UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACEUTICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y TECNOLOGIA QUIMICA

“EFECTO DE LA ADICIÓN DE HIDROLIZADOS DE LEVADURA

Saccharomyces cerevisiae EN LA OBTENCIÓN DE LECHES

ACIDIFICADAS”

Profesor Patrocinante: José Mario Romero Reyes

Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química

Universidad de Chile

Directores de Memoria: Pedro Carriles Cobos

Área Manager Lallemand Chile

José Mario Romero Reyes Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química

Universidad de Chile

MARIA JOSE CASTAÑON GONZALEZ

MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO EN ALIMENTOS

SANTIAGO, 2009

DEDICATORIA

A Dios y familia con mucho cariño

AGRADECIMIENTOS

Al profesor José Mario Romero, por su apoyo, conocimientos, carisma y

disposición durante todo el desarrollo de esta memoria.

Al profesor Luis López, por su apoyo y conocimientos.

A la profesora Andrea Bunger, por su excelente disposición.

A mis amigas por su compañía, en especial Annie, Anjela, José Novoa y otras

muy importantes durante toda la carrera.

A mi mamá y familia por su amor, paciencia y apoyo incondicional.

A Dios por estar junto a mí en cada paso.

ÍNDICE GENERAL

DEDICATORIA ………………………………………………………………………………... II

AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………………………III

ÍNDICE GENERAL ……………………………………………………………………………IV

RESUMEN ……………………………………………………………………………………..VI

SUMMARY…………………………………………………………………………………….VII

CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN……………………………………………………………....1

1.1. Antecedentes generales………………………………………………………………...4

1.1.1. Descripción general de la levadura…………………………………………….4

1.1.1.1. Hidrolizados ………………………………………………………....7

1.1.1.1.1. Proceso de autolisis celular en la levadura………….........9

1.1.1.1.2. Componentes liberados durante la autolisis………….10

1.1.2. Fermentación láctica……...………………………………………………….…11

1.1.2.1. Leches fermentadas…………………………………………..…..13

1.1.2.1.1. Leches fermentadas como alimentos funcionales………14

1.2. Objetivos………………………………………………………………………….……16

1.2.1. Objetivo general……………………………………………………………….…16

1.2.2. Objetivos específicos………...………………………………………………16

CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS……...………………………………………..17

2.1. Lugar de Trabajo………………………………………………………………………..17

2.2. Materiales………………………………………………………………………………...17

2.2.1. Materias primas…………………………………………………………………17

2.2.2. Reactivos…………………………………………………………………………17

2.2.3. Insumos y utensilios………………………………………………………….…18

2.2.4. Equipos e instrumentos……………………………………………………..….18

2.3. Métodos…………………………………………………………………………………...19

2.3.1. Proceso de autolisis para la obtención de hidrolizados de levadura………19

2.3.1.1. Levadura seca………………………………………………..……..20

2.3.1.2. Rehidratación levadura…………………………………………….20

2.3.1.3. Autolisis……………………………………………………………...20

2.3.1.4. Pasteurización………………………………………………….…..20

2.3.1.5. Centrifugación………………………………………………………20

2.3.1.6. Determinación del porcentaje de hidrólisis…………………..….20

2.3.1.7. Determinación de nitrógeno total………………………….……..21

2.3.1.8. Determinación de amino nitrógeno …………………...……...…21

2.3.2. Proceso de fermentación láctica con adición de hidrolizados……………..22

2.3.2.1. Leche entera………………………………………………………...23

2.3.2.2. Adición de inóculo…………………………………………………..23

2.3.2.3. Adición de hidrolizados………………………………………….....23

2.3.2.4. Fermentación…………………………...………………………...…24

2.3.2.5. Refrigerado……………………………………………………….....24

2.3.2.6. Determinación de lactosa……………………………………….....25

2.3.2.7. Determinación de pH…………………………………………….....25

2.3.2.8. Determinación de ácido láctico………………………………...….25

2.3.2.9. Rendimiento teórico de la fermentación láctica...........................26

2.3.3. Determinación de vitaminas………………………………………………….27

2.3.4. Evaluación sensorial del yogurt………………………………...……………27

CAPÍTULO III: RESULTADOS Y DISCUSIONES…………...……………………………29

3.1. Determinación de nitrógeno total……………………………………………………….29

3.2. Determinación de amino nitrógeno…………………………………………………….29

3.3. Determinación del porcentaje de hidrólisis……………………………………………30

3.4. Determinación de la cinética de la fermentación láctica………………………….....32

3.4.1. Rendimiento de los procesos de fermentación….…………………...…..36

3.5. Determinación de proteína total en el yogurt…………………………………………37

3.6. Determinación de vitaminas……………………...………………………………...…..38

3.7. Evaluación sensorial………………………………………………………...…………..39

CAPÍTULO IV: CONCLUSIONES………………………………………………………….42

CAPÍTULO V: BIBLIOGRAFÍA……..………………………………………………………43

RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue obtener autolizados o hidrolizados de levadura

Saccharomyces cerevisiae para su adición durante el proceso de obtención de leches

acidificadas.

Los hidrolizados se hicieron a través de un proceso de autolisis celular, donde

las enzimas endógenas degradan la pared celular de la levadura y liberan el contenido

citoplasmático al medio extracelular. El proceso de autolisis se realizó a diferentes

condiciones de temperatura, 30, 35, 40, 45 y 50ºC por 72 horas y se controló,

determinando el contenido de N total en la levadura seca y el N asimilable en el

extracto líquido del hidrolizado, obteniendo así, el porcentaje de hidrólisis total. El

mayor porcentaje de hidrólisis total fue de 18 % y se obtuvo a 45º C. El hidrolizado

obtenido en estas condiciones, se separó en extracto líquido, sólido y extracto

completo (mezcla de extracto líquido y sólido), y se adicionó a la fermentación láctica.

Todos los procesos de fermentación se realizaron en las mismas condiciones

(45º C x 6 h). Se determinó la cinética de fermentación láctica en los procesos con la

adición de los extractos en distintas etapas (al inicio y a mitad del proceso) y en

relación, 3,5 ml y 7 ml por 100 ml de medio de fermentación. Los rendimientos (Y p/s)

más altos se obtuvieron en los procesos con adición de 7 % de extracto líquido y con 7

% del extracto completo, ambos, al inicio de la fermentación, logrando un aumento de 7

% en la conversión de lactosa en acido láctico, al compararse con el control. Además

el producto obtenido con adición de 7 % del extracto líquido al inicio del proceso,

presentó un 6 % más de proteína total que el control y contenidos normales de

vitamina B1 y B2, con un aumento de tiamina.

Se realizó evaluación sensorial a los productos obtenidos en la fermentación

con adición de extractos al inicio del proceso y con las dos concentraciones utilizadas,

aplicando el test de diferencias contra control. Los datos se evaluaron mediante

análisis de ANOVA y test de Tukey (DSH), donde, no existieron diferencias

estadísticamente significativas entre jueces, pero sí, entre muestras con adición de

extractos y el control. Además los jueces destacaron la presencia de sabor salado en

las muestras, y lo calificaron como desagradable.

SUMMARY

Effect of the addition of hydrolyzed yeast (Saccharomyces cerevisiae)

during the acidified milks

The aim of this study was to obtain autolyzed or hydrolyzed Saccharomyces

cerevisiae in orden to be incorporated uring the process of acidified milk production.

The hydrolysates were obtained through a cellular autolysis process, where the

endogenous enzymes degrade the yeast cell wall and release the cytoplasmitic

contents into the extracellular medium. The autolysis process was done at different

temperature conditions; 30, 35, 40, 45 and 50 Celsius degrees for 72 hours and

monitored by determining the N total content in the dry yeast and the N assimilated in

the liquid extract of the hydrolyzed, obtaining so, the percentage of total hydrolysis.

The highest percentage of total hydrolysis was 18% at 45°C. The hydrolyzed

obtained under these conditions was divided in liquid, solid and complete extract, the

last was an extract mixture of liquid and solid, and was added to the lactic

fermentation.

All fermentation processes were conducted under the same conditions (45°C for

6 hours). The kinetics of the lactic fermentation in the processes with the addition of the

extract in different stages (at the beginning and at the middle of the process) and in

relation, 3.5 ml and 7 ml per 100ml of fermentation medium. Was determinated the

highest yields (Yp/s) were obtained in the process with addition of 7% of the liquid

extract and with 7% of the complete extract, both, at the beginning of the fermentation,

achieving a 7% increase in the conversion of the lactose in lactic acid, when compared

with the control. Additionally, the product obtained with addition of 7% of the liquid

extract at the beginning of the process; show a 6% more protein than the control, and

normal content of vitamin B1 and B2, with an increase of thiamine.

Sensory evaluation was performed on products obtained from fermentation with

the addition of extracts at the beginning of the process and with the two used

concentrations, applying the test of differences against control. The data was evaluated

using ANOVA analysis and Turkey test (DSH), where no statistically significant

differences were found among judges, but, they were found between samples

containing extracts addition and control. Besides, the judges highlighted the presence

of salty taste in samples, and described it as unpleasant.

Capítulo I

INTRODUCCIÓN

La biotecnología alimentaría tradicional utiliza las actividades de los

microorganismos para producir diferentes tipos de alimentos. Productos lácteos como

el queso y leches acidificadas, encurtidos, vinagre, vino y cerveza involucran en su

obtención un proceso de fermentación. Actualmente es creciente la preocupación de la

población por ingerir alimentos naturales y disminuir el consumo de productos ricos en

azúcar, sal y grasa. Así también, es cada vez mayor el interés por alimentos con

propiedades funcionales, como forma de prevenir enfermedades. Entre los diferentes

tipos de alimentos con estas características se destacan los productos lácteos, como

las leches fermentadas, que contienen microorganismos probióticos liberadores de

ácido láctico el cual que tiene la capacidad de facilitar la digestión de los alimentos y la

absorción de los nutrientes (Dragone ,2007).

La mayoría de los autores coinciden en definir probióticos como aditivos

alimentarios constituidos por microorganismos vivos, que tienen un efecto beneficioso

en la fisiología y la salud del hospedero (Marteau y cols., 2001). Además son capaces

de estimular la producción de anticuerpos y producir enzimas que destruyen sustancias

tóxicas o cancerígenas y presentar acción antibacteriana (Teo y Tan, 2005). Los

prebióticos son aquellos componentes no digeribles que afectan de manera positiva al

huésped porque estimulan en forma selectiva el crecimiento y/o la actividad

metabólica de una cepa, o de un número limitado de cepas de bacterias del colon

(Roberfroid, 2001).

Las leches fermentadas se consumen desde la antigüedad encontrándose

referencias a estos productos en proverbios, leyendas y textos antiguos. Los productos

lácteos acidificados proceden del Oriente y se hicieron muy populares en la Europa

central y oriental. El primer ejemplo de leche acidificada fue presumiblemente

producido de forma accidental por nómadas. Leche acidificada es el nombre genérico

que incluye productos tales como el yogur, kéfir, mazada acidificada, nata acidificada y

koumiss. Este nombre genérico deriva del hecho de ser la leche la materia prima que

se inocula con un cultivo de fermentos que convierte parte de la lactosa en acido

láctico (Manual de industrias lácteas, 2003).

En España, Isaac Carasso empieza a producir yogur industrialmente en

Barcelona para ser vendido en farmacias en 1917 (Aranceta y Serra, 2004). A este

ámbito sanitario y excepcional se limita su consumo hasta que, a partir de la década de

los 60, su popularidad empieza a extenderse, convirtiéndose en la actualidad en un

alimento habitual de consumo diario (Tamime, 1991).

El yogurt y las leches fermentadas presentan una serie de propiedades

beneficiosas para la salud que les hace considerarse como alimentos funcionales, a la

vez que contienen multitud de ingredientes funcionales para la formulación de otros

alimentos. Además, estos productos lácteos son un vehículo excelente para la

inclusión de otros ingredientes funcionales de origen lácteo o no lácteo, bacterias

probióticas, carbohidratos prebióticos, fibra alimentaria, compuestos antioxidantes, etc.

(Recio y López-Fandiño, 2005). Por estas razones, hoy en día han salido al mercado

distintos productos como yogurt congelado en forma de paletas o helados, yogurt

líquido y yogurt seco para usarse como ingrediente en sopas, aderezos para ensaladas

y productos de confitería (López y cols., [s.a.]).

El valor nutricional de la levadura por su parte es conocido y antiguo. Pero el

que la levadura constituya también un valioso complemento para el hombre y los

animales es un hecho relativamente reciente, y su introducción como tal se remonta

sólo a los últimos decenios. Las guerras desencadenadas en Europa dieron impulso a

los estudios en este sentido, porque al fallar las importaciones de ultramar, muchos

países se encontraban ante un grave déficit de proteínas. La investigación intensiva y

la experiencia práctica revelaron que el valor de la levadura no se limitaba en modo

alguno a su elevado contenido proteico, 50 % aproximadamente, sino que las

vitaminas que contiene y otros factores activos son, por lo menos, igualmente

importantes. Los experimentos sobre la alimentación revelan que la levadura, debido

especialmente a su elevado contenido de lisina y valina, es un excelente suplemento

de la proteína de los cereales, y que aumenta en grado considerable el valor nutritivo

de los alimentos a base de cereales, tales como el pan (Schmidt, 1953).

Por otra parte los hidrolizados o autolizados de levadura son el producto de la

acción autolítica de las proteasas intracelulares de la misma levadura en la fase

estacionaria del crecimiento provocando la salida del contenido citoplasmático al

medio de cultivo en el cual se encuentra la levadura (Pérez y cols., 2001).

Los hidrolizados también llamados extractos de levadura que son producidos a

partir de una cepa especialmente seleccionada de Saccharomyces cerevisiae tienen la

notable propiedad de conferir e intensificar naturalmente el aroma original de los

diversos productos finales, además de conferir cuerpo a alimentos como: sopas,

caldos, condimentos, salsas, bocados, embutidos, derivados de tomate y platos

preparados. Hoy en día existen además extractos de levadura ricos en aminoácidos

libres, minerales y vitaminas, siendo un complejo de nutrientes eficiente para ser

utilizado en procesos de fermentación industrial y medios de cultivo con la ventaja de

ser naturales o no-genéticamente modificados.

Los hidrolizados se utilizan ampliamente en la tecnología alimentaria por sus

propiedades nutricionales o funcionales, solubilidad, poder emulsificante, capacidad

espumante, etc. (Benítez y cols., 2008)

La evaluación sensorial de todos los productos, resulta hoy imprescindible para

evaluar y analizar la calidad sensorial de los alimentos, como comentan Costell−Duran,

los inconvenientes y los riesgos que conllevan son, en la mayoría de los casos,

menores que las ventajas que aporta si se utiliza correctamente (Mori, 1989).

La adición de estos hidrolizados de levadura se presenta como una alternativa

interesante para la mejora o enriquecimiento de productos como leches fermentadas.

1.1. Antecedentes Generales

1.1.1. Descripción general de la levadura:

Las levaduras son organismos unicelulares de los cuales existen cerca de 600

especies. Estos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, pero el

género Saccharomyces es el que ofrece mayor interés industria y aunque consta de

41 especies, Saccharomyces cerevisiae es la levadura que más se emplea en

numerosos procesos fermentativos. Resultan fáciles de cultivar tanto en laboratorio

como a escala industrial, con un medio de cultivo que contenga azúcares, sales

minerales y una pequeña cantidad de extracto de levaduras o peptonas. Las células

de levadura tienen una composición química aproximada de 40% de proteínas, 15%

de ácidos nucleicos, 25% de polisacáridos, 15% de lípidos y 5% de compuestos

hidrosolubles como nucleótidos, aminoácidos, azucares, factores de rendimiento y

enzimas entre otras (Pérez, 2000).

Una característica destacada de la levadura es la gran proporción de las

sustancias nitrogenadas que contiene. La cantidad varía mucho, al parecer de acuerdo

a las condiciones de nutrición en las que la levadura se ha crecido, pero en general

Figura 1.1. Imagen microscópica de la levadura.

más de la mitad de la materia seca se compone de proteínas y de otros órganos

nitrogenados. Los distintos componentes compuestos de nitrógeno son glucógeno,

goma, mucílago, la grasa, materia resinosa, de celulosa y, junto con una buena

proporción de los ingredientes minerales (Simmonds, [s.a.]).

Las levaduras contienen todos los aminoácidos considerados esenciales por la

OMS y la FAO (Informe 522 de 1973).

Las levaduras contienen una importante cantidad de vitaminas hidrosolubles

del complejo B, fuente indispensable para el hombre pues muchas veces deben ser

incorporadas para lograr el normal desarrollo de las funciones celulares durante el

crecimiento y la reproducción. El complejo B incluye a las vitaminas B1-B2-B6, niacina

y ácido fólico, biotina-pantotenato; sus funciones son las de participar en reacciones

enzimáticas como co-enzimas (B1, B6, niacina, biotina, ácido fólico y pantotenato); en

la síntesis de ácidos nucleicos (biotina y ácido fólico) y como activadores de funciones

de la respiración celular (B2 y niacina).

Los principales componentes de la pared celular de Saccharomyces cerevisiae

son mano-proteínas y β-glucanos en proporciones más o menos iguales y pequeñas

Energía [kcal] 164 Calcio [mg] 86 Vit. B1 Tiamina [mg] 9,7

Proteína [g] 27,8 Hierro [mg] 3,7 Vit. B2 Riboflavina [mg] 14,3

Hidratos carbono [g] 11,8 Yodo [µg] ___ Eq. niacina [mg] 97

Fibra [g] 3 Magnesio [mg] 180 Vit. B6 Piridoxina [mg] 1,3

Grasa total [g] 0 Zinc [mg] 2,1 Ac. Fólico [µg] 1010

AGS [g] 0 Selenio [µg] 18 Vit. B12 Cianocobalamina [µg] 0,5

AGM [g] 0 Sodio [mg] 3600 Vit. C Ac. ascórbico [mg] 0

AGP [g] 0 Potasio [mg] 2600 Retinol [µg] 0

AGP/AGS Fósforo [mg] 104 Carotenoides (Eq. ß carotenos) [µg] 0

(AGP + AGM)/AGS Vit. A Eq. Retinol [µg] 0

Colesterol [mg] 0 Vit. D [µg] ___

Alcohol [g] 0 Vit. E Tocoferoles [µg] 0

Agua [g] 34

Tabla 1.1. Composición nutricional de la levadura. Aporte por 100 g de porción comestible Porción comestible % = 100. Fuente: Sociedad Chilena de Nutrición, Bromatología y Toxicología.

cantidades de N-acetilglucosamina. (Conzelmann y cols. 1988; Ballou, 1990; Rinsum y

cols., 1991). La capa de glucano tiene la función de soportar y mantener la rigidez de

la pared, mientras que la de mano-proteínas determina su permeabilidad (Zlotnik y

cols., 1984; Blagoeva y cols., 1991).

A continuación se presenta una tabla comparativa de composición aminoácidos

y vitaminas de algunos alimentos y la levadura.

Huevo entero

Carne Leche Levadura Guisantes Trigo

Aminoácidos esenciales

Arginina 100 + 13 - 33 - 27 + 39 - 30

Histidina 100 - 10 + 20 + 13 - 43 - 5

Isoleucina 100 - 21 - 22 - 7 - 49 - 55

Leucina 100 - 13 + 23 - 17 - 30 - 26

Lisina 100 + 6 + 4 - 14 - 30 - 65

Metionina 100 - 22 - 20 - 71 - 76 - 76

Fenilalanina 100 - 27 -16 - 36 - 24 - 40

Treonina 100 + 9 - 6 + 2 - 20 - 39

Triptofano 100 - 20 + 7 - 9 - 53 - 9

Valina 100 - 21 - 10 - 9 - 45 - 44

Vitaminas

B1, tiamina 100 + 36 - 73 +1540 + 446 + 58

B2, riboflavina 100 + 3 - 39 +1680 - 21 - 25

Niacina 100 462 - 62 +1720 + 75 + 588

B6, pirodoxina 100 - 30 - 90 + 60 - 93 - 72

Acido pantoténico

100 - 46 - 89 + 36 - 75 - 64

H, biotina 100 - 96 - 97 + 100 - 97 - 100

Tabla 1.2. Contenido de aminoácidos y vitaminas en 5 alimentos. Fuente: Revista de Silvicultura y Productos Forestales, 1953.

1.1.1.1. Hidrolizados:

El grado de hidrólisis es la propiedad fundamental de un hidrolizado y va a

determinar en gran medida las características del mismo y por lo tanto su posible uso.

El grado de hidrólisis final está determinado por las condiciones utilizadas, siendo

estas, concentración, tiempo de incubación y las condiciones fisicoquímicas tales

como el pH y la temperatura. Debido a la hidrólisis, las propiedades moleculares de las

proteínas cambian, produciéndose la disminución del peso molecular, el aumento de la

carga y la liberación de grupos hidrofóbicos, entre otros fenómenos (Caessens y cols.,

1999). Estos cambios moleculares pueden ser detectados con varios métodos

analíticos. Existen diferentes métodos para realizar la hidrólisis de las levaduras

pudiendo agruparse estos en métodos químicos (hidrólisis ácida y química) métodos

físicos (hidrólisis térmica) y métodos biológicos (autolisis con o sin control, hidrólisis

enzimática) (Rodríguez y cols., 2008).

Los hidrolizados que se producen para su uso en alimentación se pueden

agrupar en: hidrolizados con bajo grado de hidrólisis, entre el 1% y el 10%, para la

mejora de las propiedades funcionales; hidrolizados con grado de hidrólisis variable

para su uso como saborizantes y por último, hidrolizados extensivos, con grado de

hidrólisis superior al 10%, para su uso en alimentación especializada (Benítez y cols.,

2008).

El material de partida para la obtención de hidrolizados puede ser de origen

animal, vegetal o microbiano. Entre los vegetales los más usados son soja, trigo arroz,

principalmente en países desarrollados. De los sustratos de origen animal se utiliza el

pescado, principalmente en países orientales, como Japón y Corea.

Para la elección de la fuente adecuada a utilizar, debe tenerse en cuenta el uso

que vaya a tener el hidrolizado, así como el valor agregado del producto final con

respecto al sustrato inicial. Por ejemplo, para la obtención de hidrolizados con

propiedades gelificantes y emulsificantes se suele emplear colágeno y gelatina por su

capacidad de formar geles transparentes (Adler-Nissen y Olsen, 1979). Como fuente

de fermentación para el crecimiento de microorganismos se emplean hidrolizados de

levadura o caseína. Cuando la finalidad del hidrolizado es su uso como fuente de

nitrógeno, se usan proteínas de pescado y proteínas microbianas en alimentación

animal y proteínas de soja y lácteas en alimentación humana, siendo estas últimas, la

materia prima ideal para la preparación de alimentos infantiles y dietas (Kong y cols.,

2007).

También dependiendo de las materias primas utilizadas suelen denominarse

según la tabla 1.3:

En forma generalizada, la preparación de estos productos se desarrolla a

través de los siguientes procesos tradicionales (Cabrera y Rolz, 1977).

Autólisis: Incubación de las células en medio acuoso a pH 6,5 y 45 – 50 ºC,

donde las enzimas endógenas degradan la pared celular, liberando la porción

intracelular.

Plasmólisis: autólisis en presencia de altas concentraciones de NaCl (hasta

25%), la cual acelera el proceso.

Fuente de materias primas de naturaleza

proteica Productos elaborado

Levadura panadera Extracto de levadura, hidrolizado enzimático de

lavadura

Kluyveromyces marxianus Autolizado de levadura

Levadura cervecera Extracto de levadura, hidrolizado enzimático de

lavadura

Levadura forrajera Extracto de levadura, hidrolizado enzimático de

lavadura

Levaduras Extracto

Otras levaduras Autolizado de levadura

Algas Hidrolizados de algas verdes-azules

Tabla 1.3. Sustratos de origen microbiano empleados en la obtención de hidrolizados

proteicos, peptonas y extractos.

Hidrólisis ácida: la suspensión de levaduras se trata con HCl concentrado y

se calienta hasta 100ºC; luego se neutraliza con NaOH. En este caso, el producto final

contiene altas concentraciones de NaCl y el proceso destruye el triptófano presente.

1.1.1.1.1. Proceso de autólisis celular en la levadura:

La autólisis ha sido estudiada por diversos autores, es un proceso que consiste

en la ruptura y degradación de las estructuras celulares por su propia dotación

enzimática. Charpentier y Freyssinet 1989, plantean cuatro etapas diferenciadas a lo

largo del proceso:

Inicialmente las actividades de las enzimas endo y exo-β-(1,3) glucanasas

liberan una mezcla de polisacáridos y de cadenas cortas oligosacaridas. Una fracción

de estos polisacáridos corresponden a las mano-proteínas unidas covalentemente al

glucano de la pared intacta.

Posteriormente, la hidrólisis parcial del glucano provoca una desestabilización

de la estructura de la pared, que supone una liberación de mano-proteínas de elevado

peso molecular con bajos contenidos de glucosa y que proviene mayoritariamente de

la zona periplasmática.

En una etapa más tardía continúa la degradación de los glucanos de la pared

por las β-(1,3)-glucanasas en los restos de pared y en el medio extracelular.

Finalmente las exo-β-(1,3)-glucanasas, solubilizadas en el medio, degradan el

glucano unido a las mano-proteínas y estas a su vez pueden ser hidrolizadas por α-

manosidasas y por otras proteasas que liberan peptidomananos de menor tamaño.

1.1.1.1.2. Componentes liberados durante la autólisis:

Consecuencia de esta ruptura y fragmentación del material celular son

liberadas moléculas de distinta naturaleza. Estas moléculas se pueden clasificar como

procedentes del interior celular o bien de las paredes (Guilloux-Benatier y cols., 1995)

figura 1.3:

Contenido celular: nucleótidos o nucleosidos (se comportan como agentes de

flavor), aminoácidos y péptidos (actúan como precursores de aromas y pueden

presentar sabores dulces o amargos).

Pared celular: glucanos y mano-proteínas (activadores del crecimiento de

bacterias lácticas, presentan interacciones con volátiles aromáticos).

El grado de autólisis se puede variar controlando las condiciones de tiempo y

temperatura del proceso (Carriles, 2008).

Figura 1.2. Proceso de autólisis celular de la levadura. Fuente: Biorigin, 2009.

1.1.2. Fermentación láctica:

La fermentación láctica consiste en la transformación de la lactosa en ácido

láctico por la acción de bacterias acidófilas del tipo homofermentativas ó

heterofermentativas. Las homofermentativas como Lactobacilos y Estreptococos

metabolizan la lactosa produciendo un 95% de ácido láctico y el resto

principalmente acetaldehído que influye en el aroma y sabor del producto lácteo, en

tanto que las heterofermentativas producen el 50% de ácido láctico además de etanol

y anhídrido carbónico como es el caso de las bacterias del tipo

Leuconostoc (Capraispana, 2008).

La acción de estas bacterias desencadena un proceso microbiano por el cual la

lactosa (azúcar de la leche) se transforma en ácido láctico. La conversión de lactosa en

Figura 1.3. Componentes liberados durante la autolisis de la levadura. Fuente:

Morata y cols. 2005).

ácido láctico tiene un efecto conservador sobre la leche. El bajo pH de la leche

acidificada inhibe el crecimiento de las bacterias de la putrefacción y de otros

organismos perjudiciales. De esta forma se prolonga la vida útil del producto (Manual

de industrias lácteas, 2003).

A medida que el ácido láctico se acumula la estructura de las proteínas de la

leche va modificándose (van cuajando), y lo mismo ocurre con la textura del producto.

Existen otras variables, como la temperatura y la composición de la leche, que influyen

en las cualidades particulares de los distintos productos resultantes (Manual de

industrias lácteas, 2003).

Durante la primera etapa de la fermentación, las bacterias se desarrollan a igual

tiempo, mientras hay péptidos y aminoácidos libres. Cuando estos se acaban, los

Streptococcus thermophilus mueren porque no producen proteasas, pero el

Lactobacillus bulgaricus si las produce por lo que sigue creciendo, luego, por acción de

estas proteasas vuelve a crecer el Streptococus thermophilus. Este proceso produce

una relación simbiótica entre ambas bacterias (Frazier, 1978).

Aunque el producto final es el ácido láctico principalmente, también se producen

metabolitos como acetaldehído (aroma típico del yogurt), siendo esta una de las

capacidades en las que se basa la selección de cepas (Frazier, 1978).

Las necesidades nutritivas de los lactobacilos son complejas, y la mayor parte

de las cepas no puede cultivarse en los medios nutritivos ordinarios, a menos que se

enriquezcan con glucosa y suero. Las necesidades individuales de aminoácidos son

variables, además, en general se requiere piridoxina, tiamina, riboflavina, biotina, ácido

fólico y ácido nicotínico, variando las necesidades en cada caso. Estos requerimientos

nutritivos variados tienen aplicación práctica en técnicas de dosificación

microbiológicas de vitaminas y de algunos aminoácidos, para los cuales son más

sensibles que los métodos químicos disponibles. En concentración adecuada, hay

cierta relación definida, incluso lineal entre la concentración de vitamina en un medio

de cultivo adecuado, pero exento de vitamina, y el desarrollo o la cantidad de ácido

producidos (Spreer y Sutherland, 1991).

1.1.2.1. Leches fermentadas:

Las leches fermentadas en general, resultan del desarrollo de microorganismos

benéficos que modifican los componentes de la leche; la lactosa que se transforma

parcialmente en ácido láctico ó en otros casos en alcohol etílico, y los prótidos que son

parcialmente peptonizados mejorando su digestibilidad (Veisseyre, 1986).

Las leches fermentadas son productos preparados con leche a la que, tras

tratarla térmicamente, se le inoculan bacterias lácticas que actúan como cultivo

iniciador de la fermentación. Las bacterias ácido lácticas tienen la capacidad de

obtener energía de la lactosa y de hidrolizar las proteínas lácteas liberando péptidos y

aminoácidos al medio.

Su capacidad proteolítica ha sido tradicionalmente explotada porque los

aminoácidos y péptidos que se forman durante la fermentación contribuyen o son

precursores de otras sustancias que influyen en el aroma, el sabor y la textura de estos

productos (Visser, 1993).

Además de un buen sabor y un buen aroma, la leche acidificada debe tener una

apariencia y consistencia adecuadas. Estas características son determinadas por

medio de una adecuada elección de los parámetros de proceso (Manual de industrias

lácteas, 2003).

Las leches fermentadas son productos de gran valor nutricional. Su

composición, similar en general a la de la leche de partida, difiere de ésta debido a la

adición de distintos ingredientes y al proceso fermentativo. El valor nutritivo de la

fracción proteica así como la asimilación de la lactosa mejoran debido a la

fermentación, que aumenta su digestibilidad, y la materia grasa, aunque muy influida

por la leche de partida, también varía en función de las especies bacterianas

fermentativas (Rota y Herrara, 2001). El contenido vitamínico es difícil de establecer

debido a la influencia que ejercen tanto los microorganismos (que sintetizan y asimilan

distintas vitaminas) como los tratamientos (térmico o desnatado) a los que se somete la

leche (Tamime, 1991). El calcio destaca como mineral tanto por su riqueza como por

su fácil absorción gracias al ácido láctico presente en estos alimentos.

La leche fermentada más conocida es el yogur, obtenido por fermentación

láctica mediante la acción de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus.

Existen diferentes tipos de yogur en función de los ingredientes que contiene, la

aplicación o del tratamiento térmico tras la fermentación, su consistencia o su origen

(Montero y cols., 2006).

Se puede clasificar al yogurt según las siguientes características: Por el método

de elaboración, por el sabor y por el contenido graso (Spreer y Sutherland, 1991):

El yogurt aflanado (cuajado o coagulado), es el producto en que la leche

pasteurizada, es envasada inmediatamente después de la inoculación, produciéndose

la coagulación en el envase.

El yogurt batido, es el producto en el que la inoculación de la leche

pasteurizada, se realiza en tanques de incubación produciéndose en ellos la

coagulación, luego se bate y posteriormente se envasa.

El yogurt natural, es aquel sin adición alguna de saborizantes, azúcares y

colorantes, permitiéndose solo la adición de estabilizantes y conservantes. El yogurt

frutado, es aquel al que se le ha agregado frutas procesadas.

1.1.2.2. Leches fermentadas como alimentos funcionales

Las propiedades beneficiosas de las leches fermentadas se pueden atribuir a

los microorganismos que se emplean en su elaboración, y a los diferentes productos

liberados durante el proceso de fermentación, tales como metabolitos, iones y

moléculas biológicamente activas. Los microorganismos contribuyen a la seguridad

bacteriológica del producto y le confieren una serie de características desde el punto

de vista organoléptico, tecnológico y nutricional. Además de aumentar la

biodisponibilidad de la lactosa y de las proteínas y producir un enriquecimiento de

ciertas vitaminas del grupo B, determinados microorganismos, en particular algunas

bacterias ácido lácticas, como lactobacilos, bifidobacterias y los estreptococos,

presentan efectos probióticos en el organismo (Leroy y cols., 2004).

Los probióticos, se definen como microorganismos vivos, principalmente

bacterias y levaduras, que pueden ser agregados como suplemento en la dieta y que

afectan de forma beneficiosa al desarrollo de la flora microbiana del intestino. Sus

efectos beneficiosos han sido descritos en algunas patologías, especialmente en las

diarreas, ciertos tumores y alérgias (Fuller, 1989).

1.2. Objetivos

1.2.1. Objetivo General:

Estudio del efecto de la adición de hidrolizados de levadura en la cinética de

fermentación láctica para la obtención de leches acidificada.

1.2.2. Objetivos Específicos:

Obtención de hidrolizados de levadura en distintas condiciones del proceso

controlando variables de tiempo y temperatura.

Controlar el proceso de hidrólisis mediante la determinación de nitrógeno total y

amino nitrógeno en los hidrolizados.

Determinar la cinética de fermentación láctica

Determinar la cinética de fermentación láctica en presencia de hidrolizados

Probar el efecto de la adición de los hidrolizados de levadura en diferentes

etapas durante el proceso fermentativo.

Evaluación sensorial de los productos obtenidos con adición de los hidrolizados

de levadura.

Capítulo II

MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Lugar de Trabajo

El estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología Aplicada de la Facultad

de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile, ubicado en Vicuña

Mackenna 20.

2.2. Materiales

2.2.1. Materias primas

Levadura Lallemand, cepa Saccharomyces cerevisiae

Leche entera UHT

Yogurt comercial

2.2.2. Reactivos

NaOH p.a. Merck

HCl p.a. Merck

Sulfato de Cobre (CuSO4)

Sulfato de Potasio (K2SO4)

Tartrato de Sodio y Potasio (KNaCH4O6·4H2O)

Formalina 40%

Ácido Sulfúrico Concentrado (H2SO4)

Buffer pH 4,0, pH 7,0 y 10,0 Cicarelli

Fenolftaleína 1%

Acido láctico (CH 3 CHOHCOOH)

Azul bromotimol

Lactosa Merck

Rojo metilo

H2O destilada y esterilizada

2.2.3. Insumos y utensilios

Frascos de 250 ml Schott

Frascos de 500 ml Schott

Matraces de diferente volumen Pyrex

Tubos de ensayo

Tubos centrífuga

Pipetas

Mechero Bunsen

Gradilla

Termómetros

Gotario

Algodón

Cinta adhesiva

2.2.4. Equipos e instrumentos

Termómetro de varilla, marca Brand

Balanza analítica Adam PW 124

Autoclave KSG 112

Estufa con Control de Temperatura Kottermann

Sistema de refrigeración

pH – metro digital Hanna Instruments HI 111

Baño Termoregulado Arquimed YCW-03S

Mechero, trípode y malla alambre

Digestor BUCHI.

Unidad de destilación BUCHI.

2.3. Métodos

2.3.1. Proceso de autólisis para la obtención de hidrolizados de levadura.

Figura 2.1. Diagrama de bloques del proceso de autólisis celular de la levadura.

2.3.1.1. Levadura seca

A la levadura Saccharomyces cerevisiae se le determinó el contenido de

nitrógeno total por el método de Kjeldahl. Luego de esto se pesó.

2.3.1.2. Rehidratación levadura

Se realizó a 30º C por 15 minutos en vasos de precipitado de 250 ml, a razón

de 1:7 (levadura:rehidratante), en baño termorregulado, usando como rehidratante

agua destilada y esterilizada en autoclave por 15 minutos a 121º C.

2.3.1.3. Autólisis

La autólisis se realizó por método físico (hidrólisis térmica). La levadura

rehidratada se colocó en estufa a distintas temperaturas, 30º, 35º, 40º, 45º y 50º C.

Las muestras se mantuvieron en estufa hasta lograr un porcentaje constante de

hidrólisis.

2.3.1.4. Pasteurización

Las muestras se pasteurizaron a 70ºC durante 10 minutos, en baño

termorregulado.

2.3.1.5. Centrifugación

El autolizado ya pasteurizado se sometió a centrifugación a 4000 rpm durante

10 minutos, para la separación del material soluble (sobrenadante extracto líquido) e

insoluble (extracto sólido biomasa decantada) (anexo 1).

2.3.1.6. Determinación del porcentaje de hidrólisis

Esta determinación es el parámetro clave para el seguimiento y control de la

reacción de autólisis a través de la hidrólisis de proteínas. Representa la proporción de

enlaces peptídicos hidrolizados sobre el número total de enlaces (Benítez y cols.,

2008). El porcentaje de hidrólisis por lo tanto, se determinó a partir del nitrógeno total

presente en la levadura seca y el amino nitrógeno presente en el extracto líquido. El

porcentaje de hidrólisis viene expresado según:

Donde:

A = animo nitrógeno en extracto líquido de hidrolizado (g /ml).

7,857 x 10 ¯³ = N total en cepa de levadura utilizada (g/ml).

2.3.1.7. Determinación de nitrógeno total

La determinación de nitrógeno total se realizó por del método de Kjeldahl, este

es un método clásico para determinar la cantidad de proteínas de un producto a partir

de su contenido en nitrógeno, donde la materia orgánica es digerida con ácido sulfúrico

y el nitrógeno obtenido en forma de una sal estable (sulfato de amonio) es valorada,

previa destilación en medio alcalino para descomponer la sal y convertirla en

amoníaco, contra una solución ácida valorada (HCl) (Schmidt-Hebbel, 1981) (anexo 2).

2.3.1.8. Determinación de amino nitrógeno

La determinación de amino nitrógeno indica la cantidad de grupos amino libres

totales liberados al medio líquido debido a la hidrólisis celular de la levadura, y se

realizó por el método de Sörensen (Association of Official Analytical, 1980) que

consiste en bloquear la función amina por adición de un exceso de metanol mediante la

titulación con formol. Se calculó mediante la siguiente fórmula:

Donde:

G = es el gasto en mL de NaOH 0,1N obtenido en la valoración.

Amino nitrógeno (mg/L) = G x 56

% Hidrólisis = A x 100

7,857 x 10 ¯³

2.3.2. Proceso de fermentación láctica con adición de hidrolizados

Figura 2.2. Diagrama de bloques del proceso de fermentación láctica con adición de

hidrolizados.

2.3.2.1. Leche entera

Para el proceso se utilizó leche entera UHT (comercial), lo que evita la dificultad

de encontrar leche cruda durante el estudio.

2.3.2.2. Adición de inóculo

También llamada inoculación, después que la leche ha sido acondicionada a la

temperatura adecuada es inoculada y homogenizada, se utilizó como inóculo yogurt

natural.

2.3.2.3. Adición de hidrolizados

Los hidrolizados se adicionan a la mezcla y esta se agita para una correcta

homogenización (Figura 2.3.)

Los hidrolizados obtenidos se adicionaron a diferentes concentraciones y en

distintas etapas del proceso. Además para poder tener una base de comparación se

utilizó un control al cual no se le adicionó ningún extracto de hidrolizado.

Xi

Leche

Adición de inóculo (yogurt)

Adición de extractos

Figura 2.3. Esquema adición de extractos.

Fermentación 45º C X 6 hrs.

Las formulaciones para las fermentaciones se presentan en la tabla 2.1.

Formulación I

Formulación II

Control

Ingredientes % Ingredientes % Ingredientes %

Inóculo (yogurt)

20

Inóculo (yogurt)

20

Inóculo (yogurt)

20

Hidrolizado

7

Hidrolizado

3,5

Hidrolizado

0

Leche

73

Leche

76,5

Leche

80

Tabla 2.1. Formulaciones utilizadas en los procesos de fermentación

2.3.2.4 Fermentación

La temperatura se eligió próxima a la temperatura óptima de desarrollo del

Streptococcus thermophilus (42° a 45°C) y del Lactobacillus bulgaricus (47° a 50° C),

de acuerdo a las bacterias probióticas presentes en el inoculo (yogurt). Además, se

determinó el tiempo de fermentación total hasta un pH aproximado de 4,6 y 4,7 ya que

el pH 4,5 es el punto isoeléctrico de las proteínas lácteas (Guerrero, 2005).

Los parámetros de proceso fueron 45ºC por 6 horas aproximadamente para

todas las fermentaciones.

2.3.2.5. Refrigerado

Terminada la fermentación, el yogurt se lleva a refrigeración a no más de 5º C

hasta la evaluación sensorial.

2.3.2.6. Determinación de lactosa

La lactosa en la fermentación láctica es el sustrato del proceso, por lo cual se

midió a tiempo cero (luego de inocular la leche) y después cada una hora para

determinar el rendimiento del proceso.

La determinación de lactosa se realizó por el método de Fehling el cual se basa

en que la glucosa y otros azúcares como la lactosa son capaces de reducir a agentes

oxidantes por lo que son llamados azúcares reductores. Así, tenemos que en el

método de Fehling se puede medir el volumen de la muestra necesario para reducir la

totalidad de los iones cúpricos de una solución cuproalcalina titulada. En medio

alcalino y caliente, los azúcares reducen al sulfato de cobre CuSO4 a Cu2O (precipitado

de color rojizo), con la desaparición del color azul del ion Cu++2 que indica el término

de la reacción (Bordeu y Scarpa, 2000).

2.3.2.7. Determinación de pH

La determinación de pH se realizó con tiras indicadoras especiales de pH, con

un rango de pH 4 – 7.

2.3.2.8. Determinación de ácido láctico

Al igual que la lactosa para poder obtener el rendimiento del proceso es

necesario obtener la cantidad de producto formado el cual es el acido láctico, por lo

tanto este se midió a tiempo cero (luego de inocular la leche) y después cada una hora

del proceso.

Se realizó con el método para la determinación de la Acidez titulable según la

NCh1738.Of98 debido a que esta norma establece el método para determinar la acidez

titulable en la leche y se aplica a leche cruda, leche pasteurizada, esterilizada, crema y

productos lácteos fluídos, sean o no fermentados.

2.3.2.9. Rendimiento teórico de la fermentación láctica

De forma general, en el rendimiento teórico para un proceso homofermentativo,

se produce ácido láctico principalmente y pequeñas cantidades de productos

secundarios entre los que destacan: acetona, acetaldehído (aroma típico del yogurt),

acetoína, diacetilo y glucanos.

C12H22O11 + H2O → 4 C3H6O3

4

PM lactosa = 342 g/mol PM ac. láctico = 90 g/mol

dS/dt = velocidad consumo sustrato (lactosa).

dP/dt = velocidad formación producto (ácido láctico).

Factor de rendimiento

Sabiendo que 1 molécula de lactosa, genera 4 moléculas de ácido láctico, se

calcula el rendimiento teórico (Romero, 2007):

Y p/s teórico = (90 · 4) / 342 = 1,04 [g ácido láctico / g lactosa]

Y p/s = - dP/dt

dS/dt

2.3.3. Determinación de vitaminas

La determinación de vitaminas B1, B2, B3 fue realizada por el laboratorio

externo Analab con los siguientes métodos (Association of Official Analytical, 2000):

Determinación de vitamina B1 tiamina en alimentos por cromatografía líquida

con detector de fluorescencia.

Determinación de riboflavina en alimentos por cromatografía líquida con

detector de fluorescencia.

Determinación de niacina en no cereales por espectrofotometría.

2.3.4. Evaluación sensorial del yogurt

Para este análisis sensorial se utilizó un panel entrenado de 7 jueces,

seleccionados entre alumnos de la carrera de Ingeniería en Alimentos que ya cursaron

el ramo Evaluación Sensorial y según sus aptitudes sensoriales. Además se realizó un

entrenamiento teórico con el fin de unificar criterios en los posibles parámetros

sensoriales presentes en las leches fermentadas.

El test empleado fue un test de diferencias contra control (anexo 3) el cual se

utiliza para determinar si existen diferencias entre una muestra o más muestras y un

control, además también se puede estimar la magnitud de estas diferencias. (Bunger,

2007).

Las muestras se ordenaron designando un “control” o “referencia”, y las demás

muestras se evaluaron con respecto a la magnitud de la diferencia con el control. El

control se presentó identificado como “control” y las muestras se presentaron

codificadas con letras al azar. Entre las muestras codificadas se colocó un control

escondido (ciego) codificado igual que las muestras. Este, ayuda a medir el error por

expectación, efecto placebo, o efecto numérico que se presenta aún cuando no

existen diferencias (Bunger, 2007).

Para la evaluación, las muestras se presentaron en tres set distintos que se

clasificaron según el tipo de hidrolizado adicionado.

Las características evaluadas fueron el color, intensidad del aroma,

consistencia, gusto salado, acidez e intensidad del sabor residual.

Los datos se evaluaron mediante de un análisis de ANOVA y con el test de

Tukey (DSH) para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas en

las características sensoriales del yogurt con adición de hidrolizados de levadura y

entre jueces. El diseño se analizó con un nivel de confianza del 95% utilizando el

Software Statgraphics Plus 5.1.

La evaluación sensorial se realizó en el laboratorio de Evaluación Sensorial de

la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.

Capítulo III.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

3.1. Determinación de nitrógeno total

En la tabla 3.1. se presentan los valores obtenidos para la determinación de

nitrógeno total por el método de Kjeldahl. El análisis se realizó por triplicado con

muestras de aproximadamente un gramo de levadura seca.

Para obtener el contenido de proteína bruta a partir del N total se usó el factor

de conversión 6,25, que representa el contenido promedio de nitrógeno en la molécula

de proteína.

La levadura tiene una composición química de proteína total aproximada de 40

% (Pérez, 2000), sin embargo la Sociedad Chilena de Nutrición, Bromatología y

Toxicología declara para esta un 27,8 % de proteína. Se observa que el porcentaje

obtenido de N total en la levadura está dentro de los márgenes esperados y la

cantidad de proteína total, obtenida, es mayor que la que declara la Sociedad Chilena

de Nutrición, Bromatología y Toxicología.

3.2. Determinación de amino nitrógeno

El resumen de datos obtenidos se encuentra la tabla 3.2.

Muestra (g) % N total % Proteína

1,0231 5,5 34,4

1,0203 5,5 34,4

1,0073 5,6 35,0

Promedio 5,5 ± 0,058 34,6 ± 0,35

Tabla 3.1. Porcentaje total de Nitrógeno y Proteína en la levadura seca.

Estos resultados revelan la cantidad de nitrógeno que ha sido solubilizado al

medio durante la autolisis celular. El amino N se midió cada 12 horas por el método

de Sörensen hasta las 72 horas de proceso. Luego de las 72 horas la cantidad de

amino N a los 45º C comienza a ser constante (anexo 4), por lo tanto, este es el

tiempo de proceso final. En la tabla 3.2 se observa que a mayor temperatura la

cantidad de nitrógeno solubilizado aumenta, por lo tanto, las temperaturas más

adecuadas para el proceso de autolisis son 45º y 50 ºC.

3.3. Determinación del porcentaje de hidrólisis

El proceso de autólisis para la obtención de hidrolizados se presenta en la

siguiente figura (anexo 4):

Temperatura de hidrólisis (ºC) mg amino N /L (72 h de proceso)

30 551,6

35 884,8

40 1069,6

45 1400

50 1321,6

Tabla 3.2. Temperatura de hidrólisis y cantidad de amino N al final del proceso.

Figura 3.1. Proceso de Hidrólisis

En la figura 3.1. se observa que a medida que aumenta la temperatura de

proceso, la autolisis celular se hace más rápida. A temperaturas más bajas como 30 y

35 ºC las curvas muestran procesos más lentos. A diferencia de lo que ocurre a 40, 45

y 50ºC y donde las curvas indican una mayor velocidad en el proceso y porcentajes de

hidrólisis al final del proceso más altos. Todas las curvas se asemejan solo en las

primeras 12 horas del proceso que es donde ocurre el aumento más rápido en el

porcentaje de hidrólisis. Sin embargo pasado este tiempo la relación porcentaje de

hidrólisis v/s tiempo, no aumenta a la misma razón.

Cabe destacar lo que ocurre a 45 y 50 ºC donde las curvas se entrecruzan a las

40 horas aproximadamente del proceso, en la primera etapa del proceso a 50ºC el

porcentaje de hidrólisis es mayor siguiendo la hipótesis que a mayor temperatura existe

un mayor porcentaje de hidrólisis, sin embargo, posterior a esto, la curva a 45ºC

muestra un mayor porcentaje que el proceso a 50ºC, lo que se pudo deber a una

saturación del medio a 50ºC. A pesar de esto, la variación en el porcentaje obtenido al

final del proceso a 45 y 50ºC solo varió en 1%.

Los porcentajes finales de hidrólisis a las diferentes temperaturas se muestran

en la tabla 3.3.

Los mayores grados de hidrólisis se obtienen a temperaturas alrededor de 50ºC

(Peppler y Red, 1913; Perlman, 1979) o entre 45 a 50º C (Haehn, 1956), según la

tabla 3.3 la temperatura donde se obtiene el mayor porcentaje de hidrólisis es a 45º C.

Temperatura de hidrólisis (ºC) % hidrólisis

30 7 ≈ 7

35 11,3 ≈ 11

40 13,6 ≈ 14

45 17,8 ≈ 18

50 16,8 ≈ 17

Tabla 3.3. Porcentajes finales de hidrólisis

3.4. Determinación de la cinética de la fermentación láctica

Todos los procesos de fermentación se realizaron bajo las mismas condiciones

de inóculo (20%), temperatura (45º C) y tiempo (6 h). La adición de los extractos se

hizo de acuerdo al siguiente esquema:

Figura 3.2. Esquema de adición de extracto.

El extracto líquido se refiere al sobrenadante del hidrolizado y extracto sólido se

refiere a la biomasa decantada después de la autolisis.

La definición “extracto completo” se refiere al extracto líquido y sólido del

hidrolizado en conjunto. Las experiencias se compararon con un control al cual no se le

adicionó ningún tipo de extracto

La cinética de fermentación (anexo 5) para todos los procesos que a

continuación se presentan tienen la siguiente codificación:

La figura 3.3 muestra la cinética de fermentación del proceso con adición de

extracto líquido de hidrolizado:

Figura 3.3.

La figura 3.4 muestra la cinética de fermentación del proceso con la adición del

extracto completo de hidrolizado:

A, a = curvas con adición de 7% de extracto al inicio del proceso.

B, b = curvas con adición de 7% de extracto a mitad del proceso.

C, c = curvas con adición de 3,5% de extracto al inicio del proceso.

D, d = curvas con adición de 3,5% de extracto a mitad del proceso.

E, e = curvas sin adición de extractos (control)

** Las letras mayúsculas representan las curvas de consumo de lactosa y las

letras minúsculas las de formación de acido láctico.

Figura 3.4.

La figura 3.5 muestra la cinética de fermentación del proceso con la adición de

extracto sólido del hidrolizado:

Figura 3.5.

Al comparar las figuras de los procesos de fermentacion no se observan

importantes diferencias al adicionar cualquiera de los tres tipos de hidrolizados.

Por otra parte, se observa, que sí existen diferencias cuando se adicionan los

extractos al inicio del proceso y a mitad del proceso de fermentación.

Cuando se adiciona cualquiera de los extractos a ambas concentraciones (7%

y 3,5%) al inicio del proceso la velocidad de consumo de lactosa es más rápido

durante la primera fase de la fermentación. Luego, como consecuencia, la producción

de ácido láctico se muestra levemente mayor comparado con la curva del control a

partir de las 2 ½ horas aproximadamente. Sin embargo no necesariamente la rapidez

en el proceso tiene relación con la obtención de un producto de calidad (Romero,

2007).

Además, se observa que al adicionar los extractos a mitad del proceso de

fermentación no hay diferencias al compararse con el control, presentando curvas muy

semejantes.

Estos resultados se pueden atribuir a que la actividad de las bacterias acido

lacticas puede ser estimulada por productos basados en levaduras que contienen

enzimas y nutrientes que estas necesitan. (Gunther, 1995).

La cinética acelerada, observada en los procesos, también se puede deber a

que los lactobacilos en general requieren de vitaminas como por ejemplo piridoxina,

tiamina, riboflavina, biotina, ácido fólico y ácido nicotínico, y también aminoácidos

(Spreer y Sutherland, 1991) presentes por ejemplo en gran cantidad principalmente en

el extracto líquido provenientes de la autólisis celular de la levadura.

Además, según Garret (1930) un buen suministro de nitrógeno debe estar

presente como alimento para las bacterias ya que este contribuye a que puedan

multiplicarse y acidificar a un ritmo rápido.

3.4.1. Rendimiento de los procesos de fermentación

La tabla 3.4. muestra el resumen de los rendimientos obtenidos en todos los

procesos fermentativos.

Tipo de

hidrolizado adicionado

Porcentaje de adición Factor de Rendimiento

Y p/s %

Extracto líquido

7% al inicio del proceso

0,3 30

7% a mitad del proceso

0,26 26

3,5% al inicio del proceso

0,29 29

3,5% a mitad del proceso

0,23 23

Extracto completo

7% al inicio del proceso

0,3 30

7% a mitad del proceso

0,26 26

3,5% al inicio del proceso

0,29 29

3,5% a mitad del proceso

0,25 25

Extracto sólido

7% al inicio del proceso

0,26 26

7% a mitad del proceso

0,26 26

3,5% al inicio del proceso

0,26 26

3,5% a mitad del proceso

0,26 26

Sin Hidrolizado Control

0,23 23

Tabla 3.4. Rendimientos de la fermentación láctica

Para obtener el rendimiento de los procesos de fermentación, éstos, se

consideraron como proceso homofermentativo. El cual, de forma general, indica que 1

molécula de lactosa produce 4 moléculas de ácido láctico:

Yp/s teórico = 1,04 [g ácido láctico / g lactosa]

Rendimiento teórico =104%

El Yp/s teórico supone que toda la lactosa es convertida en ácido láctico. Al

comparar el Yp/s teórico con los resultados obtenidos, el mayor porcentaje obtenido es

de un 30% de lactosa convertido en ácido láctico. A diferencia del control, que fue de

un 23%. Por lo tanto, la adición de extracto líquido y del extracto líquido y sólido en

conjunto del hidrolizado aumenta un 7% aproximadamente la conversión de lactosa a

ácido láctico al compararse con el control.

En la tabla 3.4 resumen se observa, que los mayores rendimientos se

presentan cuando se adiciona 7% de extracto líquido y 7% del extracto completo de

hidrolizado al inicio del proceso.

Además, de acuerdo a la IDF (International Dairy Federation), el mínimo de

acidez al término de la incubación debe ser de 0,7 g de ácido lático por 100 g de

yogurt (Rasic y Kurman,1983) y en todos los procesos con adición de extractos se

obtuvo aproximadamente 1 g de ácido lático por 100 g de yogurt.

3.5. Determinación de proteína total en el yogurt

El porcentaje de proteína total se determinó en la muestra obtenida de la

fermentación con un 7 % de extracto líquido de hidrolizado al inicio del proceso y en

una muestra control sin adición de ningún extracto. El análisis se realizó en triplicado y

los resultados se presentan en la siguiente tabla:

En este caso, para obtener el contenido de proteína bruta a partir del N total se

usó el factor de conversión 6,38, que representa el contenido promedio de nitrógeno

en la molécula de proteína para alimentos como leche y sus derivados.

Muestra Control

g de muestra 4,6101 4,6363 4,6181 4,6145 4,6241 4,6186

% N total 0,6 0,6 0,6 0,5 0,5 0,5

% Proteína 3,83 3,83 3,83 3,19 3,19 3,19

Promedio % Proteína

3,83 3,19

Tabla 3.5. Porcentaje total de Nitrógeno y Proteína en yogurt.

Los yogurt comerciales declaran entre un 3,5 y 4 % de proteína total en su

etiquetado y los resultados obtenidos muestran una diferencia cercana al 6% entre la

muestra con adición de extracto líquido del hidrolizado comparado con el control sin

extracto. Este aumento del porcentaje de proteínas en la muestra se debe claramente

a la alta cantidad de proteína total presente en el extracto adicionado.

3.6. Determinación de vitaminas

La tabla 3.6 muestra los resultados obtenidos del análisis de vitaminas en la

muestra obtenida de la fermentación con un 7 % de extracto líquido de hidrolizado al

inicio del proceso y en una muestra control sin adición de ningún extracto.

Los resultados de la muestra, se encuentran dentro de los márgenes

esperados si se comparan con la tabla de composición química de alimentos chilenos,

a pesar, de existir un aumento de en el contenido de tiamina.

3.7 Evaluación sensorial

Vitamina mg de vit./100 g muestra mg de vit./100 g yogurt comercial (Schmidt-Hebbel y cols., 1992)

B1 Tiamina 0,162 0,04

B2 Riboflavina 0,14 0,23

B3 Niacina No detectado -

En la tabla 3.6. se presentan los resultados promedios de los puntajes

obtenidos en la evaluación sensorial con el test de diferencias contra control.

Set Muestra Color Aroma Consistencia Salado Acidez Residual

1

D (control escondido)

0,1 a -0,6 a 0,7 a -0,9 a 0,6 a 0,3 a

A (con 3,5% de adición extracto líquido)

1,3 d 1,9 d -2,4 d 1,7 d 2,4 d 3,1 d

J (con 7% de adición extracto líquido)

1,3 d 2,6 d -2,3 d 2,1 d 2,4 d 3,0 d

2

M (con 7% de adición todo el extracto)

0,1 c 2,4 u -1,0 c 2,7 c 2,0 c 1,9 c

H (control escondido)

-0,1 c -0,4 a 0,4 a 0,1 a -0,4 a 0,1 a

F (con 3,5% de adición todo el extracto)

-0,1 c 1,6 v -1,6 c 2,6 c -0,4 a 1,6 c

3

B (control escondido)

0,4 a -0,3 a -0,1 a -0,1 a 0,3 a -0,4 a

L (con 7% de adición extracto sólido)

3,0 e 3,0 e -3,4 e 3,4 e 2,3 e 3,1 e

X (con 3,5% de adición extracto sólido)

2,6 e 2,4 e -2,9 e 2,9 e 2,4 e 3,7 e

Tabla 3.6. Subíndices por set en la misma columna y con letra distinta, representan

diferencias estadísticamente significativas entre muestras (P<0.05)

En la tabla resumen de diferencias entre muestras y control se observa que:

El color en las muestras L y X representan la mayor de diferencia con el control

y se identificaron en el rango de algo más oscuras que el control. En cambio, para las

demás muestras la calificación fue igual y muy cercana al color del control. La

intensidad del aroma en todas las muestras fue identificada como algo más intenso

que el control. La consistencia disminuyó en las muestras ya que todas se identificaron

como algo más liquidas que el control. La acidez se indicó como algo más acido que el

control.

El gusto a salado fue calificado como algo más salado que el control. Esta

característica a diferencia de las otras fue indicada como una nota de desagrado en la

mayoría de los jueces, debido a que al final del test al responder que muestra

preferían siempre indicaron que el control, respondiendo que esta decisión se debía a

la nota salada existente de las demás muestras. Esta nota se puede deber al

llamado quinto sabor. Los humanos sienten cinco cualidades de gusto: dulce, salado,

amargo, ácido y el sabroso, llamado también umami descubierto por investigadores

japoneses, y del cual se sabe que existe una sinergia entre este, dado por el

extracto de levadura principalmente y los nucleótidos derivados del proceso de

autolisis celular y el sabor salado, dado por la sal cloruro de sodio (Biorigin, 2009).

Finalmente la intensidad del sabor residual se calificó como algo más intenso y

mucho más intenso que el control. La diferencia e intensidad de esta característica se

puede atribuir principalmente a la nota salada presente en las muestras proveniente

del extracto adicionado. La cual, en el caso del extracto sólido, se puede eliminar al

tratar el extracto con lavados, previos, a la adición a la fermentación láctica.

El análisis de varianza para muestras indica que las diferencias

estadísticamente significativas para la mayoría de las características se presentaron

principalmente entre las muestras con adición de extractos y el control, pero no entre

las mismas nuestras.

El análisis de varianza para jueces indicó que en los sets solamente existió

diferencia estadísticamente significativa (p-value < 0,05) en la característica de

acidez, por lo tanto, esta no es una característica a considerar para conclusiones

finales, a diferencia, del color, intensidad del aroma, consistencia, gusto salado, e

intensidad del sabor residual que no presentaron diferencias estadísticamente

significativas entre jueces.

Capítulo IV

CONCLUSIONES

El trabajo presentado permitió establecer que la obtención de hidrolizados de

Saccharomyces cerevisiae aplicando temperatura por un tiempo definido y luego, su

adición al proceso de fermentación láctica para obtener yogurt, produce cambios

favorables en el proceso mismo y mejoras en el producto.

El proceso de autólisis celular para la obtención de hidrolizados a 30º, 35º, 40º

45º y 50º C mostró, que a mayor temperatura el N solubilizado al medio aumenta, por

lo tanto, el porcentaje de hidrólisis también. Obteniéndose el porcentaje más alto de

hidrólisis a 45º C por 72 horas.

No se presentaron diferencias entre la adición de extracto líquido, el extracto

completo y el extracto sólido del hidrolizado a la fermentación láctica. Pero si existieron

diferencias al adicionar los extractos al inicio y a mitad del proceso de fermentación.

Los mayores rendimientos (Yp/s), que da cuenta de la producción de ácido

láctico, se obtuvieron con la adición de 7 % de extracto líquido y con la adición de 7 %

del extracto completo al inicio de la fermentación.

La adición de estos extractos aumento un 7 % la conversión de lactosa en ácido

láctico comparado con el control sin adición de extractos.

El producto obtenido en la fermentación con 7% de extracto líquido contiene un

6% más de proteína total que el control y un aumento en el contenido tiamina.

Finalmente, en todas las características evaluadas en test de diferencias contra

control, las muestras con adición de extractos, mostraron diferencias estadísticamente

significativas comparadas con el control. Además los jueces identificaron una nota

salada y desagradable en las muestras con adición de extractos.

Capítulo VI

BIBLIOGRAFIA

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Anexo 1

Hidrolizado

obtenido a 50º C

Hidrolizado

obtenido a 45º C

Hidrolizado

obtenido a 40º C

Extracto

líquido

Extracto

sólido

Anexo 2

Método Kjeldahl

Pesar en balanza analítica una cantidad una cantidad adecuada de muestra

para la sensibilidad del método.

Introducir la muestra en un tubo de mineralización.

Agregar bajo campana, un mezcla mineral constituida por 0,6 g de CuSO4 y 12

g K2SO4 y ml de H2SO4 conc. , con probeta.

Colocar eñ tubo en el equipo de digestión térmica con arrastre y eliminación de

vapor de SO2 y dejar reaccionar hasta que la solución se vuelva completamente

transparente.

Una vez terminada la digestión, enfriar el tubo y agregar 1 ml de fenolftaleína y

llevar al equipo destilador Bϋchi.

Agregar cantidad suficiente de NaOH al 30%.

Durante la destilación recolectar los vapores de NH3 a la salida del destilador,

en un matraz de 500 ml que contenga 50 ml H2SO4 de concentración conocida (0,1N)

y al cual se le agregaron 2-5 gotas de indicador rojo de metilo.

Valorar el excedente de acido con NaOH 0,1 N (viraje de rosado a amarillo) y

determinar los mg de N reaccionantes y luego el % de proteína como sigue:

Donde:

V1 y N1 : Volumen y normalidad del H2SO4

V2 y N2 : Volumen y normalidad del NaOH

14: peso atómico del N

f: factor de conversión 6,25 para levadura y 6,38 para lácteos

Anexo 2

Mg N = (V1 X N1 – V2 X N2 ) X 14

% Proteína = (mg N x f x 100) / peso muestra

Anexo 3

Test de diferencias contra control (Muestra leche fermentada)

Nombre: ______________________________ Fecha: ________ Set: _________

Instrucciones:

Debe evaluar las muestras de izquierda a derecha. Debe evaluar el control antes de cada muestra. Califique el grado y dirección de diferencia con el control en cada atributo.

Muestra x con respecto al control:

Color:

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

Mucho más claro

Algo más claro

Igual al control

Algo más

oscuro

Mucho más

oscuro

Intensidad de Aroma:

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

Mucho menos intenso

Algo menos intenso

Igual al control

Algo más

intenso

Mucho más

intenso

Tome la muestra con la cuchara

Consistencia:

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

Mucho más

liquido

Algo más

liquido

Igual al control

Algo más firme

Mucho más firme

Ahora por favor pruebe la muestra.

Gusto a salado:

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

Mucho menos salado

Algo menos salado

Igual al control

Algo más

salado

Mucho más

salado

Acidez:

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

Mucho menos acido

Algo menos acido

Igual al control

Algo más acido

Mucho más acido

Intensidad sabor residual:

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

Mucho menos intenso

Algo menos intenso

Igual al control

Algo más

intenso

Mucho más

intenso

Indique cual presenta mejor calidad:

Control____________

Muestra ___________

Justifique brevemente, por qué?

:_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

Anexo 4

Autólisis a 30ºC

Tiempo h mL de NaOH 0,1N mg amino N /L % hidrólisis

0 5,6 313,6 4

12 6,3 352,8 4,5

24 7 392 5

48 7,9 442,4 5,3

60 8,65 484,4 6,2

72 9,85 551,6 7

96 11,5 644,3 8,2

120 12,5 699,3 8,9

Autólisis a 35ºC

Tiempo h mL de NaOH 0,1N mg amino N /L % hidrólisis

0 7,3 408,8 5,2

12 8,5 476 6,1

24 10,1 565,6 7,2

48 12,3 688,8 8,8

60 14,5 812 10,3

72 15,8 884,8 11,3

96 17,9 1005,7 12,8

120 18,9 1060,7 13,5

Autólisis a 40ºC

Tiempo h mL de NaOH 0,1N mg amino N /L % hidrólisis

0 9,15 512,4 6,5

12 10 560 7,1

24 12,5 700 8,9

48 14 784 10

60 17,6 985,6 12,5

72 19,1 1069,6 13,6

96 21,5 1202 15,3

120 22,7 1273 16,2

Autólisis a 45ºC

Tiempo h mL de NaOH 0,1N mg amino N /L % hidrolisis

0 9,8 548,8 7

12 12,7 711,2 9

24 17,8 996,8 12,7

48 22,1 1237,6 15,7

60 23 1288 16,4

72 25 1400 17,8

96 25 1400 17,8

120 25 1400 17,8

Autólisis a 50ºC

Tiempo h mL de NaOH 0,1N mg amino N /L % hidrólisis

0 13,9 778,4 9,9

12 14,5 812 10,3

24 19 1064 13,5

48 20 1120 14,2

60 21,8 1220,8 15,5

72 23,6 1321,6 16,8

96 24,3 1359 17,3

120 24,3 1359 17,3

Anexo 5

Cinética de fermentación con adición de extracto líquido del hidrolizado.

g lactosa/ml de muestra g ácido láctico/ml de muestra

tiempo h A B C D E a b c d e

0 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046

1 0,053 0,058 0,054 0,058 0,058 0,0049 0,0047 0,0049 0,0048 0,0046

2 0,049 0,053 0,049 0,053 0,052 0,0056 0,0055 0,0054 0,0056 0,0055

3 0,044 0,046 0,045 0,045 0,046 0,0079 0,0069 0,0077 0,0069 0,0071

4 0,04 0,042 0,041 0,042 0,042 0,009 0,0086 0,0088 0,0088 0,0082

5 0,039 0,04 0,04 0,041 0,04 0,0093 0,0091 0,0091 0,0091 0,0089

6 0,038 0,039 0,039 0,039 0,039 0,0105 0,0099 0,01 0,0093 0,0093

Cinética de fermentación con adición de extracto completo del hidrolizado.

g lactosa/ml de muestra g ácido láctico/ml de muestra

tiempo h A B C D E a b c d e

0 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046

1 0,053 0,058 0,053 0,057 0,058 0,0048 0,0046 0,0047 0,0047 0,0046

2 0,048 0,053 0,049 0,053 0,052 0,0057 0,0056 0,0055 0,0056 0,0055

3 0,044 0,046 0,045 0,047 0,046 0,0079 0,007 0,0075 0,0069 0,0071

4 0,041 0,042 0,041 0,042 0,042 0,009 0,0088 0,0089 0,0089 0,0082

5 0,04 0,041 0,04 0,04 0,04 0,0095 0,0091 0,0095 0,0094 0,0089

6 0,038 0,039 0,039 0,038 0,039 0,0104 0,0098 0,01 0,0101 0,0093

Cinética de fermentación con adición de extracto sólido del hidrolizado.

g lactosa/ml de muestra g ácido láctico/ml de muestra

tiempo h A B C D E a b c d e

0 0,06 0,06 0,06 0,06 0,06 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046 0,0046

1 0,052 0,058 0,053 0,057 0,058 0,0053 0,0049 0,0051 0,0047 0,0046

2 0,049 0,053 0,05 0,054 0,052 0,0069 0,0056 0,0067 0,0054 0,0055

3 0,046 0,047 0,046 0,047 0,046 0,0078 0,0069 0,0076 0,0069 0,0071

4 0,041 0,042 0,042 0,042 0,042 0,0088 0,0087 0,0087 0,0087 0,0082

5 0,04 0,04 0,04 0,041 0,04 0,0093 0,0093 0,0092 0,0091 0,0089

6 0,038 0,039 0,039 0,039 0,039 0,01 0,0101 0,0099 0,0099 0,0093