guidance on the application of thai agricultural … ·...

แนวปฏบตในการใชมาตรฐานสนคาเกษตร

มกษ. 10401 (G)-2559

GUIDANCE ON THE APPLICATION OF THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 10401 (G)-2016

การชนสตรโรคพอารอารเอส

DIAGNOSIS OF PORCINE REPRODUCTIVE AND

RESPIRATORY SYNDROME (PRRS)

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต

กระทรวงเกษตรและสหกรณ

ICS 11.220 ISBN XXX-XXX-XXX-X

รางZ

(ราง)


มกษ. 10401 (G)-2559

GUIDANCE ON THE APPLICATION OF THAI AGRICULTURAL STANDARD

TAS 10401 (G)-2016


DIAGNOSIS OF PORCINE REPRODUCTIVE AND

RESPIRATORY SYNDROME (PRRS)


กระทรวงเกษตรและสหกรณ 50 ถนนพหลโยธน เขตจตจกร กรงเทพฯ 10900

โทรศพท 0 2561 2277 โทรสาร 0 2561 3357

www.acfs.go.th

ประกาศในราชกจจานเบกษา ฉบบประกาศและงานทวไป เลม 133 ตอนพเศษ 264 งเศษ 186 ง

วนท 18 พฤศจกายน พทธศกราช 2559

(2)

คณะกรรมการวชาการพจารณามาตรฐานสนคาเกษตร

เรอง การชนสตรโรคพอารอารเอสในสกร

1. อธบดกรมปศสตว หรอผทอธบดมอบหมาย ประธานกรรมการ

นางธนดา หรนทรานนท

2. ผแทนส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต กรรมการ

นางอษา บ ารงช

นายชยศร มหนตชยสกล

3. ผแทนส านกควบคม ปองกน และบ าบดโรคสตว กรมปศสตว กรรมการ

นายรรณ ชนสอน

นายธรงศ ยนยงโอฬาร

4. ผแทนสถาบนสขภาสตวแหงชาต กรมปศสตว กรรมการ

นายประกต บญรประเสรฐ

นายวนชนะ ปนแกว

5. ผแทนคณะสตวแทยศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย กรรมการ

ผชวยศาสตราจารยคมกฤช เทยนค า

รองศาสตราจารยเกวล ฉตรดรงค

นางสาวเยาวลกษณ ปญญสงห

6. ผแทนคณะสตวแทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร……………………………………………… …… กรรมการ

นายวรวทย วชชวลค

นางรทภา เลกเจรญสข

7. ผแทนคณะสตวแทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร กรรมการ

นายจ าลอง มตรชาวไทย

นายปฏภาน ใจเปง

8. ผแทนคณะสตวแทยศาสตร มหาวทยาลยมหดล กรรมการ

นายวทวช วรยะรตน

นายกฤษฎา ใจชน

นางสาวนดา ชนาภวฒน

9. ผแทนสตวแทยสภา กรรมการ

นางบญญตา รจทฆมร

10. ผแทนสมาคมผผลตและแปรรปสกรเอการสงออก กรรมการ

11. ผแทนสมาคมผเลยงสกรแหงชาต กรรมการ

นายเกยรตภม ฤกษะวน

(3)

12. ผแทนสมาคมเวชศาสตรชนสตรทางสตวแทยไทย กรรมการ

นายรชฎ ตนตเลศเจรญ

13. ผแทนสมาคมสตวแทยควบคมฟารมสกรไทย กรรมการ

นายวลาส วบลยศรกล

14. ศาสตราจารยรงโรจน ธนาวงษนเวช กรรมการ

ผทรงคณวฒดานการชนสตรโรค

15. ผแทนส านกก าหนดมาตรฐาน กรรมการและเลขานการ


นางสาวขวญหทย ทองปลาด

นางสาวมนตรา ลกขณา

(4)

กระทรวงเกษตรและสหกรณไดประกาศมาตรฐานสนคาเกษตร เรอง การชนสตรโรคพอารอารเอส (มกษ

10401-2559) ส าหรบใชเปนหลกการของหองปฏบตการเพอการชนสตรโรคพอารอารเอส (porcine

reproductive and respiratory syndrome; PRRS) ใหสอดคลองกบขอก าหนดขององคการโรคระบาดสตว

ระหวางประเทศ (World Organisation for Animal Health; OIE) เพอใหมแนวทางในการน ามาตรฐาน

ดงกลาวไปปฏบต คณะกรรมการมาตรฐานสนคาเกษตรจงก าหนดมาตรฐานสนคาเกษตร เรอง แนวปฏบต

ในการใชมาตรฐานสนคาเกษตร การชนสตรโรคพอารอารเอส ขน เพอสงเสรมใหเกดการควบคมโรคสกร ในฟารมอยางมประสทธภาพ ถกตองตามหลกวชาการ และน าไปปฏบตไดจรง

มาตรฐานสนคาเกษตรน ก าหนดขนโดยใชเอกสารตอไปนเปนแนวทาง

มาตรฐานสนคาเกษตร. มกษ. 10401-2559. การชนสตรโรคพอารอารเอส. กรงเทพฯ: ส านกงานมาตรฐาน

สนคาเกษตรและอาหารแหงชาต.

ส านกงานมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต. 2555. รายงานโครงการศกษาวธการชนสตรโรคทเหมาะสมส าหรบโรคพอารอารเอสในสกรและการศกษาสถานะโรคในประเทศไทย. 74 หนา

World Organisation for Animal Health (OIE). 2010. Chapter 2.8.7. Porcine Reproductive and

Respiratory Syndrome. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Paris, 13 p.

มกษ. 10401 (G)-2559

1



แนวปฏบตน ใหค ำอธบำยควำมทำงวชำกำรของตวอยำงเพอกำรชนสตร กำรตรวจรอยโรค และวธชนสตร

โรคในมำตรฐำนสนคำเกษตร เรอง กำรชนสตรโรคพอำรอำรเอส (มกษ. 10401-2559) เพอเปน

ขอแนะน ำในกำรน ำมำตรฐำนดงกลำวไปปฏบต

ค าอธบาย มกษ. 10401-2559 มรายละเอยดดงน

ขอก ำหนด มกษ. 10401-2559 พมพอยในกรอบและมค ำอธบำยขอก ำหนดอยใตกรอบ

1. ขอบขาย

มำตรฐำนสนคำเกษตรน ก ำหนดกำรชนสตรโรคพอำรอำรเอสทำงหองปฏบตกำร ครอบคลมตงแตตวอยำง

เพอกำรชนสตร กำรตรวจรอยโรค กำรเพำะแยกและตรวจจ ำแนกเชอไวรส กำรตรวจหำสำรพนธกรรม

และกำรตรวจหำแอนตเจน (antigen) หรอแอนตบอด (antibody)

2. นยาม

ควำมหมำยของค ำทใชในมำตรฐำนสนคำเกษตรน มดงตอไปน

2.1 โรคพอำรอำรเอส (porcine reproductive and respiratory syndrome; PRRS) หมำยถง โรคกลม

อำกำรระบบสบพนธและทำงเดนหำยใจในสกร ทมสำเหตจำกเชอไวรสพอำรอำรเอส (porcine reproductive

and respiratory syndrome virus; PRRSV) ซงแบงออกเปน 2 จโนไทป (genotype) ไดแก ไทป 1 (กลม

สำยพนธยโรป) และไทป 2 (กลมสำยพนธอเมรกำ) สตวทไวตอกำรรบเชอ PRRSV คอ สกร ซงตดเชอได

ทกชวงอำย โดยจะพบปญหำของระบบทำงเดนหำยใจ และลกษณะควำมลมเหลวของระบบสบพนธในสกร

พอแมพนธ

2.2 สกร (swine) หมำยถง สตวเลยงลกดวยน ำนมมกบค ในวงศ Suidae ทงทเปนสตวเลยงและทเปนสตวปำ

2.3 กำรชนสตรโรค (diagnosis) หมำยถง กำรตรวจสอบเพอประกอบกำรวนจฉยโรค

2.4 ตวอยำงควบคมผลบวก (positive control sample) หมำยถง ตวอยำงทมเชอ สวนประกอบของเชอ

หรอแอนตบอดตอเชอ PRRSV ซงเมอน ำไปผำนกระบวนกำรชนสตรตำมขนตอนตำงๆ เชนเดยวกบ

ตวอยำงทตองกำรทดสอบแลว ใหผลบวก

มกษ. 10401 (G)-2559

2

ค าอธบาย

2. นยาม

นยำมทตองกำรอธบำยเพมเตมมดงตอไปน

2.1 โรคพอารอารเอส (porcine reproductive and respiratory syndrome; PRRS)

โรคกลมอำกำรระบบสบพนธและทำงเดนหำยใจในสกร (porcine reproductive and respiratory syndrome)

หรอโรคพอำรอำรเอส (PRRS) เกดจำกเชอไวรสพอำรอำรเอส (porcine reproductive and respiratory

syndrome virus; PRRSV) ซงเปนอำรเอนเอไวรสสำยเดยวชนดขวบวก (single-stranded positive sense

RNA virus) ในล ำดบนโดไวรลเลส (Nidovirales) วงศอำรเทอรรวรด (Arteriviridae) สกลอำรเทอรรไวรส

(Arterivirus)

โรคพอำรอำรเอส ถกคนพบครงแรกในป พ.ศ. 2530 ณ ประเทศสหรฐอเมรกำ จำกนนไดแพรระบำด

ทวไป (pandemic) ภำยหลงจำกกำรคนพบไวรสไดไมนำน ไดพบกำรเกดโรคเพมขนในทวปอเมรกำเหนอ

และทวปยโรป โดยไวรสทพบมควำมแตกตำงกนตำมพนธกรรม ซงแบงออกไดเปน 2 กลมสำยพนธ หรอจโน

ไทป (genotype) ไดแก ไทป 1 (กลมสำยพนธยโรป) และไทป 2 (กลมสำยพนธอเมรกำ) นอกจำกน ยง

พบควำมแตกตำงของไวรสในแตละภมภำคของทวป อยำงไรกตำม พบวำควำมแตกตำงของสำยพนธไวรส

ในปจจบนไดลดลง เนองจำกกำรแพรระบำดของไวรสไทป 2 เขำสทวปยโรปผำนทำงกำรใชวคซนเชอเปน

ทผลตจำกไวรสสำยพนธอเมรกำทผำนกำรท ำใหออนก ำลงลง และในขณะเดยวกนกพบไวรสไทป 1 ใน

ทวปอเมรกำเหนอ ส ำหรบไวรสทพบในทวปอเมรกำใตและทวปเอเชยสวนใหญเปนไทป 2 ซงคำดวำเกด

จำกกำรเคลอนยำยสกรและกำรใชน ำเชอทปนเปอนเชอไวรส สวนในประเทศไทยพบกำรระบำดครงแรกใน

ป พ.ศ. 2532 จำกกำรน ำเขำสกรพนธทตดเชอไวรส

ในป พ.ศ. 2549 พบกำรระบำดของไวรสไทป 2 สำยพนธรนแรง (highly pathogenic-porcine reproductive

and respiratory syndrome; HP-PRRS) หรอเรยกวำ porcine high fever disease ในสำธำรณรฐประชำชนจน

โดยตรวจพบกำรขำดหำยของกรดอะมโนจ ำนวน 30 ตว ในยน NSP2 (non-structural protein 2) ของไวรส

ลกษณะทเดนชดคอเชอสำยพนธรนแรงท ำใหมอตรำกำรตำยสงในทกชวงอำย นอกจำกนยงพบกำรระบำด

ของไวรสไทป 1 สำยพนธยโรปตะวนออก ซงกอใหเกดควำมรนแรงไดเชนกน แตยงไมมขอมลแนชดทระบ

ถงลกษณะกำรเปลยนแปลงของพนธกรรมทมควำมเกยวของกบควำมรนแรง

2.5 ตวอยำงควบคมผลลบ (negative control sample) หมำยถง ตวอยำงทไมมเชอ สวนประกอบของเชอ

หรอแอนตบอดตอเชอ PRRSV ซงเมอน ำไปผำนกระบวนกำรชนสตรตำมขนตอนตำงๆ เชนเดยวกบตวอยำง

ทตองกำรทดสอบแลว ใหผลลบ

2.6 รอยโรค (lesion) หมำยถง พยำธสภำพหรอลกษณะผดปกตทปรำกฏในเนอเยอหรออวยวะ

มกษ. 10401 (G)-2559

3

โรคพอำรอำรเอส เปนโรคตำมบญชโรคระบำดสตวบกของ OIE และเปนโรคระบำดตำมพระรำชบญญต

โรคระบำดสตว พ.ศ. 2558 ของประเทศไทย

สตวทไวรบเชอ PRRSV คอ สกรซงเปนสตวเลยงลกดวยน ำนมมกบค ในวงศ Suidae ทงทเปนสตวเลยง

และสตวปำ ปจจบนยงไมมขอมลทยนยนถงกำรตดเชอตำมธรรมชำตในสตวชนดอน โดยทวไปเชอ PRRSV จะถำยทอดจำกสกรตดเชอไดโดยผำนทำงรก และทำงน ำนม หรอจำกกำรสมผส

โดยตรงกบสกรทตดเชอ ผำนทำงอจจำระ ปสสำวะ น ำเชอ สงคดหลงหรอแมแตกำรรบเชอทำงอำกำศ

(aerosol route) ซงท ำใหเกดกำรตดเชอวนเวยนในฝงสกร นอกจำกนยงพบกำรตดตอผำนทำงสตวพำหะ

เชงกล (mechanical vector) เชน ยง แมลงวน รวมถงกำรตดตอผำนทำงวตถพำหะน ำเชอ (fomite) เชน

วสดรองพน เขมฉดยำ อวยวะเปำหมำยของกำรตดเชอ PRRSV คอ ปอด และเนอเยอน ำเหลอง (lymphoid tissue) ตำงๆ เชน

ตอมน ำเหลอง ทอนซล และมำม โดยมเซลลเปำหมำยหลกในกำรเพมจ ำนวนของไวรส คอ เซลลมำโครฟำจ

โดยเฉพำะเซลลมำโครฟำจในถงลม (pulmonary alveolar macrophages; PAM) หรอเซลลมำโครฟำจใน

เนอเยอน ำเหลองอนๆ

สกรทตดเชอ PRRSV แสดงอำกำรทำงคลนกในหลำยระบบรวมกน อำกำรทแสดงอำจมควำมแตกตำงกน

ตำมอำยของสกร โดยแมสกรจะแสดงอำกำรทำงระบบสบพนธ สงเกตไดจำกลกษณะกำรผสมตดยำก

(infertility) กำรตำยของตวออนในระยะแรก (early embryonic death) กำรเกดลกกรอก (mummification)

กำรแทงระยะทำย (late-gestation abortion) และลกตำยคลอด (stillbirth) ลกสกรแรกคลอดไมแขงแรง

ซงมกตำยหลงจำกคลอดไมนำนเนองจำกควำมผดปกตของระบบหำยใจหรอกำรตดเชอแทรกซอน สกร

อำยนอยจะแสดงอำกำรรนแรงกวำสกรอำยมำก โดยอำกำรของโรคในระบบทำงเดนหำยใจทมกสงเกตได เชน

มไขสง เยอบรอบดวงตำบวม มขตำ น ำมกใส และอำจพบกำรมวงคล ำ (cyanosis) ตำมปลำยระยำงค เชน

ใบห และปลำยขำ ดงแสดงในภำพท 1 หรอจดเลอดออกตำมผวหนง พอสกร แมสกรทดแทน และสกรสำว

มกตดเชอโดยไมแสดงอำกำร (subclinical infection) หรออำจพบอำกำรไข ซม และเบออำหำร และม

อำกำรของโรคระบบทำงเดนหำยใจเลกนอย พอสกรทตดเชอหรอไดรบวคซนชนดเชอเปนทท ำใหออน

ก ำลงลง (live attenuated vaccine) ยงสำมำรถถำยทอดเชอผำนทำงน ำเชอได บำงครงพบกำร

เปลยนแปลงรปรำงและกำรท ำงำนของตวอสจรวมดวย ในกรณทสกรตดเชอสำยพนธรนแรงอยำง

เฉยบพลน อำจพบอตรำกำรปวยและตำยสงในทกชวงอำย

มกษ. 10401 (G)-2559

4

(1.1) (1.2) (1.3) (1.4)

ภาพท 1 อำกำรทำงคลนกของสกรทไดรบเชอ PRRSV สกรมน ำมกใส (1.1) ตำบวมมขตำ (1.2)

และมกำรมวงคล ำ ตำมปลำยระยำงค เชน ใบห (1.3) และปลำยขำ (1.4)

ทมำ: สพ.ญ.ยลยง วนวงษ


3. ขอก าหนด

ขอก ำหนดในมำตรฐำน มกษ. 10401-2559 ระบหลกกำรส ำคญในกำรชนสตรโรคพอำรอำรเอส ดวยวธ

ทไดรบกำรยอมรบจำก OIE ทงน หองปฏบตกำรอำจใชวธกำรชนสตรทมรำยละเอยดขนตอนกำรปฏบต

แตกตำงออกไปได โดยเปนไปตำมหลกเกณฑดงน

(1) เปนวธชนสตรทตพมพในเอกสำรคมอ หรอวำรสำรทำงวชำกำรทเปนทยอมรบระดบระหวำงประเทศ

(2) เปนวธชนสตรทมผลกำรประเมนควำมใชได (validation) โดยกำรศกษำรวมกนของหองปฏบตกำร

(collaborative study) ตำมหลกเกณฑทเปนทยอมรบในระดบระหวำงประเทศ

(3) กรณไมมวธชนสตรตำมขอ (1) หรอขอ (2) ใหใชวธชนสตรทไดประเมนควำมใชไดโดยหองปฏบตกำร

เดยว (single laboratory validation) ทมระบบคณภำพและปฏบตตำมหลกเกณฑทเปนทยอมรบในระดบ

ระหวำงประเทศ

3. ขอก าหนด

กำรชนสตรโรคพอำรอำรเอส ใหเปนไปตำมตำรำงท 1 ส ำหรบรำยละเอยดขนตอนกำรปฏบตของแตละวธ

อำจแตกตำงกนในหองปฏบตกำรแตละแหง โดยตองเปนวธชนสตรทประกำศโดย OIE หรอ เผยแพรใน

วำรสำรทำงวชำกำรทเปนทยอมรบระดบระหวำงประเทศ หรอมกำรประเมนควำมใชได (validation) แลววำ

มควำมไว (sensitivity) และควำมจ ำเพำะ (specificity) ทเหมำะสม

วธกำรชนสตรโรคพอำรอำรเอสทำงหองปฏบตกำร ใหใชวธในรำยกำรท 3 ถง 8 อยำงใดอยำงหนง หรอ

หลำยอยำงรวมกน

กำรชนสตรดวยวธในรำยกำรท 3 ถง 8 ตองมตวอยำงควบคมผลบวกและตวอยำงควบคมผลลบทกครง

B A

มกษ. 10401 (G)-2559

5


รายการท 1 ตวอยางเพอการชนสตร

ใหหองปฏบตกำรตรวจสอบและบนทกขอมลของตวอยำงทไดรบลงในแบบฟอรมรบตวอยำงทกครง

ตวอยำงทใชในกำรชนสตรโรคพอำรอำรเอส มดงน

การเกบตวอยางจากสกรมชวต

กำรเกบตวอยำงซรม ใหเกบเลอดจำกเสนเลอดด ำทคอ (jugular vein) ปรมำณ 3 ml ถง 5 ml ตงไวท

อณหภมหองไมเกน 30 min เพอใหซรมแยกชนออกมำกอนน ำไปเกบไวทอณหภม 4oC ถง 8

oC แลวน ำ

ตวอยำงสงหองปฏบตกำรเพอปนแยกซรมภำยใน 24 h

กำรเกบตวอยำงน ำเชอ ตองอำบน ำท ำควำมสะอำดตวพอสกรกอนจะรดเกบน ำเชอ โดยเฉพำะบรเวณหนง

หมลงค ซงควรตดขนบรเวณนนออกใหสน เกบน ำเชอจำกพอสกรโดยกระตนใหพอสกรหลงน ำเชอ ซงท ำ

ไดโดยกำรบบนวดบรเวณปลำยอวยวะสบพนธ จำกนนรดเกบน ำเชอใสในหลอดเกบน ำเชอทผำนกำรฆำ

เชอโรค น ำหลอดเกบน ำเชอบรรจในภำชนะทควบคมอณหภม 4oC ถง 8

oC แลวน ำตวอยำงสงหองปฏบตกำร

ภำยใน 24 h

ตารางท 1 รายการขอก าหนดการชนสตรโรคพอารอารเอส

รายการท 1 ตวอยางเพอการชนสตร

1.1 ตรวจสอบและบนทกขอมลของตวอยำงทไดรบ ดงน

1.1.1 ตวอยำงทใชในกำรชนสตรโรคพอำรอำรเอส

1.1.1.1 สกรมชวต ใหเกบตวอยำงอยำงใดอยำงหนง หรอหลำยอยำงรวมกนดงตอไปน

(1) ซรม

(2) น ำเชอ

(3) สงคดหลง เชน ของเหลวในชองปำก (oral fluid)

1.1.1.2 สกรทไมมชวต ใหเกบตวอยำงอยำงใดอยำงหนง หรอหลำยอยำงรวมกนดงตอไปน

(1) ปอด

(2) เนอเยอน ำเหลอง เชน ทอนซล มำม ตอมน ำเหลอง

1.1.2 กำรเกบตวอยำงตองปองกนกำรปนเปอนจำกเชอจลชพจำกสงแวดลอม

1.1. 3 เกบรกษำตวอยำงทอณหภม 4oC ถง 8

oC น ำตวอยำงสงหองปฏบตกำรภำยใน 24 h กรณตวอยำง

เนอเยอทเกบในสำรละลำยรกษำสภำพ เกบทอณหภมหอง (25oC ถง 30

oC)

มกษ. 10401 (G)-2559

6

กำรเกบตวอยำงสงคดหลง เชน ของเหลวในชองปำก (oral fluid) ซงเปนของเหลวทประกอบดวยน ำลำย

และสำรน ำในซรมทซมผำนเขำมำอยในชองปำกผำนทำงเยอบชองปำก (oral mucosa transudate) กำรเกบ

ตวอยำงของเหลวในชองปำกโดยกำรใหสกรเคยวเชอกฝำยซงมประสทธภำพกำรดดซบสง เปนวธท

กอใหเกดควำมเครยดตอสกรคอนขำงนอยและสำมำรถปฏบตไดงำย โดยแขวนเชอกฝำยไวบรเวณพนท

สะอำดหำงจำกบรเวณใหน ำและอำหำรในคอกสกร ก ำหนดควำมสงของปลำยเชอกใหอยระดบไหลของ

สกร ขนำดเสนผำนศนยกลำงของเชอกทใชจะแตกตำงไปตำมอำยสกร เชน สกรอนบำลใชขนำด 1.3 cm

หรอสกรรน-ขนใชขนำด 1.6 cm เมอสกรเคยวเชอก ของเหลวในชองปำกจะถกดดซบไวในเสนเชอก อำจ

ใชระยะเวลำในกำรเกบตวอยำงประมำณ 15 min ถง 20 min โดยสงเกตจำกพฤตกรรมของสกร จำกนน

น ำเสนเชอกใสในถงพลำสตกทสะอำด และบบเพอแยกของเหลวออกจำกเสนเชอก แลวถำยใสในหลอด

เกบตวอยำง อยำงนอย 1 ml เกบไวทอณหภม 4oC ถง 8

oC แลวน ำสงหองปฏบตกำรภำยใน 24 h

ภาพท 2 กำรเกบตวอยำงของเหลวในชองปำกโดยกำรใหสกรเคยวเชอก

ทมำ: น.สพ. อภสทธ กจถำวรรตน และ สพ.ญ.ยลยง วนวงษ

การเกบตวอยางจากสกรทไมมชวต

กำรเกบตวอยำงเนอเยอใหเกบเนอเยอจำกปอด ทอนซล มำม หรอตอมน ำเหลอง ทสดไมเกดกำรเนำเปอย

โดยเลอกเกบเนอเยอบรเวณเชอมตอทมรอยโรคและบรเวณปกต ใสภำชนะเกบตวอยำง 2 ชน ตดฉลำก

และระบขอมลใหชดเจน ควบคมอณหภมไมเกน 4°C น ำตวอยำงสงหองปฏบตกำรภำยใน 24 h

ในกรณทตองกำรเกบตวอยำงเพอตรวจดวยวธไอเอชซ (immunohistochemistry; IHC) ตองเกบรกษำชนเนอ

ในสำรละลำยบฟเฟอรฟอรมำลน 10% ในอตรำสวนเนอเยอตอสำรละลำยบฟเฟอรฟอรมำลนเปน

1 สวนตอ 10 สวน ซงจะสำมำรถเกบรกษำทอณหภมหอง (25oC ถง 30

oC) ได และควรฝงชนเนอลงใน

บลอกพำรำฟนภำยใน 24 h ถง 48 h

มกษ. 10401 (G)-2559

7


รายการท 2 การตรวจรอยโรค

รอยโรคทำงมหภำค (gross lesion) ของกำรตดเชอ PRRSV สำมำรถสงเกตได โดยจะพบรอยโรคของปอดอกเสบซงมสแดงคล ำกระจำยตวอยทวไป (ภำพท 3) พบจดเลอดออกทไตและตอมน ำเหลองบวมโต

(ภำพท 4) ซงรอยโรคมกรนแรงในสกรอำยนอย

(3.1) (3.2) (3.3)

ภาพท 3 ปอดสกรปกต (3.1)

และปอดสกรทไดรบเชอ PRRSV รอยโรคปอดอกเสบมสแดงคล ำกระจำยตวอยทวไป (3.2 และ 3.3)

ทมำ: สพ.ญ.ยลยง วนวงษ และ น.สพ.กรกฤต พนสข

(4.1) (4.2)

ภาพท 4 รอยโรคจดเลอดออกทไต (4.1)

และรอยโรคตอมน ำเหลองบวมโต (4.2) จำกสกรทไดรบเชอ PRRSV

ทมำ: น.สพ.พชย จรวฒนพงศ และ สพ.ญ.ยลยง วนวงษ


รายการท 2 การตรวจรอยโรค

2.1 ตรวจสภำพของสกรเพอดรอยโรค อยำงใดอยำงหนง หรอหลำยอยำงรวมกน ดงตอไปน ปอดอกเสบ

จดเลอดออกทไต หรอตอมน ำเหลองบวม และบนทกผลเพอใชประกอบกำรยนยนผลกำรชนสตรโรค

มกษ. 10401 (G)-2559

8

ในกรณทสกรตดเชอสำยพนธรนแรง อยำงเฉยบพลนมกพบเนอตำยทมำม และเลอดออกรนแรงท ตอม

น ำเหลอง (ภำพท 5)

ภาพท 5 รอยโรคกรณทสกรตดเชอสำยพนธรนแรง

จะพบเนอตำยทมำม (5.1) และตอมน ำเหลองมเลอดออกรนแรง (5.2)

ทมำ: น.สพ.รชฎ ตนตเลศเจรญ


รายการท 3 การเพาะแยกและตรวจจ าแนกเชอไวรส

กำรเพำะแยกเชอไวรสเปนกำรจ ำลองเหตกำรณกำรเพมจ ำนวนของไวรสภำยในตวสตว กลำวคอ เมอสตว

ไดรบไวรส ไวรสจะเขำสเซลลเปำหมำยและเพมจ ำนวน เซลลเปำหมำยของไวรสแตละชนดจะแตกตำงกน

ทงนขนอยกบสงทไวรสแตละชนดตองกำรใชในกำรเพมจ ำนวนและสงทเซลลม โดยเฉพำะตวรบ

(receptor) ตอไวรสนนๆ ดงนนหำกสำมำรถเพมจ ำนวนเซลลเปำหมำย หรอเซลลอนๆ ทเหมำะสมตอ

ไวรสไดภำยนอกตวสตว กสำมำรถเพมจ ำนวนไวรสภำยนอกตวสตวไดเชนเดยวกน ซงมขอดคอ เปนกำร

ลดกำรใชสตวทดลอง และสะดวกตอกำรปฏบตงำน

ตารางท 1 รายการขอก าหนดการชนสตรโรค PRRS

รายการท 3 การเพาะแยกและตรวจจ าแนกเชอไวรส

3.1 เพำะแยกและจ ำแนกเชอไวรสโดยใชเซลลเพำะเลยงทจ ำเพำะ เชน เซลลมำโครฟำจในถงลม (pulmonary

alveolar macrophages; PAM) หรอเซลลเพำะเลยงตอเนองชนดเอมเออำรซ-145 (MARC-145)

3.2 กำรเพำะแยกเชอ PRRSV ปฏบตตำมขนตอนดงน

3.2.1 เตรยมตวอยำงเนอเยอ

3.2.2 เหนยวน ำใหไวรสเขำสเซลลเพำะเลยงและเพมจ ำนวน

3.2.3 สงเกตพยำธสภำพของเซลล (cytopathic effect; CPE) โดยเชอ PRRSV บำงไอโซเลต (isolate) จะ

ท ำใหเกดพยำธสภำพของเซลล เชน กำรเกดมวลเซลลรวม (syncytium) หรอ กำรตำยของเซลล

3.2.4 ยนยนกำรตดเชอโดยตรวจหำแอนตเจนของเชอ PRRSV ในเซลลเพำะเลยงโดยใชแอนตบอดทม

ควำมจ ำเพำะตอเชอ PRRSV

มกษ. 10401 (G)-2559

9

กำรเพำะแยกเชอ PRRSV นนท ำไดยำก โดยมำกจะใชเพอเพมจ ำนวนไวรสในกำรศกษำ ไมนยมใชในกำร

ตรวจวนจฉยทวไปเนองจำกเปนวธทมควำมซบซอน และใชเวลำนำนกวำวธอนๆ แมวำจะสำมำรถแยก

ไวรสจำกตวอยำงซรม และเนอเยอจำกอวยวะตำงๆ ของสกรทตดเชอ เชน ปอด ทอนซล ตอมน ำเหลอง

และมำมได อยำงไรกตำมพบวำเซลลเปำหมำยหลกของเชอ PRRSV คอ เซลลมำโครฟำจในถงลมของสกร

กำรเพำะแยกเชอ PRRSV ทแนะน ำโดย OIE จงเปนกำรเพำะแยกเชอดวยเซลลมำโครฟำจในถงลม

ดงกลำว นอกจำกน สำมำรถน ำเซลลเพำะเลยงตอเนอง (cell line) ชนดเอมเออำรซ-145 (MARC-145)

ซงมคณสมบตทเชอ PRRSV สำมำรถเพมจ ำนวนไดดมำใชในกำรเพำะแยกเชอไวรสไดเชนกนและพบวำม

ควำมสะดวกเหมำะสมกบหองปฏบตกำรทวไปมำกกวำกำรใชเซลลมำโครฟำจในถงลม เนองจำกเซลลมำโครฟำจ

ในถงลมตองเตรยมจำกลกสกรสขภำพดทมอำยนอยกวำ 8 สปดำหและใชหมดไปเปนครงๆ ในขณะท

เซลลเอมเออำรซ-145 สำมำรถเพมจ ำนวนในหองปฏบตกำรไดอยำงตอเนอง

โดยทวไปพบวำเชอ PRRSV จะท ำใหเกดพยำธสภำพของเซลล ภำยใน 1 วน ถง 2 วน แตบำงกรณอำจพบ

กำรเกดพยำธสภำพของเซลลนอย หรอจ ำเปนตองถำยเชอลงเซลลเพำะเลยงซ ำอกพำสสำจ (passage) จง

จะสงเกตเหนกำรเกดพยำธสภำพของเซลล เมอสงเกตพบกำรเกดพยำธสภำพของเซลล ใหยนยนกำรตด

เชอดวยวธไอพเอมเอ (immunoperoxidase monolayer assay; IPMA) หรอวธไอเอฟเอ (immunofluorescence

assay; IFA)

กอนน ำตวอยำงมำท ำกำรเพำะแยกเชอนน อำจคดกรองตวอยำงดวยวธอำรท-พซอำร (reverse

transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR) ซงสำมำรถท ำไดงำย มควำมไวและควำมจ ำเพำะสง

แลวจงคดเลอกเฉพำะตวอยำงทใหผลบวกมำท ำกำรเพำะแยกเชอ

กำรเพำะแยกเชอ PRRSV ประกอบดวย 2 ขนตอนหลก ซงตองปฏบตดวยเทคนคปลอดเชอ (aseptic

technique) คอ กำรเตรยมตวอยำงเนอเยอ เพอใหไวรสอยในสภำพทเหมำะสมตอกำรเขำสเซลลเพำะเลยง

และกำรเหนยวน ำใหไวรสเขำสเซลลเพำะเลยงและเพมจ ำนวน หลกส ำคญของกำรเตรยมตวอยำงเนอเยอ

คอกำรแยกไวรสใหเปนอสระจำกเนอเยอ (virus extraction) โดยตองท ำดวยควำมรวดเรว และท ำใหเกด

ควำมเสยหำยตอไวรสนอยทสด เพอใหไวรสมควำมสมบรณและสำมำรถเขำสเซลลและเพมจ ำนวนได

1. การเตรยมตวอยางเนอเยอ

กำรเตรยมตวอยำงโดยทวไปใชวธกำรบดเนอเยอรวมกบทรำยละเอยด โดยเลอกตดชนเนอทมรอยโรค

ประมำณ 1 g ตดเปนชนเลกๆ น ำไปบดในโกรงบด โดยใชทรำยละเอยดชวยในกำรบด ใสพบเอส

(phosphate buffer saline; PBS) 5 ml ถง 10 ml คนใหเขำกนน ำไปปนเหวยงทควำมเรว 1500 g ถง 1900 g นำน 15 min ถง 30 min ทอณหภม 4 °C แลวดดแยกสวนใส (supernatant) เกบไวจำกนนจงน ำมำบม

(incubation) รวมกบเซลลเพำะเลยงเพอใหไวรสสำมำรถเขำสเซลลเพำะเลยงและเพมจ ำนวนได ส ำหรบ

ตวอยำงทเปนของเหลว เชน ซรม สำมำรถน ำมำบมรวมกบเซลลเพำะเลยงไดเลย

มกษ. 10401 (G)-2559

10

2. การเหนยวน าใหไวรสเขาสเซลลเพาะเลยงและเพมจ านวน

2.1 เซลลมาโครฟาจในถงลม

2.1.1 การเกบเซลลมาโครฟาจในถงลมจากปอดสกร

กำรคดเลอกสกรทจะใชแยกเซลลมำโครฟำจในถงลม ควรเปนสกรทปลอดโรคพอำรอำรเอส หรอเปนสกร

เอสพเอฟ (specific pathogen free; SPF) อำยไมเกน 8 สปดำห

(1) สวนลำงหลอดลมและถงลมปอดสกรเพอเกบน ำลำงทมเซลลมำโครฟำจโดยใชสำรละลำยพบเอส

ปรมำตร 200 ml สวนลำงผำนทำงหลอดลม บบนวดเนอปอดเพอใหเซลลมำโครฟำจหลดออก ดดเกบน ำลำง

ท ำซ ำ 3 ครง ถง 4 ครง

(2) รวบรวมน ำลำงหลอดลมและถงลมปอดมำปนตกตะกอนเซลลท 1,000 g เปนเวลำ 10 min เพอลำง

เซลลใหสะอำด จำกนนกระจำยตะกอนดวยสำรละลำยพบเอสสลบกบกำรปนตกตะกอนอก 2 ครง

(3) กระจำยตะกอนเซลลดวยสำรละลำยพบเอส ปรมำตร 50 ml จำกนนจงนบจ ำนวนเซลลเพอหำควำม

เขมขน และน ำมำใชแยกเชอไวรสไดทนท หรอเกบเซลลไวใชตอไปโดยปรบควำมเขมขนใหไดประมำณ

6 X 107เซลล/1.5 ml ในสำรละลำยทใชส ำหรบเกบเซลลแชแขง (cryopreservative) เชน dimethyl

sulfoxide (DMSO) และเกบในไนโตรเจนเหลว

ขอควรระวง: ไมควรน ำเซลลมำโครฟำจในถงลมทเกบไดจำกสกรแตละตว มำผสมกน

2.1.2 การทดสอบประสทธภาพของเซลลมาโครฟาจในถงลมทแยกไดจากสกรแตละตว

กอนน ำเซลลมำโครฟำจในถงลมมำใช ควรทดสอบควำมใชได (validation) ของเซลลทแยกไดแตละครง

(batch) โดยกำรทดสอบวดปรมำณไวรส (titrating) ดวยวธ IPMA หรอวธ IFA โดยใชเชอ PRRSV

ททรำบปรมำณแนนอน และเลอกใชเซลลเฉพำะชดทใหคำไดถกตองเทำนน

2.1.3 การเพาะแยกไวรสดวยเซลลมาโครฟาจในถงลมและการสงเกตพยาธสภาพของเซลล

(1) กำรเตรยมเซลลมำโครฟำจในถงลมในไมโครเพลตส ำหรบกำรเพำะเลยงเนอเยอ (tissue-culture

grade microplate) ชนดกนเรยบ ขนำด 96 หลม

(1.1) น ำเซลลมำโครฟำจในถงลม 6 X 107เซลล/1.5 ml จำกไนโตรเจนเหลวมำละลำย

(1.2) ลำงเซลลดวยสำรละลำยพบเอส ปรมำตรทงสน 50 ml

(1.3) ปนตกตะกอนท 300 g เปนเวลำ 10 min ทอณหภมหอง

(1.4) กระจำยตะกอนเซลลดวยอำหำรเลยงเซลล (growth medium; GM) ปรมำตร 40 ml

สวนประกอบของอำหำรเลยงเซลล คอ อำหำรเหลวอำรพเอมไอ 1640 (Rose-Peake Memorial Institute 1640;

RPMI-1640) ซงเสรมดวยเอฟบเอส (fetal bovine serum; FBS) รอยละ 5 และยำตำนจลชพ เชน เจนทำไมซน

มกษ. 10401 (G)-2559

11

(gentamicin) 100 µg/ml หรอ เพนนซลลน (penicillin) 10,000 ยนตตอมลลลตร (unit per milliliter; U/ml)

สเตรปโทไมซน (streptomycin) 10,000 U/ml และฟงจโซน (fungizone) 250 mg/ml

(1.5) แบงเซลลใสในไมโครเพลตขนำด 96 หลม ปรมำตร 100 µl/หลม

(2) กำรเจอจำงตวอยำงในไมโครเพลต

(2.1) เตมอำหำรเลยงเซลลลงในไมโครเพลตขนำด 96 หลม ปรมำตร 90 µl/หลม

(2.2) เตมตวอยำงปรมำตร 10 µl ลงในแถว A และ E ของไมโครเพลตแลวผสมใหเขำกน (เจอจำง 10 เทำ)

(2.3) ดดตวอยำงจำกแถว A และ E ปรมำตร 10 µl ใสลงในแถว B และ F แลวผสมใหเขำกน (เจอจำง

100 เทำ)

(2.4) ดดตวอยำงจำกแถว B และ F ปรมำตร 10 µl ใสลงในแถว C และ G แลวผสมใหเขำกน (เจอจำง

1,000 เทำ)

(2.5) ดดตวอยำงจำกแถว C และ G ปรมำตร 10 µl ใสลงในแถว D และ H แลวผสมใหเขำกน (เจอจำง

10,000 เทำ)

(3) กำรบมตวอยำง โดยบมทอณหภม 37 °C ในตบมทมคำรบอนไดออกไซด (CO2) 5%

(3.1) น ำตวอยำงทเจอจำงแลวใสลงในไมโครเพลตทมเซลลมำโครฟำจในถงลม ปรมำตร 50 µl/หลม (พำสสำจท 1)

(3.2) เจอจำงเชอ PRRSV ควำมเขมขน 103 TCID50 ดวยอำหำรเลยงเซลลในอตรำสวน 1:1 และใสลง

บนเซลลเพำะเลยง 200 µl ในหลมทใชเปนตวอยำงควบคมผลบวก

(3.3) บมเปนเวลำ 2 วน ถง 5 วน และอำนผลกำรเกดพยำธสภำพของเซลล (cytopathic effect; CPE) ผำน

กลองจลทรรศนชนดหวกลบ (inverted microscope) ทกวน

(3.4) ในวนท 2 ท ำกำรเตรยมเซลลมำโครฟำจในถงลมเพมอกในไมโครเพลตเปนพำสสำจท 2 และดง

สำรละลำยจำกไมโครเพลตท 1 สไมโครเพลตท 2 ปรมำตร 25 µl/หลม (พำสสำจท 2)

(3.5) บมเปนเวลำ 2 วน ถง 5 วน และอำนผลกำรเกดพยำธสภำพของเซลลทกวน

(4) กำรอำนและแปลผล

(4.1) หลมทเกดพยำธสภำพของเซลลมำโครฟำจในถงลมจำกพำสสำจท 1 เทำนนถอเปนผลบวกลวง

ทเกดจำกควำมเปนพษของตวอยำง

(4.2) หลมทเกดพยำธสภำพของเซลลมำโครฟำจในถงลมทงจำกพำสสำจท 1 และพำสสำจท 2 ใหสงสย

วำเปนผลบวกและน ำไปยนยนผลบวกดวยกำรตรวจหำไวรสภำยในเซลลเพำะเลยงตอไป

มกษ. 10401 (G)-2559

12

(4.3) หลมทไมเกดพยำธสภำพของเซลลมำโครฟำจในถงลม ใหน ำไปยนยนผลลบดวยกำรตรวจหำไวรส

ภำยในเซลลเพำะเลยงตอไป

น ำสำรละลำยทไดจำกทงพำสสำจท 1 และพำสสำจท 2 ปรมำตร 50 µl มำตรวจยนยนผลกำรเพำะแยกเชอดวยวธ IPMA โดยใชแอนตบอดทมควำมจ ำเพำะตอเชอ PRRSV (ตรวจสำรละลำยทงจำกหลมทเกด

และไมเกดพยำธสภำพของเซลล)

2.2 เซลลเอมเออารซ-145

2.2.1 การเพาะแยกไวรสดวยเซลลเอมเออารซ-145 และการสงเกตพยาธสภาพของเซลล

(1) เตรยมเซลลเพำะเลยงเอมเออำรซ-145 ทเจรญเปนลกษณะเซลลชนเดยว ในไมโครเพลตประเภท

6 หลม (พนทผวขนำด 9.5 cm2/หลม) โดยใหเซลลมควำมหนำแนนประมำณรอยละ 80

(2) ดดอำหำรเลยงเซลลออกดวยปเปตต

(3) ลำงผวหนำของเซลลเพำะเลยงโดยกำรเตมสำรละลำยพบเอส ปรมำตร 2 ml/หลม และเคำะดำนขำง

ของไมโครเพลตเบำๆ

(4) ดดสำรละลำยพบเอสออกดวยปเปตต

(5) ท ำซ ำขนตอนท (3) และ (4) อก 1 ครง

(6) เตมตวอยำงส ำหรบแยกเชอไวรสลงบนเซลลเพำะเลยง ปรมำตร 200 µl/หลม (ในกรณทเปนตวอยำง

ซรม ท ำกำรเจอจำงซรมดวยอำหำรเลยงเซลลชนดเอมอเอม (minimum essential medium; MEM) ใน

อตรำสวน 1:1 และใสลงบนเซลลเพำะเลยง 200 µl/หลม ยกเวนหลมทใชเปนตวอยำงควบคมผลบวก และหลมทใชเปนตวอยำงควบคมผลลบ

หมายเหต กำรเพำะแยกเชอทกครงตองมหลมทใชเปนตวอยำงควบคมผลบวกและตวอยำงควบคมผลลบ

เสมอ เพอใชยนยนควำมถกตอง

(7) เจอจำงเชอ PRRSV ควำมเขมขน 103 TCID50 ดวยอำหำรเลยงเซลลในอตรำสวน 1:1 และใสลงบน

เซลลเพำะเลยง 200 µl ในหลมทใชเปนตวอยำงควบคมผลบวก

(8) เตมอำหำรเลยงเซลล ปรมำตร 200 µl ในหลมทใชเปนตวอยำงควบคมผลลบ

(9) เอยงไมโครเพลตไปมำเพอใหตวอยำงเคลอบทวผวหนำของเซลลเพำะเลยง

(10) บมเซลลเพำะเลยง โดยบมทอณหภม 37 °C ในตบมทม CO2 5% เปนเวลำ 1 h โดยระหวำงกำรบม

ควรเอยงไมโครเพลตทก 15 min เพอใหตวอยำงเคลอบทวผวเซลล และไมใหผวหนำแหง

(11) ดดสำรละลำยทงหมดออกดวยปเปตต (ทกหลม)

มกษ. 10401 (G)-2559

13

(12) เตมอำหำรเลยงเซลลทมเอฟบเอส รอยละ 2 ถง 5 ปรมำตร 2 ml/หลม (ทกหลม) และบมเปน

เวลำ 48 h ถง 72 h

(13) สงเกตกำรเปลยนแปลงของเซลลทก 24 h ในกรณทมกำรเพมจ ำนวนของไวรสในเซลลอำจพบกำร

เปลยนแปลงทำงพยำธสภำพของเซลล เชน กำรเกดมวลเซลลรวม (syncytium) หรอ กำรตำยหรออำจไม

พบกำรเปลยนแปลงใดๆ เลย

(14) ในกรณทตองกำรเกบเชอไวรสส ำหรบตรวจยนยนผลกำรเพำะแยกเชอ ใหท ำกำรแชแขงเซลล

เพำะเลยงทอณหภม -80 °C สลบกบกำรละลำยทอณหภม 25 °C ถง 37 °C จ ำนวน 2 รอบ เพอใหเซลล

แตกและไวรสแยกออกจำกเซลล จำกนนดดสำรละลำยทมไวรสทงหมดเกบไวในหลอดทดลอง ควรเกบ

รกษำตวอยำงไวรสทอณหภม -80 °C หรอเกบในไนโตรเจนเหลวจนกวำจะน ำไปตรวจในขนตอนตอไป


รายการท 4 การตรวจหาสารพนธกรรมของเชอ PRRSV

RT-PCR เปนวธกำรตรวจยนยนกำรตดเชอ PRRSV โดยตรงทไดรบควำมนยมมำกทสด เนองจำกเปนวธท

ไมซบซอน และมควำมไวสง โดยกำรเพมปรมำณสำรพนธกรรมของไวรสโดยใชไพรเมอร (primers) ท

จ ำเพำะเพอใหไดปรมำณมำกเพยงพอในกำรตรวจสอบดวยวธอเลคโตรโฟเรซสตอไป วธ RT-PCR ทใชใน

มำตรฐำนฉบบน คอ multiplex PCR

ขนตอนกำรตรวจเรมจำกกำรสกดสำรพนธกรรม หรออำรเอนเอ (RNA) ของไวรส จำกนนน ำไปผำน

กระบวนกำรสรำงดเอนเอคสม (complementary DNA; cDNA) ดวยปฏกรยำรเวอรสทรำนสครปชน

(reverse transcription) แลวท ำกำรเพมจ ำนวนสำรพนธกรรมดวยปฏกรยำ PCR (polymerase chain

reaction) ตอไป


รายการท 4 การตรวจหาสารพนธกรรมของเชอ PRRSV

4.1 วธอำรท-พซอำร (reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR) มขนตอนดงน

4.1.1 สกดอำรเอนเอ (RNA) ของเชอ PRRSV

4.1.2 สรำงดเอนเอคสม (complementary DNA; cDNA)

4.1.3 เพมจ ำนวนดเอนเอเปำหมำยแบบทวคณโดยใชไพรเมอร (primers) จ ำเพำะ จนมจ ำนวนมำก

พอทจะตรวจพบได

4.1.4 แยกแถบดเอนเอดวยวธอเลกโทรโฟรซส (electrophoresis)

มกษ. 10401 (G)-2559

14

ควำมจ ำเพำะและควำมไวของ RT-PCR ขนกบไพรเมอรทใช กลำวคอไพรเมอรทใชตองอยบนต ำแหนงทเปน

ลกษณะเฉพำะของเชอ PRRSV ไมพบในสำรพนธกรรมอนๆ ซงจะมผลใหกำรเพมปรมำณสำรพนธกรรมใน

ปฏกรยำเกดขนเฉพำะกบเชอ PRRSV เทำนน และตองสำมำรถเพมปรมำณสำรพนธกรรมของเชอ PRRSV

ไดครอบคลมทกไอโซเลต (isolate) กำรตรวจหำสำรพนธกรรมดวยวธ RT-PCR มขนตอนดงน

(1) สกดอำรเอนเอของไวรสจำกตวอยำงโดยใช Trizol reagent หรอ ชดสกดอำรเอนเอส ำเรจรป โดยตง

สำรละลำยทสกดไดไวบนน ำแขงตลอดกำรทดสอบเพอปองกนกำรเสอมสลำยของอำรเอนเอ

(2) ผสมมำสเตอรมกซ (Master mix) ส ำหรบปฏกรยำ RT-PCR ตำมจ ำนวนตวอยำงทตองกำรทดสอบ

รวมทงตวอยำงควบคม 3 ตวอยำง (ตวอยำงควบคมผลบวกไวรสสำยพนธยโรป ตวอยำงควบคมผลบวก

ไวรสสำยพนธอเมรกำ และตวอยำงควบคมผลลบ) โดยมำสเตอรมกซมสวนประกอบ ดงตำรำงท 1

ตารางท 1 สวนประกอบมำสเตอรมกซ (ส ำหรบปฏกรยำปรมำตร 25 µl)

สารเคม ความเขมขน ปรมาตร/ตวอยาง

AccessQuickTM

MasterMix (2X) 12.5

AMV-RT 0.2 U/µl*

แมกนเซยมคลอไรด (MgCl2) 1mM**

ไพรเมอร N26

(Random hexamer)

0.8 µM***

ไพรเมอร FT1 0.8 µM***

ไพรเมอร FT2 0.8 µM***

หมายเหต*ยนตตอไมโครลตร (unit per microliter; U/ µl) **มลลโมลำร (millimolar; mM)

***ไมโครโมลำร (micromolar; µM)

ตารางท 2 แสดงล ำดบนวคลโอไทดของไพรเมอรทใชในมำตรฐำนฉบบน

ไพรเมอร ล าดบนวคลโอไทดของไพรเมอร 5'-3' ความจ าเพาะ

N26 GCCCTAATTGAATAGGTGAC ไทป 1/ไทป 2 ORF7

FT1 AGAAAAAGAAAAGTACAGCTCCGAT ไทป 1 ORF7

FT2 GTGAGCGGCAATTGTGTCTGTCG ไทป 2 ORF7

(3) แบงมำสเตอรมกซใสหลอดพซอำร ปรมำตรหลอดละ 20 µl (4) เตมตวอยำงอำรเอนเอทตองกำรทดสอบ หลอดละ 5 µl เตมตวอยำงควบคมผลบวกและตวอยำงควบคมผลลบลงในหลอดควบคมผลบวกและหลอดควบคมผลลบ หลอดละ 5 µl โดยตวอยำงควบคมผลลบใหใชน ำทปรำศจำกนวคลเอส (nuclease) จำกนนผสมสำรใหเขำกน

(5) ท ำปฏกรยำ RT-PCR ดวยเครองเทอรมลไซเคลอร (thermalcycler) โดยตงสภำวะในขนตอนตำงๆ ดงน

มกษ. 10401 (G)-2559

15

ปฏกรยา อณหภม เวลา จ านวนรอบ

กำรถอดรหสยอนกลบ

(reverse transcription; RT) 48

oC 45 min 1

กำรสญเสยสภำพธรรมชำต

(denaturation) 94

oC 2 min 1

กำรสญเสยสภำพธรรมชำต

แอนนลลง (annealing)

กำรยด (extension)

94oC

56oC

72oC

25 s

30 s

45 s

35

กำรยดครงสดทำย

(final extension) 72

oC 10 min 1

(6) ตรวจสอบผลดวยวธอเลกโทรโฟรซส โดยใชอะกำโรสเจล (agarose gel) 1.5 % และเปรยบเทยบแถบ

เรองแสงทเกดจำกผลตภณฑ (product band) กบแถบดเอนเอมำตรฐำน (DNA marker) และตวอยำงควบคม

ผลบวกเพออำนผลดงน (ภำพท 6)

- พบ product band ทต ำแหนง 425 base pairs (bp) ใหอำนผลเปนบวกตอไวรสสำยพนธยโรป

- พบ product band ทต ำแหนง 265 bp ใหอำนผลเปนบวกตอไวรสสำยพนธอเมรกำ

- ไมพบหรอไมม product band ทต ำแหนง 425 bp และ 265 bp ใหอำนผลเปนลบ

ภาพท 6 ตวอยำงผลกำรทดสอบดวยวธ RT-PCR

ทมำ: โครงกำรศกษำวธกำรชนสตรโรคทเหมำะสมส ำหรบโรคพอำรอำรเอสในสกร

และกำรศกษำสถำนะโรคในประเทศไทย

Lane 1= DNA marker

Lane 2 = ตวอยำงควบคมผลลบ

Lane 3 = ตวอยำงทใหผลลบ

Lane 4 = ตวอยำงทใหผลบวกตอไวรสสำยพนธยโรป (425 bp)

Lane 5 = ตวอยำงทใหผลบวกตอไวรสสำยพนธอเมรกำ (265 bp)

มกษ. 10401 (G)-2559

16


รายการท 5 การตรวจหาแอนตเจนของไวรส ดวยวธไอเอชซ (immunohistochemistry; IHC)

วธ IHC นใชในกำรบงชโปรตนของไวรส ซงกคอแอนตเจน ในตวอยำงเนอเยอทผำนกำรคงสภำพดวยสำรละลำยรกษำสภำพ ควบคไปกบกำรศกษำรอยโรคทำงจลพยำธวทยำโดยตวอยำงทจะน ำมำศกษำตอง

ผำนกำรเตรยมชนเนอทดเพอรกษำคณสมบตของแอนตเจนในตวอยำงนนไว

1. การคงสภาพและยอมสเนอเยอ

กำรเตรยมชนเนอประกอบดวยขนตอนกำรคงสภำพเนอเยอดวยสำรละลำยบพเฟอรฟอรมำลน 10% ซง

เปนสำรละลำยรกษำสภำพทใชกนอยำงแพรหลำย แลวจงน ำไปผำนขบวนกำรเตรยมชนเนอดวยน ำยำเคม

ตำงๆ ไดแก เอทำนอล ไซลน และพำรำฟนเหลว โดยทวไปนยมเตรยมดวยเครองเตรยมชนเนออตโนมต

จำกนนท ำกำรฝงชนเนอ (embedding) ในพำรำฟน ชนเนอทฝงในพำรำฟนแลวสำมำรถเกบทอณหภมหองได

หรอน ำไปตดดวยเครองตดชนเนอ (microtome) ใหมควำมหนำ 4 µm ถง 6 µm เพอเตรยมเปนสไลด

ส ำหรบยอมสพเศษซงประกอบดวยแอนตบอดทมควำมจ ำเพำะกบแอนตเจนของไวรส ตำมขนตอนดงน

(1) ละลำยพำรำฟนออกจำกแผนเนอเยอ (deparaffinization) ดวยไซลน

(2) ท ำใหแผนเนอเยอชมน ำ (rehydration) ดวยเอทำนอล และน ำกลน ตำมล ำดบ

(3) ท ำกำรคนสภำพแอนตเจน (antigen retrieval technique) โดยใชเอนไซมหรอวธอนทเหมำะสม

เพอใหแอนตบอดเขำไปจบกบแอนตเจนไดงำยซงจะท ำใหกำรยอมตดสดขน

(4) ขดขวำงกระบวนกำรเปอรออกซเดสภำยในเซลล (endogenous peroxidase blocking) โดยใช 3%

ไฮโดรเจนเปอรออกไซด

(5) ขดขวำงกำรจบทไมจ ำเพำะ (blocking of non-specific reaction) ของแอนตบอดและโปรตนใน

เนอเยอ โดยใช skim milk หรอ normal serum

(6) หยดแอนตบอดล ำดบท 1 ลงบนสไลด แลวน ำไปบมในกลองเกบควำมชนขำมคน จำกนนน ำออกมำ

ลำงดวยสำรละลำยพบเอส


รายการท 5 การตรวจหาแอนตเจนของไวรส ดวยวธไอเอชซ (immunohistochemistry; IHC)

5.1 น ำตวอยำงเนอเยอทผำนกระบวนกำรรกษำใหคงสภำพ มำยอมดวยสซงประกอบดวยแอนตบอดทม

ควำมจ ำเพำะกบแอนตเจนของเชอ PRRSV

5.2 ตรวจตวอยำงเนอเยอทไดดวยกลองจลทรรศน เนอเยอทตดเชอ PRRSV จะปรำกฏสตรงต ำแหนงของ

เนอเยอทมแอนตบอดจำกสยอมไปจบอยกบแอนตเจนของไวรส

มกษ. 10401 (G)-2559

17

(7) หยด peroxidase labeled polymer ลงบนสไลด โดยอำจใชชดทดสอบทมสำรทเปนพอลเมอร (polymer)

ซงมโมเลกลของ peroxidase และแอนตบอดล ำดบทสองอยรวมกน เชน ชดทดสอบ EnVision System

(DAKO; Denmark, A/S)

(8) น ำออกมำลำงดวยสำรละลำยพบเอสแลวเตมสำรละลำยของโครโมเจนและสำรตงตน (chromogen/

substrate solution) แลวน ำไปบม นำน 5 min จำกนนลำงดวยน ำกลน

(9) ท ำ counterstain โดยยอมทบดวยสฮมำทอกซลน (Hematoxylin) นำน 5 s ถง 10 s หรอขนกบควำม

เขมขนของสทใชแลวลำงออกดวยน ำประปำ จำกนนท ำกำรดงน ำออกจำกเซลล (dehydration) และท ำให

เนอเยอใส (clearing) แลวจงปดดวยกระจกปดสไลด

2. การตรวจดวยกลองจลทรรศน

ตรวจสไลดเนอเยอดวยกลองจลทรรศน โดยพบวำตวอยำงทใหผลบวกจะปรำกฏสตรงต ำแหนงของเนอเยอทม

แอนตบอดจำกสยอมไปจบอยกบแอนตเจนของไวรส (ภำพท 7)

ภาพท 7 แสดงแอนตเจนของไวรส (ตดสน ำตำล) ในไซโตพลำซมของเซลลมำโครฟำจในเนอเยอปอด

ทผำนกำรชนสตรดวยวธ IHC

ทมำ: น.สพ.พลกฤษณ เจรญชนกำนต


รายการท 6 การตรวจหาแอนตเจนหรอแอนตบอดดวยวธไอพเอมเอ (immunoperoxidase monolayer

assay; IPMA)

6.1 ยอมสและตรวจหำไวรสภำยในเซลลเพำะเลยงโดยใชแอนตบอดทมควำมจ ำเพำะตอเชอ PRRSV ตำม

ขนตอนดงน

6.1.1 เตรยมเซลลเพำะเลยง

6.1.2 ใสตวอยำงทตองกำรตรวจหำเชอ PRRSV และเหนยวน ำใหไวรสเขำสเซลลเพำะเลยงและเพมจ ำนวน

6.1.3 ใสแอนตบอดล ำดบทหนงซงจ ำเพำะตอเชอ PRRSV และแอนตบอดล ำดบทสองซงผำนกำรตดฉลำก

ดวยเอนไซม

6.1.4 ตรวจเซลลเพำะเลยงทไดดวยกลองจลทรรศน หำกมเชอ PRRSV อยภำยในเซลลเพำะเลยงจะพบกำร

ตดส ในขณะทเซลลปกตจะไมตดส

มกษ. 10401 (G)-2559

18



assay; IPMA)

กำรตรวจหำไวรสดวยวธ IPMA เปนกำรยอมสไวรสภำยในเซลลเพำะเลยงโดยใชแอนตบอดทม

ควำมจ ำเพำะตอไวรส ซงโดยมำกจะใชในกำรแปลผลกำรเพมจ ำนวนไวรสดวยเซลลเพำะเลยง

หลกกำรของวธ IPMA คอ หำกมเชอ PRRSV อยภำยในเซลลเพำะเลยง สำมำรถตรวจหำเชอ PRRSV ใน

เซลลได โดยเรมจำกปรบสภำพเซลลเพำะเลยงใหแอนตบอดสำมำรถผำนเขำสภำยในเซลลได จำกนนจะ

ใหแอนตบอดล ำดบทหนง (primary antibody) ทจ ำเพำะตอเชอ PRRSV เขำไปจบกบไวรสทอยภำยใน

เซลลเพำะเลยง ตอมำจะใหแอนตบอดล ำดบทสอง (secondary antibody) ซงจ ำเพำะตอแอนตบอดล ำดบ

ทหนง เขำไปจบกบแอนตบอดล ำดบทหนง โดยแอนตบอดล ำดบทสองนจะมกำรตดฉลำกดวยเอนไซม

เมอใสสำรตงตนของเอนไซมจะมผลท ำใหสำรตงตนเกดส และจะพบเหนกำรตดสของเซลลทมไวรสอยภำยใน

(ภำพท 8) ในขณะทเซลลปกตจะยอมไมตดส

ผลกำรทดสอบดวยวธ IPMA สำมำรถน ำมำใชค ำนวณปรมำณไวรสได

กำรตรวจหำไวรสดวยวธ IPMA มขนตอนดงน

(1) เตรยมเซลลเพำะเลยงเอมเออำรซ-145 ใหมลกษณะเปนเซลลชนเดยวในไมโครเพลตชนดกนเรยบ ขนำด

96 หลม โดยใหเซลลมควำมหนำแนนประมำณรอยละ 80

(2) น ำตวอยำงไวรสทเกบไวทอณหภม -80°C ออกมำตงไวทอณหภมหองจนละลำยและตงตวอยำงบน

น ำแขงตอไป

(3) เจอจำงตวอยำงไวรสในหลอดทดลองขนำด 1.5 ml โดยเจอจำงเชงอนกรมในลกษณะ 10 เทำ (10-fold

serial dilution) ดวยอำหำรเลยงเซลลชนดเอมอเอมเพอใหไดตวอยำงทมควำมเขมขน 100 ถง 10

-7

(หลอดละหนงควำมเขมขน) โดยมปรมำตรควำมเขมขนละ 500 µl ตงตวอยำงไวรสบนน ำแขงตลอดเวลำ

(4) ดดอำหำรเลยงเซลลจำกไมโครเพลตในขนตอนท (1) ออกทง

(5) ลำงผวหนำของเซลลเพำะเลยงโดยกำรเตมสำรละลำยพบเอส 100 µl/หลม และเคำะดำนขำงของ ไมโครเพลตเบำๆ

(6) ดดสำรละลำยพบเอสออกดวยปเปตต

(7) ท ำซ ำขนตอนท (5) และ (6) อก 1 ครง

(8) ใสไวรสทง 8 ควำมเขมขนลงในเซลลเพำะเลยง โดยเรยงตำมล ำดบควำมเขมขน และท ำซ ำ

ควำมเขมขนละ 4 หลมปรมำตร 100 µl/หลม ยกเวนหลมทใชเปนตวอยำงควบคมผลบวกและตวอยำงควบคมผลลบ

มกษ. 10401 (G)-2559

19

(9) ตวอยำงควบคมผลบวกใชไวรสททรำบควำมเขมขน และตวอยำงควบคมผลลบใชเพยงอำหำรเลยง

เซลลชนดเอมอเอม

(10) บมเซลล โดยบมทอณหภม 37 °C และม CO2 5% เปนเวลำ 1 h

(11) เตมอำหำรเลยงเซลลทมเอฟบเอสรอยละ 5 หลมละ 100 µl (ทกหลม)

(12) บมเซลลเปนเวลำ 48 h

(13) ดดอำหำรเลยงเซลลออก

(14) ตรงเซลลเพำะเลยงทมกำรตดเชอไวรส โดยกำรเตมสำรละลำยส ำหรบตรงเซลล (ฟอรมำลนเขมขน

0.4% ทเจอจำงดวยสำรละลำยพบเอสท (PBS Tween; PBST) เชน polysorbate 20 (Tween 20) ควำมเขมขน

0.5% ปรมำตร 100 µl/หลม)

(15) บมทอณหภมหองเปนเวลำ 30 min

(16) สะบดไมโครเพลตเพอทงสำรละลำยและเคำะไมโครเพลตบนกระดำษดดซบเพอใหสำรละลำยออกทงหมด

(17) ลำงเซลลดวยกำรเตมสำรละลำยพบเอสท ควำมเขมขน 0.5% ปรมำตร 200 µl/หลม

(18) สะบดไมโครเพลตเพอทงสำรละลำยและเคำะไมโครเพลตบนกระดำษดดซบเพอใหสำรละลำยออกทงหมด

(19) ท ำซ ำขนตอนท (17) และ (18) รวม 3 ครง

(20) เตมแอนตบอดล ำดบท 1 (SDOW 17 ซงเปน mouse anti-PRRSV, monoclonal antibody)

ควำมเขมขน 1:1,000 (เจอจำงดวยสำรละลำยพบเอสท) ปรมำตร 50 µl/หลม

(21) บมทอณหภมหองเปนเวลำ 1 h

(22) ลำงเซลลตำมขนตอนท (17) และ (18) รวม 3 ครง

(23) เตมแอนตบอดล ำดบท 2 (HRP-conjugated, rabbit anti-mouse Ig, polyclonal antibody)

ควำมเขมขน 1:300 (เจอจำงดวยสำรละลำยพบเอสท) ปรมำตร 50µl/หลม


(25) ลำงเซลลตำมขนตอนท (17) และ (18) รวม 3 ครง

(26) เตมสำรละลำยเออซเปอรออกซเดสซบสเตรท (3-amino-9-ethylcarbazole; AEC peroxidase

substrate) ปรมำตร 50 µl/หลม


(28) ลำงดวยน ำเปลำเพอหยดปฏกรยำและตำกไมโครเพลตใหแหง

มกษ. 10401 (G)-2559

20

(29) ตรวจสอบผลดวยกลองจลทรรศน โดยเซลลทตดเชอไวรสจะพบกำรตดสน ำตำลแดงในไซโตพลำซม

(ภำพท 8)

ภาพท 8 กำรตดสน ำตำลแดงในไซโตพลำซมของเซลลเอมเออำรซ-145 ทตดเชอ

PRRSV จำกกำรชนสตรดวยวธ IPMA ทมำ: โครงกำรศกษำวธกำรชนสตรโรคทเหมำะสมส ำหรบโรคพอำรอำรเอสในสกร

และกำรศกษำสถำนะโรคในประเทศไทย


กำรตรวจหำแอนตบอดทจ ำเพำะตอเชอ PRRSV ดวยวธ IPMA ท ำไดโดยกำรบมเซลลเพำะเลยงรวมกบเชอ

PRRSV เพอใหไวรสเขำสเซลลและเพมจ ำนวน จำกนนใสตวอยำงซรมสกรทตองกำรตรวจหำแอนตบอด ซง

หำกในซรมมแอนตบอดทจ ำเพำะตอไวรสทอยภำยในเซลลเพำะเลยง แอนตบอดจะจบตดอยกบแอนตเจน

ของไวรส ในกรณทในซรมไมมแอนตบอดทจ ำเพำะตอไวรส แอนตเจนของไวรสจะยงคงอยอยำงอสระ

ตอมำเมอท ำกำรใสแอนตบอดล ำดบท 2 ซงมควำมจ ำเพำะตอแอนตบอดของสกรจะมผลใหแอนตบอด

ล ำดบท 2 จบตดอยกบแอนตบอดของสกรซงจบอยกบแอนตเจนของไวรสในเซลลเพำะเลยง นอกจำกน

แอนตบอดล ำดบท 2 ทใชนนจะเปนแอนตบอดทมกำรตดฉลำกดวยเอนไซม ซงเมอใสสำรตงตนของ

เอนไซมดงกลำวลงไปจะเกดปฏกรยำเปลยนสำรตงตนใหเปนตะกอนส และสำมำรถตรวจสอบไดดวย

กลองจลทรรศน



assay; IPMA)

6.2 วธ IPMA อำจใชในกำรตรวจวดระดบแอนตบอดตอเชอ PRRSV ในซรมตวอยำงได โดยใชไวรสท

ตองกำรศกษำมำตรวจหำแอนตบอดในซรม

มกษ. 10401 (G)-2559

21

กำรตรวจทำงซรมวทยำดวยวธ IPMA มขนตอนดงน

(1) กำรเตรยมเซลลมำโครฟำจในถงลมในไมโครเพลตชนดกนเรยบ ขนำด 96 หลม

(1.1) น ำเซลลมำโครฟำจในถงลม 6 X 107 เซลล/1.5 ml จำกไนโตรเจนเหลวมำละลำย

(1.2) ลำงเซลลดวยสำรละลำยพบเอส ปรมำตร 50 ml

(1.3) ปนตกตะกอนท 300 g เปนเวลำ 10 min ทอณหภมหอง

(1.4) กระจำยตะกอนเซลลดวยอำหำรเลยงเซลล ปรมำตร 40 ml

สวนประกอบคอ อำหำรเหลวอำรพเอมไอ 1640 ซงเสรมดวยเอฟบเอสรอยละ 5 และยำตำนจลชพ เชน

เจนทำไมซน 100 µg/ml หรอ เพนนซลลน 10,000 U/ml สเตรปโทไมซน 10,000 U/ml และฟงจโซน

250 mg/ml

(1.5) แบงเซลลใสในไมโครเพลตขนำด 96 หลม ปรมำตร 100 µl/หลม

(1.6) บมทอณหภม 37 oC ในตบมทม CO2 5% เปนเวลำ 18 h ถง 24 h

หมายเหต ขนตอนนสำมำรถใชเซลลเอมเออำรซ 145 แทนเซลลมำโครฟำจในถงลมได

(2) กำรใสเชอ PRRSV

(2.1) ใสเชอ PRRSV 105 TCID50/ml ลงในเซลลเพำะเลยง 50 µl/หลม ใหใสไวรสทกหลม โดยเวนไว

2 หลมเพอใชเปนตวอยำงควบคม

(2.2) บมเปนเวลำ 18 h ถง 24 h

(3) กำรตรงสภำพเซลล

(3.1) ดดอำหำรเลยงเซลลในไมโครเพลตออกทงหมด และลำงดวยสำรละลำยพบเอส

(3.2) เคำะไมโครเพลตเบำๆ บนผำ ใหสำรละลำยหลดออกจำกหลมไมโครเพลต

(3.3) ท ำใหแหงโดยกำรบมทอณหภม 37 oC เปนเวลำ 45 min

(3.4) น ำไมโครเพลตไปแชแขงทอณหภม -20 oC เปนเวลำ 45 min

(3.5) เตมสำรละลำยพำรำฟอรมำลดไฮดเยน (ในสำรละลำยพบเอส) ควำมเขมขนรอยละ 4 และบมท

อณหภมหองเปนเวลำ 10 min

หมายเหต ในขนตอนตำมขอ (3.4) และขอ (3.5) อำจใชกำรบมดวยเอทำนอลบรสทธเยน โดยบมท

อณหภม 5 oC เปนเวลำ 45 min แทนได

(3.6) ทงสำรละลำยเดมทอยในไมโครเพลต และลำงดวยสำรละลำยพบเอส

มกษ. 10401 (G)-2559

22

(4) กำรเจอจำงตวอยำงซรม

(4.1) ใสสำรละลำยไดลชนบฟเฟอร (dilution buffer) ซงประกอบดวยโซเดยมคลอไรด (NaCl) 0.5 โมลำร

(Molar; M) 4% ซรมมำ (horse serum) 0.5% polysorbate 80 (Tween 80) pH 7.2 ลงในแถว A และ E

ของไมโครเพลตเปลำ ปรมำตร 180 µl/หลม

(4.2) ใสสำรละลำยไดลชนบฟเฟอร 120 µl/หลม ในหลมทเหลอ

(4.3) ใสซรมสกรทตองกำรตรวจแอนตบอด (หรอตวอยำงควบคมผลบวก) ลงในแถว A และ E ปรมำตร

20 µl/หลม แลวผสมใหเขำกน (เจอจำง 10 เทำ)

(4.4) ท ำกำรเจอจำง 4 เทำโดยกำรดดสำรจำกแถว A และ E ปรมำตร 40 µl ใสลงในหลม B และ F

และท ำกำรเจอจำงในลกษณะนจนครบถงแถว D และ H (สดทำยจะไดซรมเจอจำง 10, 40, 160 และ

640 เทำ)

(5) กำรใสตวอยำงซรมและแอนตบอดล ำดบท 2

(5.1) น ำตวอยำงซรมทเจอจำงแลวใสลงในไมโครเพลตทมเซลลมำโครฟำจในถงลม ปรมำตร 50 µl/หลม

(5.2) ปดฝำไมโครเพลต และบมทอณหภม 37 oC เปนเวลำ 1 h

(5.3) ทงตวอยำงซรม และลำงเซลลดวยบฟเฟอร ซงประกอบดวยโซเดยมคลอไรด 0.15 M และ 0.5%

Tween 80 จ ำนวน 3 ครง

(5.4) เจอจำงแอนตบอดล ำดบท 2 เชน rabbit anti-swine HRPO conjugate ในบฟเฟอร โดยตองท ำ

กำรทดสอบหำควำมเขมขนทเหมำะสมกอน

(5.5) ใสสำรละลำยแอนตบอดล ำดบท 2 ทเจอจำงแลวลงบนเซลลในไมโครเพลต ปรมำตร 50 µl/หลม ทกหลม

(5.6) ปดฝำไมโครเพลต และบมทอณหภม 37 oC เปนเวลำ 1 h

(5.7) ลำงเซลลดวยบฟเฟอร 3 ครง

(6) กำรยอมส

(6.1) ใสสำรละลำยของโครโมเจนและสำรตงตน ลงในทกหลม ปรมำตร 50 µl/หลม

หมายเหต สำรละลำยของโครโมเจนและสำรตงตน เตรยมโดย

(1) เตรยมสำรละลำยแอซเทตบฟเฟอร ควำมเขมขนรอยละ 0.05 และปรบ pH ใหเปน 5.0

ดวยกรดแอซตก

(2) เตม AEC ทเตรยมเปนสำรละลำยเผอใช (stock solution) 1 ml ลงในแอซเทตบฟเฟอร 19 ml

(3) เตมสำรละลำย H2O2 ควำมเขมขนรอยละ 30 ปรมำตร 10 µl ลงไปในสำรตำมขอ (2)

มกษ. 10401 (G)-2559

23

(6.2) บมทอณหภมหอง 30 min

(6.3) แทนทสำรละลำยเออซดวยสำรละลำยโซเดยมแอซเทต (sodium acetate) 0.05 M pH 5.0

(7) กำรอำนผล

(7.1) หลมทใสซรมทมแอนตบอดทจ ำเพำะตอเชอ PRRSV จะเหนกำรตดสแดงภำยในเซลลเพำะเลยง

และรปแบบกำรตดสนนจะมลกษณะเปนกลมของเซลล ในขณะทซรมทไมมแอนตบอดทจ ำเพำะจะไมพบ

กำรยอมตดสใดๆ ในเซลลเพำะเลยง

(7.2) กำรตดสแบบไมจ ำเพำะจะเกดในลกษณะของกำรตดสเกอบทกเซลลกระจำยทวหลม

(7.3) ระดบภมคมกน (titer) ของซรมพจำรณำจำกคำกำรเจอจำงซรมสงสดทใหผลบวกรอยละ 50 ของหลม

(ระดบภมคมกนมคำเปน 10, 40, 160 และ 640 โดยทระดบภมคมกนคำมำกหมำยถงมแอนตบอดมำก)

ระดบภมคมกนนอยกวำ 10 ถอเปนลบ

ระดบภมคมกน 10 และ 40 ถอเปนบวกระดบต ำ (weak positive)

ระดบภมคมกนมำกกวำหรอเทำกบ 160 ถอเปนบวก


รายการท 7 การตรวจหาแอนตเจนหรอแอนตบอดดวยวธไอเอฟเอ (immunofluorescence assay; IFA)

วธ IFA เปนกำรตรวจหำแอนตบอดตอเชอ PRRSV ในซรมตวอยำง โดยอำศยกำรเกดปฏกรยำระหวำง

แอนตเจนและแอนตบอดของไวรสทจ ำเพำะกนแลวสงเกตกำรเรองแสงของสำรสทตดอยกบแอนตบอด


รายการท 7 การตรวจหาแอนตเจนหรอแอนตบอดดวยวธไอเอฟเอ (immunofluorescence assay; IFA)

7.1 ตรวจหำแอนตบอดตอเชอ PRRSV ในซรม โดยอำศยกำรจบกนของแอนตบอดในซรมและแอนตเจน

ของไวรสทจ ำเพำะกน ตำมขนตอนดงน

7.1.1 เตรยมเซลลเพำะเลยง

7.1.2 ใสเชอ PRRSV และเหนยวน ำใหไวรสเขำสเซลลเพำะเลยงและเพมจ ำนวน

7.1.3 ใสซรมตวอยำง และแอนตบอดล ำดบทสองซงตดฉลำกสำรเรองแสง

7.1.4 ตรวจเซลลเพำะเลยงทไดดวยกลองจลทรรศนชนดฟลออเรสเซนส (fluorescence microscope) หำกใน

ซรมมแอนตบอดตอเชอ PRRSV จะจบกบไวรสในเซลลเพำะเลยงและเรองแสงภำยใตกลองจลทรรศนฟลออ-

เรสเซนส

7.2 วธ IFA อำจใชในกำรตรวจหำเชอ PRRSV ในตวอยำงได โดยใชแอนตบอดทจ ำเพำะตอเชอ PRRSV มำ

ตรวจหำเชอในตวอยำง

มกษ. 10401 (G)-2559

24

ล ำดบทสองภำยใตกลองจลทรรศนฟลออเรสเซนสนอกจำกน ยงสำมำรถน ำวธ IFA ไปใชในกำรตรวจหำเชอ PRRSV ในตวอยำง โดยกำรใชแอนตบอดทจ ำเพำะตอไวรส

กำรทดสอบดวยวธ IFA ท ำไดโดยเพำะเลยงเซลลเอมเออำรซ-145 ในไมโครเพลตหรอสไลดแกวส ำหรบ

เพำะเลยงเชอแบบแปดชอง (eight-chamber slide) จำกนนจงใสไวรสลงในเซลลเพำะเลยงแลวน ำไปบม

เพอใหไวรสเขำสเซลล เพอน ำไปใชทดสอบทำงซรมวทยำตอไป โดยท ำกำรเจอจำงซรมสกรทจะทดสอบลง

20 เทำ แลวใสในเซลลเพำะเลยงทตดเชอไวรส หำกในซรมสกรมแอนตบอดทจ ำเพำะตอเชอ PRRSV

แอนตบอดดงกลำวจะจบกบแอนตเจนของไวรสทอยในไซโตพลำซมของเซลลเพำะเลยง ขนตอไปจงใส

แอนตบอดล ำดบทสองคอ anti-porcine IgG ซงตดสำรสฟลออเรสซน (fluorescein) เพอใหไปจบกบ

แอนตบอดในซรมสกรซงจบอยกบไวรสในเซลลอกตอหนง จำกนนน ำเซลลเพำะเลยงไปตรวจสอบภำยใต

กลองจลทรรศนฟลออเรสเซนส เพอสงเกตกำรเรองแสงของแอนตเจน-แอนตบอด คอมเพลกซดงกลำว

กำรตรวจดวยวธ IFA มขนตอนดงน

(1) เตรยมเซลลเพำะเลยงเอมเออำรซ-145 ในไมโครเพลตชนดกนเรยบ ขนำด 96 หลม

(1.1) ใสอำหำรเลยงเซลลซงปรำศจำกเอฟบเอส ปรมำตร 50 µl ลงในไมโครเพลตในแถวท 2, 4, 6, 8,

10 และ 12 ตำมแนวตง (column) ของไมโครเพลต

อำหำรเลยงเซลลมสวนประกอบ ดงน

- Minimal Essential Medium; MEM ซงม L-glutamine 2 mM

- Sodium pyruvate 1 mM

- ยำตำนจลชพเพนนซลลน 100 U และสเตรปโตมยซน 100 µg

(1.2) ยอยเซลลเอมเออำรซ-145 ทเลยงไวในขวดเลยงเชอ (culture flask) เพอน ำมำใชงำน โดยเตรยม

ใหมควำมเขมขนประมำณ 2.5 x 105 เซลลตอ ml จำกนนใชไมโครปเปตตเตมเซลลทละลำยอยในอำหำร

เลยงเซลล (cell suspension) ลงในไมโครเพลตหลมละ 150 µl

(1.3) ใสเชอ PRRSV 102.2

TCID50/50ml ปรมำตร 50 µl/หลม ลงในไมโครเพลต ในแถวท 1, 3, 5,

7, 9 และ 11 ตำมแนวตง (column) ของไมโครเพลต

(1.4) บมทอณหภม 37 oC ในตบมทม CO2 5% เปนเวลำ 48 h ถง 72 h

นอกจำกน อำจใชวธเตรยมเซลลเพำะเลยงเอมเออำรซ-145 ในไมโครเพลตแลวบมใหเซลลเกด confluent

กอน จำกนนจงเตมเชอ PRRSV ทควำมเขมขน 105 TCID50/ml ปรมำตร 50 µl/หลม แลวจงบมตออก

48 h ถง 72 h เพอใหไวรสเขำเซลล

กรณทเตรยมเซลลเพำะเลยงเอมเออำรซ-145 ใน eight-chamber slide ใหเตมเซลลเอมเออำรซ-145

ทละลำยอยในอำหำรเลยงเซลล (เชน เอมอเอมทม 10% เอฟบเอส) ซงมควำมเขมขนประมำณ 1 x 105

เซลลตอ ml ลงใน eight-chamber slide ชองละ 500 µl จำกนนบมเปนเวลำ 48 h ถง 72 h ใหเซลลเกด

มกษ. 10401 (G)-2559

25

confluent แลวจงเตมเชอ PRRSV ทควำมเขมขน 105 TCID50/ml ปรมำตร 50 µl/หลม แลวน ำไปบมตออก

18 h เพอใหไวรสเขำเซลล

(2) กำรตรงสภำพเซลล

(2.1) น ำอำหำรเลยงเซลลในไมโครเพลตหรอ eight-chamber slide ออกทงหมด และลำงดวยสำรละลำยพบเอส

(2.2) เตมแอซโทน (acetone) ทเยน อณหภม 4 oC ซงมควำมเขมขน 80% (ในน ำ) ปรมำตร 150 µl/หลม ใน

ไมโครเพลต น ำไปบมทอณหภม 4 oC เปนเวลำ 30 min ในกรณของ eight-chamber slide ใหใชแอซโทน

ซงมควำมเขมขน 80% ถง 100% ในกำรตรงสภำพเซลล ทอณหภมหอง เปนเวลำ 10 min ถง 15 min

(2.3) น ำแอซโทนออก แลวทงไวใหแหงทอณหภมหอง

(2.4) สำมำรถน ำไมโครเพลตหรอ eight-chamber slide ไปใชทดสอบในขนตอนตอไปไดทนท หรอเกบท

อณหภม -70 oC จนกวำจะใชงำน

(3) กำรเจอจำงซรม

เจอจำงตวอยำงซรมทตองกำรทดสอบลง 20 เทำ โดยใชสำรละลำยพบเอส ทมควำมเขมขน 0.01 M

(pH 7.2) ปรมำตร 190 µl และซรม 10 µl รวมทงเจอจำงซรมจำกตวอยำงควบคมผลลบ และตวอยำงควบคมผลบวกเพอน ำไปใชในขนตอนตอไป

(4) กำรใสตวอยำงซรมในเซลลเพำะเลยง

(4.1) น ำซรมจำกตวอยำงทตองกำรทดสอบ รวมถงซรมจำกตวอยำงควบคมผลลบและตวอยำงควบคม

ผลบวกทเจอจำงแลว ใสลงในไมโครเพลตหรอ eight-chamber slide ทมเซลลเอมเออำรซ-145 ซงผำน

กำรท ำใหตดเชอ PRRSV และทมเซลลเอมเออำรซ-145 ปกต โดยใสซรมปรมำตร 50 µl/หลม (หรอตอ

ชอง)

(4.2) ปดฝำไมโครเพลตหรอ eight-chamber slide แลวบมท 37 oC ในสภำพทมควำมชน เปนเวลำ 30 min

(4.3) ทงตวอยำงซรม และลำงเซลลดวยสำรละลำยพบเอส 200 µl จ ำนวน 6 ครง

(5) กำรใสแอนตบอดล ำดบท 2

(5.1) เตมแอนตบอดล ำดบท 2 เชน rabbit or goat anti-swine IgG ซงคอนจเกต (conjugate) กบสำรส

ฟลออเรสซน (fluorescein isothiocyanate; FITC) ปรมำตร 50 µl/หลม

(5.2) ปดฝำไมโครเพลตหรอ eight-chamber slide แลวบมทอณหภม 37 oC ในสภำพทมควำมชน เปน

เวลำ 30 min

(5.3) ทงแอนตบอดล ำดบท 2 และลำงเซลลดวยสำรละลำยพบเอส 200 µl จ ำนวน 4 ครง เคำะไมโครเพลตหรอ eight-chamber slide บนกระดำษดดซบเบำๆ เพอน ำสำรละลำยสวนเกนออก

มกษ. 10401 (G)-2559

26

(5.4) น ำไมโครเพลตหรอ eight-chamber slide ไปอำนผลภำยใตกลองจลทรรศนฟลออเรสเซนสดวย

ฟลเตอรทเหมำะสม เชน สำรสฟลออเรสซน FITC ใชควำมยำวคลน 460 nm ถง 490 nm

(6) กำรอำนผล

(6.1) ตวอยำงซรมทมแอนตบอดทจ ำเพำะตอเชอ PRRSV จะเหนกำรเรองแสงในไซโตพลำซมของ

เซลลเอมเออำรซ-145 ทตดเชอ แตไมพบกำรเรองแสงในเซลลเอมเออำรซ-145 ปกต ควำมเขมของกำร

เรองแสงจะแปรผนตำมปรมำณแอนตบอดทจ ำเพำะตอเชอ PRRSV ทมอยในซรม

(6.2) ตวอยำงซรมทไมมแอนตบอดทจ ำเพำะตอเชอ PRRSV จะไมพบกำรเรองแสงใดๆ ในเซลลเพำะเลยง

(6.3) ในกำรแปลผลใหเปรยบเทยบกบตวอยำงควบคมผลบวกและตวอยำงควบคมผลลบเสมอ


รายการท 8 การตรวจหาแอนตบอดดวยวธอไลซา (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)

กำรตรวจวนจฉยโรคตดเชอ PRRSV โดยวธ ELISA เปนวธทมกำรพฒนำมำอยำงตอเนอง มกำรน ำไปใช

อยำงแพรหลำยในฟำรมและหองปฏบตกำรตำงๆ เนองจำกเปนวธทมคำใชจำยต ำกวำวธอน สำมำรถใชใน

กำรตรวจตวอยำงจ ำนวนมำก และผลทไดสำมำรถน ำมำใชวเครำะหสถำนะของโรคในฝงสกรไดเปนอยำงด

ชดทดสอบ ELISA ส ำเรจรปทใชในปจจบนเปนชดทดสอบทมกำรพฒนำโดยผผลตชดทดสอบ สำมำรถ

ทดสอบกำรตดเชอ PRRSV กลมสำยพนธอเมรกำและกลมสำยพนธยโรปไดอยำงแมนย ำ ทงน ขนตอนกำร

ทดสอบและกำรแปลผล มควำมแตกตำงกนตำมเทคโนโลยทผผลตแตละรำยใชในกำรผลตชดทดสอบ และชด

ทดสอบ ELISA แตละชนดกมควำมจ ำเพำะและควำมไวในกำรตรวจโรคทแตกตำงกน

ตวอยำงกำรตรวจดวยวธ ELISA โดยใชชดทดสอบ IDEXX PRRS X3 (IDEXX Laboratory, USA) มขนตอน

ดงน

(1) ตงสำรละลำยตำงๆ ของชดทดสอบไวทอณหภมหองจนมอณหภม 18 oC ถง 26

oC และกลบขวดสำร

ไปมำเพอใหผสมเปนเนอเดยวกน

(2) เตรยมซรมทจะทดสอบโดยท ำกำรเจอจำง 40 เทำดวยสำรละลำยส ำหรบเจอจำง (sample diluent)


รายการท 8. การตรวจหาแอนตบอดดวยวธอไลซา (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA)

8.1 ตรวจหำแอนตบอดตอเชอ PRRSV ในซรม โดยอำศยกำรจบกนของแอนตบอดในซรมและแอนตเจน

ของไวรสทจ ำเพำะกน และใสแอนตบอดทตดฉลำกดวยเอนไซม เพอบงชกำรเกดปฏกรยำ

8.2 วดคำกำรดดกลนแสงดวยเครองอำนผลอไลซำ (ELISA reader)

มกษ. 10401 (G)-2559

27

(3) เตรยมสำรละลำยส ำหรบลำง โดยน ำสำรละลำยเขมขนส ำหรบลำง (wash concentrate) มำท ำกำรเจอจำง

10 เทำดวยน ำกลน หรอ deionized (DI) water

(4) ใสตวควบคมผลบวกและตวควบคมผลลบ ลงในอไลซำเพลต (ELISA plate) อยำงละ 2 หลม ปรมำตร

100 µl/หลม โดยไมตองเจอจำง

(5) ใสตวอยำงซรมทเจอจำงแลวในขนตอนท (2) ลงในหลมอนๆ ปรมำตร 100 µl/หลม

(6) บมทอณหภมหองเปนเวลำ 30+2 min แลวเทสำรละลำยจำกทกหลมทง

(7) ลำงหลมดวยกำรเตมสำรละลำยส ำหรบลำง ทเตรยมไวในขนตอนท (3) ปรมำตร 300 µl/หลม ทกหลม แลวเทสำรละลำยจำกทกหลมทง โดยใหท ำกำรลำง 3 ครง ถง 5 ครง และเคำะอไลซำเพลตเพอให

สำรละลำยออกจำกหลม

(8) ใสสำรละลำยคอนจเกต ปรมำตร 100 µl/หลม ทกหลม

(9) บมทอณหภมหองเปนเวลำ 30+2 min แลวเทสำรละลำยจำกทกหลมทง

(10) ลำงดวยวธกำรตำมขนตอนท (7)

(11) ใสสำรละลำยซบสเตรททเอมบ (TMB substrate) ปรมำตร 100 µl/หลม ทกหลม

(12) บมทอณหภมหองเปนเวลำ 15+1 min

(13) ใสสำรละลำยส ำหรบหยดปฏกรยำ (stop solution) ปรมำตร 100 µl/หลม ทกหลม

(14) น ำอไลซำเพลตไปอำนคำกำรดดกลนแสง (optical density; OD) ดวยเครองอำนผลอไลซำ (ELISA

reader) ทควำมยำวคลนแสง 650 nm

(15) อำนผลโดยค ำนวนจำกคำ S/P ratio (sample to positive ratio) (ภำพท 9)

อำนผลเปนลบในกรณทคำ S/P ratio มคำนอยกวำ 0.40

อำนผลเปนบวกในกรณทคำ S/P ratio มคำมำกกวำหรอเทำกบ 0.40

ภาพท 9 กำรค ำนวณคำ S/P ratio ในชดตรวจสอบอไลซำ

คำเฉลยตวควบคมลบ (NCavg) = (คำ OD ตวควบคมลบ 1) + (คำ OD ตวควบคมลบ 2)

2

คำเฉลยตวควบคมบวก (PCavg) = (คำ OD ตวควบคมบวก 1) + (คำ OD ตวควบคมบวก 2)

2 คำ S/P ratio = (คำ OD ตวอยำง) - (NCavg)

(PCavg - NCavg)

มกษ. 10401 (G)-2559

28

หมายเหต

กำรอำนผลจะท ำไดตอเมอ

(1) ผลตำงของคำเฉลยของตวอยำงควบคมผลลบและตวอยำงควบคมผลบวก มคำมำกกวำหรอเทำกบ

0.150 และ

(2) คำเฉลยของตวอยำงควบคมผลลบมคำนอยกวำหรอเทำกบ 0.150

มกษ. 10401 (G)-2559

29

ภาคผนวก ก

หนวย

หนวยและสญลกษณทใชในมำตรฐำนนและหนวยท SI (International System of Units หรอ Le Systè me

International d’ Unit è s) ยอมรบใหใชไดมดงน

รายการ ชอหนวย สญลกษณหนวย

ปรมาณ

ไมโครกรม (microgram) µg

มลลกรม (milligram) mg

กรม (gram) g

ปรมาตร ไมโครลตร (microliter) µl มลลลตร (milliliter) ml

ขนาด/ความยาว

นำโนเมตร (nanometer) nm

ไมโครเมตร (micrometer) µm

เซนตเมตร (centimeter) cm

เวลา

ชวโมง (hour) h

นำท (minute) min

วนำท (second) s

อณหภม องศำเซลเซยส (degree Celsius) oC

คาแรงเหวยง แกรวต (gravity) g

guidance on the application of thai agricultural … ·...

Documents