extraccion purificacion dna

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Extracci Extracci ó ó n y purificaci n y purificaci ó ó n n de ADN de ADN Bioq. Florencia Longo Bioq. Florencia Longo Laboratorio de Detecci Laboratorio de Detecci ó ó n de OGM n de OGM Instituto de Biotecnolog Instituto de Biotecnolog í í a a INTA INTA

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Page 1: Extraccion purificacion dna

ExtracciExtraccióón y purificacin y purificacióón n de ADNde ADN

Bioq. Florencia LongoBioq. Florencia Longo

Laboratorio de DetecciLaboratorio de Deteccióón de OGM n de OGM Instituto de BiotecnologInstituto de Biotecnologíía a –– INTAINTA

Page 2: Extraccion purificacion dna

Pasos del AnPasos del Anáálisis de lisis de OGMsOGMs

INFORMEINFORME

MuestraMuestra ExtracciExtraccióónnde ADNde ADN PCRPCR

Page 3: Extraccion purificacion dna

PreparaciPreparacióón de la muestra para la n de la muestra para la extracciextraccióón de ADNn de ADN

Cantidad de muestraCantidad de muestra

Grado de homogenizaciGrado de homogenizacióónn

TamaTamañño de parto de partíículacula

Page 4: Extraccion purificacion dna

ExtracciExtraccióón de ADN n de ADN

ObjetivoObjetivo

CantidadCantidadIntegridadIntegridad

PurezaPurezaAusencia de contaminacionesAusencia de contaminaciones

PCRPCR

Page 5: Extraccion purificacion dna

ExtracciExtraccióón de ADN n de ADN

Tipo de muestraTipo de muestraTargetTarget a analizara analizarGrado de procesamiento de la muestraGrado de procesamiento de la muestraTipo de anTipo de anáálisis requeridolisis requeridoResultados deseadosResultados deseados

Tener en cuentaTener en cuenta

Page 6: Extraccion purificacion dna

ExtracciExtraccióón de ADN n de ADN

Tipo de muestras a analizarTipo de muestras a analizar

AlimentosAlimentos

Granos Granos

SemillasSemillas

HarinasHarinas

HojasHojas

Page 7: Extraccion purificacion dna

ExtracciExtraccióón de ADN n de ADN

PequePequeññososTamaTamañño o frag.ADNfrag.ADNMedianosMedianos

Mediana a Mediana a altaalta

Presencia de Presencia de inhibidoresinhibidores

BajaBaja

ComplejosComplejosProtocolos Protocolos extracciextraccióónn

SencillosSencillos

AltaAltaHomogenizaciHomogenizacióónnBajaBaja

BajaBajaCantidadCantidadAltaAltaBajaBajaCalidadCalidadAltaAlta

AlimentosAlimentosCaracterCaracteríísticassticasGranosGranos

Page 8: Extraccion purificacion dna

ExtracciExtraccióón de ADN de n de ADN de Alimentos Alimentos

Distintos Distintos tratamientostratamientos

FFíísico sico QuQuíímico mico EnzimEnzimááticotico

Distintos y mDistintos y múúltiples ltiples ingredientesingredientes

Cremas Cremas Salsas, especiasSalsas, especiasAzAzúúcarescaresSales, etc.Sales, etc.

DisminuciDisminucióón en la calidad y cantidad de ADNn en la calidad y cantidad de ADNPresencia de inhibidores de PCRPresencia de inhibidores de PCR

Page 9: Extraccion purificacion dna

Pasos de los mPasos de los méétodos de todos de ExtracciExtraccióón de ADNn de ADN

PrePre--tratamientotratamientoNeutralizaciNeutralizacióón (muestras n (muestras áácidas) cidas) Tratamiento con solventes orgTratamiento con solventes orgáánicos (grasas)nicos (grasas)

Lisis celularLisis celularDisrupciDisrupcióón mecn mecáánicanicaAgente quAgente quíímicosmicos

PurificaciPurificacióón de ADNn de ADNPrecipitaciPrecipitacióónnMatrices (Matrices (kitskits comerciales)comerciales)

Page 10: Extraccion purificacion dna

ExtracciExtraccióón de ADNn de ADNLisis celularLisis celular

Detergentes Detergentes SDS, CTABSDS, CTABEDTAEDTADigestiDigestióón n enzimenzimááticatica proteinasas, RNAsas, proteinasas, RNAsas,

amilasas, etcamilasas, etc

Page 11: Extraccion purificacion dna

ExtracciExtraccióón para n para remover contaminantesremover contaminantesFenolFenolCloroformoCloroformo

PrecipitaciPrecipitacióónnSustancias Sustancias coco--precipitantes (CTAB, PVP)precipitantes (CTAB, PVP)

PrecipitaciPrecipitacióón final con n final con IsopropanolIsopropanol y/oy/oetanol etanol

PurificaciPurificacióón de ADNn de ADNMMéétodos tradicionalestodos tradicionales

Page 12: Extraccion purificacion dna

PurificaciPurificacióón de ADNn de ADNMMéétodos comerciales todos comerciales

MetodoMetodo basados en basados en silicasilica

Columnas de Columnas de silicasilicaAgentes Agentes caotrcaotróópicospicosElusiElusióón con n con isopropanolisopropanol/etanol/etanol

ADNADN

ADN ADN purificadopurificado

Page 13: Extraccion purificacion dna

ElecciEleccióón del mn del méétodo de todo de extracciextraccióónn

Tipo de muestra Tipo de muestra TargetTarget a detectara detectarGrado de pureza requeridaGrado de pureza requeridaCantidad de ADN Cantidad de ADN RendimientoRendimientoIntegridad requeridaIntegridad requeridaPresencia de inhibidoresPresencia de inhibidores

Page 14: Extraccion purificacion dna

ElecciEleccióón del mn del méétodo de todo de extracciextraccióónn

Capacidades del laboratorio Capacidades del laboratorio Cantidad de muestras a analizarCantidad de muestras a analizarFacilidades de usoFacilidades de usoRepetibilidadRepetibilidadAplicaciones Aplicaciones Tiempo de anTiempo de anáálisislisisCostosCostos

Page 15: Extraccion purificacion dna

Resultados de la extracciResultados de la extraccióón n

Incluir siempre Incluir siempre CONTROLESCONTROLES

PositivosPositivos

Muestras positivasMuestras positivas

NegativosNegativos

Blanco de reactivosBlanco de reactivosBlanco de muestrasBlanco de muestras

Chequeo de ausencia Chequeo de ausencia de inhibicide inhibicióónn

Muestras positivasMuestras positivas

Page 16: Extraccion purificacion dna

Resultados de la extracciResultados de la extraccióón n

Resultado Resultado esperadoesperado

Falsos positivosFalsos positivos

ContaminacionesContaminaciones

Falsos negativosFalsos negativos

ADN degradado resultado ADN degradado resultado del procesamiento del procesamiento

ADN degradado resultado ADN degradado resultado de la extraccide la extraccióónn

Presencia de inhibidoresPresencia de inhibidores

óó

Page 17: Extraccion purificacion dna

Inhibidores de PCR Inhibidores de PCR

En los alimentosEn los alimentos

ProteProteíínasnasPolisacPolisacááridosridosGrasasGrasasSalesSalesÁÁcidoscidos

MMéétodo de extraccitodo de extraccióónn

DetergentesDetergentesFenol Fenol Residuos orgResiduos orgáánicos nicos EDTA EDTA EtanolEtanolIsopropanolIsopropanolSales Sales

Page 18: Extraccion purificacion dna

EvaluaciEvaluacióón del ADN extran del ADN extraíídodo

EspectrofotometrEspectrofotometríía (260/280 a (260/280 nmnm))EvalEvalúúo cantidad de ADNo cantidad de ADNNo evalNo evalúúo calidado calidad

Electroforesis/ Bromuro de Electroforesis/ Bromuro de etidioetidioEvalEvalúúo cantidad de ADN o cantidad de ADN EvalEvalúúo calidad (degradacio calidad (degradacióón, presencia de n, presencia de

RNA)RNA)

Page 19: Extraccion purificacion dna

EvaluaciEvaluacióón del ADN extran del ADN extraíídodo

FluorometrFluorometrííaaEvalEvalúúo cantidado cantidadNo evalNo evalúúo calidado calidad

PCR de genes endPCR de genes endóógenos genos EvalEvalúúo cantidad de ADN o cantidad de ADN EvalEvalúúo calidado calidadMatrices con poco DNAMatrices con poco DNA

Page 20: Extraccion purificacion dna

Muchas gracias Muchas gracias por su atencipor su atencióónn

Page 21: Extraccion purificacion dna

InformaciInformacióón de contacton de contactoLaboratorio de DetecciLaboratorio de Deteccióón de n de OGMsOGMsInstituto de BiotecnologInstituto de Biotecnologíía a –– INTAINTA

Contactos: Contactos: Dr. Esteban Dr. Esteban HoppHopp

Bioq. Florencia LongoBioq. Florencia Longo

TelTelééfono: (54fono: (54--11) 462111) 4621--1278/1447 1278/1447

EE--mail: mail: [email protected]@[email protected]@cicv.inta.gov.ar