบ)

S1 ME1EM1 6 5 S2 ME1EM2 12 4 S3 ME2EM1 13 6 S4 ME2EM2 6 5 S8 ME2EM3 12 5 S9 ME2EM4 7 5 S10 ME2EM5 8 2 S15 ME4EM2 6 3 S16 ME5EM2 8 2 S17 ME3EM3 8 4 S19 ME3EM5 8 5 S21 ME4EM4 11 2 S22 ME4EM5 9 4

ผลรวม 114 45.6 %

ภาพท1 Dendrogram ของมะรม 22 ตวอยาง ทไดจากเทคนค SRAP ทมคา Dice similarity coefficient เทากบ 0.83 แบงกลมมะรมออกเปน 4 กลม และม out group 2 ตวอยาง

out group

out group

กลมท4

กลมท3

กลมท2

กลมท1

วจารณผลการทดลอง จากการศกษาความสมพนธทางพนธกรรมโดยการท าปฏกรยา PCR ซงใชเทคนค SRAP ใชไพรเมอรจ านวน 25 คไพรเมอร พบวามเพยง 13 คไพรเมอร ทมแถบดเอนเอปรากฏ ซงสามารถแบงมะรมออกเปน 4 กลม และม out group 2 ตวอยาง ซงมะรมทรวบรวมจากจงหวดสพรรณบร เปรยบเทยบกบจงหวดใกลเคยง และมะรมทรวบรวมจากประเทศอนเดย และประเทศอนโดนเซย พบวามความหลากหลายทางพนธกรรมต า จากการทดลองในครงนใหผลการทดลองแตกตางจากการทดลองของ AVRDC (2003) ทศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรม จ านวน 27 accessions ทรวบรวมจากประเทศไทย ฟลปปนส ทนซาเนย อนเดย มาลงเก อฟรกา โดยใชเครองหมายโมเลกล RAPD พบวา สามารถจดแบงกลมมะรมออกเปน 4 กลม และมะรมทรวบรวมจากประเทศไทย สามารถจดใหอยในกลมเดยวกน และมความหลากหลายทางพนธกรรมสง และมแนวโนมทจะน ามาใชในการคดเลอกสายพนธทดกวามะรมทท าการรวบรวมจากประเทศอนๆ จากการทดลองนใชไพรเมอรจ านวน 25 คไพรเมอร พบวามเพยง 13 คไพรเมอร เทานนทแสดงแถบดเอนเอทแตกตางกน เพอใหไดผลการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมทชดเจนมากยงขน ควรเพมดวยการศกษาดวยเครองหมายดเอนเอทมความเฉพาะเจาะจง เชน เทคนค AFLP RAPD และ SSR หรอเทคนคอนๆ ทเกยวของ ซงเปนการเพมความละเอยดของขอมลความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรม และในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมน ควรรวบรวมสายพนธของมะรมจากแหลงตางๆ เพมขน เพอสามารถน าไปใชประโยชนในการปรบปรงพนตอไป

สรปผลการทดลอง การศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะรมจ านวน 22 ตวอยาง ดวยเทคนค sequence related amplified polymorphism (SRAP) โดยใชไพรเมอรจ านวน 25 คไพรเมอร และพบวามเพยง 13 คไพรเมอร ทสามารถตรวจสอบความแตกตางระหวางตวอยางของมะรมทท าการเกบรวบรวมจากจงหวดอางทอง จงหวดสระบร จงหวดนครราชศรมา จงหวดราชบร จงหวดสพรรณบร มะรมจากประเทศอนเดยและ อนโดนเซย พบวาใหความแตกตางกนของแถบดเอนเอของมะรมไดจ านวน 52 (45.6%) แถบ จากทงหมด 114 แถบ (เฉลย 8 แถบ/ไพรเมอร) ซงมความหลากหลายทางพนธกรรมระดบต า เมอน ามาวเคราะหขอมลดวยวธ UPGMA พบวา มคาสมประสทธความเหมอนระหวาง 0.77- 0.94 โดยมคาสมประสทธความเหมอน (similarity coefficient) เทากบ 0.83 และสามารถจ าแนกสายพนธมะรมออกเปน 4 กลม และม out group 2 ตวอยาง คอ กลมท 1 คอตวอยางมะรมทรวบรวมจากจงหวดนครราชสมา สพรรณบร และสระบร กลมท 2 คอตวอยางมะรมทรวบรวมจากจงหวดสระบร ราชบร สพรรณบร และมะรมอนเดย กลมท 3 คอตวอยางมะรมทรวบรวมจากอนโดนเซย (Bali) และตวอยางมะรมทถกจดออกมาเปน out group คอ มะรมทรวบรวมจากจงหวดอางทอง และมะรมจากอนเดย

เอกสารอางอง

กรมวชาการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ. 2548. ผกพนเมอง : เฉลมพระเกยตรสมเดจพระเทพ รตนราชสดาฯ สยามบรมราชกมาร 50 พรรษา 2 เมษายน 2548. โรงพมพชมนมสหกรณ การเกษตรแหงประเทศไทย. กรงเทพฯ. 74-75 น.

เตม มตนนทน. 2523. ชอพรรณไมแหงประเทศไทย (ชอพฤกษศาสตร-ชอพนเมอง). กรมปาไม หนา 379.

นฤมล ธนานนต. 2547. การตรวจสอบยคาลปตสดวยเครองหมายดเอนเอและการถายยน HAL2 เขาสยคาลปตสลกผสม Eucalyptus camaldulensis x E. tereticornis. วทยานพนธปรญญา เอก, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. มะลวลย กอสกล. 2546. ความผนแปรของสณฐานวทยา กายวภาควทยาและรปแบบดเอนเอของ หมอน. วทยานพนธปรญญาโท. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ . วารน วรรณประโพธ. 2545. การใชลายพมพดเอนเอตรวจสอบยางตราด ยางพวงและยางทคาดวาเปน ลกผสม. วทยานพนธปรญญาโท. มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ . สถาบนการแพทยแผนไทย กรมการแพทย กระทรวงสาธารณสข. 2542 ผกพนบานภาคเหนอ. โรงพมพ องคการสงเคราะหทหารผานศก. กรงเทพฯ. 189 น. สธาทพ ภมรประวต. 2550. มะรมลอดไขมน ปองกนมะเรง. นตยสารหมอชาวบาน. 29 (338) : 28-32 สรนทร ปยะโชคณากล. 2552. เครองหมายดเอนเอ: จากพนฐานสการประยกต. ส านกพมพ มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. สมวงษ ตระกลรง. 2540. Molecular marker technology, น. 122 - 129. ใน เอกสารประกอบการ ฝกอบรมเชงปฏบตการ National Training Course on “Crop Improvement by Using Mutation Technique and Biotechnology” 10-14 พฤศจกายน 2540. มหาวทยาลย เกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

วนตชาญ รนใจชน. 2540. การใชเทคนค RAPD ในการจดจ าแนกและตรวจหาเครองหมายทาง พนธกรรมของสายพนธหญาแฝกในประเทศไทย. วทยานพนธปรญญาโท. มหาวทยาลเกษตร ศาสตร, กรงเทพฯ . Budak, H., R.C. Shearman, I. Parmaksiz, R.E. Gaussoin, T.P. Riordan and I. Dweikat. 2004. Molecular characterization of Buffalograss germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers. Theor. Appl. Genet. 108: 328–334. Fahey, J.W. 2005. Moringa oleifera: A Review of the Medical Evidence for Its Nutritional, Therapeutic, and Prophylactic Properties. Part 1. Trees of life Journal [Online] www.TFLJournal.org (March 3, 2012).

Feng, F., M. Chen, D. Zhang, X. Sui and S. Han. 2009. Application of SRAP in the genetic diversity of Pinus koraiensis of different provenances African Journal of Biotechnology Vol. 8 (6), pp. 1000-1008

Ferriol, M., B. Pico and F. Nuez. 2003. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers. Theor. Appl. Genet. 107: 271-282.

_______, P. F. de Cordova and F. Nuez. 2004. Molecular diversity of a germplasm collection of squash (Cucurbita moschata) determined by SRAP and AFLP markers. Crop Sci. 44: 653-664. Foidl, N., H.P.S. Makkar and K. Becker, 2001. The Potential use of Moringa Oleifera for Agriculture and Industrial uses. In: The Miracle Tree/The Multiple Attributes of Moringa oleifera. Fuglie, L.J. (Ed.). CTA, USA Jansakul C., Wun-Noi A., Croft K. and Byrne L. 1997. Pharmacological studies of thiocarbamate glycosides isolated from Moringa oleifera. J. Sci. Soc. Thailand 23 : 335 - 346.

Jia, F., L. Wu, and B. Qiu (2011), Seasonal modulation of eddy kinetic energy and its formation mechanism in the southeast Indian Ocean, J. Phys. Oceanogr., in press. Kaur, S., R. Ford, M. Nicolas, R. Norton and P. W.J. Taylor. 2004. Selection of parents for studying B tolerance in Brassica rapa. New directions for a diverse planet: Proceedings for the 4th International Crop Science Congress. Available Source: http://www.cropscience.org.au/icsc2004, March 21, 2006. Li, G. and C.F. Quiros. 2001. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet. 103: 455-461.

Makkar HPS. and Becker K. 1996. Nutritional value and antinutritional components of whole and ethanol extracted Moringa oleifera leaves. Anim Feed Sci Technol 63: 211-228. Mughul MH, Ali G, Srivastava PS, Iqbal M. 1999. Improvement of drumstick (Moringa pterygosperma Gaertn.) - a unique source of food and medicine through tissue culture. Hamdard Med 42: 37-42. Muluvi.G. M, J. I. Sprent, N. Soranzo, J. Provan, D. Odee, G. Folkard, J. W. McNicol, W. Powell. 1999. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis of genetic variation in Moringa oleifera Lam. Molecular Ecology . 8: 463–470 Riaz, A., D. Potter and M. Stephen. 2004. Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRAP molecular markers. Am. Soc. Hort. Sci. 129: 204-211. Riaz, A., G. Li, Z. Quresh, M.S. Swati and C.F. Quiros. 2001. Genetic diversity of oilseed Brassica napus inbred lines based on sequence related amplified polymorphism (SRAP) and it’s relation to hybrid performance. Plant Breed. 120(5): 411-415. Riaz, S., G.S. Dangl, K.J. Edwards, and C.P. Meredith. 2004. A microsatellite marker based framework linkage map of Vitis vinifera L. Theor. Appl. Genet. 108:864-872.

Saiki, R.K., S. Scharf, A. Faloona, K.B. Mullis, G.T. Horn, H.A. Erlich and N. Arnheim. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354. Shen, J. , Gerard, L., & Bowyer, J. (2010). Getting from Here to There: The Roles of Policy Makers and Principals in Increasing Science Teacher Quality. Journal of Science Teacher Education, 21, 283-307 Williams, J.G.K., A.R. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski and S.V. Tingey. 1990. DNA Polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl. Acids Res. 18: 6531-6535. Mughul MH, Ali G, Srivastava PS, Iqbal M. 1999. Improvement of drumstick (Moringa pterygosperma Gaertn.) - a unique source of food and medicine through tissue culture. Hamdard Med 42: 37-42. Zhang, N. R., Wildermuth, M. C. and Speed, T. R. (2008). Supplement to “Transcription factor binding site prediction with multivariate gene expression data.” DOI:, 10.1214/07AOAS142SUPP. Zhang, S.P., L.J. Wang, S.Y. Cao and T. Liu. 2008. Analysis of genetic diversity of 23 pomegranate genotypes by SRAP, J. Fruit Sci. 25(5): 655-660. Zhou, J., J. Fu, Z. Wu, S. Huang, Y. Zhang, Y. Wang, Y. Hu, G. Hu and C. Liu. 2011. Genetic diversity in litchi and longan germplasm as determined by SRAP markers. Acta. Hort. 918 :799-806.