HPLCQualificiation

injecteur-détecteur

INTROLa chaine HPLC permet de séparer et quantifier

des composés en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques en présence d’une phase mobile et sur une colonne chromatographique spécifique.

Qualification = démontrer que le matériel fonctionne correctement et donne réellement les résultats attendus.

On s’intéressera à l’injecteur et au détecteur.

Qualification de l’injecteur

1) Effet mémoire

2) Répétabilité

3) Linéarité

Injecteur: fonctionnement

Effet mémoireOn va ici vérifier qu’il y a une absence de

contamination d’une injection à l’autre.On réalise 2 blancs, un en début et l’autre en

fin, d’une batterie d’injections de méthylparaben.

Le blanc = phase mobile (méthanol/eau)On a interprété les résultats en comparant

l’air du pic de MPB de la dernière injection avec l’air du pic sur le 2e blanc au niveau du tps de rétention

observé pour le MPB.

∆/A6*100 ≤ 0,1%

Effet Mémoire :Résultats et Interprétations

Injecteurs CV % Conformité selon

spécifications avec

CV <0,1 %

Numéro 1 0,1 OUI

Numéro 2 0,3 NON

Numéro 3 2,64 NON

Numéro 4 0,05 OUI

Numéro 5 0,1 OUI

Numéro 6 0,68 NON

Répétabilité de l’injectionOn va vérifier que dans des conditions

opératoires identiques, l’injecteur fournit des volumes d’injections présentant une faible dispersion sur plusieurs essais.

On réalise 6 fois une injection d’une même solution de methylparaben à une concentration donnée.

On va interprété les résultats en étudiant les CV en se basant sur l’aire et la hauteur du pic du MPB.

CV ≤ 1%

Répétabilité :Résultats et Interprétations

Injecteurs CV % ( Aire ) CV % ( Hauteur) Conformité avec spécifications CV < 1%

Numéro 1 9,14 3,17 NON

Numéro 2 7,9 6,3 NON

Numéro 3 11,47 11,31 NON

Numéro 4 3,90 2,11 NON

Numéro 5 6,40 6,69 NON

Numéro 6 10,79 9,99 NON

Qualification du détecteur

1) Bruit de fond et dérive

2) Linéarité des absorbances

3) Exactitude de la longueur d’onde

4) Répétabilité de la longueur d’onde

Détecteur: fonctionnement

Pour la qualification du détecteur, on a fixé une longueur d’onde monochromatique. (λ= 257nm)

Lors du passage de l’échantillon sur le détecteur, une partie du rayonnement monochromatique sera absorbée et l’autre transmise.

A = -log T = -log (I/Io)• Les résultats sont donnés sous la forme

A=f(t), avec t, temps de rétention du composé.

Linéarité des absorbances

L’objectif est de montrer que le détecteur est capable de fournir des résultats directement proportionnels à la quantité de substance injectée.

On a injecté 6 solutions de MPB de concentration croissante et cela 2 fois.

On va interpréter les résultats en traçant la courbe Aire = f(conc.) et vérifier les paramètres de régression.

R²≥ 0,998ordonnée à l’origine comparé à 0 :  

Linéarité: Résultats et InterprétationsDétecteur Coefficient

d’ajustement linéaire

R²

Ordonnée à l’origine

Test student sur

l’ordonnée à

l’origine (OO)

Conformité

avec spécification

R²> 0,998

Student pour OO ,

Tthé à ddl = 10 <

2,23.

Numéro 1 0,978 - 63,00 -1,46 NON

Numéro 2 0,995 - 32,3 ? NON

Numéro 3 0,9908 - 5,6751 - 0,31 NON

Numéro 4 0,9998 -0,71723 -0,16 OUI

Numéro 5 0,9951 -6,6245 -0,32 NON

Numéro 6 0,9871 -26,39 -1,30 NON

Exemple conforme: groupe4

Bruit de fond et dériveL’objectif est de mesurer le bruit de fond et la dérive

de la ligne de base, nécessaire à l’analyse de nos composés.

Le bruit de fond sert aux calculs de limites de détection et de quantification.

La dérive sert à l’exploitation des pics.On a enregistré le signal sur 30 min en passant la

phase mobile sans injecter de composé.

Court terme: 1 à 2 min BF ≤ 5*spécifications fournisseur

Long terme: 5 à 10 minDérive: sur 15 min D ≤ 5*spécifications

fournisseur

Rq: 1UA = 1V

Bruit de fond:Résultats et Interprétations

Détecteurs Bruit de fond à court

terme (uUA)

Bruit de fond à long terme(uUA)

5*spécifications (uUA)

Conforme si

<5*spécifications

Numéro 1 50 30 50 OUI

Numéro 2 41 59 50 NON

Numéro 3 6,10 30,2 50 OUI

Numéro 4 15 27 50 OUI

Numéro 5 24,1 49,0 100 OUI

Numéro 6 26 39 100 OUI

Dérive: Résultats et Interprétations

Détecteurs Dérive à la ligne de

base ( uUA/h)

5*spécifications (uUA/h)

Conforme si

<5*spécifications

Numéro 1 10 1000 OUI

Numéro 2 129 1000 OUI

Numéro 3 86,9 1000 OUI

Numéro 4 6,45 1000 OUI

Numéro 5 178 1000 OUI

Numéro 6 156 1000 OUI