1

Gıdalarda Mikrobiyolojik Kalite Kontrolü İMMUNOLOJİK TEKNİKLER-GIDA MİKROBİYOLOJİSİNDE UYGULAMALARI* Yard. Doç. Dr. Şeref Tağı 26.04.2017 *Ş. Tağı’nın izni olmadan bu ders notunun kendi çalışma kopyeniz haricinde kısmen veya tümü hiçbir yolla çoğaltılamaz yayınlanamaz.

Kaynak: http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/45134/title/Antibody-Alternatives/ Amaç: Bu derste immunoloji ve bunun temel özellikleri hakkında genel ve özet bilgiler verilmesi, gıda analizlerinde ve gıda mikrobiyolojisinde antijenik yapıdaki maddelerin ve mikroorganizma ve toksinIerin saptanmasında kullanılması uygun olan immunolojik testlerin açıklanması ve test kitleriyle laboratuvarda uygulama yapılması amaçlanmıştır. Giriş Antijen ile antikor arasındaki özgül reaksiyona dayanan immunolojik yöntemler, biyolojinin birçok dalında uygulama alanı bulmuştur. İmmunolojik yöntemler özellikle tıpta ve veterinerlikte klinik uygulamalarda hastalıkların tanısı amacıyla geniş uygulama alanı bulmasına karşın zirai bilim dallarında, özellikle gıdaların analizlerinde kullanımı göreceli olarak yenidir.

Bağışıklık bilimi olarak bilinen "immunoloji", bağışıklık (immunite) olaylarını inceleyen bir bilim dalıdır. Günümüzde immunoloji enfeksiyon etkenlerine veya toksik maddelere karşı organizmanın kendini dayanıklı kılma mekanizmaları ve konakçıda doku zararlarına yol açan aşırı duyarlılık olaylarını da kapsamaktadır. Bağışıklık veya immun yanıt ise, hayvanlar aleminde konakçı organizmanın kendi kalıtsal yapısına yabancı maddeleri tanıması, karşı koyması ve onları nötralize veya metabolize ederek yanıt verme özelliğini ifade eder. Bağışık yanıt verme mekanizmasının en önemli özelliği, kendine yabancı maddeleri tanıyıp ayırt edebilmesi ve bu maddeleri tekrar tanıyabilmesi yeteneğidir.

2

İnsan ve hayvanlarda bağışıklık sistemi, kendine yabancı maddeye karşı spesifik (özgül), yani sadece o maddeyle reaksiyona giren ve onun1a birleşebilen bir yanıt maddesi meydana getirmektedir. Bu yanıt sayesinde söz konusu yabancı madde etkisiz bırakılmakta ve konakçıdan atılabilmektedir. Bağışık yanıtın ikinci bir özelliği ise bu sistemde bir belleğin oluşmasıdır. Diğer bir deyişle bu sistem ilk defa tanıyıp yanıt verdiği yabancı maddeyle ikinci kez karşılaştığında tekrar tanımakta ve daha kuvvetli bir yanıt verebilmekte ve yabancı maddeyi elemine etmektedir.

İmmün yanıt sonucunda çok özet olarak sonuçları açısından iki temel olay meydana gelir. İlkinde konakçıda yabancı madde yani antijenle uyarılan B lenfositlerinin başkalaşması sonucu meydana gelen plazma hücreleri tarafından antikorlar oluşturulurlar. Bu şekilde oluşan yanıta "humoral" yani sıvısal bağışık yanıt adı verilmektedir. İkincisi ise, T lenfositlerinin başkalaşması ile oluşan ve üzerlerinde spesifik hücre reseptörleri bulunan lenfoblast1arın oluştuğu yanıttır. Bu tip yanıta hücresel bağışık yanıt adı verilmektedir (şekil 1).

Antijen: Antijen terimi genellikle bağışık yanıt verebilecek düzeyde gelişmiş canlılara verildiğinde bağışık yanıt oluşumuna yol açan ve bu yanıt sonucu ortaya çıkan antikor ve duyarlı hücre reseptörleriyle in vitro (hücre dışı) veya in vivo (hücre içi) koşullarda özgül olarak birleşebilme yeteneğindeki maddeler için kullanılmaktadır. İmmun yanıta yol açan ve antikor üretimine yol açan molekül ile antikorun bağlandığı hedef molekülü birbirinden ayırt etmek için immunojen ve antijen terimleri ayrı ayrı kullanılmaktadır. Bir molekülün immunojen olması için bu molekülün kendine özgü kompleks bir yapıya yani immunojeniteye sahip olması gerekir. Ayrıca o maddenin molekül ağırlığı, yapısı, kompleks yapıda olup olmaması ve metabolize olabilirliği, antijenin immun yanıta neden olduğu organizmanın türü, antijenin miktan, veriliş yolu ve süresi, molekülün organizmaya yabancılık derecesi immunojenitesine etkilidir.

3

Şekil 1. Üzerinde farklı determinantlara sahip bir antijenin oluşturduğu hücresel ve sıvısal yanıt (çok genel) ( Ş. Tağı).

Şekil 2. Belirli bir antijene karşı antikor eldesi (http://www.the-

scientist.com/?articles.view/articleNo/45134/title/Antibody-Alternatives/) Doğal immunojenler genellikle 1000 ve normalde 5000'nin üzerinde moleküler ağırlığa sahip makromoleküllerdir. Yalnızca iki grup madde doğal olarak "immunojenik" dir. Bunlar proteinler ve polisakkaritlerdir. Proteinlerin çoğu iyi antijen iken, polisakkaritler zayıf antijenlerdir. Diğer yandan oligosakkaritler, lipidler ve nükleik asitler immun yanıt oluşturmazlar. Fakat taşıyıcı bir proteine örneğin sığır serum albumini (BSA) bağlandıklarında bağışık yanıt oluştururlar ve kendilerine karşı oluşturulan antikorlarla özgül olarak reaksiyona girebilirler. Bu tip vücutta antikor sentezini uyarmayan ancak kendisine karşı meydana gelmiş antikorlarla in vitro koşullarda spesifik olarak birleşme yeteneğinde olan maddelere "hapten" adı verilmektedir. Basit ilaçlardan digitoksin ve mikotoksinlerden aflatoksin haptenlere örnek olarak verilebilir. Yukarıda bahsedilen özellikleri gösteren antijen, bir toksin molekülü veya çözünebilir bir protein olabileceği gibi, virüs, bakteri veya küf hücresi gibi bu antijenik maddeleri bünyesinde toplayan kompleks partikül yapıda bir organizma olabilmektedir. Bir immunojende organizmaya verildiğin immun yanıt oluşturan ve oluşan antikorlarla spesifik olarak birleşebilen ve antikor-antijen reaksiyonlannın özgüllüğünü belirleyen, immunolojik aktif özel bölgeler veya gruplar vardır. Bu gruplar "antijenik determinantlar" veya "epitop" olarak adlandırılır.

Antikor: Antikorlar konakçıda (host) bağışık yanıt sonucunda antijenlere karşı oluşturulan ve bu antijenlerle özgül olarak birleşebilen protein yapısındaki maddelerdir. Antikorlar globüler yapıda olduğu için "immunoglobulinler " olarak da adlandırılırlar ve genellikle "lg" harfleriyle gösterilirler.

Antikorlar kanın serum proteinlerinin gamma (y) globulin fraksiyonunda yer almaktadır. Eğer immun yanıt oluşmuş serum örneği elektroforeze tabii tutulursa immunoglobulin fraksiyonunda dolayısıyla da y-globulin fraksiyonunda bir artış olduğu gözlenecektir (şekil ). İmmunoglobulinler molekül ağırlıklarına ve işlevlerine göre 5 sınıfa ayrılırlar. Bunlar; Immunoglobulin G (IgG), IgM, IgA, IgD, ve IgE'dir. Bunlar arasında bağışıklık yanıt sonucunda en fazla oluşturulan immunoglobulin “IgG”dir.

4

Structural representations of an IgG. The heavy chain is shown in blue, light chain in green and glycosylation in orange. On the left is a ribbon representation showing the secondary structure elements and on the right hand side is a space-filled model of the same molecule. PDB accession number of the mouse IgG1 is 1IGY. Şekil 3. İmmunogobulin G (IgG) nin 3 boyutlu yapısı ve şematik gösterimi (Ş. Tağı ve http://absoluteantibody.com/antibody-resources/antibody-overview/antibody-structure/) Antijenle antikorun birleşmesi, antijendeki spesifik determinantları (epitop) ile antikorun birleşme yanları (paratop) arasında gerçekleşir. Bu birleşmede kovalent bağlar rol almaz. Bunun yerine kovalent olmayan aşağıda gösterilen bağlar rol alır. Şekil 4. Antijen antikor etkileşiminde rol alan bağlar (Ş. Tağı 2003)

Antijenlerin çoğu genellikle çok valanslı yani çok determinanta sahiptir (multivalan

5

özellik). Bir antijen organizmaya verildiğinde her bir determinantıma uygun antikorların oluşumuna neden olur. Bu şekilde oluşan antikor "poliklonal" dır. Yani immunoglobulinler bu determinantların herbirisine karşı farklı miktarlarda oluşur. Diğer yandan "hibridoma" tekniği ile elde edilen " monoklonal" antikorlar bu antijenik determinantlardan yalnızca birisine karşı oluşmuş antikorları içermektedir. Birden fazla determinanta sahip antijenlere karşı hazırlanan poliklonal antikorlar farklı antijenler üzerinde benzer antijenik determinantlar olabileceği için çapraz reaksiyon verebilmektedirler.

Antijenle antikor arasındaki spesifik ve duyarlı reaksiyonlar antijen ve antikorun saptanması ve miktarının belirlenmesi için çok sayıda uygulama için temel oluşturmuştur. Serum kullanılarak yapılan ve bu nedenle "serolojik test" olarak da adlandırılan bu teknikler antijenlerin ve antikorların hücre ortamı dışında (in vitro) belirlenmesinde kullanılmaktadır. Bu teknikler arasında aglütinasyon, immunopresipitasyon testleri, immunodiffuzyon, dipstik assay ve bunlara göre daha duyarlı olan radyoimmunoassay (RIA), fluoresans immunoassay (FIA), enzim immunoassay’ler yaygın olarak kullanılırlar. Aşağıda bu tekniklerden özellikle gıda ve mikrobiyolojik analizler için uygun olanlar hakkında genel bilgiler verilmiştir.

Şekil 5. Antijen antikor etkileşimi (kaynak: http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/45134/title/Antibody-Alternatives/)

Aglütinasyon testi Klasik immunolojik yöntemler antijen-antikor kompleksinin çökelmesine yol açan etkileşim üzerine kuruludur. Bu etkileşime dayalı olarak geliştirilen aglütinasyon testinde partiküler haldeki bakteri, eritrosit gibi antijenlerin hücre yüzeylerindeki antijenik determinantlarm antikorlarla birleşerek ağ oluşturması, kümeleşmesi ve çökelti oluşturması esastır. Ayrıca hücreler arası elektrostatik gücün değişmesi de aglütinasyonda etkilidir. Aglütinasyon testiyle bilinmeyen bir antijen örneğin, bakteri bilinen bir antiserumla saptanabilir veya serumda bulunan antikorlar hastalık teşhisi için bilinen bir antijenle saptanabilir. Aglütinasyon aktif veya pasif olarak uygulanabilir. Aktif aglütinasyonda yukarıda açıklandığı gibi doğrudan antijen veya antikor aglütinasyonda rol alır (şekil 6 A). Pasif aglütinasyonda ise, antijen veya antikor polystren, latex gibi taşıyıcı bir madde üzerine immobilize edilmiştir (şekil 6 B). Bu testlerden örneğin "latex aglütinasyon" testi antikorların latex partikülleri üzerine immobilize edilerek mikroorganizmaların identifikasyonunda veya mikrobiyel-toksinlerin saptanmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Aglütinasyon testleri lam üzerinde, tüpte veya mikro kuyucuklarda yapılabilmektedir. Aglütinasyon testlerinin duyarlılığı bundan sonraki kısımda anlatılan presipitasyon tekniğine göre daha duyarlı olmakla birlikte yarı kantitatif sonuç vermektedir.

6

Şekil 6. A. Aglütinasyon test prensibi (Ş. Tağı 2003), B. Lateks aglütinasyon testi Presipitasyon Bu testin esası aglütinasyona benzemekle birlikte farklı olarak direk antijen yerine protein, hormon, toksin gibi çözünür (suda eriyebilen) antijenler veya antijenin çözünür fraksiyonu kullanılır. Presipitasyon tekniği tüp içinde sıvı ortamda ve katı ortamda uygulanmaktadır. Sıvı ortamda presipitasyon tekniğinde, dar çaplı küçük tüplerde antiserum antijen üzerine farklı oranlarda ilave edilir. Antijen antiserumla reaksiyona girerse iki sıvının temas yüzeyinde presipitasyon halkası oluşur. Farklı oranlarda seyreltilen antikor antijen bulunan çözeltiye ilave edilince optimum antijen antikor konsantrasyonunun bulunduğu tüplerde reaksiyon gözlenir (şekil 7). Katı ortamda presipitasyon testi ise immunodifuzyon testi olarak da bilinir. Testin esası bir jel ortamında antijen ve antikorun birbirine doğru diffüze olması ve birleşmelerine dayanmaktadır (şekil 7).

Şekil 7 . Sıvı ortamda tüpte (kaynak: http://intranet.tdmu.edu.ua) ve katı ortamda agar jel ortamında presipitasyon ( kaynak Ş. Tağı Yüksek lisans tezi 1991, http://www.mikrobiyoloji.org/pdf/702031101.pdf)

7

Yaygın olarak kullanılan çift-immunodifuzyon veya yaygın adıyla "Ouchterlony " yönteminde belirli kalınlıkta dökülmüş yumuşak agara birbirlerinden belirli uzaklıkta ve çaplardaki kuyucuklara antijen ve antiserum konulur ve inkübe edilir. Bu esnada birbirlerine doğru yayılan antijen ve antikorlar optimum konsantrasyonlarında birleştiği bölgede presipite olurlar ve presipitasyonun olduğu bölgede gözle görülür bantlar oluştururlar (şekil 7). Bu yöntemle bilinen antiserumla bilinmeyen antijen veya tam tersi yapılacağı gibi, antiserumun seri dilüsyonlarının merkezdeki antijen kuyucuğu etrafindaki kuyucuklara konulması ile antikorun titresi saptanabilmektedir (titre: Antikorun gücünü gösterir. Burada bant oluşumuna yol açan antikorun en düşük konsantrasyonudur). İşaretlenmiş antikorlarla yapılan immunoassay'ler

Bu yöntemlerde antikor immunolojik özelliklerini kaybetmeden bir işaretleyici molekül ile işaretlenir. Burada kullanılan işaretleyici fluoresans bir boyaysa Fluoresan . immunoassay; bir radyoizotopsa Radyo immunoassay ve bir enzim ise Enzim Immunoassay (EI) tekniği olarak adlandırılmaktadır. Bu tekniklerden immunofluoresans ve enzim immunoassay’lerden bahsedilecektir.

F1uoresans immunoassay (FIA) İmmunofluoresans vaya fluoresans antikor tekniği olarak da bilinen bu tekniğin esası antikorun bir fluoresans özellikteki bir maddeyle işaretlenerek antijen-antikor1a birleşme reaksiyonunun UV mikroskobu altında belirlenmesidir. Bu amaçla en yaygın olarak Fluorescein isotiosyanate (FITC) veya rhodamin B izotiyosiyanat (RITC) kullanılmaktadır. Bu maddeler isotiyosiyanat ara bileşikleriyle antikorun Fc bölgesindeki amino gruplarına bağlanarak antikor boya konjugatı oluşturulur.

Şekil 8. Salça örneğinde bulunan küf hiflerinin IFA tekniği ile boyandıktan sonra adi ışık ve floresan ışıkta görünümleri ( kaynak Ş. Tağı Yüksek lisans tezi 1991, http://www.mikrobiyoloji.org/pdf/702031101.pdf)

Yöntem direkt ve indirekt olmak üzere iki şekilde uygulanır. Direkt yöntemde antijen,

örneğin bakteri içeren örnek bir lam üzerine tespit edilir. Preparat üzerine fluoresan bir boyayla işaretli antikorlar eklenir ve inkübe edilir ve inkübasyonu takiben yıkanır. Preparat

8

UV mikroskop altında incelenir. Eğer antijenle antikor reaksiyona girmişse boyayla işaretli antikorlar antijenle birleşecek ve yıkamayla gitmeyecektir. Eğer işaretleyici boya olarak FITC kullanılmışsa 430 nm UV altında uyarılan fluoresans boya 530 nm dalga boyunda yeşil renkte ışık verecek ve bakteriler koyu renkli bir zeminde spesifik olarak görülebilecektir. İşaretleyici boya olarak Rhodamin kullanılması durumunda ise bu dalga boyları 550 ve 580 olacaktır Direkt yönteme göre daha hassas olan indirekt fluoresan antikor tekniğinde ise hazırlanan preparat üzerine ilk başta işaretlenmemiş birincil antikorlar konur ve inkübe edilir (şekil 8). Yıkamayı takiben birincil antikora karşı hazırlanmış ve işaretlenmiş antikorlar ilave edilir ve bunu inkübasyon-yıkama işlemleri takip eder. Eğer antijen antikor reaksiyonu varsa birincil antikorlar antijene bağlanacak ve sonradan ilave edilen ikincil işaretli antikorlar da işaretsiz antikorlara bağlanacaktır. UV altında yukarıda açıklandığı gibi antijen varlığı belirlenecektir. Enzim İmmunoassay (ElA)

Enzim immunoassay'de antikor fluoresan boya yerine bir enzim ile işaretlenir ve enzim aktivitesinin renk reaksiyonuna göre ölçülmesi sonucu antijen antikor reaksiyonu saptanır. EIA lerden en yaygın kullanılan şekli ([Enzyme Linked Immunosorbent Assay'ı) (ELISA)'dır. ELISA tekniği ile antijen aranmasında kullanılan direkt yöntem "sandwich" ya da "çift antikor" yöntemi olarak da bilinmektedir (şekil 9). Bu yöntemde aranılan antijene karşı antikor katı bir taşıyıcı yüzeye absorbsiyonla veya kovalent olarak bağlanır. Daha sonra, antijen saptanacak örnek ilave edilir ve inkübe edilir. İnkübasyon sonunda yıkamayı takiben enzimle işaretli antikorlar (IgG) ilave edilir ve tekrar inkübasyon ve yıkama işlemleri yapılır. Daha sonra enzimin substratı ilave edilir ve oluşan renk yoğunluğu spektrofotometrik olarak ölçülür. ELISA için en yaygın kullanılan katı taşıyıcı destek ortamı veya matriks olarak polystryene ve polyvinyl chloride'den yapılan plastik tüpler ya da daha yaygın olarak kullanılan 96 kuyucuklu mikrotiter plate'lerdir.

Şekil 9. Antijen saptanmasında sandwich ELISA yönteminin uygulanışı (Ş. Tağı 2003) Aynca katı faz olarak polycarbonate kürecikler, manyetik kürecikler de kullanılmaktadır ELISA

Antikorun katı yüzeye absorpsiyonla veya kovalent imobilizasyonu

Antijen içeren örneğin ilavesi ve inkübasyonu

Enzimle işaretli ikincil antikorun ilave edilmesi ve inkübasyonu

Enzim sustratının ilavesi, inkübasyon ve renk yoğunluğunun ölçülmesi

9

testinde her inkübasyon aşamasını takiben antikorlar tarafından spesifik olarak bağlanmayan analitler yıkama işlemi ile ayrılmaktadır. Matriks olarak küreciklerin kullanıldığı durumda ise bağlanmayan analitler santrifugasyon veya manyetik alan kullanılarak yapılmaktadır. Işaretlemede en fazla kullanılan enzimler ise alkalen fosfataz (substarı: p-nitrofenilphosphate), Peroxidase (substrat.ethylbenzidine/HrOı, phenylenediaminel Rı02), f3-galactosidase (substrat: nitrophenYl-f3-D-galactopyranoside)dır. Ayrıca işaretlemede kullanılan enzimlerin floresans veya kemiluminesans özellikdeki substratları da kullanılabilmekte ve oluşan reaksiyon ürünleri florometrik veya kemuluminometrik olarak ölçülebilmektedir.

Şekil 10. Çok kuyucuklu ELISA plakası ve okuyucu cihazı

ELISA formatının bir benzeri olan "dipstick assays" ya da test şeriti de kullanılan bir formattır. Burada antikorlar genellikle nitrosellulose ve p-divinyldifluorene gibi materyallerden yapılan. membran biçimindeki yüzeylere adsorpsiyonla bağlanarak kullanılmaktadır.

İMMUNOAFİNİTE KOLON + HPLC YÖNTEMİYLE MiKOTOKSİN TEŞHİS VE MİKTAR TAYİNİ İmmunoafinite kolon, saptanacak mikotoksine karşı spesifik (özgül) olan antikorları içerir (şekil 11). Bu antikorlar kolon dolgu veya destek materyaline bağlanmıştır. Test örneğinden elde edilen ekstrakt kolondan geçirildiğinde aranılan mikotoksin kolondaki antikorlara özgül olarak bağlanır ve böylece mikotoksin ekstraktdan ayrılmış olur. Örnek ekstraktı kolondan geçirildikten sonra antikorlara bağlanmayan ve kolon içinde bulunan diğer molekülleri uzaklaştırmak için uygun bir çözelti geçirilerek kolon yıkanır. Son aşamada ise antikor ile mikotoksin arasındaki bağ, uygun bir solvent (genelikle orta polaritede) geçirilerek kırılır ve mikotoksin kolondan serbest kalır (elue edilir). Bu şekilde mikotoksin çok saf ve temizlenmis olur ve miktarının tayin edilmesi amacıyla HPLC’e verilebilir.

10

Şekil 11. İmünoaffinite kolonunun çalışma prensibi (Ş. Tağı, 2003) LABORATUVAR UYGULAMASI Uygulamada aşağıdaki kitler ve mikroorganizmalar kullanılacaktır Kitler: Salmonella Latex Test Kiti (Oxoid), E. coli O157 Latex Test Kiti (Oxoid). Dryspot Staphytect Plus Test Kiti (oxoid) Mikroorganizmalar 18-20 saatlik stok kültürler. Tryptic Soy Broth (TSB)’de ve Tryptic Soy Agar (TSA)’da geliştirildi. Salmonella Enteritidis, E. coli O157:H7, Staphylococcus aureus