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HPLC • SMB • Osmometry
Einsatz der Gelpermeationschromatographie
(GPC)
zur Untersuchung von Chitosanen
– Möglichkeiten und Grenzen –
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HPLC • SMB • Osmometry
• Das Prinzip der konventionellen GPC
• GPC-Praxis und Chitosane
• Grenzen der konventionellen GPC und der GPC generell
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HPLC • SMB • Osmometry
Das Prinzip der GPC – Trennung nach Molekülgröße
Chromatographische Methode zur Trennung von Molekülen nach Größe.
"Größe" meint hier hydrodynamisches Volumen: Die dreidimensionale Gestalt des Moleküls im verwendeten Lösungsmittel.
Wird die Bestimmung von Molmassenverteilungen und verschiedenen Molmassenmittelwerten auf Basis einer Kalibrierung mit Standardpolymeren vorgenommen, so spricht man von konventioneller GPC.
Andere Formen der GPC: GPC-Lichtstreukopplung, Einsatz der sogenannten "Universellen Kalibrierung".
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HPLC • SMB • Osmometry
Das Prinzip der GPC – Apparativer Aufbau
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HPLC • SMB • Osmometry
Das Prinzip der GPC – Säulen 1
Die Säulen:
• Gefüllt mit sphärischen Partikeln im unteren µm-Bereich. Häufig 5 - 10 µm.
• Die Partikel besitzen Poren.
• Zahlreiche unterschiedliche Phasen und Spezialphasen verfügbar, z. B. von
Waters, Shodex, PL, PSS. Diverse Applikationsdatenbanken.
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HPLC • SMB • Osmometry
Das Prinzip der GPC – Säulen 2
Porenweite und Trennbereich eines typischen handelsüblichen Säulen-Sets
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HPLC • SMB • Osmometry
Das Zylinderporenmodell
Das Prinzip der GPC – Der Trennmechanismus 1
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HPLC • SMB • Osmometry
Das Prinzip der GPC – Der Trennmechanismus 2
Das zugängliche Porenvolumen:
Molekül > Pore Poren nicht zugänglich erster Peak (z. B. Aggregate)Elution mit dem ZwischenkornvolumenAusschlußvolumen
Molekül < Pore zugängliches Porenvolumenabhängig von der Molekülgröße Trennung nach Molekülgröße
Molekül « Pore ganzes Porenvolumen zugänglich letzter Peak (z. B. Salze)Elutionsvolumen =(Zwischenkornvolumen + Porenvolumen)Volumen totaler Permeation
Anders als bei anderen chromatographischen Methoden steht für ein gegebenes System also nur ein bestimmtes Elutions-"Fenster" für die Trennung zur Verfügung.
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HPLC • SMB • Osmometry
Das Prinzip der GPC – Kalibrierung und unbekannte Proben 1
Die Kalibrierung
• wird mit Polymer-Standards bekannter Molmasse
durchgeführt (M oder Mpeak)
• stellt eine Beziehung zwischen Molmasse und
Elutionsvolumen her
• bildet die Basis zur Bestimmung der
Molmassenverteilung unbekannter Proben.
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HPLC • SMB • Osmometry
Das Prinzip der GPC –Kalibrierung und unbekannte
Proben 2
Für jeden Streifen des Elugrammes der unbekannten Probe sind durch Messung bzw. Kalibrierbeziehung Konzentration und Molmasse bekannt.Damit können Verteilungen und Mittelwerte berechnet werden.
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HPLC • SMB • Osmometry
Das Prinzip der GPC – Kalibrierung und unbekannte Proben 3
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Messungen 1
Chitosan F: Molmassenverlauf mit Konzentrationspeaks
41.0x10
51.0x10
61.0x10
71.0x10
10 15 20 25 30
Mol
ar M
ass
(g/m
ol)
Time (min)
Molar Mass vs. Time F4_A__01F4_B__01F4_C__01
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Messungen 2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.0x10 4 1.0x10 5 1.0x10 6 1.0x10 7
Cum
ulat
ive
Wei
ght F
ract
ion
W
Molar Mass (g/mol)
Cumulative Molar Mass F4_A__01F4_B__01F4_C__01
Chitosan F: Kumulative Verteilung
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Messungen 3
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
1.0x10 3 1.0x10 4 1.0x10 5 1.0x10 6
Diff
eren
tial W
eigh
t Fra
ctio
n
Molar Mass (g/mol)
Differential Molar Mass F4_A__01Norm = Log3rd order
Chitosan F: Differentielle Verteilung
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Messungen 4
Probe Mn(g/mol) Mw (g/mol)
E, 1. Messung 109.000 210.000
E, 2. Messung 109.000 209.000
E, 3. Messung 110.000 209.000
F, 1. Messung 80.900 122.000
F, 2. Messung 78.700 121.000
F, 3. Messung 76.300 120.000
Die Chitosane E und F (aus den Vorversuchen für das UFT)
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Methodenvariation 1
Einflußgröße typisch bedeutend beispielsweise für ...
Konzentration 1 mg/ml Überladung, Viskosität (Viscosity Fingering)Loop 100 µlFlußrate 1 ml/min Scherung, AuflösungTemperatur Viskosität, DiffusionpH LadungszustandPuffer Robustheit der Methodeandere Salze Unterdrückung von AdsorptionSäulen (Material, Anzahl,Porenweite, Korngröße,Abmessungen)
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Methodenvariation 2
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0
LS, A
UX
(vol
ts)
Volume (mL)
Chromatograms HES200_A
Schultern im Signal einer HES-Probe. – Feststellen, ob diese mit einer anderen Säulenkombination erhalten bleiben.
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Methodenvariation 3
Parameter Methode A Methode B Methode C Methode DKonzentration [mg/ml] 3 0,5Schleifenvolumen [µl] 20 280 100Flußrate [ml/min] 1 1 0,7 1[°C] 25 25pH sauer 2 sauer sauer
Pufferart TFA NaH2PO4 EssigsäureEssigsäure/
Natriumacetat
Pufferkonzentration 0,2 % in Wasser 0,01 M in Wasser 1 % in Wasser 0,5 M / 0,5 Mandere Salze - Art NaNO3 NaNO3 / NaClandere Salze - Konzentration 0,5 M 0,3 M / 20 g/l
Säulen - Material PSS NovemaPL Aquagel-OH
MixedPSS HEMA Bio
linear
PL Aquagel-OH oder TSKgel
GMPWxlSäulen - Anzahl 1 2 2Säulen - Porenweite [Å] 3.000 mixedSäulen - Korngröße [µm] 10 8 10Säulen - Abmessungen [mm] 8 x 300 7,5 x 300 8 x 300Standards Pullulane
Chitosan-Methoden: Sauer, mit oder ohne Salze
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HPLC • SMB • Osmometry
Grenzen – Relativmethode 1: Beispiel HES und Dextran
31.0x10
41.0x10
51.0x10
61.0x10
4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
Mol
ar M
ass
(g/m
ol)
Volume (mL)
Molar Mass vs. Volume HES70_ADEX80K_A
Unterschiedliches Elutionsverhalten von HES und Dextran
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HPLC • SMB • Osmometry
Grenzen – Adsorption und Verschleppung 2
61.0x10
71.0x10
8.0 10.0 12.0 14.0
Mol
ar M
ass
(g/m
ol)
Volume (mL)
Molar Mass vs. Volume HYALURON
Verschleppung / Adsorption: Molmasse gegen Volumenmit Konzentrationssignal - Probe: Natrium-Hyaluronat
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HPLC • SMB • Osmometry
Grenzen – Adsorption und Verschleppung 3
Chitosane - Feldflußfraktionierung (FFF)
41.0x10
51.0x10
61.0x10
71.0x10
81.0x10
91.0x10
101.0x10
10 20 30 40 50
Mol
ar M
ass
(g/m
ol)
Volume (mL)
Molar Mass vs. Volume CHITO_ACHITO_B
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Probenvorbereitung 1
Das Probenhandling von der Einwaage bis zur Messung
• kann die Resultate erheblich beeinflussen
• kann die Reproduzierbarkeit erheblich beeinflussen
• kann die Probe stark verändern oder verfälschen.
Dies ist trivial, offensichtlich, jedermann bekannt, simpel ...
und doch ist das Probenhandling eine der häufigsten
Ursachen für Probleme und Widersprüche !
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Probenvorbereitung 2
• Nicht rühren, nur sanft schwenken
• evtl. vorquellen lassen (ohne Salze)
• Lösung inspizieren (Lupe)
- - Gelteilchen, Fussel, Trübung ?
• evtl. nachsalzen
• Lösung inspizieren
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Probenvorbereitung 3
Filtration: kann die Probe stark verändern, ist schlecht reproduzierbar.
FilterflächePorenweite
Menge des FiltratesMaterial (Adsorption)
Filtrationsgeschwindigkeitsekundärer Filtrationseffekt
Filtrationswiderstand beachten (Gele, Aggregate)
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Probenvorbereitung 4
• Zentrifugation (mitunter der Filtration vorzuziehen)
• Zeitablauf der Probenvorbereitung festlegen und einhalten
• Art der Lagerung der Proben festlegen und einhalten
Chitosane: Vorquellen in Wasser oder Säure, Salze erst später
hinzufügen.
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Reproduzierbarkeit 1
• regelmäßig Blanks messen• regelmäßig Standardgemisch messen• internen Standard verwenden• Drücke notieren
Probe: Zeiten, Flächen (Recovery), Peakformen, Resultate nichtreproduzierbar.
Fall 1: Standardgemisch ebenfalls unreproduzierbarPrüfen: Flußrate, Temperatur, Injektor, Standardgemisch, Säulen,Dichtigkeit, Detektor, Lösungsmittel.
Fall 2: Standardgemisch reproduzierbarPrüfen: Probenvorbereitung, Robustheit der Methode (Eluent-Säulen-Kombination), Eluent, Säulen.
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HPLC • SMB • Osmometry
Das Prinzip der GPC – Reproduzierbarkeit 2
-0.4
0.0
0.4
0.8
1.2
10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0
LS, A
UX
(vol
ts)
Volume (mL)
Chromatograms D_1D_2D_3D_4
D1 und D2: "Chitosan F" in Essigsäure 1%ig und 0,15 M NaNO3D3 und D4: "Chitosan F" in Essigsäure 1%ig, 0,30 M NaNO3 und 20 g/l NaCl
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HPLC • SMB • Osmometry
GPC-Praxis und Chitosane – Recovery
Bei Probenvorbereitung und Chromatographie Substanz verloren
oder "generiert"?
• Detektoren off-line kalibrieren
• Probenschleifen "nachwiegen"
• Bei Autosamplern:
Probenflaschen nachwiegen, Injektion beobachten
• Flußrate "nachwiegen"
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HPLC • SMB • Osmometry
Grenzen – Relativmethode 2: Molmasse und hydrodynamisches Volumen
Die GPC trennt nach hydrodynamischem Volumen ("Molekülgröße in Lösung") – nicht generell nach Molmasse.
Ein kompaktes Molekül und ein gestrecktes Molekül gleicher Molmasse eluieren also bei unterschiedlichen Volumina.
Die Kalibrierung ist daher strenggenommen nur gültig,• wenn die unbekannte Probe unter den exakt gleichen Bedingungen
gemessen wird• wenn Kalibriersubstanzen und Probensubstanzen das gleiche
Polymere sind.
Leider stehen aber für viele Substanzen keine Polymerstandards zur Verfügung.
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HPLC • SMB • Osmometry
Grenzen – Relativmethode 3: Auswege
• Oft ist die scheinbare Molmassenverteilung aussagekräftig genug(also die relativ zum Eichstandard berechnete).
• Unterschiede zwischen Proben werden trotz der Einschränkung erkannt.
• Kalibriersubstanzen "möglichst ähnlich wählen“.• Universelle Kalibrierung per Umrechnung.• Universelle Kalibrierung per Messung (Viskosimeter).• Absolutdetektoren einsetzen.
Chitosane: Häufig wird die Kalibrierung mit Pullulanen durchgeführt.
Chitosane: Unterschiedliche Deacetylierungsgrade könnten zu unterschiedlichem Elutionsverhalten führen. – Nachprüfen.
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HPLC • SMB • Osmometry
Grenzen – Adsorption und Verschleppung 1
• Unerwünschte Wechselwirkungen zwischen Probe und stationärer Phase.
• Tailing, verspätete Elution.• Oft mit Konzentrationsdetektoren nicht erkennbar. Nachprüfen
mit Lichtstreudetektion.• Häufig gerade bei Polyelektrolyten.
Nur zu vermeiden, wenn eine geeignete Kombination von mobiler und stationärer Phase existiert und auch gefunden wird.
• Verschleppung bei Proben mit ultrahochmolekularen Anteilen, welche sich durch die Säule "quetschen“.
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HPLC • SMB • Osmometry
Vielen Dank für Ihr Interesse !
Knauer GmbH • Technisches Büro Petershagen
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