Универзитет уНишу– Природно математички факултет

Одсек за хемију

Семинарски рад

: Хроматографске методе одвајања Општи принципи и . теорија хроматографије Течна хроматографија високих

(могућности High Performance Liquid Chromatography)

Кандидат Професор ЈованаПавловић . –доц проф Весна

Станков Јовановић

: Увод у хроматографију кратак историјски преглед развоја , хроматографије дефиниција хроматографије и

класификација хроматографскихметода

Историјски развој хроматографије

Технике засноване на хроматографији користиле су се вековима уназад за раздвајање материјала као што су боје екстраховане из биљака. Ипак термин хроматографија први пут је употребљен од стране руског ботаничара и хемичара Цвет–а (Михаил Семёнович Цвет) 1906. године. Цвет је израз хроматографија (од грчких речи χρώμα–боја и γραφειν–писати) употребио да би описао свој рад на раздвајању обојених биљних пигмената (хлорофила и каротеноида) на стакленој колони, са калцијум–карбонатом као адсорбенcом и мешавином петролетар–етанол као елуентом. Током овог процеса дошло је до раздвајања биљних пигмената у обојене траке. Током свог рада Цвет је посматрао и утицај различитих материјала за пуњење колоне и материјала разних величина честица на раздвајање. Значај његовог рада није уочен све до 1930–их година када су Lederer и сарадници раздвојили биљне пигменате, и то лутеин и зеаксантин на угљеник–дисулфиду, као и ксантофиле из жуманца јаја на колони пуњеној калцијум–карбонатом, а Zechmeister објавио прву књигу о хроматографији. Папирна и танкослојна хроматографија брзо су се развиле током овог периода. Током 1940–их дошло је до развоја јоноизмењивачке партиционе хроматографије и колонске хроматографије, као и до почетка истраживања гасне адсорпционе хроматографије. Ово је резултовало развојем гасне адсорпционе и гасно–течно партиционе хроматографије током 1950–их година. У исто време биохемичари Martin & Synge развијали су сепарациону технику за изоловање ацилованих амино киселина из хидролизата протеина, екстракцијом водене фазе са органском фазом–хлороформом. Користили су низ од 40 левака за екстракцију, а ациловане амино киселине су се раздвајале у левкове на основу брзине расподеле и коефицијената расподеле у смеши вода–хлороформ. Како је процес био доста заморан заменили су га раздвајањем на хроматографској колони која је била пуњена честицама силика гела са водом која је била адсорбована на тим честицама, а хлороформ је протицао кроз колону. У овом систему ациловане амино киселине су се успешно раздвајале према партиционим коефицијентима. Ово је означило почетак партиционе хроматографије.

Током 1960–их година дошло је до наглог пораста употребе хроматографије док је данас хроматографија опште прихваћена рутинска техника, посебно у биологији, медицини, фармацији и у изучавањима животне средине и контроли квалитета. Користи се и као препаративна метода у процесима производње, и пошто је довољно осетљива у

анализи трагова, посебно приликом праћења загађивача животне средине и испитивањима метаболита. Током година развоја три истраживача добила су Нобелову награду у области хроматографије и то: Arne Tiselius 1948. године за рад на електрофоретским и другим методама за раздвајање и детекцију колоида и протеина из серума и Archer Martin & Richars Synge 1952. године за откриће партиционе хроматографије за раздвајање супстанци из сложених смеша.

Дефиниција хроматографије

У својим ранијим радовима Цвет је хроматографију дефинисао на следећи начин: „Хроматографија је метода код које се компоненте смеше раздвајају на адсорпционој колони у датом систему“. Хроматографија је значајно напредовала од тог времена, тако да сада укључује бројне варијације основног процеса раздвајања. Из тог разлога хроматографија укључује широку област техника од којих многе имају своју сопствену терминологију. Поједине организације имају сопствену дефиницију хроматографије као што су Британски институт за стандарде (British Standards Institute) и Америчко удружење за тестирање материјала (American Society for Testing Materials). Да би се увео неки ред у језик хроматографије IUPAC (The International Union of Pure and Applied Chemistry) је 1993. године обновио номенклатуру и дефиницију хроматографије у документу „Unified Nomenclature for Chromatography“. По IUPAC–у хроматографија се дефинише на следећи начин:

„Хроматографија је физичка метода раздвајања код које се компоненте које се раздвајају расподељују између две фазе, од којих је једна стационарна док се друга креће у одређеном смеру“.

Класификација хроматографскихметода

Подела хроматографских метода може се извршити на више начина. Једна од оваквих подела јесте:

а. према физичкој природи мобилне и стационарне фазеб. према механизму одвајањав. према начину паковања стационарне фазег. према техници рада

а. Физичка природа стационарне и мобилне фазеПрема физичкој природи фаза могуће су четири комбинације фаза па према томе и

четири типа хроматографије: течно–течно, течно–чврсто, гас–течно и гас–чврсто. Често се међутим, према физичкој природи мобилне фазе под гасном хроматографијом подразумевају системи гас–течно и гас–чврсто, а под течном хроматографијом системи течно–течно и течно–чврсто.

б. Механизам одвајањаПрема механизму одвајања разликујемо партициону (подеону), адсорпциону,

јоноизмењивачку и гел хроматографију. Код партиционе хроматографије стационарна фаза је течност која се у танком слоју наноси на инертни чврсти носач (целулоза или силика гел). Раздвајање се заснива на различитим растворљивостима компоненти које се раздвајају између мобилне и стационарне фазе. Код адсорпционе хроматографије стационарна фаза је чврста и назива се адсорбент. Јоноизмењивачка хроматографија користи се за раздвајање наелектрисаних молекула. Стационарна фаза је јоноизмењивачка смола за коју су ковалентно везане катјонске или анјонске измењивачке групе. Јони супротног наелектрисања (контра јони) који се налазе у мобилној фази везују се за смолу. Код гел хроматографије стационарна фаза је порозна чврста супстанца чија је величина пора слична величини молекула узорка. Раздвајање компоненти ексклузијом врши се према величини молекула. Постоје још и зонална електрофореза, афинитетна (користи специфични афинитет протеина за лиганде) и хирална хроматографија (за раздвајање енантиомера, стационатна фаза је хирална и реагује са једним енантиомером више него са другим).

в. Начин паковања стационарне фазе Разликујемо хроматографију на колони и планарну хроматографију. Код

хроматографије на колони, стационарна фаза се налази у стакленим или металним цевима које се називају колоне. Стационарна фаза може бити фино уситњена чврста супстанца, течност која у танком слоју покрива фино уситњену чврсту супстанцу или течност која је као танки слој адсорбована на унутрашњим зидовима колоне. Код планарне хроматографије стационарна фаза може бити лист или трака порозног филтер папира и тада говоримо о папирној хроматографији, или фино уситњена чврста супстанца нанешена у танком слоју на плочицу, па говоримо о танкослојној хроматографији.

г. Техника рада Према техници рада разликујемо хроматографију елуирањем, хроматографију

истискивањем и фронталну анализу.

Хроматографија елуирањемОва техника је најчешће коришћена и користи се код скоро свих хроматографија.

Елуирање је процес испирања анализираних састојака са стационарне фазе мобилном фазом. Ако се мала количина узорка стави на врх колоне, а затим врши елуација мобилном фазом која има мањи афинитет за стационарну фазу од компоненти узорка, доћи ће до кретања компонената смеше кроз колону али знатно мањом брзином него што је брзина елуента (мобилна фаза). Брзина кретања компонената смеше одређује се релативним афинитетом сваке компоненте за стационарну фазу у односу на мобилну фазу. Компоненте се са колоне елуирају у односу на њихове афинитете али су им релативне брзине миграције кроз колону одређене интеракцијом између компоненти смеше,

стационарне и мобилне фазе. Како компоненте смеше могу у потпуности да се раздвоје појасом мобилне фазе између њих, ова врста хроматографије се користи за аналитичка раздвајања. Код просте хроматографије елуирањем колона се све време елуира истим растварачем (мобилна фаза). Ово је најпогодније када компоненте имају сличне афинитете за стационарну фазу и због тога се елуирају са колоне брзо једна за другом.

Степенаста елуација врши се мењањем елуента након одређеног временског периода. Елуенти се бирају тако да сваки следећи има већу снагу елуације, тј. већи афинитет мобилне фазе за компоненте које су остале на колони а мањи афинитет за стационарни фазу, што омогућава брже кретање заосталих компоненти кроз систем.

Градијент елуација врши се постепеним променама у саставу елуента да би се постигло раздвајање компоненти широке области афинитета за стационарну фазу. Однос два или више растварача се постепено мења у циљу лаганог повећања снаге елуације мобилне фазе. Из овога следи да се задњи део пика „реп“ компоненте појављује након елуирања растварачем који има нешто јачу снагу елуације. На овај начин се сужавају траке (пикови) и редукује заостајање компоненте на колони и самим тим појава репа.

Хроматографија истискивањем Хроматографија истискивањем такође представља процес елуације с том разликом што

се као мобилна фаза користе растварачи који имају већи афинитет за стационарну фазу него компоненте узорка. Узорак се уноси на један крај колоне, а затим се компоненте узорка адсорбују на стационарној фази. До елуације долази када мобилна фаза пролази кроз колону и на свом путу кроз колону истискује компоненте узорка са стационарне фазе. Компоненте се раздвајау на основу различитих коефицијената расподеле, и партиционих или адсорпционих особина, тј. релативној јачини којом су привучене за стационарну фазу у односу на мобилну фазу. Компоненте са најмањим афинитетом за стационару фазу се прва истискују са колоне. Уопштено ова врста хроматографије не доводи до настајања трака које су потпуно одвојене елуентом. Траке које садрже чисте компоненте се добијају али су оне одвојене зонама које садрже смешу граничних трака.

Фронаталан анализа Код фронталне анализе узорак се континуално наноси на колону. На почетку

компоненте са најмањим афинитетом за стационарну фазу ће проћи кроз колону док јаче адсорбоване компоненте остају на стационарној фази на почетку колоне. Ипак капацитет стационарне фазе је ограничен и када се он превазиђе ове компоненте такође почињу да мигрирају кроз колону. Из тог разлога прва копмонента се елуира са колоне на почетку у чистом облику, а затим у смеши са следећом компонетом која треба да се елуира.

– Теорија хроматографије ретенција и раздвајање компоненти

( ) Однос расподеле коефицијентрасподеле и раздвајање

Већ смо рекли да је хроматографија техника раздвајања где компоненте узорка мобилна фаза транспортује преко стационарне фазе. Компоненте узорка тј. аналит, мобилна и стационарна фаза представљају терцијарни систем. Између аналита и стационарне фазе долази до интеракције, тако да се аналит расподељује између стационарне и мобилне фазе. Како је аналит привучен од стране стационарне фазе, долази до успоравања његовог кретања кроз хроматографски систем. Различите компоненте се различитим брзинама крећу кроз систем, зато што свака од њих има различити афинитет за стационарну фазу у односу на мобилну фазу. Свака компонента узорка се расподељује између две фазе и ствара се равнотежа која је дефинисана коеефицијентом расподеле. За компоненту А,

[ AC ]⟷ [ A M ]

коефицијент расподеле дат је као:

K A=[ AC ][ AM ]

≡CC

C M

Компоненте смеше расподелиће се између две фазе на основу њихових коефицијената расподеле, и покушаће да задрже овај однос у свим стадијумима током кретања кроз колону. Што је већа вредност коефицијента К, већи је афинитет те компоненте за стационарну фазу. Иако је релативно лако предвидети расподелу аналита између две фазе код просте екстракције која се одвија у левку за одвајање, знатно је теже пратити велики број узастопних корака раздвајања у хроматографији. Хроматографија је динамички систем, где се процес раздвајања одвија континуално док се аналит креће преко стационарне фазе, покушавајући да постигне и задржи равнотежу одређену коефицијентом расподеле.

По теорији пода, аналит је током проласка кроз колону увек у равнотежи са мобилном и стационарном фазом. Ипак, како аналит континуално прелази из једне фазе у другу, равнотежа између фаза се никада стварно не успоставља. Да би се прилагодили ови неравнотежни услови, усвојена је техника која је била првобитно уведена у дестилацији, где се сматра да је колона подељена на одређен број подова. За сваки под дозвољена је специфична дужина и као последица тога, аналит проводи одређено време у сваком поду. Изабрано је да под буде такве величине да аналиту омогући довољно време боравка у поду да би он успоставио равнотежу са обе фазе. Из овога је произашло да што је под мањи, брже се успоставља равнотежа и већи број подова ће се наћи у колони. Самими тим број теоријских подова неке колоне директно је повезан са равнотежном брзином, и из тог разлога означава се као ефикасност колоне.

Аналит се на колону наноси на стационарну фазу у облику уске траке. Проласком кроз хроматографски систем долази до дисперзије молекула услед латералне дифузије, што

доводи до ширења траке. Услед превелике дисперзије може доћи до преклапања трака или пикова и непотпуног раздвајања. Према томе, да би се постигло ефикасно раздвајање, мобилна фаза, стационарна фаза и равнотежни услови морају бити пажљиво одабрани. На овај начин постиже се жељено раздвајање брзо колико је то могуће, али са минималном дисперзијом и ширењем трака.

Фактори који утичу на ретенцију 1. састав и особине мобилне фазе2. врста и особине стационарне фазе3. интермолекулске интеракције између компоненти и стационарне и мобилне фазе4. температураМобилна фаза у гасној хроматографији је носећи гас и његова улога је једноставно да

транспортује компоненте кроз колону. Контролни фактори код ове хроматографије су избор стационарне фазе и температура. Код течне хроматографије и мобилна и стационарна фаза утичу на расподелу, тако да се на раздвајање утиче прво избором стационарне фазе а затим модификацијом састава мобилне фазе.

Колумбов закон Интермолекулске силе које утичу на успоравање компоненти заснивају се на

колумбовом закону да слично привлачи слично, тако да ће до привлачења доћи између молекула са сличним електростатичким особинама, док ће се молекули различитих особина одбијати. Постоје два основна типа електростатичких интеракција између молекула:

поларне (van der Walls–ове) ретенционе силе које настају интеракцијом између молекула са површинским наелектрисањем

неполарне (Лононове дисперзионе) ретенционе силе између неутралних молекула или функционалних група

Компоненте које се раздвајају хроматографски могу имати поларни (молекул садржи поларне функционалне групе) или неполарни карактер. Према колумбовом закону, аналит са поларним групама јаче интерагује са поларним стационарним фазама и обрнуто.

Поларне van der Walls–ове ретенционе силе последица су дипол–дипол интеракција и водоничних веза између молекула. Интеракција дипол–индуковани дипол настаје као последица да наелектрисање на једном молекулу ремети електроне у другом молекулу, доводећи до промене у наелектрисању која затим доводи до формирања индукованог дипола.

Неполарне ретенционе силе су најуниверзалније интермолекулске силе, тако да су у неполарним растварачима или стационарним фазама Лондонове дисперзионе силе главна интеракција између молекула. Ове силе последица су интеракције индукованог дипола са поларизабилним молекулима код којих је могуће индуковање кохерентног дипола. Ове силе су релативно слабе.

Ретенција и равнотежа у хроматографији

Оптимално хроматографско раздвајање последица је промене особина стационарне и мобилне фазе и оперативних параметара у циљу постизања захтеване ретенције компоненти узорка. Просечне ретенционе особине за сваку компоненту повезане су са кинетиком и процесима преноса масе, који доводе до појаве ретенционих сила.

Ретенционо време, ретенциона запремина и ретенција

Запремина мобилне фазе која је потребна да би се молекули компоненте пренели кроз хроматографски систем до детектора назива се ретенциона запремина V R, а мери се од почетка хроматографије до појаве пика. Ипак, како је тешко тачно одредити брзину протока и укупну запремине мобилне фазе која пролази кроз хроматографски систем са колоном, као што су GC и HPLC, одржава се константна брзина протока мобилне фазе, а мери се време потребно да компонента прође кроз колону. Ово време назива се ретенционо време tR. Ако је брзина протока мобилне фазе кроз колону FC, ретенциона запремина рачуна се на следећи начин:

V R=tR FC

Брзина протока се израчунава из унутрашњег попречног пресека колоне, просечне линеарне брзине мобилне фазе u, и када је погодно из константе ϵТ , који узима у обзир порозност честица у пакованој колони. Ова константа износи приближно 0,4 за чврсте честице; 0,8 за порозна паковања и 1,0 за колону без паковања као што је GC капиларна колона.

FC=ϵT u( π dC2

4 )Просечна линеарна брзина мобилне фазе израчунава се као однос дужине колоне и

времена које је мобилној фази потребно да прође кроз колону

u= LtM

tM се добија мерењем времена које је потребно да компонента која није задржана прође кроз колону.

Ретенциона запремина и ретенционо време се мере од тренутка када је узорак унет у хроматограф до тренутка када су компоненте елуиране са колоне тј. до појаве пика;

наравно у обзир нису узети ни запремина мобилне фазе у систему, ни време које је мобилној фази потребно да прође од инјектора до детектора. Према томе, морала се извршити корекција, да би се тачније одредила ретенција компоненте стационарном фазом. Према томе уведене су следеће величине: крогована ретенциона запремина V R

, и кориговано ретенционо време tR

, .

V R, =V R−V M

tR, =tR− tM

Задржавање (ретенција) неке компоненте у колони карактерише се следећим односом:

RF=количина компоненте у јединици запремине у мобилној фазиукупна количина компоненте у мобилној+стационарној фази

RF=V M CM

V M CM +V SCS

RF је обично мања од 1. Ако је једнака јединици онда се компонента не задржава на стационарној фази, а ако је једнака 0 компонента је потпуно задржана на стационарној фази и не креће се кроз колону.

Ретенциони фактор Ретенциони фактор (фактор капацитета) k је знатно практичнији од К за описивање

ретенционих карактеристика компоненте и представља однос броја молекула у стационарној и броја молекула у мобилној фази.

k=V S CS

V M CM=K

V S

V M

Ретенциони фактор описује могућност стационарне фазе да задржи компоненте и мера је стварних ретенционих особина, а дефинише се као однос коригованог ретенционог времена и времена које је потребно да мобилна фаза прође кроз систем:

k=t R

,

t M=

t R−tM

tM

Ретенција се може описати у условима ретенционог фактора:

RF=1

1+k

Коефицијент селективности Способност стационарне фазе да раздвоји две компоненте А и B, од којих је

компонента B знатно јаче задржана стационарном фазом, одређује се њиховим релативним коефицијентима расподеле и према томе њиховим ретенционим факторима за одређену стационарну фазу.

α=kB

k A=

t RB,

t RA,

Коефицијент селективности за блиски пар трака је функција: врсте стационарне фазе која се користи, мобилне фазе и температуре колоне и мора се оптимизирати за најзахтевније раздвајање пара једињења која се прва елуирају са колоне.

– Теорија хроматографије ефикасност раздвајања хроматографске колоне

Ширина пика Пик који се налази у хроматограму представља расподелу молекула компоненти на

траке по редоследу елуирања са колоне. Ако би хроматограм био идеалан, пикови у хроматограму би требали да буду симетрични и да да имају приближан облик нормалне гаусове криве. Теоретски гаусова крива се добија ако има довољан број сорпција и десорпција, и ако су коефицијенти расподеле око 1 или већи. Чињеница је да пик несиметричан показује да је дошло до неких непожељних интеракција у систему. Сам пик представља учесталост расподеле свих молекула једног одређеног аналита, током њиховог кретања као једне групе кроз систем. Нормална гаусова расподела представља се следећом једначином:

y= 1σ √2 π

exp[−12 ( x−x

σ )2]

Приликом анализе пика који је резултат раздвајања најпогодније је независну променљиву изразити као стандардну девијацију па једначина добија облик:

y=0,3989exp (−σ2

2 )

Слика 1. Нормална Гаусова расподела

Одређен број независних фактора као што су карактеристике инјектора и детектора, температура и ретенциони процеси у колони, доприсносе дисперзији молекула у траци и ширењу траке. Кумулативни утицај малих промена код ових фактора у процесу елуације, статистички се представљају као варијанца σ 2.

По класичној теорији хроматографије процес раздвајања одвија се у низу успешних равнотежних корака. Што је више тих корака у колони, већа је ефикасност колоне, а мање ширење трака, па према томе:

σ 2∝ 1N

σ∝ 1√ N

⇒ √N ∝ 1σ

где σ стандардна девијација у Гаусовој расподели, описује расејање молекула у траци. Ширење траке је такође функција времена, и што је више потребно за елуацију молекула дате траке, молекули имају више времена да се расеју, па према томе:

σ∝ tR× 1√N

N=( tR

σ )2

Ефикасност колонеСпособност раздвајања у колони одређује се бројем теоријских корака раздвајања

(подова) N . Према томе ефикасност колоне дефинише се бројем теоријских подова:

N=( tR

σ )2

N=16 ( tR

wb)

2

Ефикасност колоне N се обично посматра у пракси, али кориговано ретенционо време утиче на ефективну ретенцију и карактеристике раздвајања колоне. Зато се ефективна ефикасност колоне изражава као:

N eff =16( tR,

wb)

2

Јасно је да број теоријских подова у колони директно пропорционалан дужин колоне. Ако је N број равнотежних подова у колони дужине L димензије једног таквог корака, тј. висина еквивалентна теоријском поду H је:

H= LN

= σ2

L

Асиметрија пикаНормалана дисперзија молекула компоненте током њиховог пута кроз хроматографски

систем представља се гаусовом расподелом у облику звона. Ипак, ако су неки молекули јаче задржани на стационарној фази услед јачих интермолекулских сила, на пример водонична веза, онда ће ти молекули заостати иза главне траке и формираће реп на

главном пику. Наравно неки молекули могу да се крећу испред главне траке, и то онда кад је ретенција стационарном фазом мања од очекиване. До овога може доћи акоје сувише велика количина узорка унета у стационарну фазу.

Асиметрија пика описује се следећим факторима: „A фактор“, „Б фактор“, „Ц фактор“.

Слика 2. Асиметрија пика: а) глава б) реп

A фактор описује вртложну дифузију молекула компоненти и различите путеве којима мобилна фаза пролази кроз паковање стационарне фазе у колони. Из тог разлога молекули могу прелазити различита растојања током пролазка кроз јединицу дужине колоне. Честице такође изазивају вртлоге или турбуленцију у мобилној фази, што доводи до мешања а самим тим и до дисперзије молекула. A фактор је независан од брзине мобилне фазе, али зависи од величине честица стационарне фазе и начина на који је

колона пакована. Добро раздвајање и минимално ширење траке постићиће се коришћењем малих честица у уском опсегу величина које су паковане равномерно у колони.

A=λ d p

λ је константа која узима у обзир опсег величине честица, равномерност паковања и димензије и геометрију колоне. d p је главни пречник честица стационарне фазе.

Б фактор описује лонгитудиналну дифузију. Молекули који су дисперговани у течној или гасовитој мобилној фази кретаће се насумично и дифундоваће у свим правцима независно од правца тока мобилне фазе. Лонгитудинална дифузија описује дифузију дуж осе колоне и паралелна је кретању мобилне фазе. Ова дифузија напред и назад доприносиће заостајњу молекула или кретању испред главне траке, што доводи до ширења траке. Лонгитудинална дифузија зависи од времена и из тог разлога Б фактор је обрнуто пропорционалан линеарној брзини мобилне фазе. Напредак дифузије биће прекинут честицама паковања колоне и коефицијентом дифузије компонената мобилне фазе

B=2 γ DM

Ц фактор описује отпор преносу масе. Пренос молекула компоненте између мобилне и стационарне фазе одвија се континуално током процеса елуирања, a молекули покушавају да постигну равнотежу дефинисану коефицијентом расподеле. На водећем крају траке компоненте се крећу преко „свеже“ стационарне фазе и из тог разлога улазе у стационарну фазу. На задњем крају траке долази до замене, трака наставља да се креће остављајући компоненте на стационарној фази, које постепено одлазе са стационарне фазе. Ц фактор узима у обзир коначно време које је потребно да дође до процеса преноса масе, који је уједно и најважнији процес који доводи до ширења траке код GC и HPLC.

Ц фактор који описује дифузију у стационарној фази директно је повезан са дебљином филма. Тање стационарне фазе доводе до бржег преноса масе, али то доводи до смањења капацитета колоне.

CS=d f

2

DS

Ц фактор описује дифузију молекула компоненте у мобилној фази током кретања ка стационарној фази. Честице паковања колоне пружају отпор преносу масе. Из тог разлога Ц фактор је функција пречника честица и дифузионог коефицијента компоненте у мобилној фази.

CM=d p

2

DM

Оптимална брзина мобилне фазе Хроматографска колона оцењује се на основу њене способности да раздвоји

компоненте сложене смеше уз помоћ одређене мобилне фазе. Највећа ефикасност колоне добиће се када је минимална вредност висине теоријског пода. Ово се може постићи када је брзина мобилне фазе оптимална, а процеси при којима долази до ширења траке и који су описани van Deemter–oвом једначином минимални. А фактор је независан од линеарне брзине, Б фактор је обрнуто пропорционалан линеарној брзини, а Ц фактор директно пропорционалан линеарној брзини. Да би се одредила оптимална брзина мобилне фазе, гледа се утицај сваког од ових фактора на висину теоријског пода при различитим брзинама мобилне фазе. А, Б и Ц фактори могу се добити рачунањем висине теоријског пода за три различите линеарне брзине мобилне фазе. Висина теоријског пода и одговарајућа вредност линеарне брзине мењају се у van Deemter–oвој једначини да би се добиле три симултане једначине које се могу решити за А, Б и Ц. Како је uopt када имамо H MIN, следи да је dH /d u=0.

H=A+ Bu

+C u dHdu

= −BuOPT

2 +C=0

uOPT=√ BC

H MIN=A+ B√B/C

+C√ B/C H MIN=A+2√BC

Постоји нколико начина за мерење асиметрије пика а један од њих је и мерење асиметричног односа или фактора заостајања (tailing factor TF):

TF=ba

Величине b и a мере се на 10% висине од основе пика као што је приказано на слици 4. Код симетричног пика овај фактор ће бити 1. Код пикова код којих имамо појаву „репа“ фактор заостајања ће бити већи од један, а код пикова код којих имамо водећи крај овај фактор ће бити мањи од 1.

Слика 3. График коришћен за одређивање асиметричног односа или фактора заостајања

Резолуција Да ли је неко хроматографско раздвајање добро или не оцењује се величином

раздвајања између два пика (резолуцијом). Ако су два блиска пика довољно раздвојена да се може тачно измерити површина пика раздвајање се сматра добрим. Из овога следи да треба да постоји добро раздвајање основе пикова, без коелуације или преклапања репа једног пика са водећим делом следећег пика. Како хроматографски пикови одговарају гаусовој расподели тешко је утврдити минимално раздвајање у условима ретенционог времена. У идеалном случају, блиски пикови треба да буду раздвојени за 6σ (3 σ А +3 σB ¿, према томе биће мање од 0,3% преклапања пошто ± 3σ обухвата 99,7% Гаусове расоделе. У пракси, резолуција (RS¿ се одређује упоређењем разлике у ретенционим временима за две компоненте на половини висине пика.

R s=tRB−tRA

2σ B+2 σ A= ∆ t

12(wbB+wbA)

= 2 ∆ t(wbB+wbA)

У идеалном случају резолуција треба да буде између 1,2 и 1,5 што одговара преклапању пика од око приближно 1% и 0,2%. Вредности резолуције око 1,8 и веће указују на превелико раздвајање што води дугој анализи и ширењу трака једињења који се касније елуирају.

Резолуција и селективност Резолуција два пика зависи од ретенционих карактеристика сваке компоненте (k ),

способности стационарне фазе да селективно задржава компоненте (α ) и просечне ефикасности колоне (N ). Употребом свих раније дефинисаних једначина, изведена је јединствена једначина која повезује раздвајање на колони са бројем подова, факторима капацитета и коефицијентима селективности две анализиране компоненте.

R s=√N4 ( k

k+1 )( αα +1 )

Ова једначина је врло важна при изради колоне, на пример, да би се постигло жељено одвајање уз минималну дужину колоне и минимално време трајања анализе. Резолуција је пропорционална квадратном корену из броја подова, тако да су потребне велике промене у броју подова да би се видео било какав утицај. Ефикасност колоне може се повећати повећањем дужине колоне, али за одређену геометрију колоне пожељно је оптимизирати k и α . Систем мобилна фаза–стационарна фаза бира се тако да се критичан пар пикова не елуира на ниским вредностима k . k је просечни ретенциони коефицијент за два пика и озбиљно ограничава резолуцију на нижим вредностима, веће вредности повећавају ретенциона времена и побољшавају сепарацију. За оптимизацију k и α врши се модификација система мобилна–стационарна фаза.

Хроматографија истискивањем и партициона хроматографија на вишеструкимколонама

Колонска хроматографија истискивањем

Када хемичар каже хроматографија на колони, обично мисли на колону у облику стаклене цеви 1–4 cm у пречнику и 15–60 cm дужине, са мобилном фазом која пролази кроз инертну фазу под утицајем силе гравитације, благог усисавања или малог притиска. Колоне могу бити различито конструисане. Неке могу бити равне са стакленим фрит за носач, неке могу имати вентил за контролу протока, док неме имају проширени резеорвар на врху. Код неких се може наћи стандардни сужени наставак на врху, за додавање резеорвара за растварач било које величине.

Вентили служе за контролу брзине протока и требали би да имају широки отвор да се не би запушили вискозном мобилном фазом. Колоне са дном које може да се по потреби уклања, користе се приликом раздвајања која захтевају доста времена. Дно се може уклонити, а затим и паковање колоне. Паковање колоне се затим подели на секције, а жељено једињење се екстрахује или испира са инертне фазе. У табелама 1 и 2 приказани су најчешће коришћени адсорбенси и мобилне фазе у колонској хроматографији.

Табела 1.* Адсорбенси који се користе у колонској хроматографији По редоследу од најактивнијег до најмање активног

1. Фулерова земља 9. калцијум–фосфат2. дрвени угаљ 10. калцијум–карбонат

3. активирани алуминијум 11. калијум–карбонат4. магнезијум силикат 12. натријум–карбонат

5. силика гел 13. талк6. калцијум оксид 14. инулин

7. магнезијум оксид 15. скроб8. Калцијум–карбонат 16. сахароза

*Фулерова земља је назив за било коју непластичну глину или земљани материјал налик глини. Користи се за деколоризацију, филтрацију и пречишћавање биљних, животињских и минералних уља и масти; алуминијум служи као адсорбент за раздвајање стерола, витамина, естра, алкалоида, неорганских једињења; силика гел за раздвајање стерола, амино киселина; магнезијум–карбонат за раздвајње порфирина; магнезијум–силикат за раздвајање стерола, естра, глицерида, алкалоида; калцијум–карбонат за каротеноиде, ксантофиле; скроб за ензиме; сахараза за каротеноиде, ксантофиле.

Табела 2. Течне мобилне фазе које се користе у колонској хроматографијиПо редоследу од најлошије до најбоље адсорбоване од стране адсорбента

1. пертол етар 30º-50º 10. толуен2. петрол етар 50º - 70º 11. естри органских киселина

3. петрол етар 50º - 100º 12. 1,2–дихлороетан, хлороформ, дихлорометан4. угљеник тетрахлорид 13. алкохоли

5. циклохексан 14. вода (варира са променом pH и конц. соли)6. угљеник дисулфид 15. пиридин

7. етар 16. органске киселине8. ацетон 17. смеше база и киселина са водом, алкохолом и

пиридином9. бензен Што се тиче математичких израчунавања код колонске хроматографије потребно је

обратити пажњу на следеће: 1) која количина мобилне фазе је потребна за раздвајање, 2) када је смеша потпуно раздвојена, и 3) у ком тренутку свака од компоненти пролази кроз колону. Једначине потребне за решавање проблема у колонској хроматографији заснивају се на процесима расподеле у систему течно–течно.

Приликом извођења колонске хроматографије потребно је испунити следеће:Не сме се допустити улазак ваздуха у паковану колону. Мехурићи ваздуха мењају

ток мобилне фазе, искошавају линије које се налазе између раздвојених једињења и не дозвољавају квантитативно одређивање. У неким случајевима мехурићи ваздуха могу да зауставе проток мобилне фазе. Да би се спречио улазак ваздуха у паковање колоне, потребно је да на врху колоне увек буде мала запремина мобилне фазе, као и да током самог раздвајања не дође до исушивања.

Колоне морају да буду чврсто паковане. Ако су колоне паковане сувише лабаво може доћи до стварања канала и појаве ефекта на зидовима колоне. Оба ова ефекта доводе до појаве неједнаких фронтова између једињења која се одвајају (као последица бржег кретања предњег дела траке) и до лоше резолуције. Стварање канала последица је отварања између делова паковања, што омогућава брже кретање мобилне фазе него што би то било кроз нормално паковану колону. Ефекти на зидовима колона последица су вишка празног простора између зидова колоне и инертне фазе. Мобилна фаза се тада брже креће преко зидова него унутар паковања, што крив облик фронта растварача. Међутим не

треба ни сувише чврсто паковати колону. У оваквим колонама мобилна фаза протицаће сувише споро, ако резултат тога имаћемо повећану дифузију и ширење трака. Нађено је да следећа техника паковања колоне даје задовољавајуће резултате. Када се пакује сува колона, материјал за паковање се додаје у деловима од неколико грама, тако да приликом сваког следећег додаваља имамо повећање у маси. Након сваког додатка материјала за паковање крај колоне се удара о чврсту подлогу да би се постигла одговарајућа чврстина паковања и да би се редуковале граничне линије између додатака. Када се заврши са додавањем материјала за паковање, треба га јако притиснути набијачем да би врх био раван.

Да би се одржала константна брзина протока, као и константан проток мобилне фазе потребно је на врх колоне ставити прилагођен нормални суд који у себи садржи растварач (мобилну фазу). Са нормалног суда одговарајуће величине одсече се врх, а затим се дода жељена количина мобилне фазе. Суд се окрене врхом на доле и смести на врх колоне. Након неколико минута ниво течности биће као и ниво течности на дну грла нормалног суда. Када ниво течности падне испод грла нормалног суда, ваздух улази у нормални суд и дозвољава малој количини растварача да изађе из суда. Овај процес се наставља док се целкупна количина растварача не истроши. Како је ниво растварача константан, брзина протока мобичне фазе је константна.

Користити суве мобилне фазе. Вода је прилчично поларна и као таква елуираће већину компоненти које су адсорбоване на колони. Најлакши начин да се осигура да је растварач сув је да се смести адсорбенс на врх колоне. Може се ставити или друга мала колона која је пакована анхидрованим натријум–сулфатом на врх главне колоне, или да се стави мала количина стаклене вуне на врх паковања колоне а затим да се дода неколико грама анхидрованог натријум–сулфата. Када растварач пролази, вода која се налази у растварачу формираће хидрат са натријум–сулфатом (Глауберова со).

Елуирање градијентом Када у једној смеши имамо једињења у широком опсегу различитих адсорптивних

капацитета, веома је тешко једном истом мобилном фазом уклонити поларније компоненте и истовремено раздвојити компоненте које се лакше елуирају. У том случају потребно је започети елуацију мање поларном мобилном фазом, а затим полагано повећавати поларност додатком растварача веће поларности. На овај начин ствара се поларни градијент, и како поларност расте поларније компоненте почињу да се крећу кроз колону. Најједноставнији начин стварања градиејнта је да у три цеви које су међусобно повезане ставимо раствараче различитих поларности, од којих ће у првој бити течност ниске поларности а у другој и трећој течности већих поларности. Како течност истиче из прве тубе, течност из друге у лази у прву и меша се са њом. Како се овај процес наставља поларност мобилне фазе полако расте.

Партициона хроматографија на вишеструкимколонама

Већ смо рекли да све хромарографске методе захтевају да се узорак пре почетка одвајања у хроматографски систем унесе у облику уске траке или мрље малог пречника. Изузетак је једино када желимо да одвојимо само једну компоненту смеше. Тада се жељена компонента задржава на колони а остатк се испира са колоне. Након тога жељено једињење се може испрати са колоне. Да бисмо ово постигли потребно је се природа

површине паковања колоне промени да би се жељена компонента задржала на колони. Ако се овакво одвајање изводи стандардном адсорпционом хроматографијом аналитичар је ограничен хемијском природом инертне фазе (паковања колоне). Да би постигли жељено раздвајање научници су модификовали класичну колонску хроматографију. Раздвајање се заснива на чињеници да су већина једињења базе или киселине до неке мере. Из тог разлога изабере се паковање колоне које је у почетку неутрално, а затим се учини базним да би се задржале киселе компоненте или обрнуто. Једно од најбољих неутралних паковања је целит (дијатомејска земља, дијатомит или кизелгур представља седиментну стену на бази силицијум диоксида. Веома је порозна и састоји се од око 80–90 % силицујум диоксида). Овај материјал који представља фини прах настаје од фосилизованих остатака дијатома (врста алги са тврдим оклопом). Колоне које се користе код овог типа одвајања су врло мале, направљене од стакла са димензијама 2,5×15 cm. Течност која се додаје на површину целита не сме се додати у односу већем од 1 g течности на 1 g целита. Најбољи однос је додати 1 g течности на 3 g целита. Површина целита покрива се на следећи начин: ставимо 3 g целита у чашу, а затим додамо 1ml 1N раствора NaOH. Течност готово одмах формира капљице и не диспергује се. Помоћу стакленог штапића мешамо течност са целитом све док капљице течности не нестану и смеша постане хомогена. Узорак се на површину целита смешта на исти начин.

Афинитетна хроматографија Раздвајања код класичних хроматографских техника зависе од разлика у ефективности

адсорпције, партиције, измене јона између молекула аналита сличних хемијских карактеристика. Модификована гел техника која користи високу специфичност биохемијских реакција назива се афинитетна хроматографија. Код ове хроматографије инертни носач (паковање колоне) је модификован тако да селективно везује једињења са специфичним функционалним групама. Сила везивања је довољно јака за ефективно раздвајање, и довољно слаба за испирање жељеног једињења када је то потребно. Лиганд који поседује специфични афинитет за одређено једињење (аналит), ковалентно је везан за матрикс (гел) а затим се материјал пакује у колону на класичан начин. Узорак у одговарајућем раствору који је пуферован се наноси на врх колоне. Током времена, компоненте са специфичним афинитетом за лиганд се реверзибилно везују док невезане компоненте само пролазе кроз колону. Састав или pH елуента се затим мења да би се ослабила веза између компонете и лиганда, што убрзава дисоцијацију и олакшава елуацију задржане компоненте.

Инертан матрикс (носач)По дефиницији матрикс треба да буде инертан и да нема никакву улогу у процесу

раздвајања. Теоретски, савршен носач састоји се од монодиспергованих савршено обликованих сфера чији се пречник креће од 5–500 µm, високе је механичке снаге, без способности неспецифичне адсорпције, са селективним порама чија се величина креће од 10–500 nm, са величином пора у веома уском опсегу. Идеалан матрикс би према томе омогућио најефикасније раздвајање при свим експерименталним условима. Као и увек потребно је наћи компромис, па се обично наглашавају најповољније карактеристике а минимизирају се ограничења, променом експерименталних услова у циљу добијања

оптималних резултата. Матрикс мора да испуни следеће услове: 1) мора да буде стабилан на елуент, 2) мора да буде механички и хемијски стабилан, 3) да има велику површину, 4) да се лако дериватизује, 5) да има добре особине за проток. У табели 3 приказани су најчешће коришћени носачи са опсегом pH за рад.

Табела 3. Носачи у афинитетној хроматографијиНосач Радни опсег pH

агароза 2–14целулоза 1–14декстран 2–14силицијум ˂ 8

порозно стакло ˂ 8полиакриламиди 3–10

полихидроксиметакрилати 2–12оксиран–акрилни полимери 0–12

стирен–дивинилбензен кополимери 1–13поливинил алкохоли 1–14

политетрафлуороетилен не зависи од pH Агароза се добија из остатака морских алги и то је линеарни полисахарид који се

састоји од наизменичних остатака β–D–галактозе и 3,6–анхидро–α–L–галактозе, повезаних α–1,3 и β–1,4 гликозидним везама, као и од неколико карбоксилатних и сулфатних јонских остатака. Наравно јонски остаци се морају уклонити јер ометају раздвајање, и најчешће се уклањају редукцијом са NaB H 4. Непречишћени материјал се назива агар. Агароза се састоји од пентагоналних пора које настају премошћавањем троструког хеликса агарозе. Ово је јако осетљива супстанца, а ојачава се додатним повезивањем са епихлорохидрином. Агароза се производи у неколико облика и то као сефароза, био–гел А, гелароза, итд.

Стакло са контролисаном величином пора настало је из разлога што је агарози недостајало механичке снаге при раду на високом притиску и у условима велике брзине протока. Ова врста носача добија се загревањем одређених врсти боросиликатног стакла на температури од 500–800 ºC, док се не одвоје две фазе и то: фаза богата силицијумом и фаза богата бором. Фаза богата бором раствори се киселином и добија се сунђераста супстанца са величином пора од 2,5–7 nm. Ако се фаза раствори у бази величина пора биће од 4,5–400 nm. Површина стакла поседује одређен јонски карактер, што је непожељно. Ово се уклања рефлуктовањем са 10% воденим раствором аминопропил–триетоксисилана.

Спејсери (Spacer Arm)Лиганд се ковалентно везује за носач помоћу спејсера, који служи да активну групу

носача држи на довољној удаљености од матрикса. На тај начин стерне сметње су сведене на минимум и обезбеђено је да лиганд буде потпуно доступан једињењу које се одваја. У биохемијским анализама везивање лиганда може да се врши на два начина на пример: можемо прво да вежемо спејсер за лиганд, а онда да овако „продужени“ лиганд доведемо да реагује са активираним носачем (6–аминохексиладенозин–монофосфат), или да неспецифични спејсер (1,6–диаминохексан) реагује са активираним матриксом а затим се куплује са лигандом (најчешће активацијом карбоксилне групе са карбоимидим и заменом карбоимида везујућим амином).

Ефективност спејсера зависи од: 1) саме дужине спејсера, 2) стабилности којом је он везан за матрикс, 3) хидрофобне природе, 4) присуства наелектрисања, и 5) концентрације. Већина комерцијално доступних материјала за афинитетну хроматографију има већ причвршћен спејсер, у неким случајевима и лиганд. Лиганди са слободним карбоксилним групама могу се везати за Affi–Gel 101 и 102. Хлориди киселина, естри N–хидроксисукцинимида, алдехиди, анхидриди и алкил халиди реагују директно. Лиганди са слободним амино групама могу се имобилизирати на Affi–Gel 201 и 202. На Affi–Gel 401 лиганди се могу везати формирањем дисулфида, тиоестара или тиоетара.

Методе за активирање носача Најчешћа метода за активирање агарозе је реакција слободних хидроксилних група са

цијано–бромидом.

Карбоксилна група се активира реакцијом са тионил–хлоридом

Везивање лиганадаПостоји више начина за везивање лиганада. Један од њих је и директно везивање

лиганада за спејсер.

Други начин је везивање лигананда за реактивне интермедијере. Лиганди са слободним алкил или арил амино групама ће спонтано реаговати у року од неколико сати унутар воденог раствора интермедијера. Такви реактивни интермедијери су N–хидроксисукцинимид и 1–етил–3–(3–диметиламинопропил) карбоимид.

( ) ( ,Ексклузиона гел хроматографија гел филтација )хроматографија намолекулским ситима

Ексклузиона хроматографија је техника код које се раздвајање заснива на разлици у величини молекула. Битно је рећи да се код ове технике раздвајање не заснива на партицији већ на просејавању молекула аналита. Стационарна фаза код ове хроматографије је порозни полимер чије су поре комплетно испуњене растварачем који се користи као мобилна фаза. Основа раздвајања лежи у томе да молекули изнад одређених величина буду потпуно ексклудовани из пора, а да унутрашњост пора буде делимични или потпуно доступна мањим молекулима. Из тог разлога величина пора је врло важна, јер величина пора одређује опсег молекулских тежина једињења која ће се раздвојити. Проток мобилне фазе кроз колону довешће до тога да велики молекули само прођу кроз колону без задржавања, док ће мањи молекули улазити у поре гела и задржаваће се на колони у зависности од степена пенетрације у гелу (што је мањи молекул то је већа пенетрација у поре гела а самим тим и веће је задржавање на колони). Компоненте смеше излазе са колоне по редолседу молекулских маси од највећих ка мањим. Било која једињења која су потпуно ексклудована из гела неће се међусобно раздвојити. Исто важи и за мале молекуле. Молекули који су потпуно ушли у поре гела неће се међусодно раздвојити. Генрално правило је да ће се једињења чије се масе разликују за 10% раздвојиће се на једној колони.

Ексклузиона хроматографија назива се и гел филтрација у случају када је стационарна фаза хидрофобна а мобилна фаза водена, као и гел пермеација када је мобилна фаза хидрофилна а мобилна хидрофобна. За ово хроматографију дефинишу се и инклузиони лимит (најмања величина честице која може да се раздвоји) и ексклузиони лимит (највећа величина честице која може да се раздвоји).

На раздвајање гел хроматографијом утичу особине пора, као и природа материјала од кога се формирају поре. Гел мора бит хемијски инертан, механички стабилан и са пажљиво формираном и репродуктивном порозном структуром, са приближно равномерном величином честица. Разликујемо два основна типа гелова и то: ксерогелове и аерогелове. Ксерогелови се састоје од умрежених полимера који у контакту са растварачем бубре и формирају релативно мекану порозну средину, где су поре одвојене ланцима полимера. Ако се растварач уклони структура гела се губи. Аерогелови су за разлику од ксерогелова чврсти. То су порозни, чврсти материјали и у њих улази растварач. Када се растварач уклони они не губе структуру. Неки материјали као што су полистирен и хибриди ксеро–аеро гелова имају скоро чврсту структуру, бубре до одређене мере у контакту са растварачем.

Гел филтрација Првобитно коришћени гел за хроматографију био је Сефадекс Г. Овај материјал

представља умрежени декстран (полисахарид), полимер епихлорохидрина и декстрана. Декстран се добија из скроба. Скроб је полисхарид глукозе, где су јединице глукозе међусобно повезане α–1,4 и α–1,6 гликозидним везама. Дејством одређених ензима на овај полисахарид кидају се α–1,4 везе, а остатак се изолује преципитацијом са метанолом. Овај остатак назива се декстран. Декстрани се користе са воденим растварачима и знатно бубре и врло лако губе своју структуру.

Лиофилни гел материјали (Сефадекс ЛХ–20 и Сефадекс ЛЕ–60) се користе са органским растварачима. Сефадекс ЛХ–20 представља хидроксипропил етар сефадекса Г–

25 (број поред ознаке гела указује на величину порозности гела). Направљени су тако да се могу користити у воденим пуферским системима, поларним органским растварачима и смешама водених растварача. Широко се употребљавају за раздвајање липида, стероида, масних киселина, хормона, витамина и других малих молекула. Идеални гел би требао бити у облику суперфиних порозних честица, велике механичке снаге у циљу омогућавања добре резолуције великих молекула при великим брзинама протока мобилне фазе. Лиофилни гелови су знатно ефикасни са растварачима као што су: сулфоксиди, пиридин и диметил формамид. Један од таквх гелова је и Сефакрил који се добија умрежавањем алил декстрана и Н,Н–метиленбис–акриламида. Пажљивом контролом тачних услова синтезе, ови гелови се производе са ексклузионим лимитом од 250 000 (Сефакрил С–200) до неколико хиљада милиона (Сефакрил С–1000). Сефакрил се може користити у воденим пуферским системима у области pH од 2–11, у концентрованом раствору урее или гванидину (HCl), и у бројним органским растварачима. Област раздвајања на овом гелу покрива опсег молекула од малих полипептида до честица величине 300–400 nm у пречнику.

Гел пермеацијаЈедан од главних недостатака сефадекс полимера је то што су ограничени само на

водене системе. Из тог разлога развијени су полимерни гелови код којих је била могућа примена органских растварача. Један од првих таквих гелова био је полимер стирена и дивинилбензена. Ови полимери користе се најчешће као јоноизмењивачка смола, али без јонизујућих група и у мање поларним органским растварачима формираће гелове. Овај гел може се користити са типичним органским растварачима као што су бензен, толуен, ксилен, угљентетрахлорид, диметилформамид, метилен–хлорид, кетони, диметил–сулфоксид, терахидрофуран, хлороформ итд.

Био–гел–п је синтетички полиакриламидни гел, добијен кополимеризацијом акриламида и умереженог Н,Н–метиленбисакриламида. Овај гел се не користи са органским растварачима који се мешају са водом. Користи се са разблаженим органским киселинама, 8М ратвором урее, 6М гванидином (HCl), хаотропним реагенсима и детерџентима.

Ензакрил је полимер једињења која садрже азот умрежених са акриламидом. Већином се користе за имобилизацију ензима.

„Flash“ (Medium Pressure Liquid Chromatography) хроматографија

Flash хроматографија је модификована колонска хроматографија. Од класичне хроматографије разликује се на два начина: прво, за пуњење колоне користе се нешто мање честице силика гела, а друго као резултата тога, потребан је низак притисак да би се омогућио проток растварача кроз такво паквање колоне. Све ово резултује раздвајањем средњег квалитета али знатно бржим раздвајањем.

Паковање колоне

Најчешћи материјал који се коисти за паковање колоне је силика гел. Паковање се врши на два начина: као суво паковање и као влажно паковање.

Суво паковање – на дно колоне смести се мало парче стаклене вуне. Затим се дода 2 mm песка (величине честица 50–100 mesh) и остави тако. Затим се дода силика гел (40–63 mesh) до висине од 14–15 cm, у само једном додавању. Када је зауставни вентил на колони отворен колона се лагано удара вертикално да би се слегло паковање. Затим се опет дода 2 mm песка (величине честица 50–100 mesh) на врх равног паковања. Растварач се пажљиво проспе преко песка да би се напунила колона. Игличасти вентил на регулатору протока који је чврсто причвршћен на врху колоне, отворен је све време. Главни хоризонтални ваздушни вентил који иде до регулатора протока незнатно је отворен, а преко испусног отвора ставља се прст. Ово доводи до тога да притисак преко адсорбента расте и на тај начин компресује силика гел приликом проласка растварача кроз колону.

Влажно паковање – код сувог паковања увек постоји проблем да се истисне ваздух из колоне. Зато се као паковање колоне користи метода паковања са влажном емулзијом. Код ове методе силика гел се направи у облику емулзије, а затим се наспе у колону са отовореним одводом. Затим се примени притисак да би се приморао растварач да изађе из колоне и да би се колона напаковала чврсто без заробљеног ваздуха у њој.

Како је код ове хроматографије потребан нижи притисак него код обичне колонске хроматографије, низак притисак се добија употребом пумпи. Пумпа за низак притисак није ништа друго до обичног балона. Један велики балон смести се унутар другог балона а затим се надува и смести на врх колоне. За нешто веће притиске користи се најобичнија пумпа за акваријум. Од гасова под притиском користе се компресовани ваздух осим ако једињења нису осетљива на кисеоник. У том случају се користи компресовани азот. Улога регулатора протока је да редукује притисак долазећег гаса до оног који је потребан да би се добила одговарајућа брзина протока, као и да би се омогућило вишку гаса да изађе кроз отвор.

Што се тиче саме апликације узорка, потребно је узорак на колону апликовати у што могућем тањем слоју. Утврђено је да се најбоље раздвајање постиже ако жељена компонента на танком слоју силика гела има RF вредност 0,35, а нечистоће ± 0,15 вредности од ове. Да би се постигло добро раздвајање на TLC плочици испроба се неколико раставарача или неколико комбинација растварача за елуирање, а онда се одговарајући пренесе у колону.

Течна хроматографија под високим притиском (High Performance Liquid Chromatography–HPLC)

HPLC је врста течне колонске хроматографије. То је модерна течна хроматографија и данас представља водећу истраживачку технику. Само име каже да је ово хроматографија под високим притиском или хроматографија високих могућности, и то је издваја од осталих хроматографских метода. Проток мобилне фазе код ове хроматографије одвија се под високим притиском, а сам високи притисак омогућава континуални проток мобилне фазе, успостављање квалитетне динамичке равнотеже са стационарном фазом, као и ефикасно елуирање раздвојених компоненти смеше са колоне. Како је ово вид течно–

чврсто хроматографије, на основу различитих врста стационарне фазе (паковање колоне) ову хроматографију делимо на: хорматографију на нормалној фази (Normal Phase HPLC), хроматографију на реверсној фази (Reversed Phase HPLC), јоноизмењивачку, хроматографију са формирањем јонских парова, афинитетну и хиралну хроматографију. У даљем тексту биће објашњена само прва четири типа хроматографије.

Normal Phase HPLC

Овај вид хроматографије користи се за раздвајање поларних компоненти. Раздвајање се заснива на разлици у јачини поларних интеракција између аналита у смеши и стационарне фазе. Мобилна фаза је неполарна. Сам процес рздвајања код ове хроматографије је компетитивни процес. Молекули аналита такмиче се са молекулима мобилне фазе за адсорпциона места на површини стационарне фазе. Као стационарна фаза (материјал за паковање колоне) користе се специјални порозни оксиди силицијума или алуминијум. Ови материјали на својој површини садрже слободне или водонично везане хидроксилне групе, и као такви омогућавају површинске интеракције молекула аналита са стационарном фазом. Као материјали за паковање колоне могу се користити и цирконијум, титанијум или флорисил, али је оксид силицијума још увек најзаступљенији. Овај материјал је порозан и некристалан са општом формулом

[ SiO2−x /2(OH )x ]n∙ H 2Op

За поларни карактер овог паковања одговорне су силанолне Si−OH групе.

Као мобилна фаза код ове хроматографије користе се неполарни органски растварачи као што су хексан, хептан, итд. Неполарни каракер ових растварача ограничава њихову

способност да растворе поларна једињења. Из тог разлога мобилној фази додају се мале количине поларних супстанци тзв. модификатори мобилне фазе који су обично алкохоли, етил–ацетат. На овај начин побољшава се растварање поларних једињења у мобилној фази, врши се контрола ретенције аналита и потпомаже елуирање. Код ове хроматографије вода се не користи као растварач, јер се у воденим растворима силанолне групе солватишу молекулима воде и деактивирају. Иако је оксид силицијума најчешће

употебљавана стационарна фаза, синтетизовае су и нове стационарне фазе са везаном поларном функционалном групом. Везане поларне фазе садрже амино, цијано, диол или комбиноване цијано–амино функционалне групе. Стационарна фаза показује особине сличне особинама фазе од порозног силицијум–оксида, али показује и неке предности као што су: брже постизање равнотеже, могућност рада са воденим системима, нема иреверзибилног везивања веома поларних молекула аналита, а у циљу промене селективности може се мењати природа поларних функционалних група стационарне фазе.

Reversed Phase HPLC

Код овог типа хроматографије стационарна фаза је неполарна, док је мобилна поларна. Она се данас широко користи, а то долази од чињенице да је за рад са овом стационарном фазом потребно присуство водене мобилне фазе. Супротно Normal Phase HPLC код ове хроматографије раздвајање се заснива на дисперзивним силама (хидрофобним или van der Waals–овим интеракцијама). Најзаступљеније стационарне фазе које се користе код овог типа хроматографије су стационарне фазе од порозног силицијум оксида на чијој површини су силоксанским (силилетарским) везама везане неполарне групе (октадецил, октил, фенил групе). Стационарна фаза припрема се реакцијом органосилана са реактивним силанолним групама на површини силицијума у одговарајућем органском растварачу. Органосилани X3−n Si R Rn

' , састоје се од органског лиганда R (засићене алкил, алкилфенил или алкилцијано функционалне групе), n других органских лиганада R ' (обично метил групе) везаних за атом силицијума и бар једне реактивне одлазеће групеX (хлоро, алкокси или диалкиламино). Одлазећа група органосилана реагује са површинским силанолним групама и даје органску стационарну фазу. Иако се користи мноштво органских лиганада за синтезу стационарне фазе и даље су најпопуларније стационарне фазе са везаним засићеним угљоводоницима C8 или C18. Најчешће коришћени растварачи код ове хроматографије су: вода, ацетонитрил, метанол, тетрахидрофуран.

Јонска HPLC

Од метода јонске хроматографије најпознатије су: хроматографија јонске измене (јоноизмењивачка) и хроматографија формирања јонског пара.

Раздвајање код јоноизмењивачке хроматогафије заснива се на различитим афинитетима јона аналита за супротно наелектрисане јонске центре на смоли или адсорбоване контра јоне на хидрофобној стационарној фази. Код јоноизмењивачке хроматографије најчешће се као стационарне фазе користе полимерне смоле на којој су ковалентним везама везане јонске функционалне групе (позитивно или негативно наелектрисане). Најважнији материјали за израду јоноизмењивачких колона су органски материјали базирани на синтетским смолама. Као носач се користи кополимер стирена и дивинилбензена, који се накнадно сулфонује ради добијања катјонског измењивача, или аминује ради добијања анјонског измењивача. Као анјоноизмењивачи користе се, поред кватернарних амонијум група и алкил амини, хидрокси алкиламини. Као катјоноизмењивачи користе се сулфонил и карбоксилне групе. Код јоноизмењивачке HPLC се ове нормалне јонизмењивачке смоле не користе, због тога што је паковање сувише меко и може запушити колону. Неки новији кополимери стирена и

дивинилбензена са већим степеном умрежења се користе. Ипак најчешће паковање код HPLC су везане јоноизмењивачке функционалне групе на чврстим честицама силицијума. Једињења која се раздвајају налазе се у воденом систему који је пуферован на око 1,5 pKa

јединица изнад највећег pKa у смеши. Ово нам обезбеђује да сва једињења у смеши буду потпуно јонизована и задржана на колони.

Хроматографија формирања јонских парова представља модификацију Reversed Phase HPLC и користи се за раздвајање јако поларних једињења на неполарној колони. Контра јон, јону који желимо да раздвојимо, додаје се мобилној фази заједно са пуфером да би се одржала јонска снага и pH. На овај начин формира се неутрални јонски пар који може да се раздвоји од сличних компоненти. Јонски реагенс за катјоне су органске сулфонске киселине, а за анјоне кватернарне амонијум соли као што су фосфати и хидрогенсулфати.

HPLC инструмент

Слика 4. Шематски приказ HPLC инструмента

Резеорвари за мобилну фазу и систем за припрему узорка Пре него почнемо са описом овог система, треба се подсетити да HPLC

хроматографија омогућава употребу широког опсега растварача: од воде преко водених пуферских раствора, до мешљивих органских растварача као што су метанол и ацетонитрил. Без обзира који се растварач употребљава, сваки растварач који се користи у HPLC хроматографији мора да буде високе спекторскопске чистоће, без икаквих честица или растворених гасова. Ови растварачи морају бити и транспарентни ако се као детектор користи УВ–детектор (не апсорбују у области од 195 nm, кроз целу област УВ спектра). Модерни HPLC апарати опремљени су са једним или више стаклених резеорвара запремине 200 до 1000 ml. Сами резеорвари су опремљени дегасификаторима за уклањање

растворених гасова (кисеоника и азота) из растварача, који стварају мехуриће у мобилној фази, као и филтрима за уклањање прашине и других честица из растварача. У циљу дегасификације растварача резеорвари су опремљени уређајима за загревање и мешање растварача, као и вакуумским пумпама и прскалицама за стварање финих мехурића инертног гаса мале растворљивости (хелијум).

Систем за покретање растварача кроз хроматографски систем (систем пумпи)Основни захтев који мора да испуни систем за покретање растварача је константан и

репродуктиван проток мобилне фазе кроз хроматографски систем. Мора да обезбеде проток елуента кроз хроматографски систем без икаквих осцилација у протоку са брзинама које се крећу од 0,1 до 10 ml/min. Цео систем мора да буде способан за рад при високим притисцима, који су већи од 7000 psi (48,3 Мpa). Пумпе морају да испуне следеће захтеве: 1) материјал од ког се праве пумпе мора да буде хемијски стабилан и инертан у односу на растварач који се користи. Пумпе се обично праве од нерђајућег челика или тефлона. Код клипних пумпи поједини делови као што су клипови и неповратни вентили праве се од сафира и рубина, 2) пумпа мора да буде способна да доставља велике запремине растварача, 3) мора да буде способна да производи притисак од најмање 500 psi, 4) мора да обезбеди да једном подешена брзина протока буде тачна и константна током целог пута мобилне фазе кроз хроматографски систем. Постоје различити типови пумпи али се све деле на две класе: пумпе које достављају мобилну фазу под константним притиском и пумпе са константним протоком мобилне фазе. Највећу примену имају пумпе са константни протоком мобилне фазе.

Клипне пумпе. Предност ових пумпи је то што могу да раде са неограниченим количинама растварача, тако да су посебно корисне када је потребно доста времена за раздвајање и у препаративне сврхе. Недостатак пумпи је пулсирање притиска, што утиче на већину детектора. Пулсирање притиска отежава обезбеђивање репродуктивног протока мобилне фазе када се ради са растварачима различитих врсти. Са променом растварача мењју се и запремине у пумпи услед компресије растварача, и на тај начин се стварају шупљине, тј. на улазном рубу када се притисак ослободи могу се створити мехурићи ваздуха од растворених гасова или растварача са високим напоном паре. Пулсирање притиска се редукује пригушивачима осцилација и/или употребом два клипа уместо једног. Брзина протока која је одређена клипним пумпама може се променити променом ударне запремине током сваког циклуса рада пумпе. Ударна запремина је она запремина која је у једном циклусу рада пумпе потребна да би се створио жељени притисак и обезбедила жељена брзина протока.

Пумпе са константним протоком и константним притиском (шприц пумпе). Ове пумпе су врло просте конструкције. Састоје се од мотора који служи за покретање клипа великог шприца, који затим мобилну фазу приморава да се креће кроз колону константном брзином протока. Ове пумпе се не користе тако често из разлога што је понекад потребно допунити шприц мобилном фазом, а сам њихов дизајн то не омогућава. Оне омогућавају само једноструко пуњење мобилном фазом. Други проблем који је повезан са овим пумпама је то да се већина растварача који се користе у HPLC компресују у одређеном степену. Ово је посебно изражено у чисто органским растварачима који се користе у Normal Phase HPLC, где поједини растварачи редукују своју запремину око 0,015% за сваки бар притиска који се примени. Тако на пример, да бисмо постигли брзину протока од 1cm3min-1, 200 ml мобилне фазе са стопом компресије од 0,01%bar-1, која се

креће под притиском од 100 bar, биће потребно бар 10 минута да се достигне назначена вредност брзине протока. Почетно покретање клипа служи само да се компресује мобилна фаза.

Систем за инјектирање узорка Да би се постигла максимална хроматографска ефективност, узорак који се анализира

мора се унети на почетак колоне као изузетно уска трака. Висок притисак који је повезан са овом врстом хроматографије захтева да се предузму специјалне мере приликом увођења узорка у колону. Углавном сви апарати користе инјекторе са вентилом. Постоји више одлика ових инјектора али сви они имају одређене заједничке особине.

Сви

инјектори су у облику петље која може бити спољашња и унутрашња у односу на вентил. Ова петља контролише количину узорка која се инјектира и задржава узорак пре његовог увођења у колону. Вентил омогућава петљи да буде и изолована од струје елуента који долази са пумпе (тада се петља налази у положају терета–load положај) и да буде смештена у струји елуента (положај инјектирања). Петља је испуњена узорком када се налази у load положају. Вишак узорка одлази кроз одвод за исушивање. Окретањем петље у положај инјектирања омогућава се испирање узорка мобилном фазом и одвођење у колону.

HPLC колонаКолона представља срце хроматографског система. Најважнија особина колоне која

утиче на ефикасност хроматографског раздвајања је сама величина колоне. Уопштено колоне које се праве најчешће од нерђајућег челика, имају дужину од 2,5 до 25 cm, са унутрашњим пречником до неколико милиметара. Оптимална дужина колоне која је

потребна за одређено раздвајање одређена је бројем теоријских подова који су потребни да би се постигла жељена резолуција. Сувише кратка колона неће имати добру моћ раздвајања, а сувише дуга колона непотребно продужава време анализе. Најчешће дужине колона које се користе су 10, 12,5, 15 и 25 cm. Аналитичке HPLC колоне су унутрашњег пречника 4,6 mm. Овај пречник последица је следећег: приликом инјектирања узорка на колону, долази до аксијалног распршивања (вертикално у односу на проток мобилне фазе) узорка. Ако распршивање оде довољно далеко у овом правцу, доћи ће до унутрашњег зида колоне. У овој области чак и најбоље паковане колоне имају неправилности, што може довести до ширења траке и редукције ефикасности. Величина честица паковања колоне креће се од 5–10 μm. Можда је најчешће коришћена колона у аналитици дужине 25 cm, унутрашњег пречника 4,6 mm и величине честица паковања 5 μm. Колоне овог типа имају око 40 000 do 60 000 подова на метру дужине.

Постоје три основна типа паковања за колону и то: потпуно порозно паковање, паковање са пеликуларним (опненим) честицама, паковање са микропорозним честицама. Потпуно порозна паковања праве се од стакла са високим садржајем бора, са величином честица најчешће око 50 μm у пречнику. Ово паковање има велику површину што даје знатно већи капацитет колоне, и самим тим се користи код осетљивих одвајања. Пеликуларне честице састоје се од чврстог језгра са кором дебљине 2–3 μm по њиховој површини. Имају знатно мању површину од потпуно порозног паковања и високо су ефикасне код аналитичких одвајања. Код микропорозног паковања честице су величине око 3 μm па и мање.

Детектори

УВ/Вис детекторЗа УВ апсорпциони детектор сматра се онај који може да детектује супстанцу која

апсорбује светлост у области од 180–350 nm. Велики број супстанци апсорбује у овој области, укључујући оне које имају једну или више двоструких веза и оне које имају слободне електронске парове (олефини, ароматична једињења као и једињења са карбонилном, сулфидном и имидо групом). Из тог разлога овај регион је посебно важан за једињења као што су адитиви хране, пестициди, експлозиви и дроге. УВ детектори користе се уз градијент елуацију, што омогућава да растварачи не апсорбују значајно у опсегу таласних дужина који се користи за детекцију. Растварачи који се најчешће користе су: код Reversed Phase HPLC, вода, метанол, тетрахидрофуран и ацетонитрил (сви су транспарентни за УВ светлост у опсегу таласних дужина који се користи), док код Normal Phase HPLC мора се водити рачуна о избору растварача, пошто већина растварача која би били одговарајућа за елуацију јако апсорбује у УВ области. Обично се као растварачи користе алифатични алкани, дихлорметан и алифатични алкани са додатком малих количина алифатичних алкохола или тетрахидрофурана. УВ детектори могу радити и на фиксној таласној дужини и на вишеструким таласним дужинама. УВ детектори на фиксној таласној дужини функционишу са светлошћу једне одређене таласне дужине која се генерише од стране специфичне лампе са пражњењем (живине лампе, где су живине паре носиоци пражњења и обично емитују светлост таласне дужине 254 nm; кадмијумова лампа која емитује светлост таласне дужине 225 nm и цинкова лампа која емитује светлост таласне дужине 214 nm).

УВ детектори који раде на вишеструким таласним дужинама захтевају извор зрачења који емитује светлост у широком опсегу таласних дужина, а светлост одређене таласне

дужине се селектује помоћу монохроматора у цилљу детекције. Ови детектори имају нешто веће границе детекције на свакој таласној дужини, због потешкоћа да се фокусира зрачење дововољног интензитета на ћелију. Постоје два основна типа ових детектора и то: дисперзиони детектор и детектор са диодним низом (diode array detector–DAD). Као извор светлости користе се деутеријумска и ксенонова лампа.

Велики број једињења није осетљив на УВ зрачење. Из тог разлога користе се две основне методе за побољшање осетивости, а обе захтеавају или реакцију једињења пре уласка у колону или након изласка са колоне. Прва метода захтева хемијско додавање јако апсорбујућих група једињењу које се детектује, а друга метода захтева додатак једињења које флуоресцира једињењу које се детектује. Једном када једињења прођу кроз колону и раздвоје се, она реагују са другим реагенсом у реакционој комори мале запремине пре него што дођу до детектора. На пример да би карбоксилне киселине биле осетљивије на таласну дужину од 254 nm додаје им се p–бромофенилбромид; за алкохоле, феноле, примарне и секундарне амине користи се 3,5–динитробензоил–хлорид итд. Многа једињења или флуоресцирају или могу да реагују са флуоресцентном групом. На пример, алифатични амини не апсорбују добро у УВ области, али могу лако да се детектују реакцијом са флуоресцамином који доводи до њихове флуоресценције. Тиоли се могу дериватизовати са 7–хлоро–4–нитробензо–2–окса–1,3–диазолом; пептиди и аминокиселине могу флуоресцирати реакцијом са аминонафтален–5–сулфонил хлоридом; алдехиди, редукујући шећери и кетони са данзил хидразид–1–диметиламинонафтален–5–сулфонил хидразидом итд.

Флуоресцентни детекторФлуоресцентни детектор је сличан УВ детектору, с том разликом што се

флуоресцентно зрачење мери под правим углом у односу на упадно зрачење. Са изузетком одређених електрохемијских детектора и масеног спектрометра, флуоресцентни детектор показује велику осетљивост на концентрацију узорка. Поред тога мање је осетљив на промене услова средине (температуре и притиска). Велика осетљивост која се постиже делимични је повезана и са малим позадинским зрачењем и малим шумом. Главни његов недостатк је то што мали број једињења флуоресцира у тачно одређеном опсегу таласних дужина. Као извор зрачења користи ксенонову лампу.

Детектор индекса преламања Детектор индекса преламања је захвалан за детекцију свих једињења, али није

осетљив као УВ детектор. Овај детектор може да детектује разлик од око 10 -5 јединица, што значи да 5·10-7 g/ml мора да прође кроз детектор да би се добио одоговарајући одзив. Опште правило је да је осетљивост приближно једнака реципрочној вредности разлика у индексима преламања растварача и узорка.

Електрохемијски детектор Овај детектор може да детектује количине у опсегу од 10-6 до 10-8 mg/l. Било који јон,

као и било које једињење могу се детектовати ако је pKa или pKb веће од 7. Детектор мери промену у отпору раствора са проласком супстанце (која се оксидује или редукује) између две електроде. Овај детектор користи три електроде: радну електроду од стакленог угљеника (електрода на којој се одиграва процес), референтну сребро–среброхлоридну електроду и помоћну (контра–електрода) металну електроду. Електрохемијски се могу

одредити: феноли, парабени, морфин, катехоламини, анилин, ферулна киселина, индоли (у оксидационом облику), као и хинони, азо једињења, ниторзамини, органометалан једињења, ароматична нитро једињења ( у редукционом облику) и многа друга.

Литертура

Braithwaite, A.; Smith, F.J. Chromatographic Methodes, 5 th ed. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, 1999.

Cazes, J. & Scott, R.P.W. Chromatography Theory, Marcel Dekker Inc., New York, USA, 2002.Miller, J.M. Chromatography: Concepts and Contrasts, John Wiley & Sons, INC., 2004.Noctor, T. Instrumentation: pumps, injectors and column design In: Lough, W.J. & Wainer, I.W.

editors. High Performance Liquid Chromatography: Fundamental Principles and Practice. Chapman & Hall, Glasgow, UK, 1996.

Scott, R.P.V. Detectors: Fluorescence Detection. In: Cooke, M.; Poole, C.F. & Wilson, I.D. editors. Encyclopedia of separation science. Elsevier Science & Technology Books, 2000.

Scott, R. P. V., Liquid Chromatography–Column Theory In: Scott, R.P.W. & Simpson, C. editors. Separation Science Series. John Wiley & Sons, INC., 1991.

Scott, R.P.V. Detectors: UV/Visible Detection. In: Cooke, M.; Poole, C.F. & Wilson, I.D. editors. Encyclopedia of separation science. Elsevier Science & Technology Books, 2000.

Snayder, L.R. & Kirkland, J.J. Intorduction to Modern Liquid Chromatography, 2nd ed. John Wiley & Sons, INC., 1997.