giardia lamblia en muestras biológicas de población...
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Iquique N° 14-285 y YaguachiTeléfono: 022568041 - 022552715 – 0984103688www.investigacionsalud.gob.ecJulio del 2017
1ER CONGRESO INTERNACIONAL DE GENETICA MÉDICA y 1ER
CONGRESO DE BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA SALUD
Estandarización y validación de la técnica de Multiplex PCR para la
investigación de Ascaris lumbricoides, Strongyloides stercoralis y
Giardia lamblia en muestras biológicas de población infantil en
Pichincha, Ecuador.
• El diagnóstico molecular por Multiplex PCR permitió detectar tres parásitos simultáneamente Giardia lamblia,Strongyloides stercoralis/venezuelensis y Ascaris lumbricoides/suum.
• El análisis de muestras biológicas validó la técnica y mostró su reproducibilidad en el diagnóstico molecular.• La implementación de pruebas moleculares representa un gran avance en el diagnóstico de las parasitosis
desatendidas en el Ecuador.
METODOLOGÍA
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1. Controles de Parásitos
2. Extracción de ADN
MagaZorb® DNA Mini-Prep Kit – Promegautiliza perlas magnéticas
3. Cuantificación por Espectrofotometría y Electroforesis
4. Multiplex PCR
El parasitismo intestinal es un problema de salud pública queafecta principalmente a la población infantil de estratos socio-económico bajos; causa deficiencia en el aprendizaje, falta decrecimiento y de desarrollo en los niños, quienes son los másvulnerables1,2,3. Las parasitosis que trasmiten los helmintos Ascarislumbricoides y Strongyloides stercoralis y el protozoario Giardialamblia, son de fácil difusión debido a malas condicioneshigiénicas4,5.Los inconvenientes en el diagnóstico correcto y oportuno de lasparasitosis ha hecho necesario el desarrollo de técnicas dediagnóstico molecular con mayor sensibilidad y especificidad enrelación a las técnicas microscópicas que siguen siendo las pruebasestándar para algunos parásitos7,8,9.
La PCR Múltiplex permite amplificar fragmentos de ADN diana dedistintos parásitos en una misma reacción de PCR, reduceconsiderablemente el esfuerzo y tiempo del diagnóstico y garantizaun elevado porcentaje de fiabilidad10. En este estudio seestandarizó y validó la técnica de Multiplex PCR para lainvestigación simultánea de estos tres parásitos en heces de niñosde educación básica, de la parroquia Quitumbe, Pichincha.
INTRODUCCIÓN
RESULTADOS
Rodríguez M1, Morey G2,3, Aguilar F1, Salazar J1, Guerrero S4, Ruano AL1,5,.1 Programa PROPAD. Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública INSPI.
2 Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública INSPI.3 Universidad de Guayaquil UG
4 Universidad De Las Américas UDLA
5 Consejo de Evaluación, Acreditación y Aseguramiento de la Calidad de la Educación Superior CEAACES
CONCLUSIONES
Pruebas Moleculares
[email protected]@ug.edu.ec
Fig.1 Electroforesis de productos de Multiplex PCR corridos en gel de agarosa al 2%teñido con SYBR SAFE (1uL/10uL Gel). MPM: Marcador de peso Molecular (100pb). GI:Control Positivo de Giardia lamblia (63 pb); ST: Control Positivo de Strongyloidesstercoralis/venezuelensis (101 pb); AS: Control Positivo de Ascaris lumbricoides/suum(192 pb). M: Control de la Multiplex. C-: Control negativo.
5. Validación de la técnica
Temperaturas y tiempos de ciclado para la amplificación de las regiones de ADN especificas de losparasitos: Ascaris lumbricoides/suum, Strongyloides stercoralis/venezuelenzis, Giardia lamblia.
Fuente: Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Disponible en: https://www.cdc.gov/parasites/whipworm/biology.html
Fig. 3 Electroforesis de productos de Multiplex PCR corridos en gel de agarosa al 2%teñido con SYBR SAFE (1uL/10uL Gel). MPM: Marcador de peso Molecular (100pb).M+: Control Positivo de Multiplex PCR de Giardia lamblia (63 pb), Strongyloidesstercoralis/venezuelensis (101 pb) y Ascaris lumbricoides/suum (192 pb). NTC: NoTemplate Control. C-: Control negativo de extracción de ADN. A. 1547-1582:Muestras biológicas. B. 1612-1626: Muestras biológicas.
• La estandarización de la multiplex PCR permitió la amplificación de los segmentos de ADN esperados: Giardialamblia (63 pb); Strongyloides stercoralis/venezuelensis (101 pb) y Ascaris lumbricoides/suum (192 pb).
• El límite de detección de la Multiplex PCR fue de 0,5 ng/µL de ADN.• La Multiplex PCR detectó dos muestras positivas para Giardia lamblia de un total de 30 muestras de heces
analizadas, que representan: Giardia lamblia (6%) Ascaris lumbricoides (0%) y Strongyloides stercoralis (0%).
Cuantificación por espectrofotometría de concentraciónde ADN utilizando equipo NanoDrop2000C
Electroforesis en geles de agarosa al 2%, utilizando Bluejuice loading buffer 10x
Strongyloides stercoralis Ascaris lumbricoides Giardia lamblia
Nombre Secuencia (5’-3’)Gen Blanco
pb
Temperatura
alineamientoCiclos MgCl2 Parasito
AsCoiF GGAGGTTTTTGGGTCTTTGG
Cox1
19258°C 40 3 mM Ascaris suum/lumbricoides
AsCoi CCAAACAAGGTAGCCAACCA
Stro 18S-1530F GAATTCCAAGTAAACGTAAGTCATTAGC
SSU rRNA
10160°C 30 2 mM
Strongyloides
venezuelensis/stercoralis
Stro 18S-1630R TGCCTCTGGATATTGCTCAGTTC
Gd-80F GACGGCTCAGGACAACGGTT
18S rRNA
6360°C 30 2,5 mM Giardia lamblia
Gd-127R TTGCCAGCGGTGTCCG
Temperatura Tiempo Ciclos
Denaturación inicial 95°C 5 min 1
Denaturación 95°C 45 sec
35Hibridación 58°C* 45 sec
Extensión 72°C 45 sec
Extensión Final 72°C 5 min 1
Almacenamiento 4°C ∞
Fig.2 Electroforesis de productos de Multiplex PCR corridos en gel de agarosa al 2%teñido con SYBR SAFE (1uL/10uL Gel). MM: Marcador de peso Molecular (100pb). C-:Control negativo. Gia+: Control Positivo de Giardia lamblia (63 pb); Str+: ControlPositivo de Strongyloides stercoralis/venezuelensis (101 pb); Asc+: Control Positivo deAscaris lumbricoides/suum (192 pb). S/D: Dilución Estándar de Multiplex PCR (50ng/µL ADN). 1/10: Dilución 1:10 del Estándar de Multiplex PCR (5 ng/µL ADN). 1/100:Dilución 1:100 del Estándar de Multiplex PCR (0,5 ng/µL ADN). 1/1000: Dilución1:1000 del Estándar de Multiplex PCR (0,05 ng/µL ADN). 1/10000: Dilución 1:10000del Estándar de Multiplex PCR (0,005 ng/µL ADN). 1/100000: Dilución 1:100000 delEstándar de Multiplex PCR (5 pg/µL ADN).
Muestras biológicas de heces recolectadas en Quitumbe y conservadas en etanol al 70%
B