A D A N A L F R E D O TA P I A E C H E G A RAYC E N T R O U N I V E R S I TA R I O D E C I E N C I A S D E L A

S A LU DM E D I C I N A G E N Ó M I C A

TERAPIA GÉNICA PARA EL TRATAMIENTO DE HEMOFILIA B UTILIZANDO PLASMIDO PINC

LIBERADO AL MÚSCULO CON ELECTROPORACIÓN.

• El uso de terapia génica para producir niveles sistémicos de factor IX humano para el tratamiento de la hemofilia B se ha evaluado clínicamente utilizando vectores basados en virus. La eficacia de este enfoque ha sido limitada debido a las respuestas inmunes contra los componentes virales.

• Un enfoque alternativo es usar métodos físicos tales como la electroporación in vivo para administrar ADN plasmídico, evitando así algunas de las complicaciones asociadas con los sistemas de administración basados en virus.

• Existe un método, que consiste en una inyección intramuscular de plásmido formulado con un polímero aniónico y seguido por electroporación, que puede producir una alta eficiencia de transfección y altos niveles de proteína sistémica de factor IX después de una única administración.

• La inyección directa de plásmido en el músculo esquelético es todavía un método relativamente ineficiente y altamente variable de transferencia génica. Sin embargo, los informes publicados han demostrado que la aplicación de un campo eléctrico al músculo inmediatamente después de la inyección del plásmido aumenta la expresión génica por lo menos 2 órdenes de magnitud.

• Usando esta metodología, hemos logrado niveles potencialmente terapéuticos circulantes de factor IX humano (cristmas) en ratones y perros.

• En ratones se logró una expresión a largo plazo y se demostró la capacidad para readministrar el plásmido formulado. En perros normales, la expresión de factor cristmas alcanzó el 0,5-1,0% de los niveles normales.

• Los niveles elevados de creatina quinasa circulante y el examen histológico indicaron un trauma menor transitorio asociado con el procedimiento.

• Estos datos muestran que la administración génica utilizando un plásmido formulado con un polímero PINC aumentado con electroporación es escalable en modelos animales grandes y representa un enfoque prometedor para tratar pacientes con hemofilia B.

• Hemofilia B, enfermedad de Christmas.• Recesivo ligado al X.

Hemorragias con frecuencia en articulaciones, hematomas intramusculares, retroperitoneales, en tubo digestivo, genitourinario y retrofaríngeo.

• 5200 hombres afectados de los cuales 45% representan un caso severo de la enfermedad.

PREPARACIÓN Y REPARACIÓN DEL PLÁSMIDO

• El plásmido de factor IX humano se preparó insertando una secuencia de codificación sintética en la que se convirtieron codones diferentes a los predominantes y se juntaron a los sitios de empalme crípticos potenciales (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA). La secuencia de codificación de FIX se insertó en el esqueleto del plásmido de Valentis que contenía una UTR de 107 pb, un intrón sintético de 117 pb, la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humano, un origen de replicación PUC12 y un gen de resistencia a la kanamicina (21).

INYECCIÓN Y ELECTROPORACIÓN

• Ketamicina (anestésico) ratones.• Xelazina• Acepromacina• Dos impulsos de 25 ms a una tensión de 375 V /

cm se generaron entonces con un Porator cuadrado eléctrico T-820.

• Los perros fueron inyectados con isoflurano.• También se inyectaron partículas de carbono en

algunos de los músculos después de la electroporación como marcador del sitio de inyección para análisis histológicos.

PLASMA Y RECOLECCIÓN DEL SUERO

• Se tomaron 250 l de sangre de los ratones, que después fue centrifugada. • Los niveles plásmaticos se obtuvieron utilizando

ELISA. Así como los niveles de eritropoyetina.• Para perros la sangre se obtuvo de la vena

yugular.

ANÁLISIS CON WESTERN BLOT• Después de la electroforesis, la proteína se transfirió a una

membrana de nitrocelulosa (Novex). Las membranas se incubaron primero en plasma canino (1:50) a partir de animales tratados o de perros normales (control negativo). Para el control positivo, la membrana se incubó en plasma canino normal marcado con anticuerpo anti-hF.IX de conejo (1: 1000 final). El segundo anticuerpo era anticuerpo anti-canino conjugado con conejo (Sigma) o anticuerpo anti-conejo de oveja conjugado con HRP (Sigma), o bien peroxidasa de rábano picante (HRP). Las bandas en las transferencias se visualizaron usando un kit de sustrato de peroxidasa

ANÁLISIS HISTOLÓGICO• En pocas palabras, las criosecciones de 10 m de tejido se

fijaron en paraformaldehído al 3% durante 15 minutos, se aclararon en PBS, se trataron con metanol durante 10 min, se lavaron tres veces en PBS y luego se bloquearon en suero de cabra normal al 20%.

RESULTADOS