guia de laboratorio extraccion dna

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UNIVERSIDAD DE PAMPLONA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR MARTHA GRISELDA FLOREZ RANGEL Ph.D GUIA DE LABORATORIO 1. EXTRACCION DE ADN Las tcnicas bsicas de biologa molecular y bioqumica permiten aislar molculas de (DNA, RNA y protenas) a partir de clulas. El poder de la biologa molecular procede de la utilizacin combinada de procedimientos genticos in vivo y de los bioqumicos in vitro. La era de oro de la biologa molecular se estableci una vez fue posible aislar segmentos especficos de DNA que representaban genes individuales. La extraccin de ADN de una muestra celular, permite realizar estudios de caracterizacin y estudios de expresin de los genes de inters utilizando diversas tcnicas de Biologa Molecular y con el uso de enzimas, sondas, o primes adecuado. La extraccin del ADN en general consta de una fase inicial de lisis celular (lisozima o detergentes), precipitacin y purificacin del DNA con alcohol, solventes desnaturalizantes y RNAsa para la remocin del RNA. Materiales y equipos: Incubadora, centrfuga, eppendorfs de 1.5 ml, micropipetas y puntas desechables. Reactivos: Medio LB (Luria Bertani ), Solucin I, Solucin II, Solucin III, etanol al 70%, etanol al 90%, TE pH 8.0. (la preparacin de los reactivos se encuentran en anexo ) PROTOCOLO (SAMBROOK, 1989) 1.1 EXTRACCION DNA PLASMIDICO 1. Dejar las cepas bacterianas en crecimiento desde la noche anterior, a 28C de temperatura y 125 r.p.m. en medio LB lquido (16h). Dispensar 1.5 ml de cada una de ellas en tubos eppendorf, agitando antes de servir. Centrifugar a 12000 r.p.m. 1.5 ml de la suspensin bacteriana por 1-3 minutos. (El procedimiento puede realizarse dos veces para as obtener el pellet de 3ml de solucin bacteriana). 2. Descartar sobrenadante y resuspender el pellet bacteriano en 100 ml de la solucin I.


3. Adicionar 200ml de solucin II. 4. Tapar, mezclar suavemente (10 inversiones mximo) e incubar de 0-4C durante 10 minutos. 5. Adicionar 150ml de la solucin III. Incubar de 0-4C durante 10. Centrifugar a 12000 r.p.m. por 5 min. 6. Transferir el sobrenadante a otro tubo eppendorf previamente marcado. Adicionar 1 ml de Etanol absoluto, mezclar bien, e incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar por 5 minutos a 12000 r.p.m. a temperatura ambiente. 7. Cuidadosamente descartar el sobrenadante e invertir el tubo abierto sobre una toalla de papel para secar el pellet. Lavar el pellet 2 veces con 1 ml de Etanol al 70% y Centrifugar a 12000rpm por 5 minutos. 8. Disolver el pellet en 50ml de TE a pH 8.0 agua. Adicionar 1ml de RNAsa (10 mg/ml) y mezclar e incubar a 37C por 15 min. 9. Adicionar 5ml de Acetato de sodio 3M y 137 ml de etanol absoluto. Incubar de 5-10 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 12000 r.p.m. por 5 min. 10. Lavar el pellet con 1 ml Etanol al 70%. Centrifugacin a 12000rpm por 5 minutos, descartar sobrenadante y secar. Disolver el pellet en 50ml de TE. 1.2 EXTRACCION DE DNA GENOMICO A APRTIR DE SANGRE PERIFERICA TOTAL (TECNICA SALTING OUT).

Una protena tiene mltiples grupos acido-base, lo que hace sus propiedades de solubilidad dependiente de la concentracin de sal, polaridad del solvente, pH, y temperatura. Diferentes protenas tiene diferentes propiedades de solubilidad, por lo que cuando una protena es soluble otras precipitan.

La solubilidad de una protena es sensible a la concentracin de sal, la concentracin de sal se expresa en trminos de fuerza inica (I= Sci Zi2). La solubilidad de una protena a baja fuerza inica generalmente aumenta con la concentracin de sal. El salting in es el fenmeno por el cual la concentracin de sal aumenta la solubilidad de la protena. A altas fuerzas inicas, la solubilidad de las protenas disminuye, este fenmeno es conocido como salting out. Este fenmeno se da bsicamente por la competencia por las molculas de agua que forman parte de la capa de solvatacin


En este mtodo se utiliza un buffer que contiene proteinasa K (tris-HCl, pH 8.3, Tween 20, nonidet p40, proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solucin los cidos nucleicos. El paso siguiente consiste en la precipitacin de los cidos nucleicos, ya que el ADN presente en soluciones con alta concentracin de sales de acetato sdico puede precipitarse mediante la adicin de alcohol etlico a dichas soluciones.

1. Adicionar a un tubo eppendorf de 2l, 500l de muestra de sangre perifrica total anticuagulada con EDTA.

2. Adicionar 1500l de solucin de lisis de rojos 3. Balancear e invertir suavemente el tubo de sangre hasta que est

completamente mezclada. 4. Centrifugar a 14500 rpm durante tres minutos. 5. Remover y descartar tanto el sobrenadante como sea posible, sin

mover el pellet blanco visible. Se recomienda el uso de bomba de vacio para la succin del sobrenadante por medio de una punta estril.

6. Adicionar 500l de solucin de lisis nuclear al tubo con clulas resuspendidas y 333 l de solucin de precipitado de protenas, luego aplique vortex hasta que desaparezca el botn.

7. Centrifugar a 14500 rpm durante tres minutos. Debe verse un pequeo pellet de protena caf oscuro.

8. Se transfiere el sobrenadante a un tubo de microcentrifuga de 2ml con 600l de isopropanol frio.

9. Mezclar suavemente por inversin del tubo hasta que el DNA sea visible.

10. Centrifugar a 14500 rpm durante tres minutos. El DNA debe ser visible en un pequeo pellet.

11. Realizar sucesivos lavados con etanol absoluto y etanol al 70%. 12. Por ltimo se decanta el etanol, se invierte el tubo sobre un pao

absorbente y se deja secar. 13. Adicionar solucin rehidratante al tubo de acuerdo a la cantidad de

DNA obtenido.


2. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS 2.1 EN GELES DE AGAROSA La electroforesis es una tcnica analtica de separacin de macromolculas. La separacin tiene lugar debido a la diferente movilidad que presentan las macromolculas cargadas cuando son sometidas a la influencia de un campo elctrico como consecuencia de su relacin carga/masa. Los cidos nucleicos son macromolculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La naturaleza del enlace fosfodister de las cadenas polinucleotdicas condiciona la carga de un cido nucleico, que es aproximadamente igual al nmero de grupos fosfato. La electroforesis en geles de agarosa se realiza en cubetas apropiadas, generalmente horizontales, y requiere dos elementos indispensables: la fase mvil y la fase estacionaria. La fase mvil es el medio amortiguado que permite la movilidad de las molculas cargadas hacia los electrodos correspondientes cuando se genera un campo elctrico. La fase estacionaria o soporte, es un polmero de naturaleza gelatinosa con un tamao de poro homogneo que se haya sumergido y embebido en la fase mvil. El polmero utilizado para el anlisis electrofortico de cidos nucleicos de gran tamao (100pb-10kb) es la agarosa. La migracin de los fragmentos de cidos nucleicos (ADN o ARN) en un gel de agarosa sometido a un campo elctrico depende tanto del voltaje del campo, como del tamao de poro del gel de agarosa. La separacin efectiva de los fragmentos de ADN o ARN (resolucin) depende tanto de la masa como de la carga de los distintos fragmentos, en realidad de la relacin carga/masa. Transcurrida la electroforesis, la localizacin relativa de los fragmentos se determina mediante distintos mtodos de deteccin. La tincin con bromuro de etidio, una sonda fluorescente tras iluminacin con luz UV, es un mtodo generalizado de deteccin de fragmentos de ADN, ya que la sonda se intercala entre la doble hlice de ADN y emite luz.


METODOLOGIA Materiales y Equipos: Cmara de Electroforesis HORIZONTAL, peines, fuente de poder, micropipetas, puntas, eppendorf Reactivos: Agarosa, buffer 5X TBE, bromuro de Etidio PROTOCOLO: Preparar un gel de agarosa de 1.0%. Para ello, pesar 0.5 g de agarosa en un papel de pesada, aadir 50 ml de buffer TBE y llevar a ebullicin. Dejar enfriar la disolucin hasta aproximadamente 50 C en un bao de agua a esa temperatura. Verter la disolucin de agarosa en el molde apropiado, sellado por los extremos y con el peine puesto. Dejar polimerizar (20 min. Aproximadamente). Mientras se polimeriza, preparar 1 litro de tampn TBE 1X. Una vez polimerizado el gel, llenar la cubeta de electroforesis con tampn 1X y quitar el peine con cuidado de no romper los pocillos. Llenar tambin un pocillo con 5 l de estndares de peso molecular, y las muestras a analizar con su buffer de carga. Aplicar la fuente de corriente, y correr la electroforesis a 120 V durante una hora. Finalizada la electroforesis, sumergir el gel en una disolucin de bromuro de etidio0.5 g/ml por 15 30 minutos y se destie por 15 30 minutos en agua. Visualizar el resultado con un transiluminador en una cmara oscura, tomando las precauciones adecuadas (guantes de ltex, gafas o pantalla protectora), ya que se trata de un compuesto txico por inhalacin y por contacto, debido a su fuerte carcter mutagnico y teratognico 2.2 METODO SDS POLYACRILAMIDA La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada el tamao del poro. Se utiliza para evaluar DNAs de pequeo tamao y para estudio de protenas.


BIBLIOGRAFIA: Brown T. A. 2002. Genomes. 2nd edition. Bios Scientific, Oxford, United Kingdom. Griffitbs A.J.F., Gelbart W.M., Lewontin R.C., y Miller J. H. 2002. Modern genetic analysis. 2nd edition. W.H. Freeman, New York. Sambrook J. y Russel D. W. 2001. Molecular cloning: A laboratoly manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Watson J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levine M., Losick R. 2006. Biologia Molecular del Gen. 5a edicin. Editorial medica Panamericana. Espaa. www.pubmed.com http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/ggongora/parte1a.htm http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Odontologia/Odo-Practica05.htm www.ucm.es/info/genetica/AVG/problemas/Rflp174.htm www.odnavaiaescola.com/spanish/enzimasspn.html REACTIVOS Y SOLUCIONES PARA BIOLOGIA MOLECULAR Medio de cultivo Luria-Bertani (LB): Hidrolizado enzimtico de caseina 1, Cloruro de sodio 0.5, Extracto de levadura 0.5. Ajustado el pH a 7.2 7.4 y autoclavado a 121C por 25 minutos y en caso de ser necesario solidificado con Bactoagar Oxoid 1.2 %. Adems, de los antibiticos necesarios para la seleccin de la bacteria. SOLUCIONES SOLUCIN DE LSIS (I): TRIS-HCl pH 8.0 25mM, EDTA pH 8.0 10 mM, Glucosa 50mM. Volumen: 100 ml SOLUCIN ALCALINA (II): SDS 1%, NaOH 0.2N SOLUCIN SALINA (III): Acetato de potasio pH 5.0 5M


TRIS-HCl 1M pH 7,65: Volumen 1 litro. Tris base 121,11 g. Ajustar pH a 7,65 con HCl (~4 ml) Agua delionizada c.s.p. 1000 ml. Autoclavar TRIS-HCl 1M pH 8,0: Volumen 1 litro. Tris base 121,11 g. Ajustar pH a 8,0 con HCl (~42 ml). Agua desionizada c.s.p. 1000 ml. Autoclavar TRIS-HCl 1M pH 7,5. Volumen 100 ml. Tris base 12,11 g. Ajustar pH a 7,5 con HCl (~5,0 ml). Agua desionizada c.s.p. 100 ml. Autoclavar EDTA 0,5 M pH 8,0: Volumen 50 ml. EDTA 9,305 g (PM = 372,22). Ajustar pH 8,0 (con NaOH concentrado hasta disolver, despus de la disolucin, ajustar pH 8,0). Agua desionizada c.s.p. 50 ml. Autoclavar y alicuotar NaCl 5,0 M: Volumen 100 ml. NaCl 29,22 g. Agua desionizada c.s.p. 100 ml. Autoclavar MgCl2 5,0 M: MgCl2.6H20 20,33 g, Agua desionizada c.s.p. 100 ml. Autoclavar SDS 10% (Sodio dodecil sulfato-libre de nucleasas) Volumen 10 ml. SDS 1 g. Calentar a 68 C para disolver y ajustar a pH 7,2 con HCl diludo. Agua desionizada c.s.p. 5 ml. OBSERVACIONES: Usar mscara para pesar el SDS (Irritante para las mucosas) BROMURO DE ETIDIO (Mutagnico) 10 mg/ml. (Usar mscaras y guantes, y pesar en cabina con extractor de gases). Volumen 10 ml. Bromuro de etidio 100 mg. c.s.p. 10 ml con agua desionizada estril. Agitar hasta disolucin. Almacenar en la oscuridad a 4o C NaOH 1 M* Volumen 100 ml. NaOH 4g c.s.p. 100 ml con agua desionizada estril * Almacenar en frasco plstico Acetato de Sodio 3 M pH 5,2: Volumen 100 ml. Acetato de sodio.3 H2O 40,81g. Ajustar pH 5,2 con cido actico glacial. c.s.p. 100 ml con agua desionizada. Autoclavar TE (Low) pH 8,0 ( Tris HCl pH 8,0 10 mM / EDTA pH 8,0 1 mM ): Volumen 50 ml. Tris HCl 1 M pH 8,0 0,5 ml. EDTA 0,5 M pH 8,0 0,1 ml. c.s.p. con agua desionizada a 50 ml (49,4 ml) Etanol Absoluto ( 95 % ): Etanol destilado y almacenado a -20 oC. Alicuotar Etanol 75%, 80% 70%: Etanol destilado 75, 80 70 ml. Agua desionizada 25, 20 30 ml. Alicuotar y almacenar a -20 oC


Isopropanol Absoluto: Isopropanol destilado. Almacenar a 4 C TBE 5 X ( Tampn de corrido ): Volumen 2 litros. Tris base 108 g. Acido brico 55 g. EDTA 0,5 M pH 8,0 40 ml (pesar 7,444 g). c.s.p. con agua desionizada 2000 ml. Disolver, filtrar y autoclavar TBE 5X / Azul de bromofenol 0,25% / Xilenocianol 0,25%/ Ficoll 400 25% ): Volumen 50 ml. Azul de bromofenol 0.05 g. Xilenocianol 0,05 g. Ficoll 400 5,00 g. TBE 5X c.s.p. 50 ml MEDIO LB (Luria-Bertani): Bacto-triptona 10 g. Bacto-extracto de levadura 5 g. NaCl 10 g. Ajustar pH 7,4 con NaOH c.s.p. con agua desionizada 1000 ml. Autoclavar y abrir en ambiente estril.


UNIVERSIDAD DE PAMPLONA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA QUIMICA

LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR: SOLUCIONES

Una solucin es una mezcla de dos o ms componentes, cada componente se mezcla ntimamente con el otro, de modo tal que pierden sus caractersticas individuales. Esto ltimo significa que los constituyentes son indistinguibles y el conjunto se presenta en una sola fase (slida, lquida o gas) bien definida.

Una solucin que contiene agua como solvente se llama solucin acuosa.

Las soluciones son distintas de los coloides y de las suspensiones en que las partculas del soluto son de tamao molecular y estn dispersas uniformemente entre las molculas del solvente.

Las sales, los cidos, y las bases se ionizan cuando se disuelven en el agua

Los componentes de una solucin son soluto y solvente.

soluto es aquel componente que se encuentra en menor cantidad y es el que se disuelve.

solvente es aquel componente que se encuentra en mayor cantidad y es el medio que disuelve al soluto.

Estas mezclas de dos o ms sustancias se pueden mezclar agregando distintas cantidades: Para saber exactamente la cantidad de soluto y de solvente de una disolucin se utiliza una magnitud denominada concentracin.

Dependiendo de su concentracin, las disoluciones se clasifican en diluidas, concentradas, saturadas, sobresaturadas.

Diluidas: si la cantidad de soluto respecto del solvente es pequea. Ejemplo: una solucin de 1 gramo de sal de mesa en 100 gramos de agua.

Concentradas: si la proporcin de soluto con respecto del solvente es grande. Ejemplo: una disolucin de 25 gramos de sal de mesa en 100 gramos de agua.


Saturadas: se dice que una disolucin est saturada a una determinada temperatura cuando no admite ms cantidad de soluto disuelto. Ejemplo: 36 gramos de sal de mesa en 100 gramos de agua a 20 C.

Si intentamos disolver 38 gramos de sal en 100 gramos de agua, slo se disolvera 36 gramos y los 2 gramos restantes permanecern en el fondo del vaso sin disolverse.

Sobresaturadas: disolucin que contiene mayor cantidad de soluto que la permitida a una temperatura determinada. La sobresaturacin se produce por enfriamientos rpidos o por descompresiones bruscas. Ejemplo: al sacar el corcho a una botella de refresco gaseoso.

Modo de expresar las concentraciones

Ya sabemos que la concentracin de las soluciones es la cantidad de soluto contenido en una cantidad determinada de solvente o solucin. Tambin debemos aclarar que los trminos diluida o concentrada expresan concentraciones relativas.

Las unidades de concentracin en que se expresa una solucin o disolucin pueden clasificarse en unidades fsicas y en unidades qumicas.

Unidades fsicas de concentracin

Las unidades fsicas de concentracin estn expresadas en funcin del peso y del volumen, en forma porcentual, y son las siguientes:

a) Tanto por ciento peso/peso %P/P = (cantidad de gramos de soluto) / (100 gramos de solucin)

b) Tanto por ciento volumen/volumen %V/V = (cantidad de cc de soluto) / (100 cc de solucin)

c) Tanto por ciento peso/volumen % P/V =(cantidad de gr de soluto)/ (100 cc de solucin)


a) Porcentaje peso a peso (% P/P): indica el peso de soluto por cada 100 unidades de peso de la solucin.

b) Porcentaje volumen a volumen (% V/V): se refiere al volumen de soluto por cada 100 unidades de volumen de la solucin.

c) Porcentaje peso a volumen (% P/V): indica el nmero de gramos de soluto que hay en cada 100 ml de solucin.

Ejercicio:

Se tiene un litro de solucin al 37%. Cuntos litros de agua se tienen que agregar para que quede al 4%?

Resolvamos:

El problema no indica las unidades fsicas de concentracin. Se supondr que estn expresadas en % P/V.

Datos que conocemos: V = volumen, C= concentracin

V1 = 1 litro

C1 = 37%

37% P/V = significa que hay 37 gramos de soluto en 100 ml de solucin (solucin = soluto + solvente).

C2 = 4%

V2 = ?


Regla para calcular disoluciones o concentraciones

V1 C1 = V2 C2

Puede expresarse en: % P/V

Reemplazando los datos que se tienen del problema, se obtiene:

Entonces, si tenemos un litro de solucin al 37%; para obtener una solucin al 4% es necesario tener un volumen de 9,25 litros; por lo tanto, para saber cuantos litros de agua hay que agregar al litro inicial, hacemos:

V2 V1 = Volumen de agua agregado

9,25 1 = 8,25 litros

Respuesta: Se deben agregar 8,25 litros de agua

Unidades qumicas de concentracin

Para expresar la concentracin de las soluciones se usan tambin sistemas con unidades qumicas, como son:

a) Fraccin molar (Xi): se define como la relacin entre los moles de un componente (ya sea solvente o soluto) de la solucin y los moles totales presentes en la solucin.


Ejercicio:

Se agregan 3 gramos de sal en una cacerola con 4 litros de agua cul es la concentracin de sal?, o dicho de otra forma cul es la concentracin de la solucin?

Calcular la fraccin molar de solvente y de soluto: Recordemos que la fraccin molar expresa la concentracin de una solucin en Moles de Soluto o de Solvente por Moles Totales de la Solucin.

Solvente: agua (H2O)

Soluto: sal (NaCl)

Datos que conocemos: 3 gramos de soluto y 4.000 cm3 (4 litros) de solvente.

Con estos datos debemos resolver el problema, calculando 4 valores significativos: moles de solvente, moles de soluto, fraccin molar de solvente y fraccin molar de soluto.

Para el agua, se conoce su masa molar = M(H2O) = 18 g/mol (1 mol de H2O contiene 18 g, formados por 2 g de H y 16 g de O).

Averiguar cuntos moles de solvente H2O) tenemos:


Para la sal (NaCl) su masa molar = M(NaCl) = 58,5 g/mol (1 mol de sal equivale a 58,5 g, formados por 23 g de Na y 35,5 g de Cl)

Averiguar cuntos moles de soluto tenemos:

Ahora que conocemos la cantidad de moles de solvente y la cantidad de moles de soluto, podemos calcular las fracciones molares de solvente y de soluto:

Fraccin molar del solvente = Xsolvente

Fraccin molar del solvente (agua) = 0,99977

Fraccin molar del soluto= Xsoluto


Fraccin molar del soluto= 0,00023

Pero sabemos que:

Entonces: 0,99977 + 0,00023 = 1

b) Molaridad (M): Es el nmero de moles de soluto contenido en un litro de solucin. Una solucin 4 molar (4 M) es aquella que contiene cuatro moles de soluto por litro de solucin.

Ejercicio:

Cul ser la molaridad de una solucin que contiene 64 g de Metanol (masa molar del metanol 32 gr/mol) en 500 ml de solucin?

Datos conocidos: metanol 64 g

Masa molar del metanol: 32 g/mol

Masa de la solucin: 500 ml (0,5 litro)

Primero calculamos la cantidad de moles que hay en 64 g de metanol.

Si un mol de metanol equivale a 32 g, 64 g equivalen a 2 moles (64/32=2)


Aplicamos la frmula:

Respuesta: 4 molar

c) Molalidad

En la molalidad relacionamos la molaridad del soluto con el que estamos trabajando con la masa del disolvente (en kg) que utilizamos.

La definicin de molalidad es la siguiente:

Relacin entre el nmero de moles de soluto por kilogramos de disolvente (m)

Ejercicio:

Calcule la concentracin molal de una solucin que contiene 32g de cloruro de sodio en 10. kilogramos de solvente.

En el ejemplo anterior se calculo que 32g de NaCl equivale a 0.55 moles de soluto. Sustituimos la ecuacin para molalidad, as:

m = 0.55 mol NaCl / 10. kg solvente = 0.055 m

La concentracin de la solucin de NaCl es de 0.055 m.


d) Normalidad:

La normalidad (N) es el nmero de equivalentes (eq-g) de soluto (sto) por litro de disolucin (Vsc).

El nmero de equivalentes se calcula dividiendo la masa total por la masa

de un equivalente: , o bien como el producto de la masa total y la cantidad de equivalentes por mol, dividido por la masa molar:

.

Normalidad cido-base Es la normalidad de una disolucin cuando se utiliza para una reaccin como cido o como base. Por esto suelen titularse utilizando indicadores de pH. En este caso, los equivalentes pueden expresarse de la siguiente forma:

para un cido, o

para una base. Donde: n es la cantidad de equivalentes. moles es la cantidad de moles. H+ es la cantidad de protones cedidos por una molcula del cido. OH es la cantidad de hidroxilos cedidos por una molcula de la base. Por esto, podemos decir lo siguiente:

para un cido, o para una base.


Donde: N es la normalidad de la disolucin. M es la molaridad de la disolucin. H+ es la cantidad de protones cedidos por una molcula del cido. OH es la cantidad de hidroxilos cedidos por una molcula de la base. Ejemplos: Una disolucin 1 M de HCl cede 1 H+, por lo tanto, es una disolucin 1

N. Una disolucin 1 M de Ca (OH)2 cede 2 OH, por lo tanto, es una

disolucin 2 N. BIBLIOGRAFIA: Brown T. A. 2002. Genomes. 2nd edition. Bios Scientific, Oxford, United Kingdom. Griffitbs A.J.F., Gelbart W.M., Lewontin R.C., y Miller J. H. 2002. Modern genetic analysis. 2nd edition. W.H. Freeman, New York. Sambrook J. y Russel D. W. 2001. Molecular cloning: A laboratoly manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Watson J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levine M., Losick R. 2006. Biologia Molecular del Gen. 5a edicin. Editorial medica Panamericana. Espaa. www.pubmed.com http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/ggongora/parte1a.htm http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Odontologia/Odo-Practica05.htm www.ucm.es/info/genetica/AVG/problemas/Rflp174.htm www.odnavaiaescola.com/spanish/enzimasspn.html

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