ho thi my linh-60701279

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

–&—

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AMYLASE

CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN SINH BÀO TỬ

GVHD: ThS. Nguyễn Kim Minh Tâm

SVTH: Hồ Thị Mỹ Linh

MSSV: 60701279

Tp. HCM, tháng 01 năm 2012

i

LLỜỜII CCẢẢMM ƠƠNN

Luận văn đề tài “Khảo sát khả năng sinh amylase ngoại bào của một số

chủng vi khuẩn sinh bào tử” được thực hiện từ tháng 9/2011 đến tháng 1/2012.

Trong suốt quá trình làm luận văn tôi đã được rất nhiều sự giúp đỡ của:

Thạc sĩ Nguyễn Kim Minh Tâm – Bộ môn Công nghệ Sinh học trường đại

học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh đã gợi ý đề tài, tận tình hướng dẫn, cung cấp

tài liệu và luôn động viên tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn.

Các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô giáo trong

khoa Kỹ thuật Hóa học Đại học Bách Khoa TpHCM đã tận tình giảng dạy,

truyền đạt những kiến thức cơ bản để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn.

Cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108 và 117 Bộ môn công nghệ Sinh học,

trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử

dụng trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.

Cán bộ phòng thí nghiệm Hữu cơ – Bộ môn Kỹ thuật Hóa hữu cơ, Đại học

Bách khoa TpHCM đã cho mượn một số dụng cụ thí nghiệm.

Cha, mẹ, anh và em tôi đã động viên tinh thần, giúp đỡ về mặt kinh tế để tôi

có thể an tâm thực hiện luận văn.

Các bạn thân và các bạn sinh viên lớp HC07BHS – Đại học Bách Khoa

TpHCM – đã cùng tôi học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá

trình làm việc.

Xin gửi đến những người trên lời cảm ơn chân thành!

ii

TTÓÓMM TTẮẮTT

Enzyme amylase giúp phân hủy tinh bột hay glycogen, nó rất hữu ích trong

nhiều lĩnh vực công nghiệp như thực phẩm, dệt, giấy và y học… Amylase được thu

nhận từ nhiều nguồn: động vật, thực vật và vi sinh vật, trong đó amylase từ vi sinh

vật được sử dụng nhiều nhất. Trong đất, có rất nhiều loài vi sinh vật có ích có khả

năng sinh amylase. Do đó, việc phân lập được chúng là bước đầu quan trọng hỗ trợ

cho các nghiên cứu về sau. Bằng quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã phân lập được

một chủng vi khuẩn sinh bào tử có khả năng sinh amylase từ trong đất và khảo sát

hoạt tính enzyme amylase của chúng. Kết quả thu được cho thấy chủng vi khuẩn

này có thể sinh trưởng và phát triển tốt ở 370C và môi trường pH7. Thời gian nuôi

cấy để lượng enzyme sinh ra cao nhất là 24 giờ, trong môi trường có 2% tinh bột,

nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme trong khoảng 50-700C.

iii

MMỤỤCC LLỤỤCC

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. I

TÓM TẮT .................................................................................................................. II

MỤC LỤC ................................................................................................................ III

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ VI

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. VII

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................ VIII

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

TỔNG QUAN ............................................................................................................. 3

1. ĐỊNH NGHĨA VỀ ENZYME ................................................................................ 3

1.1. Enzyme ngoại bào ........................................................................................... 3

1.2. Enzyme nội bào ............................................................................................... 3

2. ENZYME AMYLASE ........................................................................................... 3

2.1. Định nghĩa ....................................................................................................... 4

2.2. Phân loại .......................................................................................................... 4

2.3. Một số enzyme amylase phổ biến ................................................................... 5

3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE ..................................................... 11

4. ỨNG DỤNG CỦA AMYLASE TRONG THỰC TẾ ĐỜI SỐNG VÀ SẢN XUẤT

.............................................................................................................................. 12

4.1. Ứng dụng của amylase trong công nghệ thực phẩm ..................................... 12

4.2. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác ............................................... 14

5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP AMYLASE

Ở VI SINH VẬT ................................................................................................... 15

5.1. Nhiệt độ ......................................................................................................... 15

5.2. pH môi trường ............................................................................................... 16

5.3. Độ thông khí .................................................................................................. 16

iv

5.4. Thành phần môi trường ................................................................................. 16

6. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH AMYLASE CỦA VI SINH

VẬT ...................................................................................................................... 17

6.1. Nhiệt độ ......................................................................................................... 17

6.2. pH .................................................................................................................. 18

7. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA AMYLASE ........... 18

7.1. Xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp Wolhgemuth ...................... 19

7.2. Phương pháp Heinkel .................................................................................... 19

7.3. Phương pháp xác định đường khử tạo thành (phương pháp Nelson) ........... 19

8. PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH BÀO TỬ CÓ KHẢ NĂNG SINH AMYLASE .. 20

8.1. Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 20

8.2. Đặc điểm của chi vi khuẩn cần phân lập ....................................................... 20

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 24

1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................... 23

1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 23

1.2. Môi trường thí nghiệm .................................................................................. 23

1.3. Vật liệu thử hoạt tính sinh học ...................................................................... 24

1.4. Dụng cụ thí nghiệm ....................................................................................... 25

2. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ......................................................................................... 26

2.1. Giai đoạn 1 .................................................................................................... 27

2.2. Giai đoạn 2 .................................................................................................... 27

2.3. Giai đoạn 3 .................................................................................................... 27

2.4. Giai đoạn 4 .................................................................................................... 28

3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 28

3.1. Phương pháp phân lập ................................................................................... 28

3.2. Phương pháp kiểm tra khả năng sinh amylase của vi khuẩn ........................ 30

3.3. Phương pháp khảo sát khả năng thích nghi của vi khuẩn ............................. 31

v

3.4. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn để thu amylase ........................................... 31

3.5. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase ngoại bào của vi khuẩn .. 31

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................................... 23

1. PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH AMYLASE ........................................................ 35

2. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH AMYLASE

CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN ......................................................................... 39

3. KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU CỦA AMYLASE ................... 45

4. BÀN LUẬN .......................................................................................................... 47

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 35

PHỤ LỤC ................................................................................................................. 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 39

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ........................................................................................... 54

TÀI LIỆU TIẾNG ANH ........................................................................................... 55

vi

DDAANNHH MMỤỤCC BBẢẢNNGG

Bảng 1. Cách thực hiện giai mẫu để xác định đường chuẩn tính hoạt độ amylase .. 32

Bảng 2. Các bước pha mẫu để xác định hoạt độ amylase ........................................ 33

Bảng 3. Khả năng sinh amylase ngoại bào và khả năng thích nghi với môi trường

của một số chủng vi sinh vật phân lập được ............................................................. 35

Bảng 4. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 19 theo

thời gian .................................................................................................................... 39


thời gian .................................................................................................................... 40


thời gian .................................................................................................................... 41


thời gian .................................................................................................................... 42


thời gian .................................................................................................................... 43

Bảng 9. So sánh hoạt tính amylase cực đại của các chủng vi khuẩn ........................ 44

Bảng 10. Kết quả khảo sát hoạt tính của amylase từ chủng 20 trên tinh bột ở những

nhiệt độ khác nhau .................................................................................................... 46

vii

DDAANNHH MMỤỤCC HHÌÌNNHH

Hình 1. Sơ đồ cấu trúc không gian của α–amylase ................................................... 5

Hình 2. Sơ đồ cấu trúc không gian của β – amylase ................................................. 8

Hình 3. Sơ đồ cấu trúc không gian của enzyme γ – amylase. .................................. 10

Hình 4. Kết quả khảo sát sơ bộ khả năng sinh amylase ngoại bào của một số chủng

vi khuẩn .................................................................................................................... 37

Hình 5. Khảo sát sự phát triển của các chủng vi khuẩn trên môi trường có pH khác

nhau........................................................................................................................... 37

Hình 6. Khảo sát sự phát triển của các chủng vi khuẩn ở nhiệt độ khác nhau ......... 38

Hình 7. Kết quả so sánh khả năng sinh amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn ...

.................................................................................................................................. 38

viii

DDAANNHH MMỤỤCC BBIIỂỂUU ĐĐỒỒ

Biểu đồ 1. Đường chuẩn định lượng tinh bột bằng phương pháp Heinkel .............. 33

Biểu đồ 2. Hoạt tính amylase của chủng 19 theo thời gian ...................................... 40





Biểu đồ 7. Hoạt tính amylase cực đại của các chủng vi khuẩn khảo sát .................. 45

Biểu đồ 8. Hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 20 ở các nhiệt độ khác nhau ..... 46

MMỞỞ ĐĐẦẦUU

Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp đại học 2012

Mở đầu 1

Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú, chúng có mặt ở khắp mọi

nơi trong đất, nước, không khí… Ngoài những tác hại như gây ảnh hưởng xấu đến

sức khỏe của con người và động thực vật, vi sinh vật còn mang lại một nguồn lợi to

lớn nếu chúng ta hiểu biết và sử dụng chúng hợp lý. Các loài vi sinh vật nói chung

và các loài sinh bào tử nói riêng đã và đang được nghiên cứu ứng dụng rất nhiều

trong các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, công nghiệp và y học… nhờ khả

năng sản sinh các loại enzyme thủy phân của chúng.

Enzyme là chất xúc tác sinh học, ngoài tính chất của một chất xúc tác nó còn

đặc biệt hơn ở chỗ chúng có khả năng xúc tác ở nhiệt độ và áp suất bình thường, có

tính đặc hiệu cao. Chính vì thế, enzyme ngày càng được sử dụng rộng rãi với quy

mô sản xuất lớn, dẫn đến việc hình thành và phát triển công nghệ enzyme. Việc sử

dụng enzyme không chỉ mang lợi ích về kinh tế mà còn góp phần giải quyết hiệu

quả việc làm sạch và bảo vệ môi trường.

Trước kia, enzyme thường được khai thác chủ yếu ở thực vật và động vật, như

amylase từ malt, papain từ đu đủ hay các protease từ động vật… Tuy nhiên, việc thu

nhận enzyme từ hai nguồn này còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như thời tiết,

bệnh tật, năng suất và hơn hết đây chưa phải là sản phẩm chính của ngành trồng trọt

và chăn nuôi của nước ta. Vì vậy, việc dùng tế bào động vật và thực vật làm nguồn

nguyên liệu để thu nhận enzyme khá hạn chế, thiếu tính kinh tế và khó nâng lên quy

mô công nghiệp.

Khắc phục được các nhược điểm trên, enzyme từ vi sinh vật trở thành nguồn

thu nhận lý tưởng nhờ hệ enzyme phong phú, nguyên liệu nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm,

điều kiện nuôi cấy dễ dàng và đặc biệt enzyme lại có hoạt tính cao. Các chế phẩm

enzyme từ vi sinh vật dần thay thế cho các enzyme có nguồn gốc động vật và thực

vật.

Một trong số các enzyme được ứng dụng nhiều nhất là enzyme amylase. Nó

xúc tác thủy phân tinh bột thành các đơn vị nhỏ hơn. Được nghiên cứu từ những

năm đầu thế kỉ 18, đến nay, các nhà khoa học đã biết khá rõ về amylase. Sản xuất

Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp đại học 2012

Mở đầu 2

amylase công nghiệp đã được chú ý từ rất lâu và ngày càng được phát triển trên thế

giới. Việt Nam chúng ta cũng là một trong những nước đã và đang có rất nhiều

nghiên cứu về ứng dụng amylase trong công nghiệp, tuy nhiên nền công nghiệp sản

xuất enzyme ở nước ta vẫn chưa thực sự phát triển.

Xuất phát từ các cơ sở trên, việc chọn được những chủng vi sinh vật có khả

năng sản sinh ra amylase có hoạt tính cao, ứng dụng được trong công nghiệp là một

vấn đề hết sức cần thiết.

w Mục tiêu cần đạt

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành phân lập và khảo sát khả năng sinh

amylase của một số chủng vi khuẩn sinh bào tử, xác định hoạt tính amylase thu

được để làm tiền đề cho các nghiên cứu về sau.

w Nội dung nghiên cứu

Bao gồm nội dung chính:

- Phân lập và tuyển chọn các chủng sinh bào tử có khả năng sản sinh

amylase hoạt tính cao trong môi trường đất.

- Nghiên cứu hình thái khuẩn lạc, hình thái bào tử của các chủng tuyển chọn.

- Khảo sát thời gian nuôi cấy để thu được enzyme có hoạt tính cao.

- Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel.

- Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme thu được.

TTỔỔNNGG QQUUAANN

Hồ Thị Mỹ Linh Luận văn tốt nghiệp Đại học 2012

Tổng quan 3

1. ĐỊNH NGHĨA VỀ ENZYME [2][3]

Enzyme là những phân tử protein đặc hiệu có khả năng xúc tác các phản ứng

chuyên biệt.

Cấu trúc không gian của enzyme có vai trò quan trọng đối với hoạt tính xúc

tác của enzyme. Tuy nhiên, hoạt động của enzyme liên hệ trực tiếp với một phần

xác định trong phân tử enzyme gọi là trung tâm hoạt động - phần của phân tử

enzyme trực tiếp kết hợp với cơ chất tạo thành phức chất trung gian giữa enzyme và

cơ chất.

1.1. Enzyme ngoại bào [3]

Enzyme tiết vào môi trường xung quanh để phân hủy các cơ chất có cấu tạo

cao phân tử, biến những chất này thành những chất có phân tử thấp mà vi sinh vật

có thể đồng hóa được. Đây là những enzyme ngoại bào. Ví dụ: protease thủy phân

protein và polypeptid thành acid amin; amylase thủy phân tinh bột thành maltose và

glucose…

1.2. Enzyme nội bào [3]

Enzyme tạo ra trong tế bào cơ thể sống để xúc tác các phản ứng nội bào. Muốn

thu được các enzyme này ta cần phải phá vỡ cấu trúc tế bào của nó.

2. ENZYME AMYLASE [3][10][15][18][20]

Hệ enzyme amylase là một trong số các enzyme được sử dụng rộng rãi nhất

trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác.

Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme nói chung cũng như enzyme amylase

nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811-1814. Những nghiên cứu này gắn liền

với tên tuổi nhà bác học người Nga- viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình

phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận

thấy rằng trong malt có chất phân giải tinh bột thành đường. 19 năm sau, hai nhà


Tổng quan 4

khoa học người Pháp là Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột đó từ

đại mạch nảy mầm. Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa nó trong dịch chiết malt và

thu được enzyme ở dạng bột đồng thời đặt tên là diaslase (theo tiếng Hy Lạp có

nghĩa là phân giải). Sau này, theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột

được gọi là amylase [3].

Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật,

trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn [3]. Trong đó,

amylase từ vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất nhờ những đặc

điểm ưu việt của chúng.

Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đặt nền móng cho việc sản xuất các

chế phẩm enzyme này và là cơ sở để sử dụng chúng trong sản xuất và đời sống

Hiện nay, kỹ thuật nghiên cứu về enzyme amylase đã hoàn thiện hơn và mở ra

những phương hướng mới, triển vọng mới trong việc ứng dụng amylase trong các

ngành kinh tế quốc dân.

2.1. Định nghĩa [3][10]

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme

này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong

nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

RR’ + H-OH → RH + R’OH

Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen.

2.2. Phân loại [3][20]

Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) và

exoamylase (enzyme ngoại bào).

Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme

khử nhánh này được chia thành 2 loại:

- Khử trực tiếp là pullulanase (hay α-dextrin 6–glucosidase).


Tổng quan 5

- Khử gián tiếp là transglucosylase và amylo-1,6-glucosidase.

Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.

Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân

tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.

2.3. Một số enzyme amylase phổ biến [3][20]

2.3.1. Enzym α–amylase (EC 3.2.1.1) hay 4-α-D-glucan glucanohydrolase

Hình 1. Sơ đồ cấu trúc không gian của α–amylase [20]

α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng

phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn. α-amylase phân cắt tinh bột ở vị trí ngẫu

nhiên trên chuỗi carbohydrate, sản phẩm cuối cùng là các maltotriose và maltose từ

amylose hoặc maltose, glucose và "dextrin giới hạn" từ amylopectin.

Nó có thể hoạt động ở bất kì vị trí nào trên cơ chất, do đó xu hướng tác động

của α-amylase nhanh hơn so với β-amylase.

Ở động vật, α-amylase là enzyme tiêu hóa chính và pH tối ưu là 6.7-7.0. Đối

với con người, α-amylase được tìm thấy trong nước bọt và trong tuyến tụy. Ngoài

ra, nó còn được tìm thất trong thực vật, nấm (Ascomycetes và Basidiomycetes) và vi

khuẩn (Bacillus).


Tổng quan 6

2.3.1.1. Cơ chế tác dụng

Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn:

- Giai đoạn dextrin hóa: chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành

một lượng lớn dextrin phân tử thấp, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh

(các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).

Tinh bột à dextrin phân tử lượng thấp.

- Giai đoạn đường hóa: các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp

tục tạo ra các tetra-trimaltose. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-

amylase cho tới disaccharide và monosaccharide.

Dextrin à tetra- và trimaltose à di- và monosaccharide.

Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành

oligosaccharide (gồm 6-7 gốc glucose). Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp

tục tạo nên các mạch cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và

maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của

amylose chứa 13% glucose và 87% maltose.

Amylose à oligosaccharide à polyglucose à maltotetrose à maltotriose à

maltose.

Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không

phân cắt được liên kết α-1,6- glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử

amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường

nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose

8%.

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành

maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-

amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít

maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì


Tổng quan 7

vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch

hóa.

2.3.1.2. Đặc tính

α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi

loại α-amylase có một tổ hợp đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine,

tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm

khoảng 1/4 tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme. α-amylase có ít

methionine và có khoảng 7 – 10 gốc cysteine.

Trọng lượng phân tử của α- amylase malt: 59.000 kDa (Knin 1956; Fisher,

Stein, 1960).

Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.

Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.

Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH = 4.2 – 5.7 (Bernfeld P., 1951).

α-amylase là một metaloenzyme. Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định

cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme. Ca còn có vai trò duy trì

sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của

các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ

hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn

các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và

nồng độ Mg2+. Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+,

Ag+, Hg2+…

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không

giống nhau. Biên độ pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ malt khác với α-

amylase từ vi sinh vật.

Ví dụ: pH tối thích cho α-amylase từ malt là 5.3 (khoảng hoạt động từ pH 4.7-

5.4), α-amylase từ nấm sợi là 4.8 (khoảng hoạt động từ pH từ 4.5-5.8).

Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau.


Tổng quan 8

Ví dụ: α-amylase của A.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của

malt và vi khuẩn B.subtilis.

Độ bền của α-amylase cũng bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH. Tuy nhiên, so

với các loại enzyme amylase khác thì α-amylase có độ bền nhiệt hơn.

Ví dụ: Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn

khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác

động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50oC và bị vô hoạt ở 70oC (Kozmina, 1991).

Trong dung dịch đệm pH= 4,7 thì α-amylase của A.oryzae rất nhạy với tác động của

nhiệt độ cao, thậm chí ở 40oC trong 3 giờ hoạt tính dextrin hóa của nó chỉ còn 22-

29%, hoạt tính đường hóa còn 27-85%. Ở 50oC trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi

này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự).

2.3.2. Enzyme β – amylase (EC 3.2.1.2) hay 4-α -D-glucan maltohydrolase

Hình 2. Sơ đồ cấu trúc không gian của β – amylase [20]

β–amylase được tổng hợp từ vi khuẩn, nấm và thực vật. β–amylase xúc tác

phản ứng thủy phân tinh các liên kết α-1,4-glucoside trong tinh bột, glycogen và

polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch.

Maltose tạo thành do sự xúc tác của β–amylase có cấu hình β.

Trong quá trình chín của trái cây, β–amylase thủy phân tinh bột thành đường

maltose tạo vị ngọt cho trái. Cả α-amylase và β-amylase đều có mặt trong hạt


Tổng quan 9

giống nhưng β-amylase hoạt động trước khi hạt nảy mầm, trong khi đó α-

amylase xuất hiện khi hạt đã nảy mầm.

2.3.2.1. Cơ chế tác dụng:

β–amylase xúc tác từ đầu không khử của mạch, thủy phân các liên kết α-1,4-

glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6-

glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng.

Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-

1,6-glucoside, gọi là β–dextrin.

Tác dụng của β–amylase lên tinh bột như sau:

Tinh bột à maltose (54-58 %) + β–dextrin (42-46 %)

Nếu tinh bột bị thủy phân đồng thời bởi cả α-amylase và β–amylase thì lượng

tinh bột bị thủy phân lên tới 95%.

2.3.2.2. Đặc tính

β–amylase là một albumin, tâm phản ứng có chứa nhóm –SH, nhóm –COOH

và vòng imidazol của các gốc histodine.

β–amylase không bền khi có Ca2+, β–amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, urea,

iodoacetamide, iodin, ozon…

β–amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhưng bền với acid hơn. β–amylase

bị bất hoạt ở nhiệt độ 70 oC. Nhiệt độ hoạt động tối thích là 55 oC, pH 5.1-5.5.


Tổng quan 10

2.3.3. Enzyme γ - amylase (EC 3.2.1.3) hay 4- α-D-glucan glucohydrolase

Hình 3. Sơ đồ cấu trúc không gian của enzyme γ – amylase.

γ - amylase có khả năng thủy phân liên kết α -1,4 lẫn α-1,6-glucoside từ đầu

không khử của mạch .

Ngoài ra, γ - amylase còn có khả năng thủy phân liên kết α -1,2-glucoside và α

-1,3-glucoside. Do đó, nó có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen,

amylopectin, dextrin… thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại

enzyme amylase khác.

γ – amylase hoạt động hiệu quả trong môi trường acid, pH 3.5-5.5, ở nhiệt độ

50 oC. Nó bền với acid hơn α-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, aceton.

2.3.4. Pullulanase (EC 3.2.1.41) hay α-dextrin 6–glucosidase

Pullulanase có khả năng thủy phân liên kết α -1,6-glucoside trong các polyose

và oligosaccharide kiểu tinh bột và glucogen.

Cơ chất đặc trưng của enzyme này là pullulan-một polysaccharide tách ra từ

giả nấm men Aureobasidium pullulana.

Phân tử lượng là 145.000 Da, pH hoạt động tối ưu là pH = 5, nhiệt độ tối ưu là

47.5 oC.


Tổng quan 11

2.3.5. Transglucosyldase (EC 2.4.1.3) hay 4-α-glucanotransferase

Trans-glucosyldase có cả hoạt tính tranferase lẫn hoạt tính thủy phân. Nó thực

hiện việc chuyển các gốc glucosyl sang nhóm mono, di- và oligosaccharide, xúc tác

tạo thành các liên kết α -1,4 và α -1,6 glucoside.

Trans-glucosyldase không những thủy phân maltose thành glucose mà còn

tổng hợp izomaltose, izotriose và panose, tức là khả năng chuyển gốc glucose và

gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác nhau bằng liên kết α -1,6

glucoside thành panose và izomaltose.

3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE [3][20]

Amylase có trong nhiều nguồn khác nhau như động vật (enzyme pancreatic

trong tụy tạng), thực vật (malt đại mạch, tiểu mạch, lúa, ngô…) và vi sinh vật.

So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ vi

sinh vật có những ưu thế quan trọng như:

- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh.

- Enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao, có khả năng chuyển hóa khối

lượng vật chất rất lớn.

- Nguyên liệu dùng sản xuất enzyme rẻ tiền và dễ kiếm.

- Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết và điều kiện

địa lý như nuôi, trồng động vật và thực vật.

- Hoàn toàn có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp và kiểm soát được quá

trình sản xuất.

Do đó nó đã trở thành đối tượng được quan tâm và nghiên cứu nhiều nhất để

thu nhận enzyme.

Những chủng vi sinh vật sinh nhiều amylase thường được phân lập từ các

nguồn trong tự nhiên. Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi,

giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn.


Tổng quan 12

Vi khuẩn thường sử dụng các chủng như Bacillus subtilis, Bacillus

licheniformis, Baccillus diastaticus, Bacillus stearothemophilus, Bacillus

circulans…

Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus và Rihzopus…

Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces,

Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylase.

Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng

có một số ít như xạ khuẩn ưa nhiệt như Micromonospora vugaris có khả năng tạo

một lượng nhỏ α-amylase hoạt động ở 65°C cùng với protease và các enzyme khác.

4. ỨNG DỤNG CỦA AMYLASE TRONG THỰC TẾ ĐỜI

SỐNG VÀ SẢN XUẤT [2][3]

Ngày nay do nhận thấy được các nhược điểm của việc thủy phân bằng acid

như gây hư tổn thiết bị, gây ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm cũng như sức khỏe

con người, do đó amylase trở thành nguồn enzyme chủ đạo để tham gia các quá

trình thủy phân quan trọng trong các quá trình sản xuất công nghiệp đặc biệt là

trong công nghệ thực phẩm.

4.1. Ứng dụng của amylase trong công nghệ thực phẩm

4.1.1. Ứng dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì

Trong sản xuất bánh mì, người ta sử dụng cả α-amylase và β–amylase. Các

enzyme này tham gia thủy phân tinh bột thành đường. Nhờ đó, nấm men

Saccharomyces cerevisiae dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn, CO2 làm tăng thể

tích bánh và tạo ra hương vị, màu sắc tốt cho bánh.


Tổng quan 13

4.1.2. Ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo

Mục đích đưa enzyme vào sản xuất bánh quy là làm tăng mùi vị của bánh.

Amylase hoạt động làm tăng lượng đường khử, đường này sẽ tham gia phản ứng

oxy hóa khử và kết quả tạo bánh quy có màu và mùi hấp dẫn.

4.1.3. Ứng dụng trong sản xuất bia

Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử

dụng enzyme amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai

đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces sp.

Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch

chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm (malt), enzyme amylase sẽ được

tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng

và vật chất cho sự tạo thành mầm. Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ

enzyme của chính nó. Khi đó hạt chỉ tổng hợp ra lượng enzyme amylase vừa đủ để

phân hủy lượng tinh bột có trong hạt. Như thế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản

xuất bia ở qui mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm.

Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men tạo bia thì nhà sản xuất không

sử dụng hoàn toàn 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một

công thức nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá trình lên

men. Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm

enzyme amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột. Enzyme này có ý nghĩa

rất lớn trong việc làm bia, giúp sản xuất bia ở qui mô công nghiệp.

4.1.4. Ứng dụng trong sản xuất siro

Ứng dụng trong sản xuất siro và các sản phẩm chứa đường- phôi bắp được xử

lý bằng SO2 và vi khuẩn lactic để hạt tinh bột mềm, ra khỏi khối bột bằng li tâm.

Enzyme amylase chỉ được sử dụng sau khi tinh bột hòa vào nước.


Tổng quan 14

Ngoài tinh bột bắp, người ta còn sử dụng tinh bột khoai tây, tinh bột mì, tinh

bột sắn. Tùy theo nguồn nguyên liệu tinh bột mà người ta áp dụng kĩ thuật khác

nhau cho phù hợp.

Enzyme sử dụng trong công nghệ sản xuất siro phải là những enzyme chịu

nhiệt, những enzyme này thường được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis,

Bacillus stearothermophilus.

Đặc điểm quan trọng nhất của enzyme amylase là chúng hoạt động ở pH gần

trung tính (pH=6), đặc điểm này giúp thực hiện các quá trình đường hóa rất dễ

dàng.

4.2. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác [3]

4.2.1. Ứng dụng trong công nghiệp dệt

Sau khi vải được hồ hóa để làm mịn, người ta phải tiến hành quá trình rũ hồ

vải. Phương pháp làm sạch hồ tinh bột được sử dụng là enzyme amylase.

Trước đây, người ta sử dụng enzyme a-amylase của malt hay pancreatic

amylase. Để phá hủy nhanh lượng tinh bột thừa, người ta đưa nhiệt độ đến nhiệt độ

sôi sau đó làm giảm xuống 50°C hay 60°C và cho enzyme amylase vào.

Ngày nay người ta sử dụng a-amylase của vi khuẩn. Enzyme amylase của vi

khuẩn chịu nhiệt cao, chúng hoạt động mạnh ở nhiệt độ 85°C-90°C. Một số enzyme

amylase của Bacillus subtilis có khả năng hoạt động ở 105°C-115°C.

Tuy nhiên còn tùy thuộc vào điều kiện kinh tế, sản xuất, nguồn amylase mà

người ta tiến hành chọn lựa enzyme rũ hồ vải cho phù hợp.

4.2.2. Ứng dụng trong sản xuất chất tẩy rửa

Chất tẩy rửa bao gồm những chất kiềm, sodium silicate, sodium bicarbonate,

sodium tripolyphosphate.


Tổng quan 15

Enzyme α-amylase của vi khuẩn là một trong những enzyme thường được ứng

dụng trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, do enzyme này có khả năng chịu

nhiệt cao (khoảng 90°C), pH cao (pH = 9) [3].

Tuy nhiên, enzyme này không bền pH kiềm và nhiệt độ cao trong một thời

gian lâu, nên người ta thường bao chúng lại trước khi phối trộn với các thành phần

khác của chất tẩy rửa để bảo quản được lâu và đảm bảo khả năng hoạt động của

chúng.

Enzyme α-amylase làm tăng khả năng phân giải các vết bẩn do carbonhydrat

trong quần áo

4.2.3. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy

Việc sử dụng enzyme để khử mực giấy loại trên thế giới đã có thăm dò theo

nhiều hướng và một số chủng vi sinh, theo các công bố gần đây nhất cho thấy,

enzyme α-amylase đang có khả năng thúc đẩy quy trình khử mực tốt.

Nguyên lý hoạt động của enzyme là: chúng bẻ gãy các mạch tinh bột trên mặt

giấy, kéo theo sự các phân tử mang màu bám trên đó, tạo thuận lợi cho quá trình

tuyển nổi khử mực.

5. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH

TỔNG HỢP AMYLASE Ở VI SINH VẬT [2][3]

5.1. Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật

cũng như tính chất của enzym được tổng hợp. Mỗi loài vi sinh vật có một khoảng

nhiệt độ hoạt động thích hợp khác nhau. Nói chung đa số vi sinh vật tổng hợp

enzym không bền với nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ

thích hợp, enzyme của vi khuẩn có khoảng nhiệt độ hoạt động rộng hơn của nấm

sợi.


Tổng quan 16

5.2. pH môi trường

pH môi trường có tác động trực tiếp lên sự phát triển của vi sinh vật, nó làm

thay đổi điện tích trên bề mặt tế bào cũng như ức chế phần nào các enzyme trên bề

mặt tế bào.

Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, pH môi trường có ảnh hưởng ít do

môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong

quá trình nuôi. Vì vậy, nên tạo pH ban đầu thích hợp với vi sinh vật nuôi.

Hầu hết các loài vi sinh vật sinh tổng hợp amylase phát triển trong các điều

kiện môi trường trung tính, acid yếu hay kiềm yếu.

5.3. Độ thông khí

Độ thông khí ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tổng hợp amylase. Trong một số

trường hợp, thiếu oxy tuy có kìm hãm sự sinh trưởng vi sinh vật nhưng lại tăng quá

trình tổng hợp amylase. Một số trường hợp khác, sự hiếu khí lại kìm hãm sự tổng

hợp amylase.

5.4. Thành phần môi trường

5.4.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng

Nguồn nitơ trong môi trường dinh dưỡng có thể là muối vô cơ hay chất hữu cơ

chứa nitơ. Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi vi sinh vật tạo amylase

người ta dùng muối vô cơ. Tùy vào đặc điểm sinh trưởng mà mỗi loài vi sinh vật

cần loại muối vô cơ thích hợp để tạo amylase nhiều nhất.

Nguồn nitơ nhất định được bổ sung vào môi trường có thể kích thích tổng hợp

amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, môi

trường bị acid hóa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực

glucoamylase và ức chế tổng hợp α- amylase.


Tổng quan 17

5.4.2. Ảnh hưởng của amino acid

Amino acid là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme. Amino acid có tác

dụng tốt với sinh lý vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp amylase do:

- Nó vừa là nguồn carbon, nguồn nitơ và nguồn năng lượng.

- Một số amino acid riêng lẻ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp

amino acid khác hay trong quá trình chuyển amin hóa. Nhờ một số amino

acid như glutamic acid và aspartic acid mà thực hiện đồng hóa dị dưỡng

CO2.

Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp

enzyme, một số tăng cường cảm ứng sinh amylase, một số khác lại ức chế quá trình

này.

5.4.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng

Các nguyên tố vi lượng và đa lượng có ảnh hưởng lớn tới sự sinh trưởng và

tổng hợp enzyme amylase của vi sinh vật. Trong các cấu tử vô cơ trong môi trường

nuôi cấy B. subtilis và vi sinh vật khác cho hoạt lực amylase cao cần có muối của

mangan, kẽm cùng một số nguyên tố vi lượng khác.

6. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH

AMYLASE CỦA VI SINH VẬT [3][10][20]

6.1. Nhiệt độ

Amylase có khoảng nhiệt độ hoạt động tương đối rộng. Amylase của nấm hoạt

động ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ của amylase vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn chịu

nhiệt có thể hoạt động ở 95 – 1050C.[3]

Nhiệt độ tối ưu của vi khuẩn Bacillus trong khoảng 70 – 750C.[3]

Amylase của vi khuẩn là bền nhiệt hơn cả, nó có thể chịu được nhiệt độ 920C,

trong khi đó amylase của nấm sợi bị vô hoạt ở 700C.


Tổng quan 18

6.2. pH

Hoạt độ amylase phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường do pH môi trường ảnh

hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, trung tâm hoạt động của enzyme phức chất

giữa enzyme và cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Đa số amylase vi

khuẩn bền ở pH trung tính 6,5-7,0. Amylase nấm sợi có pH tối ưu khoảng 4.5 –

4.7.[3]

7. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA

AMYLASE [3][4][5]

Khi sử dụng bất kì chế phẩm enzyme nào chúng ta cần phải biết rõ hoạt lực

xúc tác của nó. Enzyme amylase có tác dụng phân giải tinh bột, vì vậy hoạt lực của

chúng phản ảnh hoạt lực của tác dụng của tất cả các amylase có trong chế phẩm.

Tuy nhiên, tùy vào cơ chất và phương pháp xác định mà người ta có thể biết được

sự có mặt của enzyme nào đó trong chế phẩm bằng cách gián tiếp.

Để đo hoạt tính của amylase người ta có thể dùng một trong các phương

pháp sau:

- Đo độ biến thiên của tinh bột bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ

tinh bột, khi đó các phân tử của cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt của dung dịch

giảm dần.

- Đo mật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng với dung dịch

iodine. Khi có amylase tác dụng, các sản phẩm phân giải khác nhau sẽ cho

màu khác nhau khi tác dụng với iodine.

- Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác

dụng với cơ chất.

Sau đây là một số phương pháp hay được sử dụng


Tổng quan 19

7.1. Xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp

Wolhgemuth

Phương pháp này xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn

lượng tinh bột với chất chỉ thị màu iodine.

Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 300C, khi

có ion clorua, có thể phân giải một mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu

với iodine.

Hoạt tính của enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị Wolhgemuth/ml môi

trường hoặc 1 ml dịch chiết enzyme.

7.2. Phương pháp Heinkel

Phương pháp này xác định lượng tinh bột bị phân giải trên cơ sở xác định độ

giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng của dung dịch iodine.

Một đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng phân giải 1 mg

tinh bột sau 30 phút ở 300C.

7.3. Phương pháp xác định đường khử tạo thành (phương pháp

Nelson)

Đường khử được tạo thành cùng với dextrin khi tinh bột bị phân giải bởi α –

amylase. Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định lượng đường

khử tạo thành.

Sau khi tinh bột bị thủy phân bởi α – amylase ở những điều kiện xác định, đun

hỗn hợp muối đồng hóa trị II để tạo thành kết tủa Cu2O. Hòa tan kết tủa trong thuốc

thử asenomolybden sẽ được dung dịch có màu xanh da trời, so màu ở bước sóng

660 nm rồi đối chiếu với đường chuẩn để tính ra lượng đường khử.


Tổng quan 20

Đơn vị hoạt động của enzyme trong phương pháp này được định nghĩa là

lượng enzyme có thể phân giải được tinh bột trong 30 phút ở 300C cho ra lượng

đường khử tương đương 1µmol glucose

8. PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH BÀO TỬ CÓ KHẢ NĂNG

SINH AMYLASE

8.1. Phân lập vi khuẩn [5][7]

Phân lập một vi sinh vật là quá trình tách riêng vi sinh vật đó từ mẫu hay từ

quần thể vi sinh vật ban đầu để thu nhận giống thuần khiết. Giống vi sinh vật thuần

khiết rất quan trọng trong công nghệ sinh học, chúng chỉ gồm các tế bào sinh ra từ

tế bào ban đầu. Hầu hết các ứng dụng trong công nghệ sinh học đều liên quan đến

việc sử dụng giống thuần.

Phần lớn các phương pháp phân lập giống thuần khiết đều dựa vào các kỹ

thuật pha loãng, thường gồm các bước chính như sau: chuẩn bị mẫu, tăng sinh mẫu

(nếu số lượng tế bào trong mẫu vi sinh vật có số lượng rất ít), pha loãng mẫu, cấy

mẫu lên môi trường thạch đĩa thích hợp, ủ mẫu, kiểm tra và phát hiện khuẩn lạc đặc

trưng, chọn khuẩn lạc đặc trưng đem tạp giống thuần và kiểm tra giống thuần.

Việc kiểm tra giống thuần được thực hiện bằng nhiều cách như kiểm tra vết

cấy, kiểm tra bằng kính hiển vi hay bằng phương pháp cấy trang, hay kiểm tra bằng

phương pháp cấy ria. Trong đó, việc kiểm tra bằng phương pháp cấy trang hay cấy

ria được coi là phương pháp tiện lợi và có ý nghĩa nhất. Trên các vạch tạo thành trên

bề mặt môi trường các đĩa này, giống vi sinh vật được xem là thuần khiết nếu có

duy nhất một khuẩn lạc có hình thái y hệt các khuẩn lạc được phân lập ở đĩa thứ

nhất (đĩa phân lập).

8.2. Đặc điểm của chi vi khuẩn cần phân lập [1][5][7]

Do các ưu điểm của amylase từ vi sinh vật đã nêu ở trên, người ta tiến hành

thu amylase từ vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn Bacillus.


Tổng quan 21

Chi Bacillus bao gồm 60 loài, thường được tìm thấy trong tự nhiên và được sử

dụng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.

Bacillus là loài trưc khuẩn Gram dương, thường xếp thành cặp hay thành

chuỗi, có một bào tử duy nhất. Bào tử hình bầu dục giúp vi khuẩn chống lại điều

kiện khắc nghiệt của môi trường, nhưng bào tử không ngăn sự tiếp xúc với không

khí. Các loài vi khuẩn Bacillus được chia thành ba nhóm dựa trên hình thái của bào

tử và vỏ bào tử như sau:

- Nhóm 1: Gram dương, hình thành bào tử ở trung tâm hay ở cuối, hình elip,

bào tử hình trụ không làm phình vỏ bào tử.

- Nhóm 2: Gram dương, hình elip, túi bào tử bị phình lên.

- Nhóm 3: Gram dương, túi bào tử phình ở phía cuối bào tử hay ở tận cùng 2

đầu.

Theo nhiều nghiên cứu đã phát hiện khả năng sinh amylase của chi vi khuẩn

Bacillus, trong đó được biết đến nhiều nhất là B.subtilis, B. lichenformis, B.

strepmophilis… Chúng có thể sản xuất ra lượng amylase tương đối cao và có hoạt

tính ổn định.

Sau đây là đặc điểm của một số loài tiêu biểu

w Bacillus subtilis

- Siêu giới: Vi khuẩn

- Ngành: Firmicutes

- Lớp: Bacilli

- Bộ: Bacillale

- Họ: Bacillaceae

- Chi: Bacillus

- Loài: Bacillus subtilis


Tổng quan 22

Bacillus subtilis thuộc nhóm 1 của loài Bacillus (bào tử không làm phình tế

bào lên, màng bào tử mỏng).

Bacillus subtilis có hình que, ít khi xếp thành chuỗi dài, đồng thể khi nhuộm.

Kích thuớc 0,7-0,8 x 2-3 mm. Tiêm mao nằm lệch một bên. Nội bào tử 0,8-1,5 mm,

bề mặt bào tử bắt màu yếu khi nhuộm, hình thành từ giữa tế bào dinh dưỡng. Khi

nẩy mầm, lớp vỏ bào tử nứt theo hướng xích đạo. Sau khi tế bào dinh dưỡng hình

thành, lớp vỏ bào tử tiêu dần.

Trên môi trường pepton-agar, khuẩn lạc hình tròn hay không đều, dày và đục,

bề mặt có thể nhăn nheo, màu kem hoặc nâu. Đặc điểm của khuẩn lạc thay đổi tùy

theo thành phần môi trường. Nếu bề mặt môi trường thạch ẩm, vi khuẩn có thể mọc

lan ra.

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, không sinh trưởng được ở môi

trường kỵ khí, lên men glucose sinh acid và acetoin.

w Bacillus lichenformis

- Siêu giới: Vi khuẩn

- Ngành: Firmicutes

- Lớp: Bacilli

- Bộ: Bacillale

- Họ: Bacillaceae

- Chi: Bacillus

- Loài: Bacillus licheniformis

Đây là một loại vi khuẩn thường được tìm thấy trong đất và lông chim.

Thường có nhiều ở các loại gia cầm như vịt, vi khuẩn thường được tìm thấy ở khu

vực xung quanh ngực và bộ lông.

B. lichenformis có hình que, là vi khuẩn gram dương. Nó có thể tạo bào tử

trong đất, do đó rất thích hợp cho việc sản xuất các sản phẩm phục vụ trong công


Tổng quan 23

nghiệp như enzyme, chất kháng sinh hay tham gia vào các chu trình dinh dưỡng

trong tự nhiên.

PPHHƯƯƠƠNNGG PPHHÁÁPP

NNGGHHIIÊÊNN CCỨỨUU


Phương pháp nghiên cứu 23

1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1. Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn sinh bào tử được phân lập từ đất nông nghiệp ở Đà Lạt và đất ao

nuôi tôm ở Bến Tre.

1.2. Môi trường thí nghiệm

1.2.1. Môi trường phân lập vi khuẩn sinh bào tử

w Môi trường DSM (Difco Sporulation Medium)

- Nutrient Broth 8 g

- KCl 1 g

- MgSO4 .7H20 0.25 g

- NaOH 1N 0.7 ml

- Agar 18 g

- Nước vừa đủ 1 L

Hấp tiệt trùng 121oC trong 15 phút. Môi trường sau khi hấp bổ sung

- FeSO4 1mM

- Ca(NO3)2 1M

- MnCl2 0.1M

1.2.2. Môi trường khảo sát sự phát triển của vi khuẩn

- Nutrient broth 8 g

- Agar 18 g




1.2.3. Môi trường định tính amylase


- Tinh bột tan 2 g

- Agar 18 g


1.2.4. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn thu amylase


- Tinh bột 20/50 g


1.2.5. Dung dịch đệm PBS

- NaCl 8 g

- KCl 0.2 g

- Na2HPO4 1.44 g

- KH2PO4 0.24 g

- NaOH 1N 0.7 ml

1.3. Vật liệu thử hoạt tính sinh học

Dung dịch NaCl 0.1 %

Dung dịch acid tricloacetic 5 %

Dung dịch iodine: hòa tan 1g I2 và 2g KI vào 5 ml nước (KI trước, I2 sau).

Thêm nước cho đủ 300 ml, khi sử dụng pha loãng 150 lần.

Dung dịch đệm phosphate 0.05 M, pH 6:

- A (dung dịch Na2HPO4): 27.8 g Na2HPO4 hay 36.14 g Na2HPO4.2H2O

trong 1l nước cất.



- B (dung dịch NaH2PO4): 53.56 g NaH2PO4.7H20 hay 71.7 g NaH2PO4.12

H20 trong 1l nước.

- Lấy 87.7 ml dung dịch A + 12.3 ml dung dịch B thêm nước cất đến 200 ml.

- Dung dịch tinh bột 1%: cân 1 g tinh bột với 10 ml dung dịch đệm (0.05M

pH 6), thêm vào 80 ml dung dịch đệm đang sôi, để nguội. Thêm dung dịch

đệm đến 100ml.

1.4. Dụng cụ thí nghiệm

- Bình tam giác

- Bình định mức

- Đĩa petri

- Pipette

- Cân

- Becher

- Que cấy trang

- Que cấy

- Máy li tâm

- Máy lắc

- Phễu lọc

- Ống nghiệm

- Máy đo quang

- Tủ ủ

- Tủ sấy



2. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

Xác định hoạt tính

enzyme

Lấy mẫu

Phân lập Nhuộm

xanh methylen

Chọn lọc ban đầu Khả năng sinh amylase

trên môi trường thạch đĩa

Khả năng thích nghi ở

các điều kiện môi trường

Vi khuẩn được chọn

Khả năng sinh amylase

trong môi trường lỏng

Nuôi tăng sinh vi khuẩn

trong môi trường lỏng

Mẫu đất

Dịch enzyme amylase



Thí nghiệm gồm 4 giai đoạn chính :

- Giai đoạn 1: Phân lập các chủng vi khuẩn sinh bào tử có khả năng sinh

amylase ngoại bào

- Giai đoạn 2: Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn phân

lập được ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau

- Giai đoạn 3 : Chọn lọc các chủng có khả năng sinh amylase cao

- Giai đoạn 4: Nuôi cấy và khảo sát các điều kiện sinh trưởng thích hợp để

thu amylase

2.1. Giai đoạn 1

Từ các mẫu đất thu thập được, phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào

tử và sinh amylase ngoại bào. Khi phân lập dựa vào hình thái nhóm vi khuẩn, đặc

điểm hình dạng dưới kính hiển vi để lựa chọn vi khuẩn cần phân lập. Cấy ria các

khuẩn lạc thu được để có dòng thuần.

2.2. Giai đoạn 2

Vi khuẩn được nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ (10, 37, 50oC) và pH (5, 7,

10) khác nhau để khảo sát khả năng thích nghi với môi trường

2.3. Giai đoạn 3

Nuôi cấy các chủng đã phân lập được với cùng mật độ vi khuẩn nhất định trên

môi trường thạch tinh bột để so sánh khả năng sinh amylase ngoại bào và chọn

những vi khuẩn sinh amylase cao nhất.



2.4. Giai đoạn 4

Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường lỏng có tinh bột làm chất cảm ứng

sinh amylase. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (thời gian, nồng độ tinh bột, nhiệt

độ) đến khả năng amylase ngoại bào của các chủng vi khuẩn

2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát hoạt tính amylase theo thời gian nuôi cấy

w Yếu tố 1: Thời gian nuôi cấy

Thời gian khảo sát từ 16 – 84 h tùy theo hoạt độ amylase của chủng vi khuẩn

w Yếu tố 2: Nồng độ tinh bột

Hai nồng độ tinh bột được sử dụng là 2% và 5% trong môi trường dinh dưỡng

(Nutrient broth)

w Yếu tố 3: Chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn được chọn lọc khả năng sinh amylase ở giai đoạn 1 và 3

sẽ được sử dụng cho thí nghiệm này.

2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ hoạt động tối ưu của amylase

Sử dụng chủng vi khuẩn sinh amylase có hoạt độ cao nhất khảo sát được từ thí

nghiệm 1

Nhiệt độ khảo sát lần lượt là 30, 50, 70 và 90oC

Tất cả các thí nghiệm đều được bố trí ngẫu nhiên và lặp lại ít nhất 3 lần

3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Phương pháp phân lập [5][7][19][24]

3.1.1. Phương pháp lấy mẫu

Lấy mẫu đất ở nhiều vùng, hay lấy tại nhiều vị trí khác nhau trên cùng một

mảnh đất để tạo được sự đa dạng trong các mẫu phân lập. Các mẫu đất được lưu



trong hủ nhựa hay hủ thủy tinh vô trùng, giữ ở 4oC. Các thông tin như ngày, giờ lấy

mẫu, nơi lấy mẫu, tên mẫu đất được lưu lại để tiện theo dõi.

3.1.2. Phương pháp phân lập

Cho 20 ml dung dịch PBS vào 2 g đất, vortex để phân tán đều và ủ ở nhiệt độ

65oC trong vòng 60 phút để bảo đảm chỉ có vi khuẩn sinh bào tử còn tồn tại. Pha

loãng mẫu bằng PBS sau đó trãi 0.1 ml dung dịch của 3 độ pha loãng cuối lên môi

trường DSM – môi trường đặc hiệu cho vi khuẩn sinh bào tử. Ủ qua đêm ở 37oC.

Thu các khuẩn lạc có đặc điểm đặc trưng của Bacillus: dạng tròn, màu trắng

hoặc trắng xám, bề mặt khô, mép có răng cưa. Cấy ria để thu được dòng thuần. Các

vi khuẩn phân lập được là trực khuẩn Gram dương hình que ngắn, có bào tử, mọc

riêng lẽ hay xếp thành chuỗi ngắn, xác định sơ bộ là Bacillus.

Tiến hành như nhau đối với tất cả các mẫu đất.

3.1.3. Phương pháp kiểm tra bào tử

Từ các khuẩn lạc thu được trong mẫu cấy ria, tiến hành nhuộm xanh methylen

để kiểm tra khả năng sinh bào tử của vi khuẩn.

Đặc điểm của bào tử Bacillus: quan sát dưới kính hiển vi, bào tử trong suốt

không bắt màu, đôi khi thấy bào tử chưa trưởng thành còn nằm trong tế bào sinh

dưỡng.

3.1.4. Phương pháp quan sát vi sinh vật

Vi khuẩn phát triển trên môi trường rắn sẽ tạo thành các khuẩn lạc đặc trưng

của loài đó. Việc miêu tả khuẩn lạc là một trong các việc rất cần thiết đối với công

tác định danh loài vi khuẩn nghiên cứu. Khi miêu tả khuẩn lạc cần ghi nhận các đặc

điểm như: hình dáng khuẩn lạc, màu sắc, kích thước, bề mặt, mép khuẩn lạc…

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc của

những vi khuẩn có bào tử được chọn.



3.2. Phương pháp kiểm tra khả năng sinh amylase của vi khuẩn

[7][8]

3.2.1. Nguyên tắc

Để xác định khả năng sinh amylase ngoại bào của vi khuẩn phân lập chúng tôi

sử dụng môi trường thạch Nutrient Broth có chứa tinh bột.

Vi khuẩn được gọi là amylase dương tính khi thấy xuất hiện một vòng trong

suốt bao quanh khóm vi khuẩn khi nhuộm đĩa thạch với dung dịch lugol.

Hoạt tính amylase càng cao khi tỷ lệ đường kính vòng thủy giải và đường kính

khóm vi khuẩn càng cao.

3.2.2. Cách tiến hành

Chọn khuẩn lạc đơn trên đĩa cấy ria, cấy vạch lên đĩa có môi trường Nutrient

agar và tinh bột. Ủ qua đêm ở 37oC. Nhuộm với dung dịch lugol, vi khuẩn có vòng

thủy giải tinh bột được giữ lại để khảo sát tiếp trong các thí nghiệm sau.

Các vi khuẩn được chọn sẽ được hoạt hóa bằng cách lấy 1 khuẩn lạc cho vào 1

ml môi trường Nutrient Broth, ủ ở ở 37oC để qua đêm.

Sau đó lấy 100 µl dịch huyền phù cho vào 7 ml môi trường Nutrient Broth,

nuôi lắc ở 37oC trong khoảng 4-6 giờ. Dịch huyền phù vi khuẩn được pha loãng

(nếu cần thiết) sao cho OD625 trong khoảng 0.08 – 0.1, độ đục này tương đương mật

độ vi khuẩn là 1-2 x 108 vi khuẩn/ ml. Chấm 5 µl dịch huyền phù trên lên môi

trường thạch có tinh bột. Ủ ở 370C cho vi khuẩn phát triển. Đo đường kính vòng

thủy giải (d1) và đường kính khóm khuẩn (d2). Tính tỷ lệ d1/d2.



3.3. Phương pháp khảo sát khả năng thích nghi của vi khuẩn

3.3.1. Thí nghiệm 1: khả năng thích nghi với nhiệt độ môi trường

Khuẩn lạc của các vi khuẩn được chọn sẽ được vạch lên môi trường Nutrient

Agar rồi đem ủ lần lượt ở các nhiệt độ 100C, 500C song song với mẫu đối chứng ủ ở

370C.

3.3.2. Thí nghiệm 2: khả năng thích nghi với pH môi trường

Vi khuẩn được nuôi trên môi trường Nutrient agar lần lượt có pH 4, pH 10

cùng với mẫu đối chứng là môi trường pH 7, tất cả các đĩa đều ủ ở 370C.

3.4. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn để thu amylase

Vi khuẩn được hoạt hóa trong môi trường Nutrient Broth sau khoảng thời

gian nhất định. Sau đó, hút 1 ml huyền phù trên cho vào bình erlen chứa 40 ml

môi trường có chứa 2% và 5% tinh bột. Nuôi trên máy lắc với tốc độ lắc 150

vòng/ phút ở 37oC. Sau từng khoảng thời gian nuôi cấy nhất định sẽ lấy mẫu để

khảo sát.

Mẫu được đem ly tâm với tốc độ 5000 vòng trong vòng 10 phút. Dịch enzym

thu được đem đi xác định hoạt tính.

3.5. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase ngoại bào

của vi khuẩn [5]

Sử dụng phương pháp Heinkel

3.5.1. Nguyên tắc

Xác định lượng tinh bột bị thủy giải dựa trên cơ sở, xác định mức độ giảm

cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với Iod.

Đơn vị hoạt độ là lượng enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 30

phút ở nhiệt độ 30oC



3.5.2. Cách tiến hành

3.5.2.1. Lập đồ thị chuẩn

Để xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Heinkel cần xác định đường

cong chuẩn từ dung dịch tinh bột chuẩn 1%.

Cách pha dung dịch tinh bột 1%:

- Cân 1 g tinh bột trộn với 10 ml đệm.

- Thêm 80 ml đệm đang sôi, nếu cần tiếp tục đun để được dung dịch trong

suốt. Để nguội cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch.

Lập đồ thị đường chuẩn

Bảng 1. Cách thực hiện giai mẫu để xác định đường chuẩn tính hoạt độ

amylase

Ống nghiệm số 1 2 3 4 5

Dung dịch tinh bột 1% (µl) 20 40 60 80 100

Dung dịch NaCl 0.1% (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Dung dịch đệm phosphate 0.05M (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Nước cất (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Acid Tricloacetic (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Thuốc thử Iodine (ml) 9 9 9 9 9

Đo độ hấp thu bằng máy đo quang ở bước sóng 560 nm.

Dùng nước cất để hiệu chỉnh về 0.

Vẽ đồ thị biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo lượng tinh bột trong các ống.



y = 0.209x - 0.0049R² = 0.9625

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

OD

Hàm lượng tinh bột (g/ml)

Biểu đồ 1. Đường chuẩn định lượng tinh bột bằng phương pháp Heinkel

3.5.2.2. Tiến hành xác định hoạt độ thủy phân tinh bột

Dịch nuôi cấy vi khuẩn được ly tâm loại sinh khối thu dịch enzyme. Dịch thu

được đem lọc qua giấy lọc, sau đó đem xác định hoạt tính enzyme.

Bảng 2. Các bước pha mẫu để xác định hoạt độ amylase

Dung dịch hóa chất

Ống nghiệm

Ống kiểm tra Ống thí nghiệm

1 2 3 1 2 3

Dung dịch tinh bột 1% (ml) 1 1 1 1 1 1

Dung dịch NaCl 0.1 % (ml) 1 1 1 1 1 1

Dung dịch đệm phosphate (ml) 2 2 2 2 2 2

Dung dịch acid tricloacetic 5% 5 5 5 0 0 0

Lắc đều và giữ mẫu ở 300C trong 10 phút



Dung dịch hóa chất

Ống nghiệm

Ống kiểm tra Ống thí nghiệm

1 2 3 1 2 3

Dung dịch enzyme amylase 1 1 1 1 1 1

Để yên trong 30 phút

Dung dịch acid tricloacetic 5% 0 0 0 5 5 5

Lọc, lấy dịch đem thực hiện phản ứng màu với dung dịch lugol (pha loãng 150 lần)

Dịch lọc 1 1 1 1 1 1

Thuốc thử lugol (ml) 9 9 9 9 9 9

Đo OD560

w Cách tính kết quả

Tính hiệu số giá trị độ hấp thu (OD) giữa mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra

ΔOD = ODTN – ODKT

OD = Optical Density (Mật độ quang)

Từ OD đưa vào đồ thị chuẩn tính được số mg tinh bột còn lại trong dung dịch

Hoạt độ amylase là tích số của số mg tinh bột bị thủy phân với độ pha

loãng của dung dịch tinh bột khi đo (100).

Hoạt độ amylase = A.100

Dựa theo cách tiến hành và tính toán trên thì hoạt độ tối đa là 10 đơn vị.

w Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme

Khảo sát hiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme bằng cách cho enzyme phản

ứng với cơ chất theo phương pháp Heinkel ở các chế độ nhiệt độ trong khoảng từ 30

đến 900C.

KKẾẾTT QQUUẢẢ

NNGGHHIIÊÊNN CCỨỨUU


Kết quả nghiên cứu 35

1. PHÂN LẬP VI KHUẨN SINH AMYLASE

Với phương pháp phân lập 3.1.2 chúng tôi đã phân lập được 80 chủng vi

khuẩn có khả năng chịu nhiệt tuy nhiên sau khi kiểm tra lại dưới kính hiển vi thì chỉ

có 40 chủng có sinh bào tử. Các chủng này được tiến hành khảo sát khả năng sinh

amylase ngoại bào cũng như khả năng thích nghi với môi trường có pH và nhiệt độ

khác nhau

Bảng 3. Khả năng sinh amylase ngoại bào và khả năng thích nghi với môi

trường của một số chủng vi sinh vật phân lập được

Chủng Amylase sơ bộ(a)

pH10(b) pH5(b) 50oC(c) 10oC(c) d1/d2(d)

1 + + + ─ ─ 1.17

2 ± + ± ─ ─ 1.75

3 + + ─ ─ ─ 2.17

4 ± + + ─ ─ ─

5 + + ─ ─ ─ 1.6

6 + + ─ ─ ─ 1.58

7 ++ + ─ ─ ─ 1.8

8 + + ─ ─ ─ 1.5

9 + + ± ─ ─ 1.4

10 ++ + ─ ─ ─ 1.75

11 ++ ± ± + ─ 2

12 ± + + ─ ─ ─

13 + + ─ ─ ─ ─

14 + + ─ ─ ─ 1.5

15 ─ + ─ ─ ─ 1.57

16 ++ + ─ ─ ─ 1.71

17 + + ─ ─ ─ 2



Chủng Amylase sơ bộ(a)

pH10(b) pH5(b) 50oC(c) 10oC(c) d1/d2(d)

18 +++ + ± ─ ─ 2.33

19 +++ + ± ─ ─ 2.5

20 +++ + ± ± ─ 2.67

21 +++ + ─ ─ ─ 1.38

22 +++ + ─ ± ─ 2

23 ++ + ─ ± ─ 2.67

24 +++ + ─ ± ─ 2.29

25 + + + ─ ─ ─

26 ++ + ─ ─ ─ 1.38

27 ± + + ─ ─ 1.33

28 ± + ± ─ ─ ─

29 ± + + ─ ─ 1.63

30 + ─ ─ ─ ─ 1.63

45 ─ + ─ ─ ─ 1.13

54 ++ + ± ─ ─ 1.54

55 + + ± ─ ─ 2

56 + + ─ ─ ─ 1.88

57 ± + ─ ─ ─ 1.75

71 ± + ± ─ ─ ─

73 ± + ± ─ ─ 1.25

75 ─ + ─ ─ ─ 1.07

76 ± + ─ ─ ─ 1.08

79 ± + ─ ─ ─ 1.08

(a): khả năng sinh amylase được kiểm tra sơ bộ bằng cách cấy vạch vi khuẩn

trên thạch dinh dưỡng có chứa tinh bột, quan sát vòng thủy giải tinh bột. (-): không



sinh amylase (không hiện diện vòng thủy giải); (+), (++), (+++) amylase dương

tính, vòng thủy giải từ nhỏ đến lớn.

Hình 4. Kết quả khảo sát sơ bộ khả năng sinh amylase ngoại bào của một số

chủng vi khuẩn

(b): khảo sát sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng có pH

khác nhau bằng cách cấy vạch trên môi trường, ủ 37oC qua đêm. (-): vi khuẩn

không mọc, (±) mọc không rõ, (+) mọc bình thường

Hình 5. Khảo sát sự phát triển của các chủng vi khuẩn trên môi trường có pH

khác nhau

(c): khảo sát sự phát triển của vi khuẩn ở nhiệt độ khác nhau bằng cách cấy

vạch trên môi trường dinh dưỡng ủ qua đêm. (-): vi khuẩn không mọc, (±) mọc

không rõ, (+) mọc bình thường



Hình 6. Khảo sát sự phát triển của các chủng vi khuẩn ở nhiệt độ khác nhau

(d): tỷ lệ d1/d2, đường kính vòng thủy giải tinh bột trên đường kính khóm vi

khuẩn. Lượng vi khuẩn chấm lên trên thạch tinh bột ở các chủng là tương đối bằng

nhau (3.2.2) nên có thể so sánh tương đối khả năng sinh amylase ngoại bào của các

chủng vi khuẩn

Hình 7. Kết quả so sánh khả năng sinh amylase ngoại bào của các chủng vi

khuẩn

Dựa vào d1/d2 chúng tôi chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh amylase

mạnh hơn để tham gia các thí nghiệm tiếp theo



w Nhận xét

Chỉ có một số ít vi khuẩn có thể phát triển ở điều kiện nhiệt độ 10oC và 50oC

và khả năng phát triển yếu hơn so với ở 370C.

Trong môi trường pH 10, các chủng vi khuẩn đều có thể phát triển được, trong

khi đó trong môi trường pH 5 chỉ có các chủng vi khuẩn số 1, 4, 12, 26 là phát triển

rõ rệt, các chủng vi khuẩn có thể phát triển nhưng rất yếu so với môi trường pH 7.

Þ Các chủng vi khuẩn sinh bào tử không thể phát triển được dạng tế bào sinh

dưỡng ở các điều kiện nhiệt độ 100C và 500C. Môi trường có tính kiềm

thích hợp cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn này hơn môi trường có

tính acid.

Các chủng vi khuẩn 19, 20, 21, 24, 25 có d1/d2 cao được sử dụng để thực hiện

các thí nghiệm tiếp theo

2. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ

NĂNG SINH AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN

Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn các chủng vi khuẩn 19, 20, 21, 24, 25 để

khảo sát khả năng sinh amylase ngoại bào của chúng theo các yếu tố sau:

- Thời gian nuôi cấy.

- Nồng độ tinh bột trong môi trường nuôi cấy

Bảng 4. Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 19

theo thời gian

Nồng độ tinh bột Thời gian (h)

20 24 28 36 48 60 72

2% 0.018 0.0807 0.7913 0.9013 1.0212 0.1643 0.018

5%

0.3106 0.7286 0.9852 1.4183 0.9585 0.227



0

0.4

0.8

1.2

1.6

12 24 36 48 60 72 84

Hoạ

t tín

h en

zym

e

Thời gian (h)

2%

5%

Biểu đồ 2. Hoạt tính amylase của chủng 19 theo thời gian

w Nhận xét

Hoạt tính amylase cao nhất của chủng 19 tại thời điểm 48 giờ, và hoạt tính

trong môi trường có 5% tinh bột (1.4183 µg/ml) cao hơn hoạt tính trong môi trường

có chứa 2% tinh bột (1.0212 µg/ml) tại cùng một thời điểm.


theo thời gian


16 20 24 28 32

2% 0.7077 1.481 3.08194 2.58034 2.30446

5% 0.50706 1.33052 2.44298 2.18742 1.50608



0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

12 16 20 24 28 32 36

Hoạ

t tín

h en

zym

e

Thời gian (h)

2%

5%


w Nhận xét

Hoạt tính amylase của chủng 20 cao hơn so với chủng 19. Dựa vào đồ thị có

thể thấy được thời gian thu amylase tối đa ngắn hơn chủng 19 (24 giờ). Hoạt tính

amylase trong những giờ sau có giảm, nhưng giá trị vẫn cao, tại thời điểm 28 h hoạt

tính là 2.58 µg/ml (trong môi trường có 2% tinh bột) và 2.18 µg/ml (trong môi

trường có 5% tinh bột) và hoạt tính này vẫn được duy trì sau một khoảng thời gian

dài sau đó.


theo thời gian


20 28 48 72 84

2% 0 0 0.4151 0.2061 0.1225

5% 0 0.0807 0.4569 0.7495 0.1225



0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 12 24 36 48 60 72 84

Hoạ

t tín

h en

zym

e

Thời gian

2%

5%


w Nhận xét:

Hoạt tính amylase của chủng 21 tương đối thấp, hoạt tính cao nhất vào thời

điểm 72 giờ trong môi trường có 5% tinh bột (0.7495 µg/ml). Sau đó, hoạt tính

giảm xuống rất nhanh. Hoạt tính enzyme trong môi trường có 2% tinh bột thấp hơn

so với môi trường có 5% tinh bột, cao nhất trong môi trường 2% tại thời điểm 48

giờ (0.4151 µg/ml).


theo thời gian


20 28 48 60 72 84

2% 0.0598 0.1016 0.1852 0.1852 0.018 0.018

5% 0 0.3942 0.4151 1.463 1.063 0.0389



0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 12 24 36 48 60 72 84

Hoạ

t tín

h en

zym

e

Thời gian

2%

5%


w Nhận xét:

Hoạt tính enzyme của chủng 24 đạt cực đại trong môi trường có chứa 5% tinh

bột (1.463 µg/ml) tại thời điểm 60 giờ.

Hàm lượng tinh bột trong môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính

enzyme của chủng 24. Dựa vào đồ thị ta thấy hoạt tính cực đại của enzyme ở môi

trường chứa 2% tinh bột (0.1852 µg/ml) thấp hơn nhiều so với hoạt tính của enzyme

thu được từ môi trường 5% tinh bột (1.463 µg/ml). Trong môi trường có 2% tinh

bột, hoạt tính của enzyme rất thấp, gần bằng nhau tại tất cả các thời điểm nuôi cấy.


theo thời gian


20 28 48 72 84

2% 0.015 0.3942 0.436 0.1225 0.0598

5% 0.0018 0.0598 0.4778 0



0

0.2

0.4

0.6

0 12 24 36 48 60 72 84

Hoạ

t tín

h

Thời gian

2%

5%


w Nhận xét

Hoạt tính của enzyme cao nhất vào thời điểm 48 giờ (0.4778 µg/ml) trong môi

trường có 5% tinh bột. Trong cả hai môi trường (2% và 5% tinh bột), hoạt tính

enzyme cũng không có sự khác biệt đáng kể, chỉ dao động trong khoảng từ 0.001

đến 0.4 µg/ml.

Bảng 9. So sánh hoạt tính amylase cực đại của các chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn 19 20 21 24 25

Thời gian (h) 48 24 72 60 48

Nồng độ tinh bột (%) 5 2 5 5 5

Hoạt tính amylase cực đại

1.4183 3.08194 0.7495 1.463 0.4778



1.4183

3.0819

0.7495

1.463

0.4778

0

0.8

1.6

2.4

3.2

19 20 21 24 25

Hoạ

t tín

h en

zym

e

Chủng vi khuẩn

Biểu đồ 7. Hoạt tính amylase cực đại của các chủng vi khuẩn khảo sát

w Nhận xét

4 trong 5 chủng vi khuẩn khảo sát có khả năng sinh amylase ngoại bào trong

môi trường chứa 5% tinh bột tốt hơn trong môi trường 2% tinh bột và phải từ 48 h

trở lên amylase của các vi khuẩn này mới đạt hoạt tính cực đại. Riêng chủng 20,

amylase thu được đạt hoạt tính cực đại nhanh (24 h) và cao trong cả 2 môi trường (2

và 5% tinh bột). Từ kết quả này, chúng tôi chọn chủng 20 để tiếp tục khảo sát tính

bền với nhiệt của enzyme.

3. KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU CỦA

AMYLASE

Chủng 20 được nuôi trong môi trường chứa 2% tinh bột ở 37oC, lắc 150

vòng/phút; thu dịch enzyme tại hai thời điểm 24 giờ và 28 giờ sau khi bắt đầu nuôi

cấy; thực hiện phản ứng thủy phân tinh bột lần lượt ở nhiệt độ 30, 50, 70 và 90oC.



Bảng 10. Kết quả khảo sát hoạt tính của amylase từ chủng 20 trên tinh bột ở

những nhiệt độ khác nhau

Thời gian Nhiệt độ (oC)

30 50 70 90

24 h 2.3797 2.4215 2.526 2.4842

28 h 2.4215 2.7559 2.8186 2.0035

1

1.5

2

2.5

3

30 50 70 90

Hoạ

t tín

h

Nhiệt độ

24H

28H

Biểu đồ 8. Hoạt tính amylase của chủng vi khuẩn 20 ở các nhiệt độ khác nhau

w Nhận xét

Kết quả thu được cho thấy amylase của chủng vi khuẩn 20 rất bền với nhiệt,

nó có thể hoạt động tới nhiệt độ 900C. Nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme là

700C (hoạt tính tại thời điểm 24 giờ là 2.526 µg/ml, 28giờ là 2.8161 µg/ml). Sau

700C, hoạt tính của enzyme bắt đầu giảm.

Khi tăng nhiệt độ lên đến 70oC amylase thu được tại thời điểm 28 giờ có hoạt

tính cao hơn enzyme thu được ở thời điểm 24h. Tuy nhiên, khi nhiệt độ vượt quá



70oC hoạt tính của amylase tại T28 giảm hẳn trong khi enzyme thu được ở T24

gần như vẫn không thay đổi hoạt tính

4. BÀN LUẬN

Khả năng tích tụ amylase trong mỗi loài vi sinh vật là khác nhau và thời gian

nuôi cấy chúng để thu được lượng amylase cực đại cũng khác nhau. Có loài vi

khuẩn sinh amylase cực đại trong pha tăng trưởng, nhưng cũng có loài sinh amylase

cực đại trong pha cân bằng. Do đó trong phạm vi đề tài nghiên cứu này chúng tôi

tiến hành nuôi vi khuẩn và khảo sát hoạt tính amylase theo thời gian (dựng đường

cong enzyme) để tìm được thời gian nuôi cấy đạt lượng amylase cao nhất ứng với

mỗi loài vi sinh vật.

Theo những kết quả đã nên trên, chủng 20 chỉ cần nuôi 24 giờ để đạt amylase

cực đại, trong khi đó các chủng còn lại hầu hết phải nuôi cấy đến 48 giờ. Lượng

amylase thu được từ chủng 20 có hoạt tính cao hơn các chủng 19, 21, 24 và 25.

Theo lý thuyết, đường cong enzyme có dạng như đường cong sinh trưởng.

Mỗi chủng vi sinh vật có một đường cong sinh trưởng cũng như đường cong

enyzme khác nhau. Với chủng vi khuẩn 20 đường cong enzyme khảo sát được có

thể phân biệt rõ rệt các pha thích nghi (0-16 giờ), pha tăng trưởng (16-24 giờ), pha

cân bằng (24-28 giờ) và bước đầu của pha suy vong (sau 28 giờ). Tuy nhiên, đối với

các chủng còn lại đường cong enzyme mà chúng tôi dựng được không thể hiện rõ

như vậy. Đường cong enzyme của chủng 19 chỉ có 1 điểm cực đại rồi sau đó hoạt

tính enzyme giảm xuống rõ rệt. Tương tự như đối với các chủng 21, 24 và 25.

Kết quả như trên có thể do nhiều nguyên nhân:

- Hoạt tính enzyme của vi khuẩn không bền, dễ mất đi trong quá trình khảo

sát hoạt tính do đó kết quả có phần không chính xác.

- Chưa bố trí thí nghiệm để khảo sát hoạt tính enzyme ở những khoảng cách

thời gian ngắn hơn để có thể thấy rõ được sự kéo dài của mỗi pha.



- Thành phần môi trường hay điều kiện nuôi cấy chưa phải là tối ưu cho tất

cả các chủng vi khuẩn này.

Việc sản sinh amylase còn phụ thuộc vào chủng vi khuẩn, thành phần môi

trường, phương pháp nuôi cấy, sự phát triển của tế bào vi khuẩn, nhu cầu dinh

dưỡng, các ion kim loại, pH, nhiệt độ và cả thời gian nuôi cấy. Do có sự hạn chế về

điều kiện và thời gian, trong đề tài này chúng tôi chỉ khảo sát ảnh hưởng của nồng

độ tinh bột và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh amylase ngoại bào của các

chủng vi khuẩn.

Tinh bột là nguồn cơ chất cảm ứng vi khuẩn sinh amylase. Vi khuẩn phát

triển, các nguồn dinh dưỡng dễ hấp thu trong môi trường cạn kiệt dần, đến một lúc

nào đó vi khuẩn phải tiết amylase phân hủy tinh bột thành các hợp chất đơn giản

cho vi khuẩn hấp thụ tiếp. Cơ chất cảm ứng kích thích sinh nhiều amylase, trong

giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tăng, vận tốc phản ứng sẽ tăng, nhưng khi vận tốc

phản ứng đã đạt cực đại thì có tăng cơ chất, vận tốc phản ứng cũng không thể tăng

thêm.

Trong bài, việc bổ sung cơ chất (tinh bột) không tỷ lệ thuận so với việc tăng

lượng enzyme amylase. Cụ thể theo kết quả thí nghiệm: với nồng độ tinh bột trong

môi trường 2% và 5% hoạt tính enzyme cao nhất các chủng vi khuẩn lần lượt là:

- Chủng 19: 0.9013 µg/ml và 0.9852 µg/ml.




Riêng đối với chủng 20 thì nồng độ 2% tinh bột lại là điều kiện tốt hơn cho sự

sinh enzyme của vi khuẩn: 2%: 3.082 µg/ml và 5%: 2.443 µg/ml.

Đôi khi nồng độ chất cảm ứng quá cao cũng là nguyên nhân gây ức chế quá

trình sản sinh amylase của vi khuẩn. Dựa vào các kết quả đã nêu trên, ta thấy chọn

nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có bổ sung 2% tinh bột là kinh tế và hợp lý hơn.



Tuy nhiên, trong quá trình thí nghiệm cũng có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết

quả xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp Heinkel (phương pháp so màu).

- Do điều kiện thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành lập đường chuẩn trên một

máy đo quang trong khi các mẫu đem xác định hoạt tính lại được đo trên

một máy đo quang khác, nên kết quả cũng không chính xác tuyệt đối.

- Việc dùng cuvet nhựa cũng có ảnh hưởng đến kết quả đo. Để hạn chế được

sai số trong trường hợp này, chúng tôi đã tiến hành đo tất cả các mẫu trên

cùng một cuvet và đo từ mẫu nhạt (mẫu thí nghiệm) đến mẫu đậm (mẫu

kiểm tra).

Từ kết quả xây dựng đường cong của enzyme, xác định được thời gian sinh

amylase cực đại đối với chủng 20 là 24 giờ (chủng 20 là chủng sản sinh ra enzyme

có hoạt tính cao nhất). Dựa trên cơ sở đó, thí nghiệm tiếp theo chúng tôi thiết kế thử

hoạt tính của enzyme tại các nhiệt độ từ 30 đến 900C để thấy được ảnh hưởng của

nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme.

Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến

hoạt động của enzyme thu được trong 2 thời điểm 24 giờ và 28 giờ.

Enzyme thu được có độ bền nhiệt rất cao, bằng chứng là hoạt tính của enzyme

duy trì từ 2.7 đến 2.8 µg/ml khi nhiệt độ trong khoảng từ 50 đến 70oC. Lên đến

90oC, hoạt tính của enzyme vẫn còn giữ được ở mức 2.0µg/ml.

Theo lý thuyết mỗi enzyme có một khoảng nhiệt độ hoạt động thích hợp. Khi

nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng sẽ tăng theo. Tuy nhiên, khi tăng vượt quá mức nào

đó (nhiệt độ tối ưu) thì hoạt tính của enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh. Hiện tượng

trên có quan hệ mật thiết với cấu trúc của enzyme. Bản chất của enzyme là một

protein. Khi tăng nhiệt độ, lúc đầu vận tốc phản ứng sẽ tăng do cấu trúc không gian

của enzyme phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất. Khi vượt quá giới hạn về

nhiệt độ, cấu trúc này sẽ không còn phù hợp nữa, enzyme giảm hoạt tính và dần dần

bị triệt tiêu. Enzyme amylase của vi khuẩn 20 trong đề tài này là một enzyme bền

nhiệt.



Phương pháp đo hoạt tính góp phần vào việc thu được kết quả tốt:

- Trong phương pháp đo có bổ sung thêm NaCl là chất hoạt hóa đối với

enzyme amylase, hỗ trợ cho việc xác định hoạt tính của enzyme.

- Theo như những nghiên cứu trước đây thì hoạt tính của amylase của vi

khuẩn còn phụ thuộc vào pH. Trong bài chọn dung dịch đệm pH 6 thích

hợp cho hoạt động của amylase vi khuẩn.

Ngoài ra, các yếu tố còn lại có thể do bản chất của amylase: amylase của vi

khuẩn có hàm lượng Ca rất cao trong cấu trúc của enzyme, do đó tăng khả năng

hoạt động của vi khuẩn khi nhiệt độ tăng. Hoạt lực của amylase vi khuẩn lại bền

hơn hoạt lực của amylase nấm mốc.

KKẾẾTT LLUUẬẬNN


Kết luận 51

Đất là môi trường thuận lợi cho nhiều vi sinh vật phát triển, bao gồm cả sinh

vật có lợi và có hại. Phân lập từ đất các vi khuẩn sinh bào tử có khả năng sinh

amylase và nghiên cứu để sử dụng có hiệu quả amylase thu nhận được.

Amylase là enzyme phân hủy tinh bột, nó đóng vai trò rất quan trọng trong

công nghiệp công nghệ sinh học. Có thể thu nhận amylase từ nhiều nguồn động vật,

thực vật và vi sinh vật, trong đó, amylase từ vi sinh vật là nguồn dồi dào nhất. Đặc

biệt, amylase của các vi khuẩn chịu nhiệt có thể dễ dàng ứng dụng trong nhiều lĩnh

vực.

Nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn sinh amylase tương ứng

là 370C và 7.0. Thời gian thu amylase cực đại là 24 giờ nuôi cấy, nhiệt độ hoạt động

tối ưu của amylase là 700C.

PPHHỤỤ LLỤỤCC


Phụ lục 52

Bảng 11. Hình thái của một số chủng vi khuẩn phân lập được

Chủng Màu sắc Hình dạng khuẩn lạc

Kích thước khuẩn lạc

(mm) Bề mặt Rìa

1 trắng đục không nhất định 0.5 – 2 nhám trơn

2 vàng nâu không nhất định 1 – 3 nhăn nhăn

3 vàng nâu không nhất định 1 – 2 nhăn nhăn

4 da người tròn 1.5 trơn trơn

5 vàng nâu nhạt không nhất định 1 – 3 nhăn nhăn

6 vàng nâu không nhất định 1 trơn nhăn

7 cam nhạt không nhất định 2 trơn láng trơn

8 trắng đục không nhất định 1 – 3 nhăn nhăn

9 trắng đục không nhất định 2 trơn, láng trơn

10 vàng nâu không nhất định 2 trơn nhăn

11 trắng sữa tròn 1 nhăn, khô nhăn

12 cam rất nhạt không nhất định 3 trơn trơn

13 cam tròn 1 nhám nhăn

14 cam tròn 1 – 3 nhám nhăn

15 vàng nâu nhạt không nhất định 0.5 – 2 trơn nhăn

16 màu da không nhất định 1 nhám nhăn

17 trắng sữa không nhất định 1 trơn nhăn

18 hồng không nhất định 0.5 – 2 trơn nhăn, trong

19 cà phê sữa không nhất định 0.5 trơn nhăn

20 vàng nâu nhạt không nhất định 1 trơn nhăn

21 vàng nghệ tròn 1 trơn nhăn

22 hồng cam tròn 1 – 2 trơn trơn

23 vàng nghệ không nhất định 1 trơn nhăn


Phụ lục 53

Chủng Màu sắc Hình dạng khuẩn lạc

Kích thước khuẩn lạc

(mm) Bề mặt Rìa

24 vàng nghệ tròn 1 trơn nhăn

25 vàng nghệ tròn 0.5 trơn nhăn

26 màu da tròn 0.5 – 2 trơn trơn

27 trắng sữa không nhất định 0.5 nhám nhăn

28 trắng sữa tròn 1 – 2.5 có núm

nhăn nhăn

29 trắng +vàng

rất nhạt tròn 3 trơn nhăn

30 trắng sữa tròn 1 trơn nhăn

45 nâu đất tròn 1 nhám trơn

54 trắng sữa tròn 1 trơn nhăn

55 vàng nhạt không nhất định 0.5 nhám nhăn

56 vàng nâu nhạt không nhất định 1 nhám nhăn

57 vàng nhạt không nhất định 1 nhám nhăn

71 cam rất nhạt không nhất định 1 – 3 nhám nhăn

73 vàng nhạt không nhất định 2 trơn láng nhăn

75 vàng nhạt tròn 2 trơn trơn

76 trắng ngà tròn 2 trơn láng trơn

79 trắng ngà tròn 1.5 trơn nhăn

TTÀÀII LLIIỆỆUU

TTHHAAMM KKHHẢẢOO


Tài liệu tham khảo 54

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

[1] Nguyễn Đức Lượng, 2006. Công nghệ Vi Sinh Vật tập 1, Cơ sở vi sinh vật công

nghiệp. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, Tp.HCM. 2006.

[2] Nguyễn Đức Lượng, 2002. Công nghệ Vi sinh vật tập 2, Vi sinh vật học công

nghiệp. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, Tp.HCM.

[3] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), 2004. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học

Quốc gia, Tp.HCM.

[4] Nguyễn Đức Lượng, Cao Cường, 2003. Thí nghiệm Công nghệ Sinh học tập 1-

Thí nghiệm hóa sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, Tp.HCM.

[5] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm

Công nghệ Sinh học tập 2 – Thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học

Quốc gia, Tp.HCM. 2003.

[6] Huỳnh Ngọc Oanh, Vũ Thanh Thảo, 2007. Khảo sát quá trình cố định enzyme

α- amylase (Termamyl) bởi chất mang CMC – Alginate. Science and

Technology Development, Vol 10, No.12.

[7] Nguyễn Kim Minh Tâm, 2000. Góp phần nghiên cứu khả năng sinh protease

ngoại bào của một số chủng vi sinh vật. Luận văn Thạc sĩ Dược học, ĐH Y

Dược Tp.HCM.

[8] Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn, 2009. Nghiên

cứu hoạt tính enzyme ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và

khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải. Tạp chí Khoa học

ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ , 25: 101-106.

[9] Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy, 2010. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và

phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Tuyển

tập Báo cáo Hội Nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7, Đại học Đà

Nẵng.



TÀI LIỆU TIẾNG ANH

[10] Ajayi, Adedayo Olajide and Fagade, Obasola Ezekiel, 2007. Heat activation

ang stability of amylases from Bacillus species. African Journal of

Biotechnology Vol.6 (10): 1181-1184.

[11] Belma ASLIM, Necdet Saglam, Yavuz Beyatli, 2002. Determination of some

properties of Bacillus isolated from soil. Turk J Biol, Vol 26: 41-48.

[12] Carlos Eduardo de Suoza Teodoro, Meire Lelis Leal Martins. Culture

conditions for the production of thermostable amylase by Bacillus sp.

Bzarilian Journal of Microbiology, Vol 31, pp. 298-202.

[13] E. Sarikaya and Cirakoglu, 1989. Investigation of alpha – amylase production

from Bacillus subtilis in different media. Commun. Fac, Sci. Univ. Ank. Serie

C, Vol 7: 31-37.

[14] M. Asgher, M. Javaid Asad, S. U. Rahman, R. L. Legge. A thermostable α-

amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch

processing. Joural of Food Engineering, 79 (2007), 950-955.

[15] Mohsne Fathi Najafi, Dileep Deobagkar, Deepti Deobagakar, 2005.

Purification and characterization of an extracellular anpha amylase from

Bacillus subtilis AX20. Protein Expression and Purification 41: 349-354.

[16] Mukesh D. Nimkar, N. G. Deogade and Meghna Kawale, 2010. Production of

α- amylase from Bacillus subtilis & Aspergillus niger using different agro

waste by solid state fermentation. Asiatic Joural of Biotechnology Resources,

Vol 1: 23-28.

[17] Nadia Riaz, Ikram-UL-Haq and M.A. Qadeer, 2003. Characterizatin of α-

amylase by Bacillus subtilis. International Journal of Agricultire and Biology,

Vol 5, No. 3, 2003.



[18] N. T. Mai, D. T. Giang, N. T. N. Minh and V. T. Thảo. Thermophilic amylase-

producing bacteria from Vietnamese soil. World Joural of Microbiology and

Biotechnology, Vol 8, page 505-508.

[19] N.S. Reddy, Annapoorrna Nimmagadda and K. R. S. Sambasiva Rao,2003. An

overview of the microbial anpha amylase family. African Journal of

Biotechnolgy Vol 2 (12): 645-648.

[20] Nurullah Akcan, Fikret Uyar, Aysel Guven. Alpha- amylase production by

Bacillus subtilis RSKK96 in submerged cultivation. Kafkas Univ Vet Fak

Dreg, 17: 17-22, 2011.

[21] R. Vidyalakshmi, R. Paranthaman and J. Indhumathi, 2009. Amylase

production on Submerged Fermentation by Bacillus spp. World Journal of

Chemiscal 4 (1): 89-91.

[22] Sasmita Mishra and Niranjan Behera, 2008. Amylase activity of a starch

degrading bacteria isolated from soil receiving kitchen wastes. African

Journal of Biotechnology, Vol.7 (18), 3326-3331.

[23] S. Thippeswamy, K. Girigowda and V. H. Mulimani, 2006. Isolation and

identification of anpas amylase producing Bacillis sp. From dhal industry

waste. Indian journal of Biochemistry & Biophysics, Vol. 43: 295-298.

[24] V. P. Zambare, 2011. Optimization pf amylase production from Bacillus sp.

Using statistics base experimental design. Center for Bioprocessing Research

and Development, South Dakota School of Mines and Technology, Vol 23,

No. 1, page 37-47.

[25] Wenbo Zhi, Jiangnan Song, Jingxiu Bi, Fan Ouyang, 2004. Partial purification

of anpha amylase from culture supernatant of Bacillus subtilis in aqueous

two- phase system. Bioprocess and Biosystems Engineering.

ho thi my linh-60701279

Documents