Hücre Pasajlama Ve Çoğaltma

Uzm. Bio. Gamze ÇAĞATAY

Hücrelerin tanımlanması • Morfolojik (hücre iskeleti..)

• Yaşam şartları (beslenme, doubling time)

• Genetik karakterizasyon (karyotip, onco ve tsg belirlenmesi)

• İmmunolojik karakterizasyon

• Tümörijenik karakterizasyon

Pasajlama • Hücreler sıkışık (konfluent) duruma gelince hem besi

ortamı hücreler için yetersiz hale gelir, hem de kültür kabında yer olmadığı için kontakt inhibisyon adı verilen mekanizma ile hücrelerin çoğalmaları durur.

Neler gerekli? • Soğutmalı santrifüj

• Plastik tüpler

• Pastör pipeti

• Mikropipetler

• PBS

• Tripsin veya hücre kazıyıcı

• Flask

• Sayım lamı

• Serolojik pipet

Soğuk /Ilık tripsinizasyon

Pasaj (subculture) süreci

Sorular? • Neden pasaj? Çok sayıda hücre eldesi için, uzun süreli kullanımlarda,

senesense girmelerini engellemek için

**Hücreler çok yalnız kalırlarsa ya da çok kalabalık olurlarsa da ölürler

• Neden Tripsin? • Tripsin dışında enzim kullanabilir miyiz? Papain, PBS/EDTA, Detachin Cell

Detachment Solution (protease, and collagenase activities), Sitrik salin metot (KCl, sodyum sitrat)

• Yalnızca EDTA kullanabilir miyiz? √ • Transforme hücrenin (tumor immortelize; karsinojen ya da virüs ile) pasajı ile

primer kültür hücrelerinin pasajı aynı mıdır?

Ne zaman pasaj yapmalıyız? • Hücreler %70- 80

yoğunluğa ulaşınca • Büyüme artışının

olduğu gözlenip karar verilemezse

• pH düşüklüğünden kaynaklanan medyum rengine belirleyicidir.

• Son pasajdan 7 gün geçmiş ise (Uzun aralıklı pasaj yapmayınız)

• Kons düşük olsa bile ölümler artınca.

Besiyeri değiştrime zamanı

• pH:6,5 Büyüme durduğunda

• pH:6 Canlılık kaybında

• Hücre konsantrasyonu ilk yapılandan tam iki kat olduğunda yapılabilir. (%20’den %50’ye çıkınca)

• Kons düşük ancak ölümler artınca

İlk aşama: Hücrelerin yüzeyden kaldırılması

Tripsin

Tripsinizasyon • Dokudaki hücrelerin veya flasklarda yer alan hücrelerin süspansion

haline getirilmesi işlemi...

• Farklı konsantrasyonları var. %0,25, %0,05 37° C’de 5 dakika İnkübasyon

• FBS veya içinde FBS olan medyumla tripsinizasyon durdurulur

• Neden FBS?

İçinde α2- macroglobulin (α2M, A2M;antiproteaz) var. Tripsini inaktive eder.

• SANTRİFÜJ

İkinci aşama: Tripsinin üzerine besiyeri eklenmesi

Taze besiyeri ekleme

Üçüncü aşama: Hücre sayımı

Üçüncü aşama: Hücre sayımı

Dördüncü aşama: Hücre bölme ve

Besiyeri ekleme

Teşekkür ederim..