“impacto de la fibrosis en la fisiologÍa muscular
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE Facultad de Ciencias Biológicas
Departamento de Biología Celular y Molecular Laboratorio de Diferenciación Celular y Patología
“IMPACTO DE LA FIBROSIS EN LA FISIOLOGÍA MUSCULAR ESQUELÉTICA: PAPEL DEL
ANDROGRAFÓLIDO”
DANIEL ALEJANDRO CABRERA GARCÍA
Memoria de investigación entregada a la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile en cumplimiento de los requisitos para optar
al grado de Doctor en Ciencias Biológicas mención Biología Celular y Molecular
Director de Memoria: Dr. Enrique Brandan 2012
INDICE
INDICE DE FIGURAS ........................................................................................................ 5
INDICE DE TABLAS .......................................................................................................... 8
ABREVIATURAS ................................................................................................................ 9
RESUMEN .......................................................................................................................... 11
ABSTRACT ........................................................................................................................ 14
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 17
Distrofia muscular de Duchenne ....................................................................................... 18
El ratón mdx: modelo de la DMD ..................................................................................... 20
Daño y reparación muscular ............................................................................................. 21
Terapias para tratar las distofias musculares .................................................................... 24
Relación entre factores pro-fibrosantes y pro-inflamatorios en la DMD. ........................ 26
HIPÓTESIS ......................................................................................................................... 35
OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................... 35
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 35
1. Determinar el efecto del andrografólido sobre la expresión y los efectos de TGF−β y CTGF en el músculo esquelético. ................................................................................. 35
1.1. Evaluar el efecto del andrografólido sobre la expresión de CTGF y TGF−β en músculos distróficos. ................................................................................................. 35
1.2. Determinar el efecto del andrografólido sobre los niveles de MEC e inflamación en músculos distróficos. ............................................................................................ 35
1.3. Estudiar el efecto del andrografólido en la inflamación y fibrosis muscular inducida por TGF−β. ................................................................................................. 35
1.4. Evaluar el efecto del andrografólido en la inflamación y fibrosis muscular inducida por CTGF. ................................................................................................... 35
2. Determinar si la modulación de la fibrosis por el andrografólido afecta la migración celular, la eficiencia de las terapias celulares y la función muscular. ........................... 36
2.1. Estudiar si la disminución de la fibrosis por el andrografólido facilita la migración celular en el músculo esquelético. ............................................................ 36
2.2. Determinar si la disminución de la fibrosis por el andrografólido aumenta el número de fibras capaces de revertir distrofina ......................................................... 36
2.3. Evaluar el efecto del andrografólido en la fuerza muscular ............................... 36
MATERIALES Y METODOLOGÍA ............................................................................... 35
1. Materiales .................................................................................................................. 37
1.1 Material Biológico .............................................................................................. 37
1.1.1 Cepas de Bacterias ...................................................................................... 37
1.1.2 Vectores y plasmidios. ................................................................................ 37
1.1.3 Líneas Celulares Eucarióticas ..................................................................... 38
1.1.4 Animales de Experimentación .................................................................... 39
1.2 Anticuerpos ........................................................................................................ 39
1.3 Partidores para RT-PCR en tiempo real ............................................................. 41
1.4 Material Anestésico y Quirúrgico ...................................................................... 42
1.5 Material de Cultivo Celular ................................................................................ 42
2.1 Reactivos Generales ........................................................................................... 44
2.2 Reactivos para Histología e Inmunofluorescencia ............................................. 44
2.3 Reactivos de Biología Molecular ....................................................................... 45
2.4 Marcadores de Masa Molecular ......................................................................... 45
2.5 Enzimas Comerciales ......................................................................................... 46
2.6 Sistemas Comerciales ......................................................................................... 46
2.7 Medios de Cultivo Celular ................................................................................. 47
3. Metodología ............................................................................................................... 48
3.1 Cultivo Celular ................................................................................................... 48
3.1.1. Mantención de Líneas Celulares ................................................................. 48
3.1.2. Diferenciación de células C2C12 ................................................................ 48
3.1.3 Transfección Transiente en Células Eucariontes ........................................ 49
3.2. Ensayos enzimáticos .......................................................................................... 50
3.2.1. Ensayo de luciferasa ................................................................................... 50
3.2.2.. β-galactosidasa ............................................................................................ 50
3.3. Ensayo de Northern ............................................................................................ 51
3.3.1. Electroforesis de RNA en geles de agarosa y transferencia a membranas de Nytran 51
3.3.2. Marcación radioactiva de la sonda de DNA ............................................... 52
3.3.3. Hibridación y lavados ................................................................................. 52
3.4 Amplificación y Purificación de Adenovirus Recombinantes ........................... 53
3.5. Preparación de Lisados Celulares ...................................................................... 54
3.6. Genotipificación Ratones mdx ........................................................................... 54
3.7. Infección de Animales con Adenovirus Recombinantes .................................... 55
3.8. Inyección intramuscular de TGF−β ................................................................... 55
3.9. Tratamiento con andrografólido y PARACTIN. ................................................ 56
3.10. Inyección intramuscular de fibroblastos. ........................................................ 56
3.11. Inducción de fibrosis por ejercicio en ratones mdx .............................................. 57
3.12. Trasplante intramuscular de miobloastos ....................................................... 58
3.13. Cirugía y Toma de Muestras .......................................................................... 62
3.14. Obtención de Homogenizado Total de Músculo ............................................ 62
3.15. Determinación de Proteínas en Lisados Celulares y en Homogenizados de Músculo. ........................................................................................................................ 63
3.16. Hibridación tipo Western Blot ........................................................................ 63
3.17. Extracción de RNA en músculo esquelético y síntesis de cDNA .................. 64
3.18. RT-PCR en tiempo real .................................................................................. 65
3.19. Ensayos de electrofisiología ........................................................................... 66
3.20. Ensayos de Inmunofluorescencia ................................................................... 67
3.21. Ensayos de Inmunohistoquímica .................................................................... 68
3.22. Tinciones histológicas .................................................................................... 68
3.22.1. Tinción de Hematoxilina y Eosina .......................................................... 68
3.22.2. Tinción de Rojo de Picrosirio .................................................................. 69
3.23. Análisis Estadístico ......................................................................................... 69
RESULTADOS ................................................................................................................... 70
1.-Determinar el efecto del andrografólido sobre la expresión y los efectos de TGF−β y CTGF en el músculo esquelético. ..................................................................................... 70
1.1. Evaluar el efecto del andrografólido sobre la expresión de CTGF y TGF−β en músculos distróficos. ..................................................................................................... 70
1.2. Determinar el efecto del andrografólido sobre los niveles de MEC e inflamación en músculos distróficos. ................................................................................................ 79
1.3. Estudiar el efecto del andrografólido en la inflamación y fibrosis muscular inducida por TGF−β. ..................................................................................................... 86
2.- Determinar si la modulación de la fibrosis por el andrografólido afecta la migración celular, la eficiencia de las terapias celulares y la función muscular. ............................. 104
2.1. Evaluar si la disminución de la fibrosis por el andrografólido facilita la migración celular en el músculo esquelético. ............................................................................... 105
2.2. Determinar si la disminución de la fibrosis por el andrografólido aumenta el número de fibras capaces de revertir distrofina .......................................................... 106
2.3. Evaluar el efecto del andrografólido en la fuerza muscular ................................. 109
DISCUSIÓN ...................................................................................................................... 115
Expresión de TGF−β y CTGF en músculos distróficos: papel del andrografólido ........ 117
TGF−β y CTGF como pro-inflamatorios ....................................................................... 120
Inflamación en el músculo distrófico: Papel del andrografólido sobre las células inflamatorias ................................................................................................................... 123
Otros agentes reguladores de la inflamación y la fibrosis en músculos distróficos ....... 127
Impacto de la fibrosis en la migración celular ................................................................ 129
Impacto de la fibrosis en la eficiencia de las terapias celulares ...................................... 132
Impacto de la fibrosis en la fuerza muscular .................................................................. 133
CONCLUSIONES ............................................................................................................ 136
REFERENCIAS ............................................................................................................... 138
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. El ejercicio acelera la progresión del fenotipo fibrótico en el musculo esquelético de animales distróficos mdx
Figura 2. El ejercicio acelera la progresión del fenotipo fibrótico en el musculo esquelético de animales distróficos mdx.
Figura 3. El ejercicio acelera la progresión del fenotipo fibrótico en el musculo esquelético de animales distróficos mdx.
Figura 4. El ejercicio induce un aumento en la expresión de TGF−β en músculos distróficos.
Figura 5. El ejercicio induce un aumento en el numero núcleos positivos para la proteína smad 3 fosforilada en ratones mdx.
Figura 6. El ejercicio induce un aumento en la expresión de CTGF en músculos distróficos.
Figura 7. El andrografólido no afecta la inducción de TGF−β en ratones mdx ejercitados.
Figura 8. El andrografólido inhibe la inducción de CTGF en músculo de ratones mdx ejercitados.
Figura 9. El Andrografolido inhibe el aumento en el número de núcleos positivos para smad-3 fosforilada en ratones mdx ejercitados.
Figura 10. El Andrografolido inhibe el aumento en el número de núcleos positivos para smad-3 fosforilada en ratones mdx ejercitados.
Figura 11. El andrografólido disminuye el numero de macrófagos en el músculo distrófico de ratones mdx
Figura 12. El andrografólido disminuye el numero de células inflamatorias en el músculo distrófico de ratones mdx
Figura 13. El andrografólido inhibe la inducción de fibrosis en músculos distróficos.
Figura 14. El andrografólido inhibe la inducción de colágeno tipo III en músculos ditsróficos.
Figura 15. El andrografólido inhibe la inducción de MEC en músculo de ratones mdx.
Figura 16. El andrografólido inhibe la inducción de CTGF por TGF−β.
Figura 17. El andrografólido inhibe la inducción de proteínas de MEC por TGF−β en células musculares.
Figura 18. El andrografólido inhibe la insucción de colágeno tipo III por TGF−β.
Figura 19. El andrografólido inhibe la inducción de colágeno tipo III por TGF−β.
Figura 20. El andrografólido inhibe la inducción de proteína de MEC por TGF−β en miotubos y fibroblastos.
Figura 21. El andrografólido inhibe la inflamación inducida por TGF−β en el músculo esquelético
Figura 22. El andrografólido no afecta la fosforilación de smad-3 inducida por TGF−β en células musculares.
Figura 23. El andrografólido no afecta la translocación nuclear de smad-3 inducida por TGF−β en células musculares.
Figura 24. TGF−β es capaz de activar la ruta de activación canónica de NFkB en células musculares C2C12.
Figura 25. TGF−β induce la actividad de un reportero para NFkB en células musculares C2C12.
Figura 26. El andrografólido inhibe la formación de fibras de estrés inducida por CTGF en células musculares.
Figura 27. El andrografólido inhibe el aumento de colágeno tipo III inducido por CTGF en el músculo esquelético.
Figura 28. CTGF induce fibrosis e inflamación en el musculo esquelético y el andrografólido es capaz de inhibir estos efectos.
Figura 29. CTGF induce un aumento en la infiltración de macrofágos en el musculo esquelético y el andrografólido inhibe este efecto.
Figura 30. El andrografólido disminuye principalmente el número de Macrófagos M1 inducidos por CTGF en el músculo esquelético.
Figura 31. La fibrosis inhibe la migración celular y el andrografólido revierte este efecto.
Figura 32. Las células migratorias se encuentran preferentemente en aéreas con bajo contenido de Colágeno tipo III.
Figura 33. El tratamiento previo con andrografólido aumenta la eficiencia de la terapia celular.
Figura 34. El andrografólido induce un aumento en la fuerza en músculos distróficos.
Figura 35. El andrografólido induce un aumento en la fuerza en músculos distrófico.
Figura 36. El andrografólido mejora el performance de los animales distróficos frente al ejercicio.
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Lista de anticuerpos y las aplicaciones en que fueron utilizados……………...…40
Tabla 2. Lista de partidores utilizados para la expresión de genes a través de RT-PCR en
tiempo real…………………………………………………………………………….……41
ABREVIATURAS
AraC Citosina β-D-arabinofuranósido
BCA Acido bicinconínico
BCIP/NBT 5-bromo-4-cloro-3-indolil-1-fosfato/azul nitro tetrazolium
cDNA DNA complementario
CTGF Factor de crecimiento de tejido conectivo
dCTP Desoxicitosíntrifosfato
DEPC Di-etilpirocarbonato
DMEM Medio Eagle modificado por Dulbecco
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Acido desoxirribonucleico
dTs Desoxitimidinas
MEC Matriz extracelular
NFκB Factor nuclear kappa B
EDTA Acido etilén-diamino tetra-acético
FAK Quinasa de adhesión focal
FITC Tetrametil-fluoresceina isotiocianato cristalina
kb Kilobase
kDa Kilo Daltones
Luc Luciferasa
MAP Quinasa activada por mitógenos
mRNA Ácido ribonucleico mensajero
PMSF Fenil metil sulfonil metilo
RNA Ácido ribonucleico
RT-PCR Transcripción reversa y reacción en cadena de polimerasa
SDS Dodecil sulfato de sodio
SFB Suero fetal bovino
TA Músculo tibialis anterior
TCA Acido tri-cloracético
TGF-β Factor de crecimiento transformante tipo β
TNF-α Factor de necrosis tumoral tipo a
TRITC Tetrametil-rodamina isotiocianato cristalina
UV Ultravioleta
RESUMEN
La fibrosis se caracteriza por una acumulación excesiva de componentes de la
matriz extracelular (MEC) y es el resultado De una cascada de eventos posteriores a una
lesión y que resulta en la formación de cicatrices permanentes. En el músculo esquelético la
fibrosis está mayormente asociada a las distrofias musculares. La más severa de estas, es la
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), patología genética recesiva ligada al cromosoma
X, caracterizada por la ausencia de la proteína distrofina. El modelo murino de la DMD es
el ratón mdx. En la actualidad no existe un tratamiento efectivo para la DMD. Se han
estudiado diversas estrategias para intentar re-expresar la proteína distrofina en el musculo
de los pacientes y del ratón mdx, mediante la utilización de vectores virales como también
mediante terapias celulares utilizando diferentes tipos celulares con potencial miogénico,
sin embargo, todas ellas han mostrado una baja efectividad debido a la escasa o nula
incorporación de los vectores en el tejido muscular. El grupo de Giulio Cossu, demostró
que células con potencial miogénico pero que sobre-expresan la enzima MMP-9 han
mostrado una efectividad significativamente mayor. Este resultado puso de manifiesto que
la fibrosis presente en los músculos distróficos dificulta la incorporación celular en el
tejido. Dentro de los factores involucrados en la inducción de fibrosis en los músculos
distróficos encontramos el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor
de transcripción NFκB. Un elemento común es el factor de crecimiento de tejido conectivo
(CTGF), el cual es inducido por TGF−β y además presenta en su promotor sitios de unión
para NFκB. Se ha demostrado que CTGF es capaz de mediar la acción pro-fibrosante de
TGF−β. Sin embargo, los mecanismos por los cuales NFκB y TGF−β colaboran en la
regulación de la expresión de CTGF no han sido dilucidados. Un potente inhibidor de la
actividad de NFκB es el anti-inflamatorio de origen natural, andrografólido, el cual ha sido
utilizado para combatir la esclerosis múltiple y la artritis reumatoide, sin presentar efectos
secundarios nocivos.
En esta tesis nos planteamos como hipótesis que: “El andrografólido inhibe la
fibrosis, la cual afecta la fisiología muscular en un mecanismo que involucra a CTGF
y TGF−β“. Cuyos objetivos generales fueron: Determinar el efecto del andrografólido
sobre la expresión y los efectos de TGF−β y CTGF en el músculo esquelético y evaluar
si la modulación de la fibrosis por el andrografólido afecta la migración celular, la
eficiencia de las terapias celulares y la función muscular.
Mediante el modelo de inducción de fibrosis por ejercicio en ratones mdx,
estudiamos la regulación de la expresión de las citoquinas CTGF y TGF−β, observando que
el andrografólido es capaz de inhibir la expresión de CTGF, sin afectar la de TGF−β
Dentro de este contexto, demostramos que tanto TGF−β y CTGF tienen actividad pro-
inflamatoria en el músculo esquelético y que TGF−β puede activar a NFκB en células
musculares. Mediante ensayos in vivo, mostramos que la fibrosis disminuye
considerablemente la migración celular y que estos efectos pueden ser revertidos mediante
la utilización del andrografólido. Del mismo modo, demostramos que el tratamiento previo
con andrografólido, de músculos distróficos aumenta en un 300% el número de fibras
musculares capaces de re-expresar distrofina en respuesta a protocolos de terapia celular y
que la inhibición de la fibrosis, por si sola provoca efectos benéficos en la fisiología
muscular desde el punto de vista de la generación de fuerza contráctil y de la resistencia de
animales distróficos a protocolos de ejercitación extenuante.
ABSTRACT
Fibrosis is characterized by an excessive accumulation of extracellular matrix components
(ECM), as a result of a cascade of events after a lesion, which end-up in the formation of a
permanent scar. In the skeletal muscle, the fibrosis is generally associated to muscular
dystrophies. The most severe of these diseases is the Duchenne Muscular Dystrophy
(DMD), a genetic pathology linked to the X chromosome, characterized by absence of
dystrophin. The murine model of DMD is the mdx mice. At this moment does not exist an
effective treatment for DMD. Diverse strategies have been studied attempting to re-express
dystrophin in both patient´s and mdx mice muscles, using viral vectors as well as cellular
therapies with cell types with miogenic potential. However, all of them have shown a
reduced efficiency due to the few or nule incorporation of vectors in the muscular tissue.
Giulio Cossu and co-workers, demonstrated that cells with miogenic potential
overexpressing the enzyme MMP-9 are significantly more effective. These findings
unveiled that fibrosis in the dystrophic muscles difficult cellular incorporation at the tissue.
From the factors involved in the induction of fibrosis at the dystrophic muscles, we found
the transforming growth factor type β (TGF-β) and the transcription factor NFκB. A
common element is the connective tissue growth factor (CTGF), which is induced by
TGF−β and also have NFκB binding sites at its promoter. It has been demonstrated that
CTGF mediates the pro-fibrotic effects of TGF−β. However, the mechanism by which
NFκB and TGF−β collaborates in the regulation of the CTGF expression have not been yet
elucidated. A potent inhibitor of the NFκB activity is the natural derived anti-inflammatory,
andrographolide, which has been used to treat multiple sclerosis and rheumatoid arthritis,
without side effects.
In this Thesis we propose the following hypothesis: “The andrographolide
inhibits the fibrosis, which affects the muscle physiology in a mechanism that involves
CTGF and TGF-β”. The goal of this thesis work was: To determine the effect of
andrographolide over TGF-β and CTGF in the skeletal muscle. And also evaluate if
the modulation of fibrosis by andrographolide affects cellular migration, efficiency of
cell based therapies and muscle function.
By using the exercise-induced model of fibrosis in mdx mice, we studied the
regulation CTGF and TGF−β expression, observing that andrographolide is able to inhibit
CTGF expression, without affecting the TGF−β expression. On this context, we
demonstrated that TGF−β, as well as CTGF, have pro-inflammatory activity in the skeletal
muscle and TGF−β can activate NFκB in muscle cells. In in vivo assays, we show that
fibrosis significantly decreases the cell migration, effect that can be reverted by
andrographolide treatment. Moreover, we demonstrated that prophylactic treatment of
dystrophic muscles with andrographolide, increases in 300% the number of muscular fibers
able to re-express dystrophin in response to cell based therapies. Besides, the inhibition of
fibrosis by andrographolide per se, has benefic effects in the muscle physiology increasing
contractile force and performance of mdx mice in exercise protocols.
INTRODUCCIÓN
La fibrosis fisiopatológica, se caracteriza esencialmente por una acumulación
excesiva de componentes de la matriz extracelular (MEC), particularmente colágeno, y es
el resultado final de una cascada de eventos posteriores a una lesión de los tejidos y que
resulta en la formación de cicatrices permanentes.
La fibrosis puede afectar la función de los tejidos y causar enfermedades crónicas en
una gran variedad de órganos y tejidos vitales como el renal, hepático, pulmonar, muscular,
etc. Pero, a pesar de la amplia gama de tejidos susceptibles a la fibrosis, toda las reacciones
fibróticas comparten mecanismos celulares y moleculares comunes, tales como la
degeneración celular del tejido, la infiltración de células inflamatorias, la persistencia de la
inflamación en los tejidos y la proliferación de células tipo fibroblastos (Serrano y cols.,
2011). La interacción y el desequilibrio de diferentes tipos de células sustenta la producción
de numerosos factores de crecimiento, enzimas proteolíticas, factores angiogénicos y
citoquinas fibrogénicas, que en conjunto perturban el microambiente del tejido dañado y
estimulan la deposición de elementos del tejido conectivo que progresivamente van
remodelando, destruyendo y sustituyendo a la arquitectura normal del tejido. Sin embargo,
a pesar de muchos elementos en común, también hay diferencias importantes entre los
distintos sistemas y es así como la identidad de algunos de los factores celulares que inician
y contribuyen a las vías fibrogénicas aún se desconocen. Por lo tanto, mejorar nuestra
comprensión de los factores y mecanismos involucrados en este proceso es crucial para el
desarrollo de estrategias de tratamiento para estas enfermedades.
Distrofia muscular de Duchenne
En el músculo esquelético la fibrosis está mayormente asociada con un grupo
clínico y molecularmente heterogéneo de enfermedades, conocidas como distrofias
musculares. Fenotípicamente, estas enfermedades se caracterizan por la inflamación y el
debilitamiento del tejido muscular, el cual compromete la movilidad de los pacientes
pudiendo dejarlos confinados de por vida a la utilización de una silla de ruedas (Amato and
Griggs, 2011; Durbeej and Campbell, 2002). La más severa de las distrofias musculares, es
la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). Es una patología genética recesiva ligada al
cromosoma X, en la cual la ausencia de la proteína distrofina se debe a una mutación en el
gen que la codifica (Ervasti y Campbell, 1993).
La DMD tiene una incidencia de 1/3500 niños varones nacidos (Emery, 2002)
provoca degeneración muscular progresiva que conduce a la muerte alrededor de la
segunda o tercera década de vida (Blake y cols., 2002). Los niños comienzan con debilidad
muscular proximal lo cual les dificulta pararse, luego deambular y, alrededor de los 12
años, deben utilizar silla de ruedas. Dado la debilidad de las masas musculares de la espalda
también desarrollan escoliosis, la cual, unida a atrofia en los músculos respiratorios provoca
complicaciones respiratorias, siendo las neumonías causa frecuente de muerte. El
compromiso cardíaco es frecuente, el 25% de los pacientes presentan evidencia de
cardiomiopatías preclínicas antes de cumplir 6 años. Hacia la tercera década de vida cerca
de un 100% de los pacientes presenta algún tipo de cardiopatía (McNally, 2007).
Molecularmente la DMD se caracteriza por mutaciones en el gen que codifica la
proteína distrofina, produciendo una disminución severa o ausencia de ésta. El gen, de
alrededor de 2500 Mb está compuesto de 86 exones y localizado en Xp21(Muntoni y cols.,
2003). Distrofina es una proteína de 427 kDa que, en su forma completa (también existen
isoformas más cortas) se expresa principalmente en el músculo esquelético, cardíaco y en el
cerebro. La expresión de la proteína completa, está comandada por tres promotores que
determinan la presencia de distrofina en los tejidos antes mencionados. También existen
promotores internos que comandan la expresión de isoformas truncadas de la proteína
principalmente en sistema nervioso central además de la isoforma más pequeña, Dp71, que
se expresa en la mayoría de los tejidos. En el músculo se localiza bajo el sarcolema
(membrana plasmática de la fibra muscular) y se ancla al citoesqueleto de actina y a un
conjunto de glicoproteínas de transmembrana (complejo de glicoproteínas asociadas a
distrofina o DGAC) a través de ß-distroglicán (Blake y cols., 2002). A su vez, este conjunto
de proteínas se unen a proteínas de la MEC, y en este sentido distrofina actuaría como un
puente que ancla el citoesqueleto de la fibra muscular al espacio extracelular dándole
estabilidad a la fibra durante los ciclos de contracción y relajación muscular. De hecho, en
ausencia de distrofina existe una disrupción de la membrana celular evidenciable por la
entrada y salida de moléculas de alto peso molecular. Sin embargo, esta función de
andamiaje no parece ser la única de la proteína ya que podría jugar un papel en señalización
intracelular a través de su asociación al complejo DGAC (Batchelor and Winder, 2006).
Histológicamente, la biopsia de tejido muscular de pacientes con DMD muestra
degeneración, regeneración, fibras hipertróficas aisladas y un reemplazo significativo del
tejido muscular por grasa y tejido conectivo. Incluso en las primeras biopsias realizadas por
Duchenne y reportadas en 1868 se describe que “La hiperplasia del tejido conectivo
intersticial, con producción de más o menos tejido fibroso, es la lesión anatómica
fundamental de los músculos en la parálisis pseudohipertrófica”(Tyler, 2003). Estudios
posteriores han identificado a las moléculas de MEC que aumentadas están en los músculos
distróficos de ratones y humanos. Colágeno I y III, y fibronectina están aumentados en los
espacios endomisiales y perimisiales (Morrison y cols., 2000).
El ratón mdx: modelo de la DMD
Existen varios modelos animales para la DMD como el perro, GRMD (golden
retriever muscular dystrophy), el gato, HFMD (hypertrophic feline muscular dystrophy), y
el ratón, mdx (x-linked muscular dystrophy). Los tres modelos no expresan distrofina, pero
es el perro el modelo que más asemeja la patología en el humano (Blake y cols., 2002).
El ratón mdx fue descubierto por un grupo de investigadores que buscaban mutantes
de actividad enzimática glicolítica en ratones, quienes observaron que una de sus cepas
presentaba en el plasma, niveles elevados de piruvato quinasa y creatina quinasa (Bulfield y
cols., 1984). Los autores describieron el hallazgo de un modelo animal que presenta
cambios distróficos en los músculos que son dependientes de la edad del ratón y ligados al
cromosoma X tal como lo son la DMD y DMB (distrofia muscular de Becker). Dada la
facilidad para trabajar con el ratón, éste se ha convertido en el modelo in vivo más utilizado
para estudiar la patología. La progresión de la enfermedad en este modelo sigue un curso
temporal bien delimitado, existe un período de necrosis alcanzando un máximo entre las 3-
4 semanas y una respuesta regenerativa importante que se evidencia por la presencia de
núcleos centrales en las fibras (Blake y cols., 2002). Si bien el ratón mdx tampoco expresa
distrofina, el grado de distrofia en los músculos de las extremidades es mucho menor en
comparación con el niño. Sin embargo el diafragma del ratón mdx ha sido descrito como el
músculo que presenta mayor degeneración y más se asemeja al músculo distrófico de la
DMD (Stedman y cols., 1991). Este también sufre reemplazo del parénquima muscular por
tejido fibrótico y se ha observado un aumento en la cantidad del factores pro-fibrosantes
(Andreetta y cols., 2006). Dentro de este contexto, se ha demostrado que el ejercicio es
capaz de inducir daño muscular en este modelo, evaluado a través de la actividad creatina
quinasa presente en el plasma de estos ratones (De luca A. y cols., 2005). Estos
antecedentes, sugieren que el excesivo daño observado en el músculo diafragma se debe
principalmente a la actividad física a la cual está sometido.
Daño y reparación muscular
El músculo esquelético tiene una gran capacidad regenerativa y ésta depende de una
población de células que se encuentran bajo la lámina basal de las fibras musculares y que
están normalmente mitóticamente inactivas, las células satélite. En respuesta a estímulos
como estrés inducido por traumas, las células satélite se activan, expresan marcadores de
células musculares y comienzan a proliferar, luego se diferencian y forman nuevas fibras o
se fusionan con fibras pre-existentes (Chen and Goldhamer, 2003; Hawke and Garry, 2001;
Seale and Rudnicki, 2000).
En la reparación normal del músculo después de una lesión aguda, como en
animales de experimentación o en humanos luego de lesiones deportivas o accidentes, las
fibras dañadas o muertas son removidas por células inflamatorias como los macrófagos,
para luego ser reparadas o reemplazadas por células satélites residentes del tejido muscular
(Mauro, 1961). Sin embargo, en enfermedades humanas crónicas como la DMD, las fibras
musculares recién generadas son también susceptibles a la degeneración, ya que conservan
el defecto molecular, lo que conlleva a constantes ciclos de degeneración de las fibras
musculares estableciendo un proceso inflamatorio crónico (Porter y cols., 2002a). En la
DMD, la población celular de células satélite va disminuyendo a medida que progresa la
enfermedad, resultando en un reemplazo progresivo del tejido muscular por tejido adiposo
y fibrótico. Sin embargo, los eventos celulares y moleculares que ligan al fenómeno de
inflamación con el desarrollo de fibrosis aun son desconocidos. Por consiguiente, es
importante determinar los factores involucrados con el fin de obtener nuevos blancos
terapéuticos que logren separar ambos procesos.
Los macrófagos son el principal tipo de célula inflamatoria encontrada luego de una
lesión muscular. En el músculo distrófico, actúan por un lado removiendo los restos
celulares como también modulando el proceso de regeneración. La evidencia actual apunta
a que la naturaleza, duración e intensidad de la respuesta inflamatoria en el músculo dañado
impacta críticamente en el desarrollo óptimo del proceso de reparación del músculo o,
alternativamente, en la formación de tejido fibroso, particularmente durante la progresión
de las distrofias musculares. Cuando se interfiere con la respuesta inflamatoria transitoria,
originada luego de una lesión aguda, puede afectar negativamente la remoción de los restos
celulares y por ende la formación de nuevas fibras musculares, mientras que por otro lado
el interferir con la inflamación crónica en las distrofias musculares parece ser beneficiosa
en la atenuación de la degeneración y la progresión de la fibrosis, al tiempo que mejora la
regeneración (Tidball, 2005). Estudios que utilizan una variedad de agentes anti-
inflamatorios en ratones mdx, que actúan sobre citoquinas, como TNF-α y sus receptores
celulares, y sobre las principales vías pro-inflamatorias, tales como NFκB, han dado como
resultado una mejora de la progresión de la distrofia (Pelosi y cols., 2007; Peterson and
Guttridge, 2008; Radley y cols., 2008). Estudios realizados por Arnold y cols. han
demostrado que los macrófagos presentes luego de una lesión muscular constituyen una
población heterogénea, cuyas funciones serían opuestas (Arnold y cols., 2007). Una
población de macrófagos (M1, ED-1 (CD68) positivos) producen altos niveles de
citoquinas pro-inflamatorias como TNF−α e IL-1β y se encuentran en las primeras etapas
después de una lesión muscular en asociación con el reclutamiento de monocitos y la
eliminación de material necrótico. Por otra parte, una subpoblacion de macrófagos anti-
inflamatorios (M2C, ED-2 (CD163) positivos) son abundantes en las etapas avanzadas del
proceso de regeneración en asociación con la recuperación y reparación de tejidos en los
que secretan IL-10 y tienen una función de desactivación de la primera oleada de
macrófagos M1 (Arnold y cols., 2007). In vitro, los macrófagos pro-inflamatorios
aumentan la proliferación e inhiben su diferenciación, mientras que los macrófagos anti-
inflamatorios estimulan la diferenciación y la fusión de éstos. Es importante destacar que el
agotamiento de cualquiera de estos tipos de macrófagos tiene efectos negativos en el
proceso de reparación después de una lesión muscular (Arnold y cols., 2007).
Terapias para tratar las distofias musculares
Un estudio longitudinal de 25 pacientes con DMD, con un seguimiento medio de
más de 10 años, mostró que entre las características patológicas, las cuales incluyen atrofia
miofibrilar, necrosis y reemplazo por tejido graso, solo la fibrosis observada en biopsias de
estadíos iniciales de la enfermedad se correlacionó con pobres resultados en fuerza
muscular y debilitamiento progresivo con la edad. Este hallazgo apoya la idea de que la
fibrosis contribuye directamente a la disfunción muscular progresiva y al fenotipo letal de
la DMD (Emery, 1993).
En la actualidad, no existe ningún tratamiento eficaz para la DMD. Hoy en día el
manejo y control de los pacientes con DMD, consiste en la administración de
corticosteroides (Prednisona), lo que prolonga parcialmente la fuerza muscular y la
habilidad de caminar en los primeros años, pero a las larga conduce a efectos secundarios
indeseables e invalidantes (Angelini, 2007). Aunque inicialmente la prednisona fue
evaluada para inhibir la inflamación muscular, su mecanismo de acción en la DMD, no se
comprende del todo. En este contexto, no existen terapias efectivas para combatir la fibrosis
en la DMD.
Dado que el defecto primario en la DMD es la ausencia de distrofina, se han
planteado diversas terapias para revertir este problema, no obstante uno de los principales
obstáculos es la necesidad de realizar terapias sistémicas, ya que el tejido muscular
comprende a más de 600 músculos en todo el organismo, lo cual hace imposible la
realización de terapias directas y locales. Dentro de las terapias que se han intentado,
podemos encontrar las del tipo génico con la finalidad de revertir la mutación que impide la
expresión correcta de la proteína distrofina, la utilización vectores de sobrexpresión, como
también intentos de realizar exón-skipping (Adkin y cols., 2011) para generar isoformas
funcionales de la proteína distrofina. Por otro lado, se han realizado terapias celulares
utilizando diferentes células con potencial miogénico, es así que se han utilizado células
derivadas de la medula ósea (Mafi y cols., 2011), células satélites propiamente tal, pericitos
(Peault y cols., 2007) y mesangioblastos (Sampaolesi y cols., 2006). Sin embargo, la
eficiencia de estas aproximaciones aun es un problema. Por otra parte, la fibrosis y la
pérdida de tejido muscular en las distrofias musculares no solo reducen las funciones
móviles y de contracción, sino que también provocan mayores obstáculos a eventuales
intervenciones terapéuticas, ya que por un lado el deterioro progresivo y la pérdida de masa
muscular, disminuye la cantidad de tejido blanco para estas intervenciones. como también
el exceso de tejido conectivo y MEC impondría una barrera física, la cual podría
menoscabar la eficacias de estas terapias (Muir and Chamberlain, 2009). Dentro de este
contexto, se han observado los siguientes problemas en terapias celulares para la DMD. En
primer lugar, las células inyectadas se distribuyen de manera local, lo cual implica que en
un paciente se deban realizar múltiples inyecciones para tratar un músculo completo
(Huard, 1992). Segundo, se ha descrito una respuesta inmune en contra de las células
satélites inyectadas incluso en los casos de coincidencia entre los complejos mayores de
histocompatibilidad, por lo tanto las nuevas terapias deben considerar una forma de
regulación inhibitoria de la respuesta inflamatoria y por último, la mayoría de las células
satélites muere en las primeras 72 horas luego de la inyección (Fan, 1996; Guerrete, 1997).
Una posible explicación a la baja eficiencia de estas terapias queda de manifiesto en un
trabajo del grupo de Giulio Cossu (Gargioli y cols., 2008) quienes demostraron que la
eficiencia puede ser aumentada al utilizar células con potencial miogénico que
sobrexpresen la metaloproteinasa MMP-9. Esta enzima tiene como sustratos múltiples
proteínas de MEC como colágeno tipo I, III y fibronectina (Hrabec y cols., 2007), lo cual
sugiere que estas células al tener la capacidad de degradar la MEC adquieren mayor
capacidad migratoria y por ende se distribuyen de mejor manera en el músculo distrófico.
Por lo tanto, es interesante evaluar si una disminución en la fibrosis aumenta la migración
celular y de esta forma la eficiencia de las terapias celulares.
Relación entre factores pro-fibrosantes y pro-inflamatorios en la DMD.
El microambiente de los músculos distróficos se caracteriza por un elevado número
de células inflamatorias. En particular, los niveles de TNF−α se encuentran incrementados
en músculos de animales distróficos y pacientes con DMD (Porreca y cols., 1999; Porter y
cols., 2002b). Entre sus efectos pleiotrópicos, TNF−α actúa como un potente inductor del
factor de transcripción de respuesta inflamatoria (NFκB) (Hayden and Ghosh, 2004; Li y
cols., 2005). NFκB es un dímero compuesto de varias combinaciones de proteínas: p65
(RelA), RelB, C-Rel, p50 y p52, de las cuales p50/p65 es el complejo más típico. Se ha
encontrado a NFκB constitutivamente activo en el diafragma de ratones mdx (Kumar and
Boriek, 2003).
La importancia de NFκB en el progreso de procesos fibróticos, en especial en la
fibrosis asociada a distrofias musculares, ha sido estudiada a través de modelos animales de
ratones mdx heterocigotos para la subunidad p65 de NFκB (Acharyya y cols., 2007), los
que presentan menor daño y fibrosis muscular, lo cual sugiere fuertemente la participación
de NFκB en la patología fibrótica muscular. A nivel molecular la actividad de NFκB es
regulada principalmente por la proteína IκBα. NFκB es secuestrada por IκBα en el
citoplasma impidiendo su translocación al núcleo y la consiguiente activación
transcripcional (Ahn y cols., 2007). La acción de IκBα depende de un citoesqueleto de
actina estable. A nivel muscular la ausencia de distrofina produce la inestabilidad del
citoesqueleto de actina (Rybakova y cols., 2000) lo que produciría una ineficiente
inhibición de NFκB. Agentes que estabilizan IκB y por ende impiden la activación de
NFκB han mostrado tener efectos protectores frente al daño muscular (Carlson y cols.,
2005). Existen diversos inhibidores específicos para NFκB, dentro de ellos se encuentra el
andrografólido. El andrografólido es un terpeno de origen natural, encontrado
abundantemente como el principal compuesto activo en extractos de la planta
angiospérmica Andrographis paniculata (PARACTIN). El andrografólido es un potente
inhibidor de la actividad de NFκB modifica en forma covalente un residuo de cisteína de la
subunidad p50 (Xia y cols., 2004), lo cual impide la unión al DNA de este factor de
transcripción. El andrografólido no afecta las rutas de activación NFκB (fosforilación y
degradación proteasomal de IκB), como tampoco afecta la translocación nuclear, de esta
forma inhibe la expresión de varias proteínas pro-inflamatorias que son inducidas por
NFκB (Burgos y cols., 2005; Hidalgo y cols., 2005; Iruretagoyena y cols., 2005). El
andrografólido ha sido utilizado como fármaco para el tratamiento del resfrío común
(Gabrielian y cols. 2002), artritis reumatoide (Burgos y cols., 2009) y esclerosis múltiple,
(Iruretagoyena y cols., 2005), sin presentar efectos secundarios adversos, lo cual desde el
punto de vista farmacológico lo hace muy atractivo. Por lo tanto sería interesante estudiar el
uso del andrografólido para entender como factores relacionados con inflamación y fibrosis
se relacionan entre si en el músculo esquelético
La mayoría de los factores pro-fibrogénicos son producidos por la células
inflamatorias infiltradas en el tejido, por células mesenquimales, fibroblastos y como
también por células especificas del tejido, lo que facilita los efectos profibrogénicos
paracrinos que perpetúan la fibrosis impulsada por la inflamación (Wynn, 2008). Una de las
más potentes citoquinas pro-fibrogénicas es el factor de crecimiento transformante tipo beta
o TGF−β. A la fecha se han descrito tres isoformas de TGF−β (TGF−β1, TGF−β2 y
TGF−β3), todas las cuales son sintetizadas como proteínas precursoras (Zhou y cols.,
2006). Cuando TGF−β se activa se libera y se une a un receptor heterodimérico. La ruta de
señalización clásica activada por TGF−β consiste en la unión de TGF−β a su receptor lo
activando el dominio quinasa de éste, lo cual resulta en la fosforilación de las proteínas
smad-2 y smad-3, las cuales unen smad 4 para formar un complejo que transloca dentro del
núcleo, activando la transcripción (Bonniaud y cols., 2005). Sin embargo, también se ha
demostrado que TGF−β puede señalizar a través de varias vías adicionales, dentro de las
cuales podemos encontrar la proteína quinasa p38 activada por mitógenos (MAPK), ERK,
c-abl, JNK, etc.(Shi and Massague, 2003). Estas vías de señalización aparentemente
modifican la expresión de genes de una manera selectiva. Por ejemplo, FAK, JNK y TAK1
se requieren para la diferenciación de fibroblastos a un fenotipo fibrótico denominado
miofibroblastos, cuya característica principal es su alta capacidad de sintetizar MEC y tener
actividad contráctil debido a la expresión de α−SMA (alfa actina de músculo liso)
(Vaughan y cols., 2000; Hinz y cols., 2007). Por otro lado, ERK es necesaria para la
expresión de colágeno tipo I. Sin embargo, p38 MAPK no parece estar involucrado en la
actividad fibrogénica de TGF−β. Por lo tanto, es probable que otras vías de señalización
sean anormalmente activadas en fibroblastos o células musculares de una manera
independiente de la ruta canónica de TGF−β.
TGF−β se expresa en el músculo normal después de la lesión y en el músculo
distrófico de los pacientes con DMD y ratones mdx. Igualmente importante es la capacidad
de TGF−β de disminuir la producción de enzimas que degradan la MEC, tales como la
enzima colagenasa, al tiempo que aumenta la producción de proteínas que inhiben las
enzimas que degradan MEC como las TIMPs y PAI-1. La inyección, in vivo, directa de
TGF−β recombinante en el músculo estimula la expresión de TGF−β en células musculares
en una forma autocrina e induce la formación del tejido conectivo en el área de la inyección
(Brandan y cols., 2008; Zhu y cols., 2007). En conjunto, estos estudios ponen de relieve el
papel crucial de TGF−β en la iniciación de los procesos de fibrosis, y en la inducción de
diferenciación de las células musculares en miofibroblastos en el músculo lesionado. El
antagonismo de la señalización de TGF−β por una serie de estrategias han demostrado que
inhibe la fibrosis y mejora la regeneración muscular en varios modelos experimentales. Sin
embargo, no se ha demostrado ningún agente con la capacidad de reducir la fibrosis, una
vez formada. Por ejemplo, la inmunomodulación directa de TGF−β inhibió la acumulación
de tejido conectivo (Isaka y cols., 2000; Denton y cols., 2007) y la progresión de la fibrosis
en el diafragma de ratones mdx, aunque la inflamación aumentó considerablemente
(Andreetta y cols., 2006). Estos resultados sugieren una fuerte relación entre el fenómeno
de fibrosis y el de inflamación.
Dentro de los genes regulados por TGF-β, se encuentra una proteína de sumo interés
en las patologías fibróticas: el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) (Igarishi y
cols., 1993). Una de las principales características de CTGF, es su efecto sobre la
producción de MEC, donde regula positivamente la expresión de colágeno tipo I, integrina
α5 y fibronectina (Frazier y cols., 1996).
Basado en estudios de expresión de CTGF durante el desarrollo se ha sugerido que
este factor cumple una función en la formación de cartílago, hueso, dientes y maduración
de células nerviosas (Leask y Abraham, 2003). Consistente con esto los ratones deficientes
en CTGF mueren al nacer debido a una alteración de los embriones en la producción de
matriz específica de hueso, incapacidad de condrocitos para proliferar y una alterada
osificación de las costillas (Ivkovic y cols., 2003).
CTGF es una proteína modular rica en cisteína perteneciente a la familia
Cyr61/CTGF/NOV (CCN) de factores de crecimiento (Perbal, 2004) cuyos miembros
tienen una gran variedad de funciones biológicas altamente dependientes de su contexto
celular, dentro de las que se incluyen la proliferación, migración y diferenciación celular
(Perbal, 2004; Leask y Abraham, 2003; Leask y Abraham, 2006). CTGF está involucrado
en una serie de procesos celulares que incluyen la diferenciación, proliferación (Yosimishi
y cols., 2001; Grotendorst y cols., 2004), adhesión (Ball y cols., 2003), migración (Gao y
Brigstock, 2006), apoptosis (Hishikawa y cols., 1999), producción de MEC (Frazier y cols.,
1996), condrogénesis (Ivkovic y cols., 2003) y angiogénesis (Babic y cols., 1999). Hasta la
fecha no se ha identificado un receptor específico de alta afinidad para CTGF, pero se sabe
que algunas de sus funciones tales como adhesión y migración las realiza a través de
integrinas y proteoglicanes de heparán sulfato (Babic y cols., 1999; Ball y cols., 2003; Gao
y Brigstock, 2004; Droppelmann y cols., 2009). CTGF además interactúa con el receptor
relacionado al receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP-1) a través del cual sería
internalizado y degradado vía endosomas (Segarini y cols., 2001).
Los niveles de CTGF se correlacionan con el grado y severidad de fibrosis en
muchos tejidos incluyendo desórdenes fibróticos de la piel como esclerosis sistémica y
queloides (Igarishi y cols., 1993), lesiones ateroescleróticas (Oemar y cols., 1997), fibrosis
pulmonar (Lasky y cols., 1998), fibrosis renal (Ito y cols., 1998), pancreatitis crónica (di
Mola y cols., 1999), fibrosis hepática (Paradis y cols., 1999) y distrofias musculares (Sun y
cols., 2008).
Los efectos de TGF−β sobre la fibrosis pueden ser, al menos parcialmente, imitados
y amplificados por CTGF. Se han reportado aumentos en los niveles de CTGF en el
músculo esquelético de pacientes con DMD, perros distróficos y ratones mdx. La inyección
subcutánea de TGF−β indujo la producción de CTGF, mientras que la inyección de CTGF
puede causar una reacción fibrótica equivalente a la de TGF−β. Esta respuesta fibrótica es
específica para TGF−β y CTGF, y no es imitada por EGF, PDGF o FGF2 (Frazier y cols.,
1996). Estos resultados sugieren un papel de ambos (TGF−β y CTGF) en la inducción de
fibrosis, inhibición de la miogénesis y promoción de desdiferenciación de mioblastos en
miofibroblastos (Vial y cols., 2008). Debido a que muchas actividades de CTGF son
paralelas a aquellas inducidas por TGF-β, se ha sugerido que algunas de las respuestas de
TGF-β son mediadas a través de CTGF (Gore-Hyer y cols., 2002; Grotendorst y cols.,
2004). Se ha observado que durante el proceso de reparación frente a un daño TGF-β es
inducido antes que CTGF sugiriendo que este factor es un mediador río abajo de TGF-β
(Igarishi y cols., 1993).
Con estos antecedentes muchas de las terapias se han enfocado a modular la
actividad pro-fibrótica de TGF-β a través de la inhibición directa de su blanco CTGF,
mediante RNA de interferencia en modelos de fibrosis hepáticas (Li y cols., 2008),
oligonucleótidos antisentido en modelos de nefropatía diabética (Guha y cols., 2007; Sisco
y cols., 2008) anticuerpos bloqueantes (Usinger y cols., 2005; Schwartz y cols., 2007;
Ikawa y cols., 2008). En estos estudios, tanto el uso de RNA de interferencia como
anticuerpos bloqueantes específicos para CTGF revelan que existe una disminución en la
cantidad de proteínas de MEC y una mejoría del fenotipo fibrótico en los modelos
analizados.
En nuestro laboratorio se demostró, que la expresión de CTGF es inducida por
TGF-β en células de músculo esquelético. Más aún CTGF induce la síntesis de MEC en
mioblastos ejerciendo además un efecto inhibitorio sobre la diferenciación muscular,
provocando la desdiferenciación de mioblastos C2C12 (Vial y cols., 2008). Esto último
indicaría que la expresión de CTGF en células musculares podría estar involucrada en el
proceso de regeneración muscular. Estudios sobre la expresión de CTGF han mostrado un
incremento en su mRNA en músculo esquelético de perros distróficos (Passerini y cols.,
2002), y de ratones mdx (Cabello-Verrugio y cols., 2011; Porter y cols., 2003)).
Recientemente se ha encontrado que músculos distróficos de pacientes DMD presentan un
aumento de CTGF localizado en la lámina basal de la fibra muscular, fibras en
regeneración y en intersticio. Además se observó una colocalización de TGF-β y CTGF en
fibroblastos activados de estos pacientes (Sun y cols., 2008), sugiriendo que la expresión de
CTGF es regulada a través de TGF-β y que ambas vías se encuentran ligadas a la
patogénesis de la fibrosis muscular esquelética. Además, en nuestro laboratorio se demostró
que ratones mdx heterocigotos para CTGF presentan menor grado de fibrosis muscular
(Tesis Gabriela Morales, en curso) y que, además, la sobrexpresión de CTGF en el músculo
esquelético de un ratón control induce similares características a las observadas en un
músculo distrófico (Morales y cols., 2011). En resumen, estos antecedentes indicarían que
al igual que en otros tejidos fibróticos CTGF se correlaciona con el desarrollo y la
severidad de la fibrosis muscular esquelética, por lo que sería relevante buscar formas de
inhibir su expresión o actividad para prevenir su efecto fibrótico.
Aunque en el adulto CTGF no se expresa bajo condiciones normales en la mayoría
de los tejidos, la expresión de esta proteína puede ser inducida por TGF-β, factor de
crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF),
angiotensina II, glucocorticoides, endotelina 1 e hipoxia, el ácido lisofosfatídico (LPA),
entre otros estímulos (Leask y Abraham, 2006; Leask y cols., 2009;(Muehlich y cols.,
2004; Ruperez y cols., 2003; Vial y cols., 2008)).
Un factor común a todos estos inductores es NFκB. El promotor de CTGF presenta
sitios de reconocimiento de diferentes factores de transcripción y dentro de este punto se ha
demostrado que el promotor de CTGF presenta sitios para NFκB, los cuales son
importantes para la expresión de CTGF, ya que al ser mutados, inhiben la expresión de un
reportero para CTGF en respuesta a estímulos como el estrés mecánico (Chaqour y cols.,
2006). Además la sola inhibición de NFκB disminuye la expresión de CTGF y colágeno
tipo I. Estos antecedentes sugieren una fuerte relación entre la citoquina profibrosante
CTGF y el factor de transcripción relacionado con inflamación NFκB.
Estudios recientes han sugerido la participación de CTGF en la respuesta
inflamatoria en donde actúa como factor quimiotáctico para monocitos y aumenta la
producción de factores pro-inflamatorios (Cicha, 2005). Esto indicaría que CTGF además
de su propiedad pro-fibrótica estaría involucrado en la respuesta inflamatoria, la cual es una
característica de la DMD. De este modo es importante determinar si CTGF y/o TGF−β
tienen actividad proinflamatoria en el músculo esquelético.
Esta tesis plantea estudiar los eventos celulares y moleculares involucrados en la
fibrosis muscular esquelética asociada a las distrofias musculares. Determinando el papel
de las citoquinas TGF−β y CTGF y su relación con los procesos de inflamación y fibrosis,
como tambien la participación del factor de transcripción NFκB a través del inhibidor de
origen botánico andrografólido.
HIPOTÉSIS
“El andrografólido inhibe la fibrosis, la cual afecta la fisiología muscular en un
mecanismo que involucra a CTGF y TGF−β“
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el efecto del andrografólido en la fibrosis, inflamación y función de músculos
distróficos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar el efecto del andrografólido sobre la expresión y los efectos de TGF−β y
CTGF en el músculo esquelético.
1.1. Evaluar el efecto del andrografólido sobre la expresión de CTGF y TGF−β en
músculos distróficos.
1.2. Determinar el efecto del andrografólido sobre los niveles de MEC e
inflamación en músculos distróficos.
1.3. Estudiar el efecto del andrografólido en la inflamación y fibrosis muscular
inducida por TGF−β.
1.4. Evaluar el efecto del andrografólido en la inflamación y fibrosis muscular
inducida por CTGF.
2. Determinar si la modulación de la fibrosis por el andrografólido afecta la migración
celular, la eficiencia de las terapias celulares y la función muscular.
2.1. Estudiar si la disminución de la fibrosis por el andrografólido facilita la
migración celular en el músculo esquelético.
2.2. Determinar si la disminución de la fibrosis por el andrografólido aumenta el
número de fibras capaces de revertir distrofina
2.3. Evaluar el efecto del andrografólido en la fuerza muscular
MATERIALES Y METODOLOGÍA
1. Materiales
1.1 Material Biológico
1.1.1 Cepas de Bacterias
La cepa de E. Coli XL1-Blue (supE44, hsdR17, recA1, endA1, gyrA46, thi, relA1,
lac-, F’ (proAB+, lacIq, lacZΔM15, Tn10 (tetr)) forma parte del cepario de bacterias
utilizadas para técnicas de DNA recombinante del Laboratorio de Diferenciación Celular y
Patología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de
Chile.
La cepa comercial BJ5183-Easy (endA, sbcBC, rec, BC galK, met, thi- 1, bioT,
hsdR (Strr)) transformada con el vector adenoviral AdEasy-1se obtuvo de Stratagene (Santa
Clara, CA, USA).
1.1.2 Vectores y plasmidios.
a) pAdTrack-CMV: Vector que permite la expresión del gen de interés bajo el
control del promotor de citomegalovirus (CMV) además, contiene como secuencia
bicistrónica el gen codificante para la proteína fluorescente verde (GFP) bajo un promotor
independiente de CMV. Este vector fue donado gentilmente por la Dra. Silvana Zanlungo
del Departamento de Gastroenterología, Facultad de Medicina, pontificia Universidad
Católica de Chile, Santiago, Chile.
b) pCMV-Sport6-mCTGF: Vector comercial obtenido de la empresa Open
Biosystem (Thermo Fisher Scientific, Walthman MA, USA), el cual contiene el cDNA de
CTGF ratón, con su secuencia 5’ y 3’ UTR.
c) pGL2-Basic, fue obtenido de Promega, WI, EE.UU., gen reportador para la enzima
luciferasa (Luc) de Photinus pyralis, que contiene resistencia a ampicilina.
d) pNFκB-Luc, fue donado por el Dr. Francesc Ventura (Unidad de Bioquímica,
Ciencias Fisiológicas II, Universidad de Barcelona, España). Contiene el DNAc del
promotor para NFκB clonado en pGL2-Basic, el que contiene resistencia a ampicilina
(Lopez-Rovira y cols., 2000).
e) p3Tp-Luc, Reportero inducible por TGF−β el que contiene la región promotora del
inhibidor del inductor del plasminógeno (PAI-1) sub-clonado en un vector modificado que
contiene el cDNA para la luciferasa de luciérnaga. Fue donado por el Dr. Fernando Lopez
Casillas, Universidad Nacional de Mexico (Wrana y cols., 1992).
1.1.3 Líneas Celulares Eucarióticas
Las siguientes líneas celulares fueron obtenidas de ATCC, American Type Culture
Collection (Manassas, VA, USA).
a) C2C12 (ATCC CRL-1772): Subclón derivado de Blau y colaboradores (Blau, y
cols., 1985) utilizando la línea celular establecida por Yeffe y Saxel a partir del músculo
esquelético de la extremidad posterior de un ratón C3H normal (Yaffe y Saxel, 1977).
b) NIH/3T3 (ATCC CRL-1658): Línea permanente de fibroblastos embrionarios de
ratón espontáneamente inmortalizados (Todaro y cols., 1967).
1.1.4 Animales de Experimentación
Los ratones mdx corresponden a una cepa de animales reproductores con un
background genético C57BL/10 ScSn que junto con los ratones controles C57BL/10 fueron
obtenidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Estos animales poseen una
mutación puntual en el exón 23 del gen que codifica para distrofina (Sicinski y cols, 1989).
Los ratones se mantuvieron en el vivero de la Facultad de Ciencias Biológicas de
la Pontificia Universidad Católica de Chile, a temperatura controlada (21ºC) y sometidos a
un régimen de luz correspondiente a ciclos alternados de 12 horas (luz: 9 AM – 9 PM) para
la mantención de un ritmo circadiano constante. Los animales tuvieron libre acceso a agua
y a una dieta estándar que permite una adecuada reproducción y crecimiento de los ratones
manteniendo un estado metabólico estable.
Todos los procedimientos con animales se desarrollaron con la aprobación del
Comité de Bioética de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
1.2 Anticuerpos
Los anticuerpos que fueron utilizados en el desarrollo experimental de esta Tesis
son detallados en la Tabla 1, en la cual se indican sus características así como también la
técnica para la la cual fueron utilizados.
Tabla 1. Lista de anticuerpos y las aplicaciones en que fueron utilizadas. WB: Western
blot, IFI: Inmunofluorescencia indirecta, IHC: Inmunohistoquímica
Nombre Antígeno (Especie) Origen Técnica y
Dilución
Fuente de
obtención
Anti-CTGF CTGF (humano) Cabra WB:1/500
IHC:1/100
Santa Cruz
(CA, USA)
Anti-GFP GFP (aequoerea) Conejo WB:1/1000 Santa Cruz
(CA, USA)
Anti-Fibronectina Fibronectina (humano) Conejo WB:1/5000
IFI:1/100
Sigma
(MO, USA)
Anti-Colágeno I Colágeno tipo I (humano) Conejo WB:1/1000
IFI:1/100
Anti-Colágeno III Colágeno tipo III (humano) Conejo WB:1/500
IFI:1/50
Rockland
(PA, USA)
Anti-fosfo Smad3 Smad-3
Fosfoserinas 423 y 425
(humano)
Conejo WB:1/1000
IFI:1/50
Cell
Signaling
(MA, USA)
Anti-Smad3
Smad-3
(humano)
Conejo Cell
Signaling
(MA, USA)
Anti-GAPDH Gliceraldehído Ratón WB:1/5000 Chemicon-
deshidrogenasa (ratón) Millipore
(MA, USA)
Anti-Tubulina α -Tubulina
(erizo de mar)
Ratón WB:1/5000 Sigma
(MO, USA)
Anti-Miosina
neonatal
Miosina neonatal
(humano)
Ratón WB:
IFI:1/50
Santa Cruz
(CA, USA)
Anti CD 68 Anti CD 68 (ratón) Conejo WB:1/500
IFI:1/100
Serotec
(OX, UK)
Anti CD 206 Anti CD 206 (ratón) Conejo WB:1/500
IFI:1/100
Serotec
(OX, UK)
Anti F4/80 Anti F4/80 (rata) Cabra WB:1/500
IFI:1/100
Abcam
(CA, USA)
1.3 Partidores para RT-PCR en tiempo real
Los partidores que fueron utilizados en el desarrollo experimental de esta Tesis son
detallados en la Tabla 2, en la cual se indican sus secuencias.
Tabla 2. Lista de partidores utilizados para la expresión de genes a través de RT-PCR en
tiempo real.
Gen Forward primer Reverse Primer
IFN-g 5′-GACAATCAGGCCATCAGCAAC-3′ 5′-CGGATGAGCTCATTGAATGCTT-3′
CD68 5′-CAAAGCTTCTGCTGTGGAAAT-3′ 5′-GACTGGTCACGGTTGCAAG-3′
CD206 5′-GGATTGTGGAGCAGATGGAAG-3′ 5′-CTTGAATGGAAATGCACAGAC-3′
IL-6 5′-GAACAACGATGATGCACTTGC-3′ 5′-CTTCATGTACTCCAGGTAGCTATGGT-3′
IL-4 5′-GGATGTGCCAAACGTCCTC-3′ 5′-GAGTTCTTCTTCAAGCATGGAG-3′
CD163 5′-GCAAAAACTGGCAGTGGG -3′ 5′-GTCAAAATCACAGACGGAGC-3′
MCP-1 5′-GCTCAGCCAGATGCAGTTAAC-3′ 5′-CTCTCTCTTGAGCTTGGTGAC-3′
B-actin 5′-CAACCGTGAAAAGATGACCC -3′ 5′-GTAGATGGGCACAGTGTGGG-3′
RNSP1 5′- AGGCTCACCAGGAATGTGAC-3′ 5′- CTTGGCCATCAATTTGTCCT-3
SRP14 5′- GAGACGAGCAGTTCCTGAC-3′ 5′- CGGTGCTGATCTTCCTTTTC-3′
1.4 Material Anestésico y Quirúrgico
Durante la cirugía de los animales de experimentación, se utilizó como anestésico
isofluorano administrado por vía aérea a través de sistema de anestesia Moduflex
Anesthesia Equipment (Moduflex, San Diego, CA, USA)
Para la administración de andrografólido por vía intraperitoneal se utilizaron
jeringas insulínicas de 0.5 ml obtenidas de Terumo Medical Corporation (New Jersey, NY,
USA). Para la toma de muestra de sangre se utilizaron jeringas de 1 ml de Beckton
Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda. (Curitiba, Brasil).
El material quirúrgico fue obtenido de Kent Scientific (Torrington, CT, USA), el
cual fue autoclavado previo a cada cirugía.
1.5 Material de Cultivo Celular
Los siguientes materiales para cultivo celular se obtuvieron de Orange Scientific
(Braine-l'Alleud, Bélgica): frascos de 25 cm2 y 75 cm2, placas de 20 mm, 60 mm y 150
mm, pipetas estériles desechables de 5 ml y 10 ml y rastrillos estériles desechables. Los
tubos cónicos de polipropileno de 15 ml y 50 ml se obtuvieron de Falcon (St. Louis, MO,
USA). Los filtros de 0.22 µm se adquirieron de Millipore (Bedford, MA, USA).
2 Reactivos
2.1 Reactivos Generales
De Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA): se obtuvieron los siguientes
reactivos: Tritón X-100, albúmina de suero de bovino (BSA), acrilamida, bisacrilamida,
Tween 20, persulfato de amonio (PSA), β-mercaptoetanol, azul de bromofenol
tetrametiletilendiamina (TEMED), NaHCO3, CsCl, dimetilsulfóxido (DMSO), fluoruro de
fenil metil sulfonilo (PMSF), NP-40, sarcosil, glicerol y andrografólido.
De Merck (Darmstadt, Alemania) se obtuvieron los siguientes reactivos: NaCl,
KCl, MgCl2, MgSO4, Na2HPO4, KH2PO4, CH3COONa, CaCl2x2H2O, ácido
etilendiamintetracético (EDTA), piperazina-N,N'-bis ácido etanosulfónico (PIPES),
glucosa, y los solventes de grado analítico.
De US Biological (Swampscott, MA, USA), se obtuvieron los siguientes reactivos,
tris base, dodecil sulfato de sodio (SDS) y glicina.
De Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) se obtuvo el suero de
cabra.
TGF-βI humano recombinante en su forma soluble, se obtuvo en R&D systems,
MN, EE.UU
2.2 Reactivos para Histología e Inmunofluorescencia
De Dako (Glostrup, Dinamarca) se obtuvo la solución de montaje para
inmunofluorescencia Fluoromont y diaminobencidina (DAB)
De Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) se obtuvo el reactivo de bloqueo
para anticuerpos monoclonales Mouse on Mouse Basic Kit (MOM) y el lápiz hidrofóbico
para inmunofluorescencia, ImmEdge.
De Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA) se obtuvo el líquido de montaje
Entellan, Rojo Sirio F3BA, ácido pícrico, ácido fosfomolíbdico (PMA)
De Merck (Darmstadt, Alemania) se obtuvo eosina Y, 2-metibutano (isopentano),
xilol y hematoxilina de Mayer.
2.3 Reactivos de Biología Molecular
Los siguientes reactivos de grado biología molecular se obtuvieron de Invitrogen
Life Technologies (Carlsbad, CA, USA): Agarosa, SybrSafe, desoxiadenosinatrifosfato
(dATP), desoxitiminatrifosfato (dTTP), desoxiguaninatrifosfato (dGTP),
desoxicitosinatrifosfato (dCTP), estándar de peso molecular de 1 Kb y 100 pb DNA, medio
de crecimiento de bacterias Terrific Broth y agar.
Los antibióticos kanamicina, tetraciclina y estreptomicina se obtuvieron de Gibco
(Grand Island, USA).
2.4 Marcadores de Masa Molecular
De Fermentas (MD, USA,) fueron obtenidos los estándares preteñidos para
electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS,
2.5 Enzimas Comerciales
De Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) se obtuvieron las enzima
Taq DNA polimerasa recombinante, DNAse I, transcriptasa reversa M-MLV RT (Moloney
Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) y Proteinasa K.
2.6 Sistemas Comerciales
De Qiagen (Valencia, CA, USA) se obtuvieron los sistemas de purificación de
DNA plasmidial HiSpeed Plasmid Midi Kit y QIAquick Gel Extraction Kit.
De Axygen (Union City, CA, USA) se obtuvo el sistema de purificación de DNA
plasmidial AxyPrep Plasmid Miniprep Kit.
De Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) se obtuvo el sistema de
transcripción reversa de DNA SuperScript II RT First-Strand Synthesis System.
De Applied Biosystem (Grand Island, NY, USA) se obtuvo el sistema comercial
de extracción de RNA Arcturus Pico-Pure RNA kit.
De Thermo Fisher Scientific (Walthman, MA, USA) se obtuvieron los sistemas de
detección de quimioluminiscencia utilizados para los ensayos de Western blot; West Pico,
West Dura y West Femto.
De BioRad se obtuvo el IQ SYBR Green supermix utilizado para los ensayos de
RT-PCR en tiempo real.
2.7 Medios de Cultivo Celular
Los siguientes reactivos se obtuvieron de Gibco (Grand Island, USA): medio de
cultivo Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM), Opti-MEM, suero fetal bovino, tripsina-
EDTA y mezcla de antibióticos-antimicótico.
La lipofectamina utilizada para transfección transiente de células en cultivo se
obtuvo de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA).
3. Metodología
3.1 Cultivo Celular
3.1.1. Mantención de Líneas Celulares
Las línea celular NIH/3T3 fue mantenida en medio de cultivo DMEM
suplementado con 5% suero fetal de bovino inactivado y 1% de antibiótico-antimicótico a
37°C y 5% de CO2.
El cultivo celular C2C12 se mantuvo en medio de cultivo DMEM suplementado
con 10% suero fetal de bovino y 1% de antibiótico-antimicótico a 37°C y 8% de CO2.
El medio de cultivo de ambas líneas se cambió en forma periódica y cuando las
células alcanzaban 80% de confluencia eran tripsinizadas y resembradas para continuar su
crecimiento.
3.1.2. Diferenciación de células C2C12
Se plaquearon 6000 células/cm2 en 6 ml (para placas de 55 cm2) o 3 ml (para placas
de 21 cm2) de medio de crecimiento por 2 a 3 días o hasta alcanzar un 80% de confluencia.
Las células obtenidas en esta etapa, se denominarán mioblastos. Para inducir su
diferenciación, el cultivo de células se lavó 3 veces con medio mínimo y se incubó por 2
días en el mismo volumen de medio de diferenciación, que corresponde a medio mínimo
suplementado con SC 5% (v/v). El medio se reemplazó cada 2 días, o bien, como se indica
en cada experimento. En algunos experimentos, el medio de diferenciación que se agregó
desde 2 días después de gatillada la diferenciación contenía AraC 0,1 mM (Larrain y cols.,
1997a).
3.1.3 Transfección Transiente en Células Eucariontes
Se sembraron 9000 células/cm2 en placas de 10 cm2 y, después de 48 horas, éstas
fueron transfectadas con los plasmidios pGL2-Basic, pId1-Luc, pNfkB-Luc o p3TP-LUC.
Se tomaron 5 µg o 2,5 µg (para triple transfección) de los DNA plasmidiales mencionados,
previamente purificados por MaxiPrep y se disolvieron en 0,125 ml de Opti-MEM I.
Después de filtrar la mezcla (en filtros de 0,2 µm), se adicionaron 4 µl del reactivo PLUS y
se incubó 15 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla, se adicionó gota a gota y con
agitación a un tubo que contenía 6 µl de lipofectAMINA, previamente disuelta en 0,125 ml
de Opti-MEM I y se incubó por 15 minutos adicionales. La mezcla DNA/lipofectAMINA-
PLUS, se adicionó gota a gota a placas que habían sido lavadas 3 veces con Opti-MEM I, y
que contenían 1 ml del mismo medio. Se adicionaron 0,139 ml de SFB y 7 µl de extracto de
embrión de pollo y las placas se incubaron por 12-14 h a 37°C, CO2 8% y 95% de
humedad. Las placas se lavaron tres veces con HBSS, se tripsinizaron y las células re-
suspendidas en medio de crecimiento, fueron repartidas en 6 pocillos de 1,9 cm2. Luego de
4 horas, las células fueron lavadas con medio mínimo y se comenzaron los tratamientos con
TGF−β, H2O2, andrografólido, PARACTIN, etc. Todos re-suspendidos en medio mínimo
y suplementados con 0,1% SFB (v/v).
3.2. Ensayos enzimáticos
3.2.1. Ensayo de luciferasa
Se utilizó el kit Luciferase Reporter Assay System. Células transfectadas en forma
transiente, y luego del tratamiento correspondiente, fueron lavadas 2 veces con tampón PBS
e incubadas durante 20 minutos a 37°C con 0,1 ml de un tampón de lisis pasiva, provisto
por el fabricante. Para cuantificar la actividad de luciferasa 20 µl de extracto celular,
previamente removido con un raspador de células, fueron incubados con 0,1 ml del reactivo
de ensayo de luciferasa (LAR II) y cuantificado en un luminómetro TD-20/20, Turner
Designs, con un tiempo de preincubación de 5 segundos y 10 segundos de medida.
3.2.2.. β-galactosidasa
Se utilizó el kit Luminiscent β-galactosidase Detection kit, el que permite la
detección luminiscente de la actividad de β-galactosidasa. La determinación, fue realizada
en los mismos extractos obtenidos para la detección de actividad de luciferasa. 50 µl de
extractos, fueron incubados con 0,1 ml del reactivo de ensayo de β-galactosidasa, e
incubados por 1 hora a temperatura ambiente. La cuantificación se hizo en un luminómetro
TD-20/20, Turner Designs, con un tiempo de lectura de 10 segundos.
3.3. Ensayo de Northern
3.3.1. Electroforesis de RNA en geles de agarosa y transferencia a membranas de
Nytran
Las muestras de RNA total, se fraccionaron en geles de agarosa al 1,2% (p/v), los
que se prepararon en amortiguador MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico 40 mM, pH:
7,0, acetato de sodio 10 mM y EDTA 1mM), conteniendo formaldehido 0,66 M y que
habían sido precorridos a 70 V por 1 hora en tampón MOPS. Se denaturaron 10 µg de RNA
total disuelto en formamida, que contenían amortiguador de carga (0,75 ml formamida
desionizada, 0,15 ml de tampón MOPS 10X, 0,24 ml formaldehido al 37% p/v, 0,1 ml de
agua tratada con DEPC, 0,1 ml glicerol y 0,08 ml de una solución de azul de bromofenol al
10% p/v) y 3 µl de bromuro de etidio 1 mg/ml. Las muestras se aplicaron al gel y éste se
corrió a un voltaje constante de 70 V, hasta que el frente de azul de bromofenol llegara al
final del gel. El gel se fotografió, previo a la transferencia.
Para la transferencia a membranas de Nytran, se preincubaron el gel y la membrana
en una solución SSC 10X (NaCl 1,5 M, citrato de sodio 0,15 M, pH: 7,0), que contenía
DEPC durante 20 minutos con agitación suave. El gel, se colocó sobre un trozo de papel
Whatmann 3MM, cuyos extremos estaban sumergidos en un recipiente que contenía SSC
10X. Sobre el gel, se colocó la membrana de Nytran y sobre ésta, un trozo de papel
Whatmann 3MM (ambos del mismo tamaño del gel) y, finalmente, papeles absorbentes. La
transferencia por capilaridad, se dejó proceder por 12 horas. Los ácidos nucleicos se
entrecruzaron a la membrana, exponiendo esta última 2 minutos en un transiluminador UV
(302 nm).
3.3.2. Marcación radioactiva de la sonda de DNA
Las sondas de DNAc, obtenidas mediante PCR a partir de sondas, previamente
preparadas, fueron marcadas utilizando el kit Rediprime II Random Prime Labelling
System. Para esto, 25 ng de la sonda fueron ajustados a un volumen final de 45 µl en
tampón TE y denaturados incubando 5 minutos a 100°C y 5 minutos a 4°C. A uno de los
tubos del kit, que contenía la enzima Klenow, dATP, dGTP y dTTP en una solución
tampón, se agregaron la sonda denaturada y 5 µl de α-[32P]dCTP (3000 mCi/mmol), se
mezcló e incubó a 37°C durante 20 minutos. La reacción se detuvo agregando 5 µl de una
solución EDTA 0,2 M. Previo a la hibridación, la sonda fue denaturada en las condiciones
descritas.
3.3.3. Hibridación y lavados
Para bloquear la unión inespecífica, las membranas se prehibridaron con el tampón
Rapid-hyb, provisto por el fabricante, que contenía DNA de espermio de salmón 0,1 mg/ml
previamente denaturado. Después de una incubación de 20 minutos, a 65°C, con agitación
continua en un horno de hibridación Shel Lab, 1012, se adicionó la sonda marcada y
denaturada sobre el mismo tampón y se incubó a 65°C durante 60 minutos. Las
membranas, se lavaron una vez con tampón SSC 2X, SDS 0,1% (p/v) por 30 minutos, y dos
veces, con tampón SSC 0,1X, SDS 0,1% (p/v) por 15 minutos cada uno, a 65°C. Las
membranas se expusieron a películas de rayos X a -80°C.
3.4 Amplificación y Purificación de Adenovirus Recombinantes
Los adenovirus recombinantes Ad.GFP y Ad.CTGF fueron replicados a gran
escala como ha sido descrito previamente (He y cols., 1998). Las células HEK-293 se
crecieron en 50 placas de 150 mm hasta confluencia en medio de cultivo DMEM
suplementado con 10% suero fetal de bovino y 1% de antibiótico-antimicótico. Las células
fueron infectadas con 1x1010 partículas por placa en 4 ml de DMEM suplementado con 2%
suero fetal de bovino y 1% antibiótico-antimicótico. Las células infectadas se incubaron por
2 hrs. a 37°C y luego se adicionaron 10 ml de medio de cultivo completo.
Después de 30 hrs. de incubación a 37°C, las células fueron cosechadas en tubos
de polipropileno cónico de 50 ml y centrifugadas a 1000 g por 5 min. a 4ºC, se eliminó el
sobrenadante y las células se resuspendieron en 0,5 ml de Tris-HCl 10 mM pH 8,1 por
placa. Luego, las células se lisaron tres veces mediante un proceso de
congelamiento/descongelamiento en alcohol-hielo seco/baño a 37°C para liberar las
partículas virales desde el interior de las células. Los lisados se centrifugaron a 2000 g por
10 min. a 4°C y se recuperó el sobrenadante donde se recuperan las partículas virales. Este
sobrenadante se sometió a un fraccionamiento en una gradiente de cloruro de cesio
discontinua y se ultracentrifugó por 2 hrs. a 30000 g a 5°C. La banda inferior de la
gradiente formada post centrifugación fue recolectada y se realizó un proceso de
purificación final del DNA en una columna de Sephadex G-25 grado DNA (Pharmacia,
Uppsala, Suecia) para eliminar el exceso de sales. La cuantificación de la concentración se
realizó midiendo la DO260nm de las fracciones obtenidas, recuperándose el virus
mayoritariamente entre la fracción 4 a 6.
El virus recombinante así obtenido se guardó alicuotado en PBS-glicerol al 10% a
–80°C hasta el momento de ser utilizado en la infección de animales.
3.5. Preparación de Lisados Celulares
Las células se lavaron 3 veces con 2 ml de PBS frío, se desprendieron mediante un
rastrillo y se traspasaron a un tubo de microcentrífuga junto con 1,5 ml de PBS para
centrifugación a 800 g por 5 min. a 4ºC. El pellet de células se resuspendió en 100-300 µl
buffer de lisis (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM MgCl2 y 0,5% NP-40, 1mM PMSF) y se incubó
por 15 min. a 4ºC. Finalmente, el lisado se centrifugó a 15700 g por 10 min. a 4ºC para
eliminar la fracción nuclear y los restos celulares y el sobrenadante se almacenó a -20ºC
hasta su utilización para ensayos de Western blot.
3.6. Genotipificación Ratones mdx
La reacción de PCR para la genotipificación de ratones mdx se realizó según
Amalfitano y cols (1996) con algunas modificaciones. Brevemente se utilizaron los
oligonocleotidos p9427 (5'-AAC TCAT CAA ATA TGC GTG TTA GTG-3'), P260E (5'-
GTC ACT CAG ATA GTT GAA GCC ATT TAG-3') y p259E (5'-GTC ACT CAG ATA
GTT GAA GCC ATT TAA-3'). La combinación de los oligonucleótidos P9427 y P259E
amplifican la zona donde se encuentra el codón prematuro de término en el exón 23 en el
gen de distrofina de los ratones mdx. La combinación de oligonucleótidos P9427 y P260E
amplifican la misma zona pero en un animal silvestre. Ambas reacciones generan un
producto de 100 pb. El DNA genómico se obtuvo como se detalló en Metodología 2.12.1.
La reacción de PCR se llevó a cabo como se detalla en la sección Metodología 2.12.2. El
producto de PCR obtenido se visualizó en un gel de agarosa al 2%.
3.7. Infección de Animales con Adenovirus Recombinantes
En el desarrollo de todos los experimentos con infección adenoviral, se utilizó
ratones machos C57BL/10 de 12 semanas de edad. Para administrar el adenovirus (Morales
y cols., 2010), los animales fueron anestesiados con isoflurano. Se identificó en tibialis
anterior y se inyectó directamente en el músculo 2x1011 partículas de adenovirus
recombinante en 50 µl de amortiguador fosfato salino con una jeringa insulina de 0.5 ml.
Como grupos controles, se utilizó animales inyectados exclusivamente con solución salina
(PBS) o con un adenovirus control (Ad.GFP).
Luego de la infección, los ratones se mantuvieron desde 5 días días en dieta
control con disposición a alimento y agua ad libitum. La administración de adenovirus en
animales se desarrolló con la aprobación del Comité de Bioética Animal de la Pontificia
Universidad Católica de Chile.
3.8. Inyección intramuscular de TGF−β
En el desarrollo de todos los experimentos con inyección intramuscular de TGF−β,
se utilizó ratones machos C57BL/10 de 12 semanas de edad. Para administrar la citoquina,
los animales fueron anestesiados con isoflurano. Se identificó el TA y se inyectó
directamente en el músculo un total de 5ng de TGF−β1 en 50 µl de suero fisiológico con
una jeringa de insulina de 0.5 ml. Como grupos controles, se utilizó animales inyectados
exclusivamente con solución salina (PBS).
Luego de la inyección, los ratones se mantuvieron durante 5 días en dieta control
con disposición a alimento y agua ad libitum.
3.9. Tratamiento con andrografólido y PARACTIN.
La administración de andrografólido (2mg/Kg) en ratones mdx se realizó en forma
intraperitoneal en un volumen máximo de 50 µl de suero salino, utilizando jeringas de
insulina de 0,5 ml. La administración de andrografólido se realizó 3 veces por semana en el
cuadrante inferior derecho de cada animal, introduciendo la aguja paralela a la línea de la
pierna e ingresando a través de la pared abdominal hasta el interior de la cavidad peritoneal.
Para el tratamiento con el PARACTIN (andrografólido al 37%) en forma oral, se
calculó la cantidad de agua que los animales beben diariamente, esta fue estimada en 2 ml.
De esta forma el PARACTIN fue diluido en el bebedero de los animales a una
concentración tal, que por cada 2 ml de líquido se encuentre una cantidad de 2 mg de
andrografólido total. Los animales no tuvieron acceso a otro tipo de líquido.
3.10. Inyección intramuscular de fibroblastos.
Se aislaron fibroblastos provenientes del tendón de Aquiles de ratones control recién
nacidos. Estos fibroblastos se caracterizan por su alta capacidad migratoria, además de ser
capaces de subsistir en condiciones de hipoxia. Para aislar los fibroblastos, primero se
procedió a extraer el tendón y luego fue triturado para ser incubado con la enzima
colagenasa durante 10 minutos. Luego fueron filtrados a través de un tamiz celular y el
eluído fue sembrado en placas de 60 mm permitiendo su adherencia durante 30 minutos.
Posteriormente se retiró el sobrenadante y las células adheridas fueron cultivadas en una
estufa a 37°c y 5% de CO2.
Una vez alcanzada una alta confluencia, los fibroblastos aislados de tendón fueron
teñidos según las indicaciones del fabricante con la sonda lipofílica fluorescente DiI
(Molecular probes). Una vez teñidas se procedió a inyectar, 5 millones de estas células en
el centro del músculo tibialis anterior de ratones mdx, para luego de un mes, evaluar
mediante inmunofluorescencia su localización intramuscular.
3.11. Inducción de fibrosis por ejercicio en ratones mdx
Para acelerar el fenotipo fibrótico en el músculo de las extremidades de ratones
mdx, estos fueron sometidos a protocolos de ejercitación sobre una cinta trotadora a una
velocidad de 12 metros/minuto (Bizario y cols., 2009). La duración del protocolo fue de 30
minutos totales de ejercitación con descansos cada 3 y 5 minutos para los ratones mdx y
C57BL/10 respectivamente. El protocolo de ejercitación se realizó 3 veces a la semana
durante periodos que variaron desde 1 a 4 meses.
El protocolo de resistencia al ejercicio consistió en una ronda de 5 minutos a una
velocidad de 15 metros/min y se contabilizó el número de veces en que los ratones
retrocedían en la cinta trotadora.
Previo a la experimentación correspondiente de esta tesis, realizamos la
caracterización de este modelo. En primer lugar caracterizamos mediante tinción de
Hematoxilina/Eosina el fenotipo muscular en respuesta a diferentes periodos de
ejercitación. Como se muestra en la figura 1, el ejercicio acelera el fenotipo fibrótico, lo
cual fue corroborado mediante inmunofluorescencia indirecta para la proteína colágeno tipo
III (figura 2) y mediante ensayos de western blot para la proteína fibronectina (figura 3)
En algunos experimentos los ratones fueron tratados con andrografólido a una dosis
de 2 mg/Kg de peso de andrografólido, el cual fue inyectado intraperitonealmente 3 veces
por semana.
3.12. Trasplante intramuscular de miobloastos
Músculos soleos de animales C57BL/10 fueron digregados enzimáticamente con
colagenasa y mecánicamente a través de pipeteo extensivo para obtener fibras musculares,
intactas las cuales sirven como vehículos para llevar las células satélites a los músculo de
ratones mdx que fueron sometidos a protocolos de terapia celular, tanto el tratamiento con
andrografólido como los protocolos de ejercitación se detuvieron 1 semana antes del
trasplante con el propósito de que los animales eliminen todo el andrografólido y evitar el
efecto de este sobre las células trasplantadas evaluando así solo el efecto del ambiente, de
tal manera que el trasplante se realizó en animales de 7 meses. Luego del trasplante se
esperó un mes (sin terapia, ni andrografólido ni ejercicio) antes de la eutanasia y
congelamiento de los músculos para realizar cortes histólogicos. Por lo tanto los cortes
histológicos corresponden a animales de 8 meses.
0 1 2 3
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tinc
ión
nucl
ear (
Hoe
chst
).
0 1 2 3 0 1 2 3 C57BL/10 mdx
FN
GAPDH
Ejercicio (meses)
C57BL/10 mdx
Meses de ejercicio
Veces d
e indu
cción de
(Fibrio
necFna
/GAP
DH)
Figura 3. El ejercicio acelera la progresión del fenotipo fibrótico en el musculo esquelético de animales distróficos mdx. A. Ratones mdx y controles fueron sometidos a protocolos de ejercitación, 3 veces por semana, por el periodo de tiempo señalado. Al finalizar el protocolo se procedió a aislar el musculo Tibialis Anterior para evaluar los niveles de fibronectina mediante western blot, como control se evaluaron los niveles de la proteína GAPDH. B. Cuantificación de 3 ensayos distintos. Las barras azules representan muestras provenientes de ratones control y las barras rojas muestras provenientes de animales mdx.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1 2 3 4 5 6 7 8
* *
A
B
3.13. Cirugía y Toma de Muestras
Los ratones fueron anestesiados con isofluorano, se registró el peso de cada animal
y se procedió a realizar una incisión abdominal para dejar expuesta la vena cava inferior, de
donde se procedió a extraer sangre con una jeringa de 1 ml heparinizada. El plasma se
separó del resto de los componentes sanguíneos por centrifugación a 1500 g por 20 min. a
temperatura ambiente. Posteriormente los ratones fueron sacrificados a través de
dislocación cervical y se procedió a remover los músculos de las extremidades,
gastrocnemius y tibialis anterior. Los músculos utilizados para los ensayos de
electrofisiología fueron mantenidos en buffer Krebs-Ringer (118 mM NaCl, 25 mM
NaHCO3, 11 mM D-glucosa, 4,7 mM KCl, 3,2 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM
MgSO4) oxigenado a temperatura ambiente hasta su análisis.
Los músculos utilizados para obtención de homogenizado total de músculo para
ensayos de western blot, fueron rápidamente congelados en N2 líquido y almacenados a -
80°C hasta su procesamiento. Los músculos utilizados para análisis histológico e
inmunofluorescencia fueron rápidamente congelados en isopentano enfriado en N2 líquido
y almacenados a -80°C hasta su procesamiento.
3.14. Obtención de Homogenizado Total de Músculo
Los músculos fueron homogenizados en 10 volúmenes de amortiguador de
homogenización (50 mM Tris-HCl pH 8,3, 10 mM EDTA pH 8,0, 1 mM PMSF) por 1 min.
mediante Ultraturrax (Kinematica, Littau, Suiza). El homogenizado resultante se mezcló
con amortiguador de tratamiento 2X (0,125 M Tris pH 6,8, 4% SDS, 20% Glicerol) y se
incubo por 20 min. a 50°C. Posteriormente se centrifugó a 16000 g por 20 min. para
eliminar el material insoluble. Al sobrenadante obtenido se le determinó la concentración
de proteínas y se almacenó a -20°C.
3.15. Determinación de Proteínas en Lisados Celulares y en Homogenizados de
Músculo.
La concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo del ácido
bicinconínico, utilizando el kit comercial BCA protein assay (Thermo Fisher Scientific,
Walthman MA, USA). La reacción se llevó a cabo en una placa de 96 pocillos según las
instrucciones del proveedor y se midió la DO505nm. Los valores de absorbancia corregidos
por los blancos respectivos se interpolaron en una curva de calibración preparada a partir de
una solución de BSA de concentración conocida.
3.16. Hibridación tipo Western Blot
Para el análisis de Western blot de lisados celulares y homogenizados de músculo,
20 µg y 80 µg de proteínas respectivamente. Las muestras de proteínas se mezclaron con un
1/5 de su volumen de una solución de carga (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 25% glicerol, 2%
SDS, 0,7 M β-mercaptoetanol, 0,1% azul de bromofenol) y luego fueron sometidas a
electroforesis denaturante en un gel del 8% al 12% de poliacrilamida-0,1% dodecilsulfato
de sodio (SDS-PAGE) en amortiguador 25 mM Tris-HCl pH 8,3, 192 mM glicina, 0,1%
p/v SDS a 100 V por 1,5-2 hrs. y luego transferidas a una membrana de PVDF (Thermo
Fisher Scientific, Walthman MA, USA) en amortiguador 25 mM Tris-HCl pH 8,3, 192 mM
glicina, 20% v/v metanol a 350 mA por 2,5 hrs. Después de la transferencia, la membrana
fue bloqueada con metanol, secada a 37°C y almacenada a temperatura ambiente hasta su
posterior uso. Las membranas fueron incubadas con los distintos anticuerpos en TBS (150
mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5)-Tween 20 0.1% - leche 5% por una hora a temperatura
ambiente. Luego, se procedió a lavar la membrana 3 veces con TBS-Tween 20 0,1% - leche
5% por 5 min. y se adicionó el anticuerpo secundario contra la IgG respectiva del primario
en TBS-Tween 20 0.1%-leche 5% por una hora a temperatura ambiente.
La unión del complejo anticuerpo primario/anticuerpo secundario a las muestras
proteicas fue visualizada usando el procedimiento de quimioluminiscencia (Thermo Fisher
Scientific, Walthman MA, USA) y detectadas a través de un sistema de documentación de
imágenes Chemidoc. (UVP, Upland CA, USA)
Las señales proteicas detectadas en los Western blots se cuantificaron mediante el
programa Image J (NIH, USA) y los niveles de expresión se normalizaron con respecto a
los niveles del control de carga respectivo en cada muestra.
3.17. Extracción de RNA en músculo esquelético y síntesis de cDNA
El RNA total obtenido de corte histológicos mediante Microdisección Láser
(LMD) se extrajo a través del sistema comercial Arcturus Pico-Pure RNA kit de acuerdo a
las instrucciones del fabricante.
Para la síntesis de DNA complementario (cDNA) se utilizó y el sistema comercial
Superscript RT II. La reacción de transcripción reversa se realizó en un volumen de 20 ul
,para lo cual 1 ug de RNA total se mezclo con 50 ug/ml de Oligo(dT), 50 ng de random
hexámeros y 1 mM de dNTP, la mezcla se incubó por 5 min a 65ºC y se enfrió rápidamente
en hielo. Posteriormente se adicionó 1/5 de volumen de buffer de la enzima (250 mM Tris-
HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 5 mM MgCl2), 10 mM DTT y 2 unidades RNAsaOUT, la
mezcla se incubó por 2 min. a 42ºC. Luego se adicionó 200 unidades de la transcriptasa
reversa SuperScript II RT y se incubó por 10 min. a 25ºC, 50 min a 42ºC y finalmente 15
min. a 70ºC. El cDNA obtenido se almacenó a -20ºC hasta su posterior uso..
3.18. RT-PCR en tiempo real
Las reacciones cuantitativas de PCR en tiempo real se realizaron por triplicado en
el sistema de detección ABI Prism 7700 (Applied Biosystem, Grand Island, NY, USA) Un
10% del producto de transcripción reversa (Metodología 2.17) se utilizó para la reacción de
PCR en tiempo real en un volumen final de 25 µl, utilizando 0,05 volúmenes de mezcla de
partidores y sondas pre-diseñadas Taqman (Materiales X:X), 0,5 volúmenes de la mezcla
universal de Taqman y H2O libre de nucleasas para completar el volumen final. La
expresión del mRNA fue cuantificado usando el método comparativo del dCt usando
GAPDH como gen de referencia.
3.19. Ensayos de electrofisiología
La fuerza muscular se determinó según Gregoveric 2002 y Bognadovick 2002.
Brevemente los músculos posicionados horizontalmente en un baño de órganos que
contenía solución Krebs-Ringer oxigenada. Un extremo fue unido directamente a un
transductor de fuerza isométrica (MLT0201, Panlab, España), dos electrodos de platino
(MLA0303, Panlab, España) fueron posicionados en el baño de órganos flanqueando el
largo del músculo. Los músculos fueron estimulados por un estimulador generador de
pulsos de ondas cuadradas (S48 Stimulator, Grass, USA). Los parámetros de estimulación y
la respuesta muscular se controlaron y midieron usando el programa LabChart (AD
Instrument, USA)
El largo muscular óptimo y el voltaje de estimulación fueron determinados por
micromanipulación del largo muscular para producir la máxima contracción isométrica. La
fuerza isométrica máxima tetánica fue determinada del valor máximo de la curva de
relación entre fuerza isométrica especifica (mN/mm2) y la frecuencia de estimulación entre
1 a 200 Hz por 450 mseg. con 2 minutos de descanso entre cada estímulo. Finalizado los
ensayos funcionales los músculos fueron removidos del baño, se eliminó el tendón y tejido
adherente no muscular, se secaron brevemente papel filtro y se pesaron. La masa muscular
y el largo optimo fueron usados para calcular la fuerza neta especifica (fuerza normalizada
por el area transversal de músculo (CSA, mN/mm2).
3.20. Ensayos de Inmunofluorescencia
Mioblastos C2C12 fueron sembrados y crecidos directamente en cubreobjetos de
vidrio por el tiempo correspondiente al ensayo utilizado. Posteriormente las células fueron
lavadas 2 veces en buffer fosfato salino (PBS) y luego fijadas en PBS-3%
paraformaldehido por 20 min. Para permeabilizar las células se incubaron con PBS-Tritón
X-100 0,05% por 5 min. Para evitar la unión inespecífica epítope-anticuerpo las células se
incubaron por 1 hr. en solución de bloqueo TBS-2% BSA.
Para ensayos de inmunofluorescencia en tejido muscular esquelético utilizando
anticuerpos policlonales, criosecciones de 7 µm de grosor fueron fijadas por 2 min. en
TBS-4% paraformaldehido y bloqueadas por 1 hora en TBS-10% suero de cabra para
anticuerpos policlonales. Para anticuerpos monoclonales el tejido se fijó por 20 min en
acetona fría (-20ºC) y posteriormente se incubó por 1 hora con el sistema comercial MOM
en solución de bloqueo (TBS-Triton-MOM).
Posteriormente los cortes fueron incubados con el anticuerpo primario
correspondiente (tabla anticuerpos), diluidos según tabla en solución de bloqueo. Como
anticuerpos secundarios se utilizaron anticuerpos anti-rabbit de cabra y anti-mouse de
conejo conjugados a fluoróforos Alexa 408 y 505. Los cuales fueron diluidos 1000 veces en
solución de bloqueo e incubados por 1 hora. Para la tinción nuclear las secciones se
incubaron con 1mg/ml de Hoechst 33258 en PBS por 10 min., después de lavar 3 veces en
PBS, las secciones fueron montadas con cubrebjetos usando Fluoromont y visualizados a
través del microscopio invertido Nikon Diaphot (equipado con epifluorescencia.
3.21. Ensayos de Inmunohistoquímica
Para ensayos de inmunohistoquímica en tejido muscular esquelético, criosecciones
de 7 µm de grosor fueron fijadas por 20 min en acetona fría (-20ºC), secadas al aire por 10
min. y posteriormente incubadas toda la noche a 4ºC con anti-CTGF en PBS-5% suero de
cabra, las muestras se lavaron 3 veces en PBS-0,05% Tween-20 y luego se incubaron por 1
hora con anticuerpo anti-goat hecho en conejo en PBS-5% suero de cabra, finalizada la las
muestras fueron bloqueadas por 15 min en metanol-3% H2O2, para bloquear la actividad
peroxidasa endógena del tejido. Posteriormente las muestras se incubaron por 1 hora con
poly-HRP anti-rabbit IgG (Immunologic, Netherlands), lavadas 3 veces con PBS e
incubadas con diaminobencidina (DAB), la reacción cromogénica se detuvo con H2O
destilada. Los núcleos fueron teñidos con hematoxilina por 5 min., lavados con H2O de la
llave por 10 min y finalmente deshidratadas bajo batería de alcoholes desde 70% a 100%,
incubadas en xilol y montadas en Entellan.
3.22. Tinciones histológicas
3.22.1. Tinción de Hematoxilina y Eosina
Para las tinciones histológicas criosecciones de 7 µm de grosor fueron fijadas por
10 min. en 10% de formalina, lavadas en H2O destilada por 10 min. Los núcleos fueron
teñidos con 20% de hematoxilina en PBS por 10 min. y lavadas por 10 min. bajo agua de la
llave. La tinción citoplasmática se realizó incubando las muestras por 30 seg. en 0,25% de
eosina en 80% etanol, las muestras se lavaron con H2O destilada y posteriormente fueron
deshidratadas bajo batería de alcoholes desde 70% a 100%. Finalmente las muestras fueron
incubadas en xilol y montadas en Entellan.
3.22.2. Tinción de Rojo de Picrosirio
Para las detección de colágeno intersticial, criosecciones de 7 µm de grosor fueron
fijadas por 30 min en etanol 100% a -20ºC, lavadas por 3 min en H2O destilada e incubadas
en ácido pícrico acuoso saturado, por 60 min a 50ºC. Luego las muestras fueron lavadas por
3 min en H2O destilada, incubadas por 2 min. en 0,2% PMA acuoso y lavadas 2 veces por 3
min en H2O destilada. Posteriormente las muestras fueron incubadas en 0,1% de Rojo de
Picrosirio en àcido pícrico acuoso saturado por 5 min, lavados en HCl 0,001N por 2 min y
en etanol 70% por 5 min. Finalmente las muestras fueron deshidratadas por batería de
alcoholes desde alcohol 70% a 100%, pasadas por xilol y montadas con Entellan.
3.23. Análisis Estadístico
La significancia estadística de las diferencias entre los promedios de más de dos
grupos experimentales se evaluó usando el análisis de varianza de 1 vía (ANOVA) con un
test múltiple de comparación posterior de Bonferroni (Prism 3,0, GraphPad). Las
diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas con un valor de p<0,05.
La significancia estadística de las diferencias entre los promedios de dos grupos
experimentales se evaluó usando el análisis de t de student (Prism 3,0, GraphPad). Las
diferencias fueron consideradas estadísticamente significativas con un valor de p<0,05.
RESULTADOS
1.-Determinar el efecto del andrografólido sobre la expresión y los efectos
de TGF−β y CTGF en el músculo esquelético.
1.1. Evaluar el efecto del andrografólido sobre la expresión de CTGF y TGF−β en
músculos distróficos.
Como se comentó en la introducción, es posible inducir y acelerar la fibrosis en los
músculos de las extremidades del ratón mdx, mediante protocolos de ejercitación (Ver
materiales y métodos). En primer lugar, evaluamos si el ejercicio induce un aumento en la
expresión de TGF−β, en músculos de animales distróficos mdx. La figura 4 muestran
mediante análisis de RT-PCR y RT-PCR en tiempo real, que el ejercicio induce
significativamente la expresión del mRNA para TGF−β en el músculo esquelético de
ratones mdx. Para determinar si el aumento de la expresión de TGF−β, se correlaciona con
un aumento en la actividad de su ruta de señalización canónica, evaluamos mediante
inmunofluorescencia indirecta, en cortes histológicos de músculo esquelético, el número de
núcleos positivos para la proteína smad-3 fosforilada. Como se demuestra en la figura 5, el
número de células positivas para la proteína smad-3 fosforilada, aumenta
significativamente en respuesta al ejercicio en el músculo de ratones mdx y no así en
músculos de animales control. Este aumento en el número de núcleos positivos se relaciona
directamente con un aumento en el número de células infiltradas en el tejido, ya que no se
Figura 4. El ejercicio induce un aumento en la expresión de TGF-β en músculos distróficos. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de ejercitación 3 veces por semana a una velocidad de 12 metros por minuto, por un período de 1, 2 y 3 meses. Al finalizar el protocolo se procedió a extraer el RNA total del músculo tibialis anterior para evaluar la expresión de TGF-β en este músculo. A) Se evaluó la expresión de TGF-β mediante RT-PCR. B) Del mismo modo se evaluó en forma cuantitativa los niveles del mensajero para TGF-β mediante RT-PCR en tiempo real.
00,51
1,52
2,53
3,54
1 2 3 4
A
B
Niv
eles
rela
tivos
de
expr
esió
n de
l m
RN
A pa
ra T
GF-β
0 1 2 3
*
* *
0 1 2 3
mdx
Ejercicio (meses)
28s
CTGF
0 1 2 3
mdx
Ejercicio (meses)
28s
CTGF
0 1 2 3
mdx
Ejercicio (meses)
28s
CTGF
0 1 2 3
mdx
Ejercicio (meses)
28s
CTGFTGF-‐β
28s
-‐ + -‐ +
-‐ -‐ + +Ejercicio
PARACTIN
mdx
Figura 5. El ejercicio induce un aumento en el número núcleos positivos para la proteína smad-3 fosforilada en ratones mdx. Ratones mdx y controles de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de ejercitación, 3 veces por semana, durante 3 meses. A. Al finalizar el protocolo se procedió a aislar el músculo tibialis anterior para mediante inmunofluorescencia para el número de núcleos positivos para la proteína smad 3 fosforilada (rojo). B. Razón entre núcleos positivos para smad-3 fosforilada y núcleos totales..
C57 BL/10 Sedentario C57 BL/10 ejercitado
mdx Sedentario mdx ejercitado
50 µm
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Nucleos positivos para smad
-‐3
fosforilada/nucleos totales
Ejercicio - +-+
C57BL/10 mdx
A
B
observaron cambios en la razón entre núcleos positivos y núcleos totales. Un blanco de
TGF−β es CTGF, por esta razón evaluamos mediante RT-PCR y RT-PCR en tiempo real,
la expresión del mRNA de CTGF en respuesta al ejercicio en ratones mdx. La figura 6
muestra, mediante ensayos de RT-PCR y RT-PCR en tiempo real, que el ejercicio indujo la
expresión del mRNA de CTGF en el músculo esquelético de ratones distróficos mdx.
En este modelo de inducción de TGF−β y CTGF, por protocolos de ejercitación, en
músculo esquelético de ratones mdx, estudiamos el efecto del antiinflamatorio de origen
botánico, andrografólido. La figura 7 muestra mediante análisis de expresión, que el
andrografólido disminuye los niveles basales del mRNA de TGF−β, pero no su inducción
por ejercicio. Dado este resultado, en el cual mostramos que el andrografólido no tiene
efectos sobre los niveles de expresión de TGF−β inducidos por ejercicio, decidimos evaluar
a expresión de su mediador río abajo CTGF mediante análisis de expresión (RT-PCR y RT-
PCR en tiempo real). A diferencia de lo observado para TGF−β, La figura 8 muestra que el
andrografólido inhibe la inducción de CTGF en respuesta al ejercicio, en el músculo de
animales distróficos. Estos resultados, en conjunto, muestran que el andrografólido sólo
afecta la expresión de CTGF y no la de TGF−β inducida por ejercicio. Como TGF−β,
induce a CTGF y para ahondar en un posible mecanismo de acción del andrografólido,
evaluamos si este último, afectaba la ruta de señalización canónica activada por TGF−β.
Por esta razón, estudiamos mediante inmunofluorescencia indirecta, el efecto del
andrografólido sobre la fosoforilación de smad-3 (figura 9), observando que el
andrografólido disminuyó el aumento en el número de núcleos positivos para smad-3
fosforilada en ratones mdx ejercitados, no obstante la razón entre núcleos positivos para la
proteína smad 3 fosforilada y núcleos totales no fue afectada (figura 10), lo cual sugiere
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1 2 3 4
0 1 2 3
mdx
Ejercicio (meses)
28s
CTGF
Α
Β
Niv
eles
rela
tivos
de
expr
esió
n de
l mR
NA
para
CTG
F
Figura 6. El ejercicio induce un aumento en la expresión de CTGF en músculos distróficos. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de ejercitación 3 veces por semana durante 1, 2 y 3 meses. A) Se evaluó de forma cualitativa la expresión de CTGF mediante RT-PCR. B) Del mismo modo se evaluó en forma cuantitativa los niveles del mensajero para CTGF mediante RT-PCR en tiempo real.
0 1 2 3 0 1 2 3
mdx
Ejercicio (meses)
28s
CTGF
* *
TGF -‐ β
28s
-‐ + -‐ + -‐ -‐ + + Ejercicio
Andrografólido
mdx
Figura 7. El andrografólido no afecta la inducción de TGF-β en ratones mdx ejercitados. Ratones mdx tratados o no con andrografólido, fueron ejercitados durante 3 meses a partir de los 3 meses de edad 3 veces por semana, al finalizar el protocolo se procedió a extraer RNA total del musculo Gastronemio para determinar A) cualitativamente mediante RT-PCR la expresión del mRNA de TGF-β como también en forma cuantitativa a través de RT-PCR en tiempo real (B).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1 2 3 4
Niv
eles
rela
tivos
de
expr
esió
n de
l m
RN
A pa
ra T
GF-β
-‐ + -‐ +
-‐ -‐ + Ejercicio Andrografólido
+
* *
28s
CTGF
-‐ + -‐ + -‐ -‐ + + Ejercicio
Andrografólido
mdx
Figura 8. El Andrografólido inhibe la inducción de CTGF en músculo de ratones mdx ejercitados. Ratones mdx tratados o no con Andrografólido fueron ejercitados durante 3 meses a partir de los 3 meses de edad 3 veces por semana, al finalizar el protocolo se procedió a extraer RNA total del musculo Gastronemio para determinar A) cualitativamente mediante RT-PCR la expresión de CTGF como también en forma cuantitativa a través de RT-PCR en tiempo real (B).
A
B
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1 2 3 4
Niv
eles
rela
tivos
de
expr
esió
n de
l m
RN
A pa
ra C
TGF
-‐ + -‐ + -‐ -‐ + Ejercicio
Andrografólido +
*
-‐ -‐
+ +
Ejercicio
C57B
L/10
mdx
Andrografólid
o -‐
-‐ +
+
Figu
ra 9
. E
l A
ndro
graf
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l A
ndro
graf
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cleo
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pro
teín
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ad-3
fosf
orila
da (r
ojo)
.
50 µ
m
Figura 10. El andrografólido inhibe el aumento células positivas para smad-3 fosforilado en respuesta al ejercicio en ratones mdx. Ratones mdx y C57BL/10 fueron ejercitados durante 3 meses. Al finalizar el protocolo se realizó una inmunofluorescencia para la proteína smad-3 fosforilada. A. cuantificación del promedio total de núcleos por sección. B. Proporción de núcleos positivos para smad-3 fosforilada y núcleos totales (DAPI).
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Nucleos positivos para smad
-‐3 fo
sforilada
Ejercicio - + - +
C57BL/10 mdx
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Nucleos positivos para smad
-‐3
fosforilada/nucleos totales
Ejercicio - + - +
C57BL/10 mdx
una disminución en el número de células positivas para la proteína smad3 fosforilada presente en el tejido.
Conclusiones objetivo 1.1. El andrografólido inhibe la expresión de CTGF, pero no la de
TGF−β inducida por ejercicio en músculos de ratones mdx. El aumento en la expresión de
TGF−β se correlaciona con un aumento en el número de células positivas para smad-3
fosforilada. El andrografólido disminuye el número de células positivas para smad-3
fosforilada inducidas por ejercicio en el músculo de ratones mdx.
1.2. Determinar el efecto del andrografólido sobre los niveles de MEC e inflamación
en músculos distróficos.
Los resultados del objetivo anterior sugieren que existe una regulación del número
de células presentes en el tejido muscular distrófico en respuesta al ejercicio y al
andrografólido. El músculo esquelético distrófico se caracteriza por presentar un alto
número de células inflamatorias (Macrófagos, linfocitos, etc.), muchas de las cuales son
capaces de responder a TGF−β. En colaboración con el laboratorio del Dr. James Tidball
(University of California Los Ángeles, Estados Unidos) estudiamos la presencia de células
inflamatorias en el músculo esquelético de ratones mdx y el efecto del andrografólido sobre
estas poblaciones. Mediante inmunohistoquímica determinamos la presencia de macrófagos
(F4/80 positivos), linfocitos ayudadores (CD4 positivos, CD4+), linfocitos cito-tóxicos
(CD8 positivos, CD8+) y eosinófilos (MBP positivos, MBP+). Las figuras 11 y 12
muestran que el andrografólido redujo significativamente el número de macrófagos
A
B
mdx mdx + Andrografólido
200 µm
200 µm
mdx mdx + Andrografólido
Figura 11. El Andrografólido disminuye el numero de macrófagos en el músculo distrófico de ratones mdx. Ratones mdx de 2 semanas de edad fueron tratados durante las siguientes 2 semanas con Andrografólido, para luego evaluar mediante inmunohistoquímica en el musculo Gastronemio (A)y diafragma (B), la presencia de macrófagos (F4/80).
Macrofagos Eosinófilos CD4+ CD8+ mdx + Vehículo 12145 4635 841 339
mdx + PARACTIN® 6323 2298 417 170
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
Células/mm2
Figura 12. El Andrografólido disminuye el numero de células inflamatorias en el músculo distrófico de ratones mdx. Ratones mdx de 2 semanas de edad fueron tratados durante las siguientes 2 semanas con Andrografólido, para luego evaluar mediante inmunohistquímica en el musculo quadriceps, la cantidad de células inflamatorias presentes por unidad de area. A) inmuhistoquímica para diferentes tipos de células inflamatorias encontradas en el músculo distrófico, eosinófilos (MBP), macrófagos (F4/80), Linfocitos citotóxicos (CD8+) y linfocitos ayudadores (CD4+). B) Cuantificación del numero total de células inflamatorias encontradas en el musculo de los animales distróficos tratados o no con el Andrografólido.
infiltrados en el músculo distrófico de animales mdx, como también la cantidad de otras
células de origen inflamatorio como los eosinófilos, los linfocitos T cito-tóxicos (CD8+) y
los linfocitos T ayudadores (CD4+).
La infiltración de células inflamatorias en un tejido, se correlaciona con un
incremento en el daño tisular y con un aumento en el contenido de MEC (fibrosis). Por esta
razón, estudiamos el fenotipo muscular mediante tinción de hematoxilina/eosina y la
deposición de proteínas de MEC, como colágeno tipo III, mediante ensayos de
inmunofluorescencia indirecta. La figura 13 muestran que el andrografólido inhibió la
inducción de fibrosis por ejercicio en el músculo esquelético de ratones mdx, como también
inhibió el número de sitios de alta infiltración inflamatoria. Al evaluar específicamente los
niveles de MEC, mediante inmunofluorescencia indirecta, para detectar el contenido de
colágeno tipo III alrededor de las fibras musculares, observamos que el andrografólido
inhibió el aumento de esta molécula de MEC inducida por ejercicio en músculos distróficos
(Figura 14). Estos resultados fueron corroborados mediante ensayos de western blot
determinando los niveles de la proteína colágeno tipo III y de otra proteína de MEC como
lo es fibronectina (Figura 15). Los resultados muestran que el ejercicio no es capaz de
inducir fibrosis muscular en animales distróficos que han sido tratados con el
andrografólido.
Conclusión 1.2. El andrografólido inhibió la inducción por el ejercicio, de proteínas de
MEC como colágeno tipo II y fibronectina, en ratones mdx. Además, el andrografólido
disminuyó el número de células inflamatorias, especialmente macrófagos, en el músculo
Figu
ra 1
3. E
l And
rogr
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cció
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C57B
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-‐-‐
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Ejercicio
C57B
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+
Figu
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4. E
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50 µ
m
Col III
GAPDH
-‐ + -‐ +
-‐ -‐ + +Ejercicio
PARACTIN -‐ + -‐ +
-‐ -‐ + +
C57BL/10 mdx
FN
Ejercicio Andrografólido
FN
Tub
Paractin -‐ + -‐ +mdx
Ejercicio -‐ -‐ + +Ejercicio
Andrografólido
Figura 15. El Andrografólido inhibe la inducción de MEC en músculo de ratones mdx. A. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con el inhibidor de Andrografólido y además fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el protocolo, se aisló el músculo Tibialis Anterior y se procedió a realizar un extracto de proteínas para determinar los niveles de Fibronectina (FN) y colágeno tipo III (Col III) mediante ensayos de western blot. Como control de carga se evaluaron los niveles de la proteína GAPDH. B. Ratones mdx de 2 semanas de edad fueron tratados o no con el inhibidor de NFkB (Andrografólido) y a partir de los 3 meses de edad fueron también ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el protocolo, se aisló el músculo Tibialis Anterior y se procedió a determinar los niveles de fibronectina (FN) mediante ensayos de western blot. Como control de carga se evaluó la proteína Tubulina (Tub).
A
B
esquelético distrófico. Por último, el andrografólido inhibió la inducción de fibrosis e inflamación muscular inducida por ejercicio en músculos distróficos.
1.3. Evaluar el efecto del andrografólido en la inflamación y fibrosis muscular
inducida por TGF−β.
En los capítulos anteriores, los resultados sugieren que el andrografólido inhibe la
inducción de fibrosis e inflamación en el músculo esquelético de ratones mdx y que este
efecto se correlaciona con un efecto río abajo de TGF−β y río arriba de CTGF. Por esta
razón, para ahondar en este mecanismo, evaluamos, in vitro, si el andrografólido afecta la
expresión del mediador río abajo de TGF−β, CTGF. Para ello utilizamos la línea celular de
músculo C2C12 la cual fue incubada con TGF−β durante 6 horas en presencia y ausencia
de andrografólido para determinar posteriormente mediante ensayos de northern blot la
expresión del mRNA para CTGF. Como se observa en la Figura 16, el andrografólido
inhibió la expresión de CTGF inducida por TGF−β en células musculares C2C12. La dosis
óptima de andrografólido para efectuar el efecto inhibitorio fue de 50 µΜ. Del mismo
modo, evaluamos en células musculares C2C12, el efecto del andrografólido sobre la
inducción de proteínas de MEC, mediante ensayos de western blot e inmunofluorescencia
indirecta. La figura 17 muestra que una dosis de 50 µΜ de andrografólido es capaz de
inhibir la inducción de proteínas de MEC como fibronectina y colágeno tipo III. Asimismo,
evaluamos los niveles proteicos de CTGF inducidos por TGF−β en presencia y ausencia del
andrografólido (figura 17), encontrando similares efectos a los encontrados mediante
northern blot en la figura 16, en el cual el andrografólido inhibió la inducción de CTGF por
Figura 16. El andrografólido inhibe la inducción de CTGF por TGF-β. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 6 horas con TGF-β en presencia y ausencia de Andrografólido, al finalizar la incubación se procedió a extraer el RNA total de los extractos para evaluar mediante ensayos de Northern Blot los niveles de expresión del mRNA de CTGF en respuesta a TGF-β. Como control de carga se muestran las subunidades ribosomales 28s y 18s.
-‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ + + + + TGF-‐β1 (10 ng/ml)
-‐-‐ -‐-‐ 50 25 12.5 -‐-‐ 50 25 12.5 Andrografólido (µM)
CTGF
CTGF
28S
18S
-‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ + + + TGF-‐β1 (10 ng/ml)-‐-‐ 50 -‐-‐ -‐-‐ 50 -‐-‐ Andrografólido (µM)
A
B
25
Figura 17. El Andrografólido inhibe la inducción de proteínas de MEC por TGF-β en células musculares. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF-β en presencia y ausencia de Andrografólido. Finalizado el protocolo se evaluó mediante ensayos western blot los niveles de fibronectina, Colágeno tipo III y CTGF. Como control de carga se utilizó la proteína GAPDH.
Control
TGF-‐β
Andrografólido
TGF-‐β + Andrografólido TGF-‐β + PARACTIN
PARACTIN
-‐ + -‐ +
-‐ -‐ + +TGF-‐β
PARACTIN
mdx
FN
GAPDH
COL III
CTGF
TGF-‐β (10 ng/ml) Andrografólido (50µM)
Figura 18. El Andrografólido inhibe la insucción de colágeno tipo III por TGF-β. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF-β en presencia y ausencia del inhibidor de Andrografólido y el extracto enriquecido en el (PARACTIN). Finalizado el protocolo se evaluó mediante inmunofluorescencia indirecta en celulas no permeabilizadas, la acumulación de Colágeno tipo III (verde). En azul (Hoechst) se muestran los núcleos celulares.
TGF−β. Para caracterizar la localización extracelular de estos componente de la MEC,
evaluamos mediante inmunofluorescencia indirecta en células musculares C2C12 no
permeabilizadas, la deposición de Colágeno tipo III en respuesta a TGF−β. La figura 18
muestra la inhibición de la inducción de colágeno tipo III por TGF−β, cuando las células
están en presencia de andrografólido o extractos enriquecidos en él (PARACTIN). Para
demostrar que el colágeno se encuentra depositado sobre la MEC y no adherido a las
células, realizamos una inmunofluorescencia, en la cual previamente las células fueron
soltadas con una solución tampón que contenía EDTA (figura 19), observando que el
andrografólido ininibió la inducción de colágeno tipo III depositado en la MEC por TGF−β
en células musculares C2C12. Para determinar si este efecto era capaz de replicarse en
otros tipos celulares presentes en los músculos, como fibras musculares y fibroblastos,
evaluamos mediante ensayos de western blot, el efecto del andrografólido sobre la
inducción de proteínas de MEC (colágeno tipo III y fibronectina) en células musculares
C2C12 diferenciadas (miotubos) y en fibroblastos (línea celular de fibroblastos 3T3). Los
resultados de la figura 20 muestran que el andrografólido también fue capaz de inhibir la
inducción de colágeno tipo III y fibronectina en estos tipos celulares.
Dado los efectos inhibitorios del andrografólido sobre la acción de TGF−β
observados in vitro, decidimos determinar si el andrografólido podía actuar del mismo
modo in vivo. Para ello inyectamos con TGF−β músculos tibialis anterior de ratones control
tratados o no con el andrografólido, para evaluar mediante RT-PCR en tiempo real, la
expresión de moléculas de MEC y de marcadores relacionados con inflamación. Como se
puede observar en la figura 21, TGF−β indujo la expresión de colágeno tipo I, la cual fue
inhibida en ratones tratados con andrografólido. Asimismo, TGF−β indujo la expresión de
Control
TGF-‐β
Andrografólido
TGF-‐β + Andrografólido
Hoechst
TGF-‐β + Paractin
Paractin
Figura 19. El andrografólido inhibe la inducción de colágeno tipo III por TGF-β. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF-β en presencia y ausencia del inhibidor de andrografólido y el extracto enriquecido en el (PARACTIN®). Finalizado el protocolo, las células fueron soltadas utilizando el quelante de calcio EDTA para luego evaluar mediante inmunofluorescencia indirecta, la deposición de Colágeno tipo III (rojo). En azul (Hoechst) se muestran los núcleos celulares. Se utilizó la tinción Hoechst para demostrar que la señal es proveniente de la MEC y no de células adheridas.
Figura 20. El Andrografólido inhibe la inducción de proteína de MEC por TGF-β en miotubos y fibroblastos. A. Células musculares C2C12 fueron diferenciadas para formar miotubos, al día 5 de diferenciación fueron incubadas durante 24 horas con TGF-β en presencia y ausencia de Andrografólido. Finalizado el protocolo se evaluó mediante ensayos de western blot los niveles de fibronectina y colágeno tipo III, como control de carga se utilizó la proteína GAPDH. B. Fibroblastos 3T3 fueron incubados durante 24 horas con TGF-b en presencia y ausencia de Andrografólido. Finalizado el protocolo se evaluó mediante ensayos de western blot los niveles de fibronectina y colágeno tipo III, como control de carga se utilizó la proteína GAPDH.
+ + -‐ -‐ -‐ -‐ + +
Andrografólido TGF-‐β
FN
Col III
Tub
+ + -‐ -‐ -‐ -‐ + +
Andrografólido TGF-‐β
FN
Col III
Tub
A
B
A
C
B
D
Figura 21. El andrografólido inhibe la inflamación inducida por TGF-β en el músculo esquelético. Músculos tibialis anterior de ratones C57 BL/10 tratados o no con andrografólido, fueron inyectados con TGF-b1, para evaluar mediante RT-PCR en tiempo real, los niveles de expresión de moléculas relacionadas con fibrosis como colágeno tipo I (A) e inflamación como IFN-γ (B), además se evaluaron los niveles de expresión de marcadores celulares específicos de macrófagos del tipo M1 como es CD68 (C) y de macrófagos M2 como CD 206 (D).
0
2
4
6
8
10
12
Adv GFP + Vehiculo
Adv GFP + Andrografólido
Adv CTGF + Vehiculo
Adv CTGF + Andrografólido
Veces d
e indu
cción Co
lágeno
tipo
I
BSA + Vehículo
TGF-β + Andrografólido
BSA + Andrografólido
TGF-β + Vehículo
0
2
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12
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
Veces d
e indu
cción CD
206
BSA + Vehículo
TGF-β + Andrografólido
BSA + Andrografólido
TGF-β + Vehículo
BSA + Vehículo
TGF-β + Andrografólido
BSA + Andrografólido
TGF-β + Vehículo
0
2
4
6
8
10
12
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
Veces d
e indu
cción CD
68
0
2
4
6
8
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12
BSA + Vehiculo BSA + Andrografólido
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
Veces d
e indu
cción IFN-‐gam
ma
BSA + Vehículo
TGF-β + Andrografólido
BSA + Andrografólido
TGF-β + Vehículo
BSA + Vehículo
TGF-β + Andrografólido
BSA + Andrografólido
TGF-β + Vehículo
0
2
4
6
8
10
12
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
Veces d
e indu
cción CD
68
marcadores inflamatorios como IFN-γ, marcadores específicos de macrófagos del tipo M1
(CD68) y de macrófagos M2 (CD206), efectos que fueron inhibidos por el andrografólido.
No obstante, es interesante destacar que el andrografólido mostró un efecto inhibitorio
mayor sobre la inducción de marcadores de macrófagos M1 en comparación a los de
macrófagos M2.
Estos resultados muestran que los efectos inhibitorios del andrografólido sobre la
acción de TGF−β, pueden replicarse in vivo. Gran parte de los efectos pro-fibrosantes son
mediados a través de las proteínas smad (ruta de señalización canónica) y el andrografólido
es un inhibidor covalente de la subunidad p50 de NFκB, por ende, para descartar un efecto
del andrografólido sobre las rutas de activación canónica de TGF−β, evaluamos, in vitro, si
el andrografólido afectaba la fosforilación de las proteínas smad 2/3. La figura 22 muestra
un western blot para la proteína smad-3 fosforilada de extractos provenientes de células
musculares C2C12 tratadas con TGF−β en presencia y ausencia de andrografólido. Se
puede observar que el andrografólido no tuvo un efecto significativo sobre la fosforilación
de smad-3. Para corroborar este resultado, realizamos inmunofluorescencia indirecta para la
proteína smad-3 fosforilada y de esta forma evaluar si la translocación nuclear de esta se
encontraba afectada. En la figura 23 se observa que el andrografólido, como también el
extracto enriquecido en él (PARACTIN), no afecta la translocación nuclear de la proteína
smad-3 fosforilada en respuesta a TGF−β. Por último, realizamos ensayos de genes
reporteros específicos para TGF−β encontrando que el andrografólido no tuvo efecto sobre
la inducción de este reportero (Figura 24). Estos resultados sugieren que el andrografólido
no afecta la vía de señalización canónica activada por TGF−β.
TGF-‐ β (1ng/ml) -‐ -‐ + Andrografólido(50µM)
-‐ + -‐ + p -‐ smad3
smad3
+
Control
TGF-‐β
Andrografólido
TGF-‐β + Andrografólido TGF-‐β + PARACTIN
PARACTIN
Figura 22. El Andrografólido no afecta la fosforilación de smad-3 inducida por TGF-β en células musculares. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 30 min. con TGF-β en presencia y ausencia de Andrografólido para evaluar mediante ensayos de western blot la fosforilación de la proteína smad-3. Como control se determinaron los niveles de la proteína smad-3 total.
Figura 23. El Andrografólido no afecta la translocación nuclear de smad-3 inducida por TGF-β en células musculares. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 1 hora con TGF-β, en presencia y ausencia de Andrografólido y PARACTIN, para evaluar mediante inmunofluorescencia la translocación nuclear de la proteína smad-3 fosforilada (verde).
Figura 24. El andrografólido no afecta la inducción del reportero especifico para TGF-β, p3Tp-Luc en mioblastos C2C12. Mioblastos C2C12 fueron transfectadas transitoriamente con el reportero especifico para TGF-β, p3Tp-Luc, para luego ser estimuladas durante 48 horas con 10ng/ml de TGF-β1 en presencia y ausencia de 50 µM de andrografólido. Finalizado el protocolo se determinó la actividad de la enzima luciferasa.
0
5
10
15
20
25
control TGF-‐b andrografólido andrografólido + TGF-‐b
Veces d
e indu
cción repo
rtero p3
Tp-‐Luc
Dado que está descrito que el andrografólido inhibe a NFκB y en esta investigación
hemos demostrado que además inhibe los efectos de TGF−β decidimos determinar si
TGF−β es capaz de activar a NFκB en células musculares C2C12. Existen ciertos eventos
necesarios que conllevan a la activación de NFκB, como la fosforilación de IκB y la
posterior degradación de este. La figura 25a muestra que TGF−β induce la fosforilación de
IκB, además observamos que esta fosforilación trajo por consecuencia la degradación de la
proteína IκB (figura 25b). Para corroborar la observación de que TGF−β podría activar la
ruta de señalización de NFκB en células musculares, evaluamos la actividad de un gen
reportero que posee elementos de respuesta específicos para NFκB en respuesta a TGF−β
en células musculares C2C12. Los resultados obtenidos sugieren que TGF−β es capaz de
inducir la actividad del reportero para NFκB y que esta es inhibida completamente por el
andrografólido (Figura 26). Además, se observa que existe una menor actividad del
reportero en las células no inducidas con TGF−β pero tratadas con andrografólido, lo cual
indica una inhibición de la actividad basal de NFκB en estas células.
Conclusiones objetivo 1.3: El andrografólido inhibe los efectos pro-fibrosantes y pro-
inflamatorios inducidos por TGF−β de una manera smad independiente. Además TGF−β es
capaz de activar la ruta canónica de NFκB en células musculares C2C12, la cual es inhibida
por el andrografólido.
Figura 25. TGF-β es capaz de activar la ruta de activación canónica de NFκB en células musculares C2C12. A) Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 30 min. con TGF-b en presencia y ausencia de Andrografólido para evaluar mediante western blot la fosforilación de la proteína IκB, como control positivo se utilizó TNF-α. B) Células musculares C2C12 fueron incubadas con TGF-β durante 60 y 360 min. en presencia y ausencia de Andrografólido para evaluar mediante western blot los niveles de la proteína IκB, como control positivo se utilizó TNF-α.
PARACTIN -‐-‐+ +TGF-‐β-‐+ -‐+
P-‐IκB
IκBtotal
-‐ + -‐ +
-‐ -‐ + +TGF-‐β
AndrografólidoPARACTIN -‐ -‐ + +
TGF-‐β -‐ + -‐ +
P-‐IκB
IκB total
P-‐IκB
IκB
TGF-‐ β (1ng/ml) -‐ -‐ + Andrografólido (50µM) -‐ + -‐ +
+
TGF-‐β (1 ng/ml) -‐ 60 360
IκB
TGF-‐ β (1ng/ml) -‐ 60 360
A
B
Veces d
e indu
cción gen
repo
rtero NFκB
Andrografólido (50 µM)
H2O2
TGF-‐β (10 ng/ml)
PARACTIN
012345678910111213141516
-‐ + -‐ -‐ + -‐ -‐ +-‐ -‐ + -‐ -‐ + -‐ -‐-‐ -‐ -‐ + + + -‐ -‐-‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ + +
-‐+-‐+
Figura 26. TGF-β induce la actividad de un reportero para NFκB en células musculares C2C12. Células musculares C2C12 fueron transfectadas con un reportero específico para NFκB y posteriormente fueron incubadas durante 24 horas con TGF-β en presencia y ausencia de Andrografólido y/o PARACTIN. Como control positivo de la inducción del reportero se utilizó H2O2 (200 µM).
1.4. Evaluar el efecto del andrografólido en la inflamación y la fibrosis muscular inducida por CTGF.
En el objetivo anterior demostramos que el andrografólido inhibe los efectos pro-
fibróticos y pro-inflamatorios inducidos por TGF−β tanto in vivo como in vitro. Por lo
tanto, nos planteamos estudiar si este efecto era exclusivo para TGF−β o también podía
afectar los efectos de su mediador río abajo CTGF. Un ensayo para determinar la actividad
de CTGF, es evaluar la formación de fibras de estrés en respuesta a CTGF en células
musculares C2C12. La figura 27 muestra, a través de inumonofluorescencia, que en células
tratadas con andrografólido, CTGF no es capaz de inducir la formación de fibras de estrés,
lo cual sugiere que el andrografólido no sólo afecta la expresión de CTGF, como se mostró
en el sub objetivo anterior, sino que también tiene un efecto río abajo de la señalización de
CTGF (figura 27).
En nuestro laboratorio, Gabriela Morales (Morales y cols., 2011) demostró que
CTGF es capaz de inducir fibrosis en el músculo esquelético de ratones control. Por ello,
decidimos evaluar si el andrografólido era capaz de inhibir, in vivo, los efectos pro-
fibrosantes inducidos por CTGF. Para tal efecto, ratones control fueron tratados o no con
andrografólido e inyectados en el músculo tibialis anterior con un adenovirus que contiene
la secuencia codificante para CTGF. La figura 28 muestra una inmunohistoquímica para
colágeno tipo III en cortes histólogicos de músculo Tibialis Anterior, en donde se observa
que el andrografólido inhibió la inducción de este marcador de MEC por CTGF. Además,
mediante ensayos de RT-PCR en tiempo real (figura 29), evaluamos los niveles de
expresión de marcadores de fibrosis (colágeno tipo I) e inflamación (IFN-γ, CD68 y
Figura 27. El andrografólido inhibe la formación de fibras de estrés inducida por CTGF en células musculares. Células musculares C2C12 fueron pre-incubadas durante 2 horas con andrografólido para luego ser co-incubadas con CTGF durante 1 hora. Al finalizar la incubación las muestras fueron estudiadas mediante inmunofluorescencia utilizando la toxina faloidina acoplada a FITC (verde).
Control
CTGF + Andrografólido
Andrografólido
CTGF
Figura 28. El andrografólido inhibe el aumento de colágeno tipo III inducido por CTGF en el músculo esquelético. Ratones C57BL/10 fueron inyectados en el músculo Tibialis Anterior con un adenovirus que contiene la secuencia codificante para CTGF. Previamente los ratones fueron tratados con andrografólido durante 2 días previos a la inyección y durante los 5 días posteriores a la inyección. Se evaluó mediante inmunohistoquímica la proteína de MEC colágeno tipo III.
Adv CTGF + Andrografólido CTGF + PBS Adv
100 µm
0
2
4
6
8
10
12
Adv GFP + Vehiculo Adv GFP + PARACTIN
Adv CTGF + Vehiculo
Adv CTGF + PARACTIN
Veces d
e indu
cción CD
206
Adv CTGF + Andrografólido
Adv GFP + Vehículo
Adv GFP + Andrografólido
Adv CTGF + Vehículo
Adv CTGF + Andrografólido
Adv GFP + Vehículo
Adv GFP + Andrografólido
Adv CTGF + Vehículo
0
2
4
6
8
10
12
BSA + Vehiculo BSA + PARACTIN TGFb + Vehiculo TGFb + PARACTIN
Veces d
e indu
cción IFN-‐gam
ma
0
2
4
6
8
10
12
Adv GFP + Vehiculo Adv GFP + PARACTIN
Adv CTGF + Vehiculo
Adv CTGF + PARACTIN
Veces d
e indu
cción Co
lágeno
tipo
I
Adv CTGF + Andrografólido
Adv GFP + Vehículo
Adv GFP + Andrografólido
Adv CTGF + Vehículo
0
2
4
6
8
10
12
Adv GFP + Vehiculo Adv GFP + PARACTIN
Adv CTGF + Vehiculo
Adv CTGF + PARACTIN
Veces d
e indu
cción CD
68
Adv CTGF + Andrografólido
Adv GFP + Vehículo
Adv GFP + Andrografólido
Adv CTGF + Vehículo
A
C
B
D
Figura 29. CTGF induce fibrosis e inflamación en el musculo esquelético y el andrografólido es capaz de inhibir estos efectos. Músculos tibialis anterior de ratones C57BL/10 tratados o no con andrografólido, fueron inyectados con un adenovirus que contiene la secuencia codificante para CTGF, para evaluar mediante real time RT-PCR, los niveles de expresión de moléculas relacionadas con fibrosis como colágeno tipo I (A) e inflamación como IFN-γ (B), además se evaluaron los niveles de expresión de marcadores celulares específicos de macrófagos del tipo M1 como es CD68 (C) y de macrófagos M2 CD206 (D).
CD206), observando que CTGF no solo actúa como un pro-fibrótico sino que también tiene
actividad pro-inflamatoria. Ambos tipos de actividades fueron inhibidas por el
andrografólido, teniendo este un mayor efecto sobre la inducción de marcadores del tipo
M1 (CD68) por sobre M2 (CD206). Para ahondar en este tema, evaluamos mediante
inmunofluorescencia indirecta la presencia de células inflamatorias, específicamente
macrófagos, en el músculo esquelético de animales tratados o no con el andrografólido que
fueron inyectados con el adenovirus codificante para CTGF. La figura 30 muestra que
CTGF indujo una elevada infiltración macrofágica tanto del tipo M1 (F4/80 positivos y
CD206 negativos) como del tipo M2 (F4/80 positivos y CD206 positivos). El
andrografólido disminuyó considerablemente esta respuesta inflamatoria inducida por
CTGF, teniendo un efecto principalmente sobre la respuesta inflamatoria del tipo M1 como
se puede observar en la figura 31.
Conclusiones objetivo 1.4. El andrografólido inhibe, in vitro, la formación de fibras de
estrés inducidas por CTGF. CTGF no solo es capaz de inducir fibrosis, sino que también
induce inflamación en el músculo esquelético. El andrografólido inhibió tanto los efectos
pro-fibrosantes como los pro-inflamatorios inducidos por CTGF, afectando principalmente
la respuesta inflamatoria del tipo M1 inducida por CTGF.
Conclusiones generales objetivo 1. TGF−β es capaz de activar a NFκB en células
musculares y el andrografólido es capaz de inhibir los efectos de TGF−β de una manera
smad independiente. CTGF y TGF−β tienen efectos pro-fibróticos y pro-inflamatorios en el
músculo esquelético, los cuales son inhibidos por el andrografólido.
AdvCTGF + AndrografólidoAdvCTGF + PBS
A
B
Figura 30. CTGF induce un aumento en la infiltración de macrofágos en el musculo esqueletico y el andrografólido inhibe este efecto. Ratones C57BL/10 fueron inyectados en el musculo tibialis anterior con un adenovirus que contiene la secuencia codificante para CTGF. Previamente los ratones fueron tratados con andrografólido durante 2 días previos a la inyección y durante los 5 días posteriores a la inyección. A) Se evaluó mediante inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos anti F4/80 (verde) y CD206 (rojo) para determinar los tipos de poblaciones presentes en el tejido. Los macrofagos del tipo M1 (F4/80 positivos y CD206 negativos) se observan en verde, mientras los macrófagos del tipo M2 (F4/80 positivos y CD206 positivos). Se observan en color amarillo. (B) Para determinar de forma más específica la presencia de macrófagos M1, determinamos mediante inmunohistoquímica la presencia de estos utilizando el anticuerpo anti CD68.
50 µm
50 µm
A
Figura 31. El andrografólido disminuye principalmente el número de Macrófagos M1 inducidos por CTGF en el músculo esquelético. Ratones C57BL/10 fueron inyectados en el musculo tibialis anterior con un adenovirus que contiene la secuencia codificante para CTGF. Previamente, los ratones fueron tratados con andrografólido durante 2 días previos a la inyección y durante los 5 días posteriores a la inyección. A) Cuantificación del número de macrófagos M1 por unidad de área, evaluados mediante inmunofluorescencia (F4/80 positivos y CD206 negativos). B) Cuantificación del número de macrófagos M2, evaluados mediante inmunofluorescencia (F4/80 positivos y CD206 positivos) por unidad de área. C) Porcentaje del número de macrófagos M1 y M2 versus el número total de Macrófagos.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
Adv CTGF + Vehículo Adv CTGF + Andrografólido
Macrófagos M2
N°de MacrófagosM
2/mm
2
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
Adv CTGF + Vehículo Adv CTGF + Andrografólido
Macrófagos M1
N°de MacrófagosM
1/mm
2
C
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Adv CTGF + Vehículo Adv CTGF + Andrografólido
Macrófagos M1
Macrófagos M2
% de MacrófagosM1 o M2/
Macrófagos totales
2. Determinar si la modulación de la fibrosis por el andrografólido afecta
la migración celular, la eficiencia de las terapias celulares y la función
muscular.
2.1. Evaluar si la disminución de la fibrosis por el andrografólido facilita la migración
celular en el músculo esquelético.
En el objetivo 1, hemos demostrado que tanto TGF−β y CTGF poseen efectos pro-
inflamatorios y pro-fibrosantes y que además el andrografólido es capaz de inhibir estos
efectos. No obstante, consideramos importante y necesario evaluar el impacto de estos
fenómenos patológicos en la fisiología del músculo esquelético. Observamos que tanto
CTGF y TGF−β se relacionan con un deterioro del fenotipo muscular y que estos
fenómenos pueden ser reveritidos por el andrografólido, Sin embargo no queda claro cuáles
son los procesos celulares que la fibrosis podría estar afectando. Por un lado, para que
exista una correcta reparación de las fibras dañadas, las células precursoras deben llegar a
tiempo a los sitios en donde comenzarán a formar fibras musculares nuevas, por lo tanto, es
plausible pensar que en el tejido muscular fibrótico este proceso se vea dificultado. Por otra
parte, no necesariamente un músculo distrófico con menor grado de fibrosis se traducirá en
un músculo de mejores características funcionales o contráctiles.
Para determinar si la fibrosis propiamente tal, afecta la migración celular en
músculos distróficos, aislamos fibroblastos de tendón, los cuales tienen un alta capacidad
migratoria además de tener la facultad de sobrevivir en zonas con alto contenido de MEC y
bajo contenido de oxigeno (Gargioli y cols., 2008). Estos fibroblastos fueron teñidos con
una sonda lipofílica fluorescente (DiI) y fueron inyectados en el músculo tibialis anterior.
Luego de un mes los músculos fueron procesados para análisis inmunohistológicos. La
figura 32 muestra que la migración se ve disminuida en músculos de animales distróficos
con un mayor grado de fibrosis (músculo ejercitado), el tratamiento previo con el
andrografólido para inhibir la inducción de fibrosis, logró recuperar a niveles control la
migración celular. Del mismo modo, en la figura 33 se puede observar como las células
migratorias migran hacia zonas con menor deposición de colágeno tipo III.
Conclusión objetivo 2.1. La fibrosis producto del ejercicio inhibe la migración celular en
músculo de ratones mdx, efecto que puede revertirse con el tratamiento con adrografólido.
Del mismo modo, fibroblastos migratorios se distribuyen preferentemente en zonas con
bajo contenido de MEC.
2.2. Determinar si la disminución de la fibrosis por el andrografólido aumenta el
número de fibras capaces de revertir distrofina
Como demostramos en el sub objetivo anterior la fibrosis afecta la migración
celular, impidiendo que las células puedan distribuirse en forma homogénea en el tejido,
este efecto fue revertido por el uso del andrografólido, por dicha razón decidimos evaluar si
la inhibición de la fibrosis por el andrografólido es capaz de incrementar la eficiencia de las
terapias celulares cuya finalidad es la de re-expresar la proteína distrofina en las fibras
musculares de músculos distróficos. Para tal efecto, ratones mdx fueron tratados
previamente con el andrografólido para disminuir la fibrosis y luego fueron trasplantados
Figure 32. La fibrosis inhibe la migración celular y el andrografólido revierte este efecto. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con andrografólido y además ejercitados durante 3 meses. Finalizado este protocolo se procedió a inyectar 5 millones de células migratorias (fibroblastos de tendón) teñidas con DiI (rojo) en el musculo Tibialis Anterior. A. Luego de transcurrido un mes post-inyección se cuantificó el número de células encontradas en lugares lejanos al sitio de la inyección en relación al numero total de células encontradas por sección. En verde se muestra la proteína colágeno tipo III teñida mediante inmunofluorescencia. B. Cuantificación del porcentaje de células encontradas en zonas alejadas al sitio de la inyección (mayor a 1 mm de distancia).
A
B
Ejercicio Andrografólido
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4-‐ -‐
+ -‐
-‐ +
+ +
mdx sedentario + vehículo
mdx sedentario + vehículo
mdx ejercitado + Andrografólido
mdx ejercitado+ Andrografólido
Figura 33. Las células migratorias se encuentran preferentemente en aéreas con bajo contenido de Colágeno tipo III. Músculos tibialis anterior de animales mdx tratados o no con andrografólido, fueron inyectado con 5 millones de células migratorias (fibroblastos de tendón) teñidas con DiI (rojo). Luego de un mes se procedió a realizar cortes histológicos y del músculo para determinar el número de células migratorias en diferentes zonas con diferentes niveles de colágeno tipo III (verde). El contenido se colágeno se cuantifico de forma indirecta, mediante el software image J (NIH/USA), determinando el area de la imagen ocupada por colágeno.
0-‐10 10-‐20 20-‐30 30-‐40 40-‐50 50-‐60 60-‐70 70-‐80 80-‐90 90-‐100 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
% de colágeno 6po III
% de celulas m
igratoria
s
en el músculo Tibialis Anterior con precursores miogénicos (células satélites) estos ensayos
fueron realizados en colaboración con el Dr. Jaime Gutiérrez de nuestro laboratorio. La
figura 34 muestra una inmunofluorescencia doble, en donde se observa la disminución de
la proteína colágeno III (verde) en ratones mdx tratados con el andrografólido y un aumento
significativo en el número de fibras musculares que re-expresan la proteína distrofina
(rojo), llegando a un incremente de más de un 300% en comparación a la reversión
observada en músculos provenientes de ratones mdx no tratados con el andrografólido.
Conclusiones 2.2. El tratamiento previo con andrografólido aumenta el número de fibras
musculares que re-expresan distrofina en músculos distróficos trasplantados con células
miogénicas.
2.3. Evaluar el efecto del andrografólido en la fuerza muscular
Dado que el ejercicio indujo fibrosis en el músculo esquelético de los ratones mdx y
ésta es disminuida por el andrografólido (como se observó en el objetivo 1), nos
propusimos determinar cómo estos eventos afectan la funcionalidad muscular. De esta
forma, nos enfocamos en determinar directamente la fuerza muscular desarrollada en
músculos aislados, mediante técnicas de electrofisiología. Primero se procedió a determinar
la frecuencia en la cual el músculo desarrolla una contracción máxima (sacudida),
realizando un barrido de 0 a 200 pulsos/segundo (pps) (De Luca y cols., 2005). En la figura
35 se observa una medición electrofisiológica para el músculo Gastronemio, en donde se
aprecia una curva típica de frecuencia versus fuerza muscular tanto para el músculo de
Vehículo Andrografólido
0
40
80
120
160
200
mdx + Vehículo mdx + PARACTIN
# Fibras distrofi
na (+
) / Tibialis
Anterio
r
Figura 34. El tratamiento previo con andrografólido aumenta la eficiencia de la terapia celular. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados durante 2 meses con andrografólido. Finalizado este tratamiento se esperaron 2 semanas para luego trasplantar mioblastos de musculo control en el musculo Tibialis Anterior de estos ratones. A) Al cabo de 1 mes se procedió a analizar los músculos mediante inmunofluorecencia indirecta para determinar el numero de fibras capaces de expresar distrofina (rojo). Para demostrar que los músculos provenientes de ratones mdx tratados con andrografólido presentan menos fibrosis, realizamos inmunofluorescencia para la proteína de MEC (colágeno tipo III) mostrada en color verde, en azul se muestran los núcleos celulares teñidos con Hoechst. B) cuantificación del numero de fibras musculares positivas para distrofina.
A
B
Figura 35. El andrografólido induce un aumento en la fuerza en músculos distróficos. Ratones mdx y control fueron tratados o no con andrografólido a partir de las 2 semanas de edad durante 4 meses. Al finalizar el protocolo se procedió a evaluar mediante electrofisiología la fuerza inmediata (sacudida) a diferentes frecuencias.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80 100
mN/m
m2
Frecuencia (pps)
C57 + Vehículo
C57 + PARACTIN®
mdx + PARACTIN®
mdx + Vehículo
C57 BL/10 + Vehículo
C57 BL/10 + Andrografólido
mdx BL/10 + Andrografólido
mdx BL/10 + Vehículo
** * *
*
ratones control como mdx tratados o no con el andrografólido. A partir de una frecuencia de
30 pps las curvas comienzan a diferenciarse significativamente, llegando el músculo del
animal control a desarrollar más del doble de fuerza por unidad de área que su par mdx.
Cuando se analizaron los músculos provenientes de ratones mdx y se compararon con los
provenientes de mdx tratados con andrografólido, se observó que estos últimos desarrollan
alrededor de un 40% más de fuerza. Este resultado es muy interesante, ya que muestra que
el andrografólido no solo inhibe la inducción de inflamación y fibrosis, sino que a su vez es
capaz de mejorar la capacidad de generar fuerza, lo cual es vital en modelos de
enfermedades distróficas como la DMD. De la misma forma, luego de obtenida la
frecuencia mínima con la que se genera mayor fuerza contráctil, procedimos a determinar la
fuerza sostenida (tétanos) producida por estos músculos. En la figura35 podemos observar
que ratones mdx tratados con el andrografólido producen mayor fuerza contráctil llegando
incluso hasta un incremento cercano al 50%.
Se sabe que los ratones mdx presentan una disminución en su rendimiento frente al
ejercicio cuando se comparan con ratones control. La principal característica observada es
la acentuada fatiga que presentan cuando son ejercitados. De esta forma decidimos
determinar si esta característica está relacionada directamente con la inducción de fibrosis.
Para dicho objetivo, montamos un protocolo para evaluar el rendimiento de los animales
frente al ejercicio (ver materiales y métodos). En este ensayo se evaluó el número de veces
en que los animales tienden a descansar sobre la cinta corredora. En la figura 36 se puede
observar que el número de veces que retrocede el ratón mdx es 5 veces mayor que sus pares
control. En contraste, los ratones mdx que recibieron el tratamiento con el andrografólido
presentan una menor fatiga, la cual en promedio es solo 3 veces mayor que las de los
Figura 36. El andrografólido induce un aumento en la fuerza en músculos distrófico. Ratones mdx y control fueron tratados o no con andrografólido a partir de las 2 semanas de edad durante 4 meses. Al finalizar el protocolo se procedió a evaluar mediante electrofisiología la fuerza tetánica producida a la mínima frecuencia que produjo la mayor fuerza inmediata (sacudida).
0
5
10
15
20
25
30
C57Bl/10 + Vehículo
C57Bl/10 + Andrografólido
mdx+ Vehículo mdx + Andrografólido
mN/m
m2
*
Figura 37. El andrografólido mejora el performance de los animales distróficos frente al ejercicio. A. Ratones mdx y control fueron tratados o no con andrografólido a partir de las 2 semanas de edad durante 4 meses. A partir del 6 semanas de edad comenzaron a ser entrenados en una cinta trotadora durante los siguientes 3 meses. Luego fueron desafiados un protocolo de ejercicio extenuante durante 5 minutos y se evaluó el número de veces en que estos paraban y retrocedían en la cinta trotadora, cruzando la zona demarcada con la línea roja. B. Cuantificación de un promedio de 5 mediciones de 8 animales distintos para cada tratamiento.
A
B
0
5
10
15
20
25
30
C57Bl/10 + Vehículo
C57Bl/10 + Andrografólido
mdx+ Vehículo mdx + Andrografólido
mN/m
m2
05
101520253035
C57 + Vehículo C57 + PARACTIN®
mdx + Vehículo mdx + PARACTIN®
#Retrocesos
*
animales control, o dicho de otra manera alrededor de un 50% menor que la presentada por
ratones mdx no tratados. Estos resultados en conjunto sugieren que una disminución en la
fibrosis muscular, como también en la inflamación crónica en músculos distróficos
repercute positivamente en la funcionalidad del tejido muscular.
Conclusión objetivo 2.3: El tratamiento con andrografólido produjo un aumento
considerable en la fuerza desarrollada por ratones mdx. El tratamiento con el andrografólido
mejoró considerablemente la resistencia de los ratones mdx frente al ejercicio, no teniendo
efectos sobre el rendimiento en ratones control, lo cual sugiere un rol específico del
andrografólido sobre la patología distrófica.
Conclusiones generales objetivo 3. El grado de fibrosis determina una inapropiada
migración celular, la cual puede ser revertida con el tratamiento con andrografólido. El
tratamiento con andrografólido aumenta la eficiencia del trasplante de células satélite
aumentando el número de fibras musculares capaces de re-expresar distrofina. Por último,
ratones mdx que presentan menor grado de fibrosis, gracias al tratamiento con
andrografólido, desarrollan mayor fuerza y resistencia frente a protocolos de ejercitación.
Discusión
Gran parte de la investigación científica acerca de la DMD se ha centrado en evaluar
tratamientos dirigidos a restablecer la expresión de distrofina en las fibras musculares. Para
ello las aproximaciones que han sido probadas varían desde diferentes tipos de terapias
génicas (Bachrach y cols., 2004; van Deutekom, 2005; van Deutekom and van Ommen,
2003), potenciar la reparación muscular, mediante la utilización de células con potencial
miogénico (Auda-Boucher y cols., 2007; Sampaolesi y cols., 2006) como también se ha
estudiado el uso de moléculas capaces de potenciar el proceso de reparación muscular
(Bogdanovich y cols., 2002; Harcourt y cols., 2005; Minetti y cols., 2006). No obstante,
estas no han sido exitosas debido principalmente a la baja efectivad que han mostrado en
ensayos in vivo, utilizando modelos de la DMD, como el ratón mdx y perros distródicos
(GRMD) (Gargioli y cols., 2008; Muir and Chamberlain, 2009; Sampaolesi y cols., 2006).
Los pacientes con DMD, son tratados en clínica al igual que pacientes afectados por una
patología que cursa con inflamación crónica, prescribiéndoles una vez confirmada la
ausencia de distrofina, mediante ensayos histológicos y de PCR, el uso de corticosteroides,
los cuales han mostrado tener efectos positivos disminuyendo la inflamación muscular, la
fibrosis y finalmente retardando el uso de sillas de ruedas y aumentando levemente la
esperanza de vida de estos pacientes. No obstante, dada la periodicidad y dosis del uso de
este tipo de fármacos, se provocan en los pacientes un sinnúmero de efectos secundarios
severos e incluso acentuando los efectos invalidantes de la patología distrófica (De Luca y
cols., 2005). Está claro que existe una estrecha relación entre el fenómeno de inflamación
con el de fibrosis, sin embargo los mecanismos celulares y moleculares que ligan ambos
eventos no están del todo claro.
En esta tesis demostramos que el andrografolido es capaz de inhibir la actividad
pro-fibrosante y pro-inflamatoria de TGF−β y CTGF en el músculo esquelético. Además,
demostramos que la fibrosis dificulta la correcta migración celular en el músculo
esquelético y que la disminución de la fibrosis aumenta la eficiencia de las terapias
celulares así como también provoca un aumento en el desarrollo de fuerza muscular.
Expresión de TGF−β y CTGF en músculos distróficos: papel del
andrografólido
Los patrones de expresión de TGF-β y sus receptores en el músculo esquelético de
pacientes con DMD y ratones mdx apoyan un papel patogénico de esta citoquina en la
fibrosis muscular asociada con la deficiencia de la distrofina. Los niveles de expresión de
TGF-β se relacionan con la fibrosis muscular en biopsias de pacientes con DMD
(Bernasconi y cols., 1995). Además, la expresión de TGF-β y sus receptores se encuentra
aumentada también en los músculos esqueléticos de ratones mdx y se localiza
principalmente en áreas inflamatorias y de fibrosis (Bernasconi y cols., 1995; Zhou y cols.,
2006). Del mismo modo, en otros tejidos la fibrosis se relaciona directamente con la
expresión de TGF−β. Utilizando el modelo de aceleración del fenotipo fibrótico en las
extremidades del ratón mdx mediante protocolos de ejercitación (De Luca y cols., 2005),
demostramos que la expresión de las citoquinas pro-fibrosantes CTGF y TGF−β, en
respuesta al ejercicio, se indujo en forma sostenida. Esto pudo deberse a un efecto directo
del ejercicio sobre la expresión de estas citoquinas o por consecuencia del daño
inflamatorio producto del estrés mecánico. En este contexto, se ha demostrado que la
expresión de CTGF, puede ser inducida en forma transitoria en respuesta al ejercicio en
músculos de individuos sanos (Kivela y cols., 2007), probablemente producto de la tensión
mecánica a la cual se someten la fibras musculares en actividad contráctil. Esta evidencia se
sustenta con experimentos in vitro que demuestran que la sola tensión mecánica de células
musculares induce transitoriamente la expresión de CTGF (Chaqour y cols., 2006). Estas
observaciones podrían explicar la causa del aumento de la expresión de CTGF en ratones
mdx sometidos a ejercitación, no obstante en este último caso la expresión de CTGF fue
sostenida en el tiempo, lo cual da cuenta de una diferencia tangencial entre el aumento
transitorio de CTGF en músculos sanos en respuesta al ejercicio en comparación al
aumento sostenido observado en músculo distrófico. Nuestros resultados sugieren que el
proceso de inflamación está involucrado en este proceso, ya que demostramos que el anti-
inflamatorio de origen botánico, andrografólido, inhibe la inducción de CTGF en respuesta
al ejercicio sin afectar la inducción de la expresión de TGF−β. Nuestros resultados se
correlacionaron con la disminución de la fibrosis inducida por ejercicio en el músculo
distrófico de ratones mdx tratados con el andrografólido, en donde observamos que el uso
del andrografólido inhibió la inducción de colágeno tipo III y fibronectina. El aumento de
expresión de TGF−β por el ejercicio resultó ser concomitante con un aumento en el número
de células positivas para la proteína smad-3 fosforilada, lo cual sugiere un aumento en la
actividad de esta ruta, no obstante la razón de células positivas para smad-3 fosforilada y el
número de células totales, no presentó cambios significativos, lo cual sugiere un cambio en
el número total de células que responden a TGF−β y no en su actividad. Por su parte, el
andrografolido disminuyó el número de células positivas para smad-3 fosforilada, lo cual
sugiere que la población celular que responde a TGF−β en el músculo esquelético
distrófico corresponde principalmente a células de origen inflamatorio. Estos resultados
proponen un efecto del andrografólido río abajo de TGF−β pero río arriba de CTGF.
El andrografólido inhibió en células musculares y fibroblastos, la inducción de
CTGF y de moléculas de la MEC (colágeno tipo III y fibronectina) en respuesta a TGF−β.
Estos efectos pueden explicarse mediante la participación de NFκB, ya que CTGF presenta
en su promotor sitios funcionales de unión a este factor de transcripción (Xia y cols., 2004)
y se ha demostrado que el andrografólido lo inhibe en forma específica, impidiendo que
pueda unirse directamente al DNA y modular la transcripción de sus genes blancos
(Chaqour y cols., 2006). Nuestros resultados muestran que TGF−β indujo la activación de
la ruta canónica de NFκB, ya que indujo la fosforilación y la posterior degradación de la
proteína de IκB (proteína que secuestra a NFκB en el citoplasma), además de Inducir la
actividad de un gen reportero para NFκB. En este último ensayo, se demostró además que
la inducción del reportero de NFκB es inhibida por el andrografólido, lo cual demuestra
que el andrografólido es capaz de inhibir la actividad de NFκB. Se ha descrito, en otros
sistemas, la capacidad de TGF−β de activar a NFκB e incluso se ha demostrado que NFκB
es capaz de interactuar funcionalmente con las proteínas adaptadoras smad (Lopez-Rovira y
cols., 2000). No obstante, no es posible descartar que el andrografólido también tenga
efectos sobre otras vías de señalización necesarias para la expresión de factores pro-
fibróticos como CTGF. La ruta de señalización clásica activada por TGF−β es a través de
cascadas de fosforilación mediadas por las proteínas smad 2/3 y se sabe que esta ruta es
clave para la inducción de CTGF en respuesta a TGF−β (Leask and Abraham, 2004).
Nuestros resultados indican que el andrografólido no afecta la ruta de señalización canónica
activada por TGF−β, descartando de esta forma una acción inespecífica del andrografólido,
al menos, en esta ruta de señalización.
TGF−β y CTGF como pro-inflamatorios
En esta tesis hemos demostrado que TGF−β tiene actividad pro-inflamatoria in vivo.
TGF−β indujo la expresión de proteínas de MEC como colágeno tipo III y de marcadores
específicos de células inflamatoria. Todos estos efectos fueron inhibidos o al menos
reducidos cuando los ratones habían sido tratados con andrografólido, por lo tanto el
andrografólido es capaz de inhibir in vivo la acción pro-inflamatoria de TGF−β. Es
interesante destacar, el fuerte efecto pro-inflamatorio observado en respuesta a TGF−β en
el músculo esquelético, el cual indujo un fuerte aumento de los marcadores de macrófagos
M1 y M2. No obstante, este resultado no indica una acción directa de TGF−β sobre estas
poblaciones de células inflamatorias. Otra observación importante, es que el andrografólido
tuvo un efecto inhibitorio mayor en la inducción de CD68 (marcador de macrófagos M1)
por TGF−β en comparación a la expresión de CD206 (macrófagos M2).
Es interesante destacar que todos los efectos evaluados, inducidos por TGF−β,
fueron emulados por la sobrexpresión adenoviral de CTGF en el músculo esquelético.
CTGF indujo una fuerte respuesta inflamatoria, caracterizada por una elevada infiltración
de macrófagos M1 y M2. De la misma manera que lo observado para TGF−β, el
andrografólido inhibió la inflamación inducida por CTGF. En otros tejidos se ha descrito
una acción pro-inflamatoria similar, inducida por CTGF, por ejemplo en el tejido renal se
ha demostrado que CTGF induce inflamación en un mecanismo mediado por NFκB,
resultados que concuerdan con lo que hemos observado durante el desarrollo de esta tesis,
en el músculo esquelético, mediante el uso del andrografólido. Sin embargo, aún falta
dilucidar los mecanismos específicos por los cuales CTGF podría inducir inflamación en el
músculo esquelético.
Existe la posibilidad de que TGF−β y/ o CTGF induzcan fibrosis e inflamación en
un mecanismo que involucre un incremento en el daño tisular, sin embargo no existe
información en la literatura acerca de estos posibles roles, al contrario, hay un gran número
de evidencias que señalan como ambas citoquinas aumentan la sobrevida celular e inducen
proliferación en cultivos celulares, sin embargo una posibilidad es que su acción sea
indirecta, mediante el reclutamiento de otros tipos celulares con características fagociticas
como los macrófagos. En este ámbito, demostramos que ambas citoquinas son capaces de
inducir la expresión de IFN-γ y este último factor participa en el daño tisular a través de la
regulación de la migración de células inmunológicas contribuyendo a la acumulación de
células inflamatorias principalmente macrófagos en el tejido dañado (Carvalho-Pinto y
cols., 2002; Rice y cols., 2003).
Existe un extenso debate acerca de la regulación del proceso inflamatorio por parte
de TGF−β, existen trabajos que apoyan tanto la idea de que TGF−β es un inhibidor del
proceso inflamatorio, como también la idea de que TGF−β es un potente pro-inflamatorio.
Andreetta y cols. evaluaron si la inmunomodulación de TGF-β podría mejorar la fibrosis en
los ratones mdx (Andreetta y cols., 2006). Con esa finalidad, trataron a ratones mdx de 6 a
12 semanas de edad con inyecciones intraperitoneales de anticuerpos bloqueantes de
TGF−β. Los ratones mdx tratados mostraron una reducción significativa de la fibrosis con
disminución de la expresión de TGF-β y la expresión de proteínas de MEC. Sin embargo,
TGF-β al actuar también como una citoquina inmunosupresora, trajo por consecuencia un
aumento descontrolado de linfocitos CD4+ y una desregulación de los procesos
inflamatorios. Por dicha razón, los autores sugirieron que tratamientos a largo plazo con
inhibidores de TGF−β deben ser evaluados.
Se ha demostrado que CTGF puede actuar como un quemoatractante de monocitos
en cultivo (Crean y cols., 2002) y que participa en fenómenos de migración y adhesión (Wu
y cols., 2006). Existen evidencias experimentales que demuestran que CTGF es capaz de
activar la ruta canónica de NFκB (Barnes and Karin, 1997; Guijarro and Egido, 2001). Del
mismo modo, CTGF es capaz de inducir la expresión de genes blancos de NFκB como
MCP-1, IL-6, e ICAM-1, todos involucrados en la respuesta inflamatoria. Las quemoquinas
son mediadores importantes al reclutar sub-poblaciones de células inflamatorias en los
tejidos. Por ejemplo, MCP-1 tiene un papel clave en el reclutamiento de macrófagos en
modelos animales de daño renal y en biopsias renales de pacientes con diabetes tipo I y tipo
II (Ruster and Wolf, 2008).
La administración sistémica de CTGF en ratones induce la producción de factores
quemo-tácticos como MCP-1 y RANTES (Sanchez-Lopez y cols., 2009). MCP-1 es un
potente factor quemotáctico para los macrófagos. Como hemos observado en nuestros
resultados, CTGF indujo una fuerte infiltración macrofágica en el músculo esquelético. La
transmigración es considerada como un evento clave en el proceso de inflamación. Durante
este proceso, los estímulos inflamatorios activan las células endoteliales para expresar
moléculas de adhesión y quemoquinas, las cuales reclutan linfocitos al sitio de daño. CTGF
contribuye activamente a este fenómeno, de hecho estudios in vitro demuestran que CTGF
induce la adhesión de monocitos y macrófagos de una manera dependiente de integrinas
(Bai y cols., 2010; Schober y cols., 2002). La administración sistémica de CTGF promueve
la infiltración de linfocitos T y macrófagos en el intersticio renal (Sanchez-Lopez y cols.,
2009).
Inflamación en el músculo distrófico: Papel del andrografólido sobre las
células inflamatorias
En los últimos años ha ganado importancia el estudio de la regulación del proceso
de inflamación por parte de sub-poblaciones de células inflamatorias con funciones
opuestas, en este contexto se ha comenzado a estudiar el papel de poblaciones de
macrófagos del tipo M1 y M2. En esta tesis demostramos que tanto TGF−β como CTGF
son capaces de inducir la infiltración de estas poblaciones inflamatorias y que en ambos
casos el andrografólido inhibió esta acción pro-inflamatoria, teniendo un efecto mayor
sobre la población de macrófagos M1. Las células de tipo M1 secretan citoquinas
características como IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18 y CD40L y evocan la inmunidad mediada
por células y la inflamación dependiente de fagocitosis. Por otro lado las células de la
respuesta inflamatoria del tipo M2 secretan otro tipo de citoquinas tales como IL-4, IL-5,
IL-6, IL-9, IL-10 e IL-13, y evocan un fuerte respuesta de anticuerpos (incluyendo los de
clase IgE) y acumulación de eosinófilos, pero inhiben varias de las funciones de las células
fagocíticas (inflamación independiente de fagocitosis) (Uhm y cols., 2003).
Dentro de la caracterización del andrografólido, demostramos que este afectó la
fibrosis muscular en el ratón mdx y que esta se relacionó directamente con una fuerte
inhibición de la progresión inflamatoria de la patología, observando que el andrografólido
disminuyó a menos de la mitad el número de células inflamatorias presentes en el tejido
muscular distrófico, dentro de las cuales encontramos linfocitos CD8+, linfocitos CD4+,
eosinófilos y macrófagos. Previamente, Wehling-Henricks y cols. obtuvieron resultados
muy similares para el corticosteroide prednisona, el cual es el único fármaco que ha
mostrado, al menos una parcial efectividad clínica.
Las células inflamatorias son las principales fuentes celulares de factores de
crecimiento fibrogénicos (como se ha demostrado para la expresión de TGF-β y PDGF), y
sus receptores también son sobre-expresados y localizados con células inflamatorias en los
músculos de pacientes con DMD y ratones mdx (Bernasconi y cols., 1995; Tidball y cols.,
1992; Zhao y cols., 2003; Zhou y cols., 2008). Las células inflamatorias que en el músculo
esquelético mdx consisten en linfocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos y en menor
proporción de mastocitos (Cai y cols., 2000; Gorospe y cols., 1994; Hodgetts y cols., 2006;
Spencer y cols., 2001; Wehling y cols., 2001). Producen, además de factores de
crecimiento, linfoquinas que juegan un rol crítico en el establecimiento de entornos que
pueden ser pro-inflamatorioss, anti-inflamatorios o pro-fibróticos en los tejidos. La fibrosis
tisular está estrechamente regulada por la respuesta celular de linfocitos T ayudadores
(CD4+) (Wynn, 2004) y la fibrogénesis está fuertemente ligada a la respuesta celular del
tipo TH2 de estos linfocitos, la cual involucra la síntesis de citoquinas como IL-4, IL-5 e
IL-13. La respuesta celular TH1 de los linfocitos CD4 + involucra la producción de
interferón-γ (IFN-γ) e IL-12 para promover la inflamación de los tejidos.
El rol de los linfocitos en la patología distrófica se ha estudiado mediante la
utilización de ratones mdx/scid (Farini y cols., 2007). Los ratones mdx/scid mostraron una
menor fibrosis muscular a los 12 meses y una disminución de los niveles de TGF-β en el
músculo en comparación con los ratones mdx. Una disminución funcional de linfocitos T en
ratones mdx/nu/nu/ también redujo la fibrosis (Morrison y cols., 2005). Estos hallazgos
apoyan un papel patogénico de las células T en la fibrogénesis del ratón mdx e indica que
los linfocitos son una fuente importante de TGF-β. Por otro lado, una disminución postnatal
de células T mediante timectomía a la edad de 4 semanas, seguida por tratamiento con
anticuerpos anti-CD4 y/o anti-CD8 no logró mejorar la fibrosis muscular. Estos resultados
sugieren que la activación temprana de las células T o células T residentes puede jugar un
papel fundamental en la inducción de la fibrosis en el músculo de ratones mdx (Gordon,
2003).
Los macrófagos son una población numerosa en el músculo esquelético de pacientes
con DMD y ratones mdx y son las principales fuentes de TGF-β1. El agotamiento de los
macrófagos que circulan por vía intraperitoneal, gracias a inyecciones de anticuerpos contra
la proteína F4/80 en ratones mdx de 1 a 4 semanas suprimió la fibrosis y el daño de los
músculos en etapas tempranas de la enfermedad (Wehling y cols., 2001).El efecto a largo
plazo de la depleción de los macrófagos en el músculo esquelético distrófico de ratones
mdx no ha sido estudiado.
Los macrófagos pueden mostrar diferentes fenotipos funcionales en función de las
citoquinas presentes el medio ambiente del tejido (Gordon, 2003; Martinez y cols., 2009).
Los macrófagos activados clásicamente (M1) son activados por citoquinas del tipo TH-1
como IFN-γ e IL-12, y estos se caracterizan por expresar altos niveles de la óxido nítrico
sintasa inducible (iNOS). Estos aumentan la expresión de TNF−α , IL-1β, óxido nítrico, y
las principales moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad tipo II para de esta
forma promover la inflamación de los tejidos. Por su parte, los macrófagos alternativamente
activados (M2) son activados por las citoquinas TH-2, IL-4 e IL-13 y expresan altos niveles
de la enzima arginasa, pero un bajo nivel de iNOS. Estos macrófagos suprimen la respuesta
TH-1 e inhiben la expresión de TNF−α e IL-1β. El receptor de manosa CD206 parece ser
un marcador relativamente específico de esta población celular. Debido a que la arginasa
puede catalizar la conversión de arginina en L-prolina, una molécula precursora de la
síntesis de colágeno, se cree que los macrófagos M2 pueden promover la fibrosis de los
tejidos. Sin embargo, un estudio reciente demostró que la arginasa-1 que expresan los
macrófagos suprime las citoquinas TH-2 impulsada por la inflamación y la fibrosis en el
hígado inducida por la infección con Schistosoma mansoni (Pesce y cols., 2009). En este
modelo de la enfermedad, la arginasa-1 que expresan los macrófagos suprime la
proliferación de los linfocitos T CD4 + e inhibe tanto las repuestas TH-1 y TH-2 de la
arginina. Estos resultados indican que el M2 puede funcionar como un supresor de la
inflamación y la fibrosis del tejido. La L-arginina también suprimió la inflamación en los
músculos de ratones mdx. La inyección intraperitoneal de L-arginina en ratones mdx
suprimió la inflamación muscular y redujo la expresión de mediadores inflamatorios,
incluyendo IL-1β, TNF, IL-6 y NFκB (Hnia y cols., 2008). El efecto de la L-arginina en la
fibrógenesis del músculo mdx no ha sido abordada aún. Villalta y cols. estudiaron sub-
poblaciones funcionales de macrófagos en los ratones mdx y encontraron que ambos, M1 y
M2, están presentes a las 4 semanas en el músculo de ratones mdx en zonas de necrosis e
inflamación prominente (Villalta y cols., 2009). In vitro, los macrófagos M1 promueven la
lisis muscular en un mecanismo mediado por óxido nítrico, mientras que los macrófagos
M2 inhiben este efecto a través de la competencia de la enzima arginasa con la iNOS por su
sustrato en común, la arginina. A las 12 semanas, mientras que la expresión de ambas
enzimas, iNOS y arginasa, se redujo, la expresión de IL-4 e IL-10 se incrementó,
desactivando el fenotipo M1. La IL-10 también activó el fenotipo M2, promoviendo la
proliferación de células satélites para la regeneración muscular. Estos resultados sugieren
que un cambio en el fenotipo de macrófagos pueden contribuir a la regeneración muscular y
a la resolución de la inflamación en los músculos de ratones mdx. La población de
eosinófilos se encuentra claramente aumentada en las biopsias musculares de pacientes con
DMD y en los músculos esqueléticos de ratones mdx (Cai y cols., 2000). Los eosinófilos
pueden promover la respuesta TH-2 mediante la producción de IL-4 e IL-10 para influir en
la fibrógenesis de los tejidos. Los eosinófilos también producen la proteína básica mayor-1
(MBP-1), la cual puede atenuar la respuesta inmune celular. Ratones MBP-1-/-/mdx
mostraron reducción de la sin ningún cambio de los macrófagos o la de la expresión de la
iNOS, TNF−α, IFN γ (Wehling-Henricks y cols., 2008). Por lo tanto, MBP-1 podría servir
como un blanco para el tratamiento de la fibrosis muscular en la DMD.
Otros agentes reguladores de la inflamación y la fibrosis en músculos
distróficos
Se han estudiado diversos agentes farmacológicos con la finalidad de regular la
inflamación y la fibrosis en el músculo distrófico. El Imatinib es un agente antineoplásico
que bloquea selectiva y competitivamente los sitios de unión de ATPde varias proteínas
tirosina quinasas, incluyendo c-abl, c-kit, y los receptores de PDGF (Druker, 2004) y ha
sido aprobado por la FDA de EE.UU. para el tratamiento de varios tumores malignos. El
Imatinib también se ha demostrado para reducir la fibrosis del tejido a través de bloqueo de
c-abl y el receptor de PDGF en muchos modelos experimental de fibrosis, incluyendo la
fibrosis pulmonar (Abdollahi y cols., 2005; Daniels y cols., 2004), cirrosis (Yoshiji y cols.,
2005), esclerosis renal (Wang y cols., 2005), y fibrosis en la piel (Distler y cols., 2007). La
señalización de c-abl es una ruta alternativa no-Smad que media los efectos fibrogénicos de
TGF-β, además la actividad quinasa de c-abl puede ser activada también por PDGF
(Daniels y cols., 2004; Wang y cols., 2005). La expresión génica y proteíca de TGF-β y
PDGF (así como la de sus receptores) se encuentra aumentada en las células inflamatorias y
en la regeneración de las fibras de los músculos esqueléticos de pacientes con DMD y
ratones mdx (Bernasconi y cols., 1995; Tidball y cols., 1992; Zhao y cols., 2003). Se ha
probado que el Imatinib reduce la fibrosis en el ratón mdx. El Imatinib redujo la necrosis
del músculo esquelético, la inflamación y la fibrosis, además de mejorar la función
muscular. En otro estudio realizado por Bizario y cols. Se demostró que el Imatinib reduce
la fibrosis inducida por ejercicio en ratones mdx, pero produjo una significativa pérdida de
peso en los animales (Bizario y cols., 2009).
El losartán, el cual es un inhibidor del receptor I de Angiotensina II y que se ha
utilizado ampliamente como un medicamento antihipertensivo. La Angiotensina II
estimula directamente la producción de TGF-β aumentando su señalización mediante el
aumento de los niveles de Smad-2 y la translocación nuclear de Smad-3 fosforilada
(Rosenkranz, 2004). Cohn y cols. trataron ratones mdx de 7 semanas a 9 meses con losartán
oral y demostraro que el tratamiento inhibe la señalización de TGF-β y redujo
significativamente la fibrosis en el ratón mdx sin efectos secundarios significativos (Cohn y
cols., 2007).
Del mismo modo la Halofuginona, un potente agente antifibrótico que suprime la
síntesis de colágeno mediada por la señalización de TGF-β (Granot y cols., 1993; Halevy y
cols., 1996) inhibe la fosforilación y la activación de Smad-3 (McGaha y cols., 2002). El
tratamiento de ratones mdx con inyecciones intraperitoneales de halofuginona redujo el
nivel de Smad3 fosforilada y depósito de colágeno en las extremidades y los músculos
cardíacos y este último fue acompañado de mejoría de la función cardiaca (Huebner y cols.,
2008; Turgeman y cols., 2008). Sin embargo, el uso a largo plazo de esta droga trae serios
efectos secundarios adversos, debido a la inhibición de la síntesis de colágeno.
En este contexto el andrografólido ha sido usado por períodos prolongados para el
tratamiento de patologías como la esclerosis múltiple y la artritis reumatoide, por lo cual es
un buen candidato como alternativa terapéutica para pacientes con DMD.
Impacto de la fibrosis en la migración celular
En la actualidad no hay una terapia efectiva para la DMD. La terapia génica y la
terapia celular para reemplazar el gen de la distrofina tienen un gran potencial, pero no
están desarolladas lo suficiente, como para pensar en una aplicación clínica amplia. En
1990, Peter Law y su equipo reportaron el primer transplante de células satélite en un niño
de 9 años de edad afectado por DMD, demostrando la producción de distrofina por las
fibras musculares y la seguridad de estas terapias (Law y cols., 1990). Luego surgieron 11
ensayos clínicos en pacientes con DMD, los cuales fueron conducidos utilizando
inyecciones intramusculares de células satélites (Neumeyer y cols., 1998; Huard y cols.,
1992; Law y cols., 1992; Gussoni y cols., 1992; Tremblay y cols., 1993; Morandi y cols.,
1995; Mendell y cols., 1995; Miller y cols., 1997; Skuk y cols., 2006). Aunque no
existieron efectos adversos, la producción de distrofina solo fue demostrada en muchos
casos pero no en todos y no se observaron beneficios clínicos en ninguno de ellos (cossu y
cols., 2007; Partridge y cols., 2000). Esto no es sorprendente considerando que la inyección
intramuscular debe realizarse en varios músculos, por lo cual no puede mostrar un efecto
general, aunque se detectó un efecto benéfico, en la fuerza muscular de los músculos
inyectados en el 15% de los pacientes tratados. El tratamiento de las distrofias musculares
por inyección intramuscular presenta varios problemas que aun no han sido resueltos. En
primer lugar, las células inyectadas intramuscularmente se distribuyen de manera local,
debido a la baja capacidad migratoria de estas células y al denso entramado fibrótico
impuesto por la MEC en el músculo distrófico, lo cual implica que en un paciente se deban
realizas múltiples inyecciones para tratar un músculo completo (Huard y cols., 1992).
Segundo, se ha descrito una respuesta inmune en contra de las células satélites inyectadas
incluso en los casos de coincidencia entre los complejos mayores de histocompatibilidad,
por lo tanto las nuevas terapias deben considerar una forma de regulación inhibitoria de la
respuesta inflamatoria. Por último, la mayoría de las células satélites muere en las primeras
72 horas luego de la inyección, producto del ambiente desfavorable, causado por una baja
irrigación sanguínea que tiene por consecuencia el generar un entorno hipóxico (Fan y
cols., 1996; Guerrete y cols., 1997). Las investigaciones posteriores se han enfocado en
resolver estos problemas y una prueba clínica en fase I ha sido completada (Skuk y cols.,
2006). Aunque se han obtenido resultados esperanzadores, este método sigue siendo
limitado por la imposibilidad de inyectar estas células de manera sistémica a través de la
circulación.
En esta tesis hemos demostrado que la migración celular en los músculos distróficos
depende directamente del grado de fibrosis de este. Demostramos que la migración celular
en músculos con alto grado de fibrosis (músculos de animales distróficos ejercitados), era
significativamente menor que la observada en músculos también distróficos pero con un
fenotipo menos severo (músculos de animales distróficos sedentarios). El efecto directo que
pudiese tener el ejercicio sobre la migración celular puede ser descartado, ya que en
animales mdx ejercitados pero tratados con andrografólido, observamos una recuperación
en la migración y además el protocolo de ejercitación se detuvo una semana antes del inicio
de los ensayos. Del mismo modo, descartamos un efecto directo del andrografólido sobre la
migración celular, ya que el andrografólido fue administrado previamente a la inyección de
los fibroblastos migratorios, por lo tanto la única diferencia fenotípica evidente es el grado
de fibrosis y la inflamación asociada. No obstante, sería interesante evaluar el efecto directo
del andrografólido sobre la migración celular.
Demostramos, además que la células no solo recorrían una mayor distancia, sino
que se distribuían preferentemente en zonas con menor contenido de colágeno (áreas no
fibróticas). Experimentos realizados por el laboratorio de Giulio Cossu (Gargioli y cols.,
2008), han demostrado que células que sobre-expresan la enzima MMP-9 tienen una mayor
capacidad migracional en músculos distróficos (Gargioli y cols., 2008). Los sustratos
principales de la MMP-9 son en su mayoría proteínas de MEC, como colágeno tipo I, III y
fibronectina (Hrabec y cols., 2007). Esto sugiere que la fibrosis presente en músculos
distróficos, dificulta la correcta migración celular. Lo cual explica en parte nuestros
resultados. No obstante, otra explicación plausible, es el efecto de la fibrosis o de músculos
distróficos fibróticos, sobre la sobrevida celular, ya que la fibrosis asociada a la DMD, se
caracteriza por una disminución en la irrigación sanguínea, debido al reemplazo de
capilares por tejido conectivo, lo cual genera un ambiente inhóspito para células con altos
requerimientos energéticos y de oxigenación, como las células musculares. Sin embargo, en
nuestro ensayo, este efecto puede descartarse, ya que el número total de células migratorias
al finalizar el protocolo de migración permaneció constante.
Impacto de la fibrosis en la eficiencia de las terapias celulares
Como se ha comentado anteriormente, la causa inicial de la DMD es la ausencia de
la proteína distrofina, por lo tanto las terapias deben restituir la expresión de esta o de una
proteína análoga, para eliminar el problema génico. Demostramos que la fibrosis dificulta
la migración celular en los músculos distróficos y que esto se correlacionó directamente
con una menor eficiencia en la re-expresión de distrofina. Nuestros resultados demostraron
que en los animales que recibieron el tratamiento previo con el andrografolido y que por
ende presentan menor daño fibrótico, la eficiencia de la terapia celular aumentó un 300%
en comparación a la observada en animales mdx no tratados con la droga botánica. Estos
resultados demuestran que por un lado la fibrosis afecta la eficiencia de las terapias
celulares y que la disminución de la fibrosis e inflamación por el andrográfólido claramente
mejora la eficiencia de estas. Una explicación para este fenómeno es que la fibrosis
probablemente actúa como una barrera física que impide la correcta migración de las
células. Otra posibilidad es que lugares ricos en tejido cicatricial, presentan una baja
irrigación sanguínea debido a la escasa presencia y deterioro de los vasos sanguíneos, lo
cual produce zonas isquémicas en el tejido, lo cual por un lado induce la muerte de células
con altos requerimientos de oxigeno como las células musculares (Wynn, 2008).
Una publicación reciente del grupo de Paula Clemens (Reay y cols. 2012) avala
nuestros resultados. Ellos demostraron que al combinar la sobre-expresión de un inhibidor
de NFκB y una versión de la proteína distrofina, mejora ostensiblemente la expresión de
distrofina por las fibras musculares en comparación a la terapia génica sin sobre-expresión
del inhibidor de NFκB.
Impacto de la fibrosis en la fuerza muscular
Disminuir la fibrosis de un tejido no es garantía de una mejora en la funcionalidad
tisular. Por lo tanto, cuando se piensa en terapias netamente anti-fibróticas es importante
evaluar el efecto de la disminución de la fibrosis sobre la función del tejido. En el caso del
músculo esquelético, existe una estrecha correlación entre el grado de fibrosis y la
capacidad contráctil del músculo. Nuestros resultados mostraron un sorprendente
incremento en la fuerza efectuada por los músculos de ratones distróficos tratados con el
andrografólido. No hay que olvidar que la causa inicial del deterioro y debilitamiento en
músculos distróficos se debe a una mutación genética que causa la ausencia de la proteína
distrofina, (Straub y cols., 1997) y como hemos mencionado anteriormente el
andrografólido es un anti-inflamatorio el cual inhibe específicamente a NFκB, no atacando
por tanto el problema genético causante de la patología distrófica. Estos resultados ponen
de manifiesto que la ausencia de distrofina no es el único agente causal del debilitamiento
muscular, si no que este es potenciado por el fenómeno inflamatorio y fibrótico. Esto apoya
la idea de que una buena alternativa para tratar pacientes con DMD es la utilización de una
terapia combinada, que por un lado restablezca la expresión de distrofina en los músculos
afectados y que por otro atenúe la inflamación y la fibrosis tisular para facilitar la
infiltración, migración e incorporación celular en el tejido blanco
Por otra parte, evaluamos de manera sistémica si el aumento de fuerza producido
por el Andrografóldio observado mediante técnicas electofosiológicas de músculos
aislados, repercute en una mejoría en el comportamiento físico del animal. Tanto los
pacientes con DMD como su modelo animal mdx, se caracterizan por tener un
comportamiento más bien sedentario a medida que progresa la patología, por un lado
debido al debilitamiento muscular y por otro, ya que la actividad física, aumenta el daño
mecánico por contracción de las fibras musculares, lo cual acelera la progresión de la
patología. Sin ir más lejos, en clínica se recomienda a los pacientes con DMD que
desarrollen la menor actividad física posible, para de esta forma retardar la progresión de la
enfermedad, el uso de silla de ruedas y así también aumentar la esperanza de vida (Bizario
y cols., 2009).
Frente a protocolos de ejercitación, los ratones mdx presentan un rendimiento muy
por debajo del observado en ratones control, tendiendo a descansar sobe la cinta trotadora
un mayor número de veces. Nuestros resultados demuestran que los animales mdx tratados
con el andrografólido presentan un claro aumento en su rendimiento frente a este protocolo,
lo cual pone de manifiesto que la acción anti-inflamatoria y anti-fibrótica de esta droga no
solo repercute en una mayor fuerza muscular sino que tiene claros efectos positivos en el
comportamiento sistémico del animal. No obstante, con estos resultados no es posible
descartar que el andrografólido tenga un efecto directo sobre la fuerza muscular,
modulando la expresión de actina y miosina, induciendo hipertrofia y/o hiperplasia
muscular, etc. Sin embargo, al observar el efecto del andrografólido sobre animales control,
encontramos que este no tuvo efectos sobre el desarrollo de fuerza contráctil de los
músculos y tampoco sobre el rendimiento frente a protocolos de ejercitación, lo cual
sugiere que la acción del andrografólido no produciría en forma directa tales efectos.
Es probable que para una cura definitiva para esta devastadora enfermedad se
requieran enfoques integrales, lo cuales combinen farmacoterapia con terapia génica o
terapia celular. Se necesitan más estudios de caracterización de la fibrogénesis asociada a
los músculos deficientes de distrofina y explorar la seguridad y efectividad de las terapias
anti-fibróticas. La fibrosis muscular no sólo causa la disfunción del músculo, sino que
también afecta la regeneración de este y reduce eficiencia de las terapias (Cordier y cols.,
2000; Gargioli y cols., 2008). Por lo tanto, la terapia anti-fbrótica representará una útil y
necesaria complementación a las terapias génicas y celulares para optimizar el tratamiento
de la DMD. Un cóctel farmacoterápico dirigido a diferentes aspectos de la fibrogenesis
muscular será necesario para lograr un adecuado efecto anti-fibrótico en la DMD.
CONCLUSIONES
1.- El andrografólido inhibió la expresión de CTGF, pero no la de TGF−β inducida por
ejercicio en músculos de ratones mdx.
2.- El aumento en la expresión de TGF−β por el ejercicio se correlaciona con un aumento
en el número de células positivas para smad-3 fosforilada, las cuales disminuyen en
respuesta al tratamiento con el andrografólido.
3.- El andrografólido inhibió la inducción de proteínas de MEC (colágeno tipo III y
fibronectina) por el ejercicio en ratones mdx.
4.- El tratamiento con andrografólido disminuyó el número de células inflamatorias,
especialmente macrófagos, presentes en el músculo esquelético distrófico.
5.- El andrografólido inhibe de una manera no smad dependiente los efectos pro-fibrosantes
y pro-inflamatorios inducidos por TGF-β
6.- TGF-β es capaz de activar la ruta canónica de NFkB en células musculares C2C12, la
cual es inhibida por el andrografólido.
7.- CTGF no solo es capaz de inducir fibrosis, sino que también induce inflamación en el
músculo esquelético, ambos efectos son inhibidos por el tratamiento con andrografólido.
8.- El efecto anti-inflamatorio del andrografólido es principalmente a través de la inhibición
de la respuesta inflamatoria del tipo M1.
9.- La fibrosis producto del ejercicio inhibe la migración celular en músculo de ratones mdx
10.- Fibroblastos migratorios se distribuyen preferentemente en zonas con bajo contenido
de MEC.
11.- El andrografólido aumenta el número de fibras musculares que re-expresan distrofina
en músculos distróficos trasplantados con células miogénicas.
12.- El tratamiento con andrografólido produjo un aumento considerable en la fuerza
muscular desarrollada por ratones mdx y en la resistencia a protocolos de ejercitación.
Referencias
Abdollahi, A., Li, M., Ping, G., Plathow, C., Domhan, S., Kiessling, F., Lee, L.B., McMahon, G., Grone, H.J., Lipson, K.E., y cols. (2005). Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of experimental medicine 201, 925-935. Acharyya, S., Villalta, S.A., Bakkar, N., Bupha-Intr, T., Janssen, P.M., Carathers, M., Li, Z.W., Beg, A.A., Ghosh, S., Sahenk, Z., y cols. (2007). Interplay of IKK/NF-kappaB signaling in macrophages and myofibers promotes muscle degeneration in Duchenne muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation 117, 889-901. Adkin, C.F., Meloni, P.L., Fletcher, S., Adams, A.M., Muntoni, F., Wong, B., and Wilton, S.D. (2011). Multiple exon skipping strategies to by-pass dystrophin mutations. Neuromuscul Disord. Ahn, K.S., Sethi, G., and Aggarwal, B.B. (2007). Nuclear factor-kappa B: from clone to clinic. Current molecular medicine 7, 619-637. Amato, A.A., and Griggs, R.C. (2011). Overview of the muscular dystrophies. Handb Clin Neurol 101, 1-9. Andreetta, F., Bernasconi, P., Baggi, F., Ferro, P., Oliva, L., Arnoldi, E., Cornelio, F., Mantegazza, R., and Confalonieri, P. (2006). Immunomodulation of TGF-beta 1 in mdx mouse inhibits connective tissue proliferation in diaphragm but increases inflammatory response: implications for antifibrotic therapy. J Neuroimmunol 175, 77-86. Angelini, C. (2007). The role of corticosteroids in muscular dystrophy: a critical appraisal. Muscle Nerve 36, 424 - 435. Arnold, L., Henry, A., Poron, F., Baba-Amer, Y., van Rooijen, N., Plonquet, A., Gherardi, R., and Chazaud, B. (2007). Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med 204, 1057 - 1069. Atkins BZ, y cols. Intracardiac transplantation of skeletalmyoblasts yieldstwo populations of striated cellsin situ. Ann Thorac Surg. 1999;67(1):124–129. Auda-Boucher, G., Rouaud, T., Lafoux, A., Levitsky, D., Huchet-Cadiou, C., Feron, M., Guevel, L., Talon, S., Fontaine-Perus, J., and Gardahaut, M.F. (2007). Fetal muscle-derived cells can repair dystrophic muscles in mdx mice. Exp Cell Res 313, 997-1007. Bachrach, E., Li, S., Perez, A.L., Schienda, J., Liadaki, K., Volinski, J., Flint, A., Chamberlain, J., and Kunkel, L.M. (2004). Systemic delivery of human microdystrophin to
regenerating mouse dystrophic muscle by muscle progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 3581-3586. Bai, T., Chen, C.C., and Lau, L.F. (2010). Matricellular protein CCN1 activates a proinflammatory genetic program in murine macrophages. J Immunol 184, 3223-3232. Barnes, P.J., and Karin, M. (1997). Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases. N Engl J Med 336, 1066-1071. Batchelor, C.L., and Winder, S.J. (2006). Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biol 16, 198-205. Bernasconi, P., Torchiana, E., Confalonieri, P., Brugnoni, R., Barresi, R., Mora, M., Cornelio, F., Morandi, L., and Mantegazza, R. (1995). Expression of transforming growth factor-beta 1 in dystrophic patient muscles correlates with fibrosis. Pathogenetic role of a fibrogenic cytokine. J Clin Invest 96, 1137-1144. Bizario, J., Cerri, D., Rodrigues, L., Oliveira, G., Nomizo, A., de Araujo, D., Fukuhara, P., Ribeiro, J., de Castro, F., and Costa, M. (2009). Imatinib mesylate ameliorates the dystrophic phenotype in exercised mdx mice. J Neuroimmunol 212, 93 - 101. Blake, D., Weir, A., Newey, S., and Davies, K. (2002). Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiological reviews 82, 291 - 329. Bogdanovich, S., Krag, T.O., Barton, E.R., Morris, L.D., Whittemore, L.A., Ahima, R.S., and Khurana, T.S. (2002). Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade. Nature 420, 418-421. Bonniaud, P., Margetts, P., Ask, K., Flanders, K., Gauldie, J., and Kolb, M. (2005). TGFbeta and Smad3 signaling link inflammation to chronic fibrogenesis. J Immunol 175, 5390 - 5395. Brandan, E., Cabello-Verrugio, C., and Vial, C. (2008). Novel regulatory mechanisms for the proteoglycans decorin and biglycan during muscle formation and muscular dystrophy. Matrix Biol 27, 700 - 708. Bulfield, G., Siller, W.G., Wight, P.A., and Moore, K.J. (1984). X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 1189-1192. Burgos, R.A., Seguel, K., Perez, M., Meneses, A., Ortega, M., Guarda, M.I., Loaiza, A., and Hancke, J.L. (2005). Andrographolide inhibits IFN-gamma and IL-2 cytokine production and protects against cell apoptosis. Planta medica 71, 429-434. Cabello-Verrugio, C., Morales, G., Cabrera, D., Vio, C.P., and Brandan, E. (2011). Angiotensin ii receptor type 1 blockade decreases CTGF/CCN2-mediated damage and fibrosis in normal and dystrophic skeletal muscles. J Cell Mol Med.
Cai, B., Spencer, M.J., Nakamura, G., Tseng-Ong, L., and Tidball, J.G. (2000). Eosinophilia of dystrophin-deficient muscle is promoted by perforin-mediated cytotoxicity by T cell effectors. Am J Pathol 156, 1789-1796. Carlson, C.G., Samadi, A., and Siegel, A. (2005). Chronic treatment with agents that stabilize cytosolic IkappaB-alpha enhances survival and improves resting membrane potential in MDX muscle fibers subjected to chronic passive stretch. Neurobiology of disease 20, 719-730. Carvalho-Pinto, C.E., Garcia, M.I., Mellado, M., Rodriguez-Frade, J.M., Martin-Caballero, J., Flores, J., Martinez, A.C., and Balomenos, D. (2002). Autocrine production of IFN-gamma by macrophages controls their recruitment to kidney and the development of glomerulonephritis in MRL/lpr mice. J Immunol 169, 1058-1067. Chaqour, B., Yang, R., and Sha, Q. (2006). Mechanical stretch modulates the promoter activity of the profibrotic factor CCN2 through increased actin polymerization and NF-kappaB activation. J Biol Chem 281, 20608-20622. Chen, J.C., and Goldhamer, D.J. (2003). Skeletal muscle stem cells. Reprod Biol Endocrinol 1, 101. Cohn, R.D., van Erp, C., Habashi, J.P., Soleimani, A.A., Klein, E.C., Lisi, M.T., Gamradt, M., ap Rhys, C.M., Holm, T.M., Loeys, B.L., y cols. (2007). Angiotensin II type 1 receptor blockade attenuates TGF-beta-induced failure of muscle regeneration in multiple myopathic states. Nat Med 13, 204-210. Cordier, L., Hack, A.A., Scott, M.O., Barton-Davis, E.R., Gao, G., Wilson, J.M., McNally, E.M., and Sweeney, H.L. (2000). Rescue of skeletal muscles of gamma-sarcoglycan-deficient mice with adeno-associated virus-mediated gene transfer. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 1, 119-129. Crean, J.K., Finlay, D., Murphy, M., Moss, C., Godson, C., Martin, F., and Brady, H.R. (2002). The role of p42/44 MAPK and protein kinase B in connective tissue growth factor induced extracellular matrix protein production, cell migration, and actin cytoskeletal rearrangement in human mesangial cells. J Biol Chem 277, 44187-44194. Daniels, C.E., Wilkes, M.C., Edens, M., Kottom, T.J., Murphy, S.J., Limper, A.H., and Leof, E.B. (2004). Imatinib mesylate inhibits the profibrogenic activity of TGF-beta and prevents bleomycin-mediated lung fibrosis. J Clin Invest 114, 1308-1316. De Luca, A., Nico, B., Liantonio, A., Didonna, M.P., Fraysse, B., Pierno, S., Burdi, R., Mangieri, D., Rolland, J.F., Camerino, C., y cols. (2005). A multidisciplinary evaluation of the effectiveness of cyclosporine a in dystrophic mdx mice. Am J Pathol 166, 477-489.
Distler, J.H., Jungel, A., Huber, L.C., Schulze-Horsel, U., Zwerina, J., Gay, R.E., Michel, B.A., Hauser, T., Schett, G., Gay, S., y cols. (2007). Imatinib mesylate reduces production of extracellular matrix and prevents development of experimental dermal fibrosis. Arthritis and rheumatism 56, 311-322. Druker, B.J. (2004). Imatinib as a paradigm of targeted therapies. Advances in cancer research 91, 1-30. Durbeej, M., and Campbell, K. (2002). Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. Curr Opin Genet Dev 12, 349 - 361. Emery, A. (2002). The muscular dystrophies. Lancet 359, 687 - 695. Emery, A.E. (1993). Duchenne muscular dystrophy--Meryon's disease. Neuromuscul Disord 3, 263-266. Fan Y, Maley M, Beilharz M, Grounds M. Rapid death of injected myoblasts in myoblast transfer therapy. Muscle Nerve. 1996;19(7):853–860. Farini, A., Meregalli, M., Belicchi, M., Battistelli, M., Parolini, D., D'Antona, G., Gavina, M., Ottoboni, L., Constantin, G., Bottinelli, R., y cols. (2007). T and B lymphocyte depletion has a marked effect on the fibrosis of dystrophic skeletal muscles in the scid/mdx mouse. J Pathol 213, 229-238. Frazier, K., Williams, S., Kothapalli, D., Klapper, H., and Grotendorst, G. (1996). Stimulation of fibroblast cell growth, matrix production, and granulation tissue formation by connective tissue growth factor. J Invest Dermatol 107, 404 - 411. Fukatsu, A., Matsuo, S., Yuzawa, Y., Miyai, H., Futenma, A., and Kato, K. (1993). Expression of interleukin 6 and major histocompatibility complex molecules in tubular epithelial cells of diseased human kidneys. Lab Invest 69, 58-67. Gargioli, C., Coletta, M., De Grandis, F., Cannata, S., and Cossu, G. (2008). PlGF-MMP-9-expressing cells restore microcirculation and efficacy of cell therapy in aged dystrophic muscle. Nature medicine 14, 973 - 978. Gordon, S. (2003). Alternative activation of macrophages. Nature reviews Immunology 3, 23-35. Gorospe, J.R., Tharp, M., Demitsu, T., and Hoffman, E.P. (1994). Dystrophin-deficient myofibers are vulnerable to mast cell granule-induced necrosis. Neuromuscular disorders : NMD 4, 325-333. Granot, I., Halevy, O., Hurwitz, S., and Pines, M. (1993). Halofuginone: an inhibitor of collagen type I synthesis. Biochimica et biophysica acta 1156, 107-112.
Guerette B, y cols. Prevention by anti-LFA-1 of acute myoblastdeathfollowingtransplantation.J Immunol. 1997;159(5):2522–2531. Guijarro, C., and Egido, J. (2001). Transcription factor-kappa B (NF-kappa B) and renal disease. Kidney Int 59, 415-424. Gussoni E, y cols. Normal dystrophin transcripts detected in Duchenne muscular dystrophy patients after myoblast transplantation. Nature. 1992;356(6368):435–438. Halevy, O., Nagler, A., Levi-Schaffer, F., Genina, O., and Pines, M. (1996). Inhibition of collagen type I synthesis by skin fibroblasts of graft versus host disease and scleroderma patients: effect of halofuginone. Biochemical pharmacology 52, 1057-1063. Harcourt, L.J., Holmes, A.G., Gregorevic, P., Schertzer, J.D., Stupka, N., Plant, D.R., and Lynch, G.S. (2005). Interleukin-15 administration improves diaphragm muscle pathology and function in dystrophic mdx mice. Am J Pathol 166, 1131-1141. Hawke, T.J., and Garry, D.J. (2001). Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol 91, 534-551. Hayden, M.S., and Ghosh, S. (2004). Signaling to NF-kappaB. Genes & development 18, 2195-2224. Herrera-Esparza, R., Barbosa-Cisneros, O., Villalobos-Hurtado, R., and Avalos-Diaz, E. (1998). Renal expression of IL-6 and TNFalpha genes in lupus nephritis. Lupus 7, 154-158. Hidalgo, M.A., Romero, A., Figueroa, J., Cortes, P., Concha, II, Hancke, J.L., and Burgos, R.A. (2005). Andrographolide interferes with binding of nuclear factor-kappaB to DNA in HL-60-derived neutrophilic cells. British journal of pharmacology 144, 680-686. Hnia, K., Gayraud, J., Hugon, G., Ramonatxo, M., De La Porte, S., Matecki, S., and Mornet, D. (2008). L-arginine decreases inflammation and modulates the nuclear factor-kappaB/matrix metalloproteinase cascade in mdx muscle fibers. Am J Pathol 172, 1509-1519. Hodgetts, S., Radley, H., Davies, M., and Grounds, M.D. (2006). Reduced necrosis of dystrophic muscle by depletion of host neutrophils, or blocking TNFalpha function with Etanercept in mdx mice. Neuromuscular disorders : NMD 16, 591-602. Hrabec, E., Naduk, J., Strek, M., and Hrabec, Z. (2007). [Type IV collagenases (MMP-2 and MMP-9) and their substrates--intracellular proteins, hormones, cytokines, chemokines and their receptors]. Postepy Biochem 53, 37-45. Huard J, y cols. Human myoblast transplantation between immunohistocompatible donors and recipients produces immune reactions. Transplant Proc. 1992;24(6):3049–3051.
Huebner, K.D., Jassal, D.S., Halevy, O., Pines, M., and Anderson, J.E. (2008). Functional resolution of fibrosis in mdx mouse dystrophic heart and skeletal muscle by halofuginone. American journal of physiology Heart and circulatory physiology 294, H1550-1561. Iruretagoyena, M.I., Tobar, J.A., Gonzalez, P.A., Sepulveda, S.E., Figueroa, C.A., Burgos, R.A., Hancke, J.L., and Kalergis, A.M. (2005). Andrographolide interferes with T cell activation and reduces experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 312, 366-372. Karpati G, y cols. Myoblast transfer in Duchenne muscular dystrophy. Ann Neurol. 1993;34(1):8–17. Kivela, R., Kyrolainen, H., Selanne, H., Komi, P.V., Kainulainen, H., and Vihko, V. (2007). A single bout of exercise with high mechanical loading induces the expression of Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 in human skeletal muscle. J Appl Physiol 103, 1395-1401. Kumar, A., and Boriek, A.M. (2003). Mechanical stress activates the nuclear factor-kappaB pathway in skeletal muscle fibers: a possible role in Duchenne muscular dystrophy. Faseb J 17, 386-396. Law PK, y cols. Dystrophin production induced by myoblast transfer therapy in Duchenne muscular dystrophy. Lancet. 1990;336(8707):114–115. Law PK, y cols. Feasibility,safety, and efficacy of myoblast transfer therapy on Duchenne muscular dystrophy boys. Cell Transplant. 1992;1(2-3):235–244. Law PK, y cols. Myoblast transfer therapy for Duchenne muscular dystrophy. Acta Paediatr Jpn. 1991;33(2):206–215. Leask, A., and Abraham, D.J. (2004). TGF-beta signaling and the fibrotic response. FASEB J 18, 816-827. Li, Q., Withoff, S., and Verma, I.M. (2005). Inflammation-associated cancer: NF-kappaB is the lynchpin. Trends in immunology 26, 318-325. Lopez-Rovira, T., Chalaux, E., Rosa, J.L., Bartrons, R., and Ventura, F. (2000). Interaction and functional cooperation of NF-kappa B with Smads. Transcriptional regulation of the junB promoter. J Biol Chem 275, 28937-28946. Mafi, R., Hindocha, S., Mafi, P., Griffin, M., and Khan, W.S. (2011). Sources of adult mesenchymal stem cells applicable for músculoskeletal applications - a systematic review of the literature. Open Orthop J 5 Suppl 2, 242-248. Martinez, F.O., Helming, L., and Gordon, S. (2009). Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology 27, 451-483. Mauro, A. (1961). Satellite cells of skeletal fibers. J Biophys Biochem Cytol 9, 493 - 495.
McGaha, T.L., Phelps, R.G., Spiera, H., and Bona, C. (2002). Halofuginone, an inhibitor of type-I collagen synthesis and skin sclerosis, blocks transforming-growth-factor-beta-mediated Smad3 activation in fibroblasts. The Journal of investigative dermatology 118, 461-470. McNally, E.M. (2007). New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annu Rev Med 58, 75-88. Mendell JR, y cols. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J Med. 1995;333(13):832–838. Miller RG, y cols. Myoblast implantation in Duchenne muscular dystrophy: the San Francisco study. Muscle Nerve. 1997;20(4):469–478. Minetti, G.C., Colussi, C., Adami, R., Serra, C., Mozzetta, C., Parente, V., Fortuni, S., Straino, S., Sampaolesi, M., Di Padova, M., y cols. (2006). Functional and morphological recovery of dystrophic muscles in mice treated with deacetylase inhibitors. Nat Med 12, 1147-1150. Morales, M.G., Cabello-Verrugio, C., Santander, C., Cabrera, D., Goldschmeding, R., and Brandan, E. (2011). CTGF/CCN-2 over-expression can directly induce features of skeletal muscle dystrophy. J Pathol 225, 490-501. Morales, M.G., Cabello-Verrugio, C., Santander, C., Cabrera, D., Goldschmeding, R., and Brandan, E. (2011). CTGF/CCN-2 over-expression can directly induce features of skeletal muscle dystrophy. J Pathol 225, 490-501. Morandi L, y cols. Lack of mRNA and dystrophin expression in DMD patients three months after myoblast transfer. Neuromuscul Disord. 1995;5(4):291–295. Morrison, J., Lu, Q., Pastoret, C., Partridge, T., and Bou-Gharios, G. (2000). T-cell-dependent fibrosis in the mdx dystrophic mouse. Lab Invest 80, 881 - 891. Morrison, J., Palmer, D.B., Cobbold, S., Partridge, T., and Bou-Gharios, G. (2005). Effects of T-lymphocyte depletion on muscle fibrosis in the mdx mouse. Am J Pathol 166, 1701-1710. Muehlich, S., Schneider, N., Hinkmann, F., Garlichs, C.D., and Goppelt-Struebe, M. (2004). Induction of connective tissue growth factor (CTGF) in human endothelial cells by lysophosphatidic acid, sphingosine-1-phosphate, and platelets. Atherosclerosis 175, 261-268. Muir, L., and Chamberlain, J. (2009). Emerging strategies for cell and gene therapy of the muscular dystrophies. Expert Rev Mol Med 11, e18.
Muntoni, F., Torelli, S., and Ferlini, A. (2003). Dystrophin and mutations: one gene, several proteins, multiple phenotypes. Lancet Neurol 2, 731-740. Neumeyer AM, y cols. Pilot study of myoblast transfer in the treatment of Becker muscular dystrophy. Neurology. 1998;51(2):589–592. Partridge T. The current status of myoblast transfer. Neurol Sci. 2000;21(suppl 5):S939–S942. Patel, N.S., Chatterjee, P.K., Di Paola, R., Mazzon, E., Britti, D., De Sarro, A., Cuzzocrea, S., and Thiemermann, C. (2005). Endogenous interleukin-6 enhances the renal injury, dysfunction, and inflammation caused by ischemia/reperfusion. J Pharmacol Exp Ther 312, 1170-1178. Peault, B., Rudnicki, M., Torrente, Y., Cossu, G., Tremblay, J.P., Partridge, T., Gussoni, E., Kunkel, L.M., and Huard, J. (2007). Stem and progenitor cells in skeletal muscle development, maintenance, and therapy. Mol Ther 15, 867-877. Pelosi, L., Giacinti, C., Nardis, C., Borsellino, G., Rizzuto, E., Nicoletti, C., Wannenes, F., Battistini, L., Rosenthal, N., Molinaro, M., y cols. (2007). Local expression of IGF-1 accelerates muscle regeneration by rapidly modulating inflammatory cytokines and chemokines. Faseb J 21, 1393 - 1402. Pesce, J.T., Ramalingam, T.R., Mentink-Kane, M.M., Wilson, M.S., El Kasmi, K.C., Smith, A.M., Thompson, R.W., Cheever, A.W., Murray, P.J., and Wynn, T.A. (2009). Arginase-1-expressing macrophages suppress Th2 cytokine-driven inflammation and fibrosis. PLoS pathogens 5, e1000371. Peterson, J., and Guttridge, D. (2008). Skeletal muscle diseases, inflammation, and NF-kappaB signaling: insights and opportunities for therapeutic intervention. Int Rev Immunol 27, 375 - 387. Porreca, E., Guglielmi, M.D., Uncini, A., Di Gregorio, P., Angelini, A., Di Febbo, C., Pierdomenico, S.D., Baccante, G., and Cuccurullo, F. (1999). Haemostatic abnormalities, cardiac involvement and serum tumor necrosis factor levels in X-linked dystrophic patients. Thrombosis and haemostasis 81, 543-546. Porter, J., Khanna, S., Kaminski, H., Rao, J., Merriam, A., Richmonds, C., Leahy, P., Li, J., Guo, W., and Andrade, F. (2002a). A chronic inflammatory response dominates the skeletal muscle molecular signature in dystrophin-deficient mdx mice. Hum Mol Genet 11, 263 - 272. Porter, J.D., Merriam, A.P., Leahy, P., Gong, B., and Khanna, S. (2003). Dissection of temporal gene expression signatures of affected and spared muscle groups in dystrophin-deficient (mdx) mice. Hum Mol Genet 12, 1813-1821. Pouzet B, y cols. Factors affecting functional outcome after autologous skeletal myoblast transplantation. Ann Thorac Surg. 2001;71(3):844–850; discussion 850–851.
Radley, H., Davies, M., and Grounds, M. (2008). Reduced muscle necrosis and long-term benefits in dystrophic mdx mice after cV1q (blockade of TNF) treatment. Neuromuscul Disord 18, 227 - 238. Rice, E.K., Nikolic-Paterson, D.J., Hill, P.A., Metz, C.N., Bucala, R., Atkins, R.C., and Tesch, G.H. (2003). Interferon-gamma induces macrophage migration inhibitory factor synthesis and secretion by tubular epithelial cells. Nephrology (Carlton) 8, 156-161. Rosenkranz, S. (2004). TGF-beta1 and angiotensin networking in cardiac remodeling. Cardiovascular research 63, 423-432. Ruperez, M., Ruiz-Ortega, M., Esteban, V., Lorenzo, O., Mezzano, S., Plaza, J.J., and Egido, J. (2003). Angiotensin II increases connective tissue growth factor in the kidney. Am J Pathol 163, 1937-1947. Ruster, C., and Wolf, G. (2008). The role of chemokines and chemokine receptors in diabetic nephropathy. Front Biosci 13, 944-955. Sampaolesi, M., Blot, S., D'Antona, G., Granger, N., Tonlorenzi, R., Innocenzi, A., Mognol, P., Thibaud, J.L., Galvez, B.G., Barthelemy, I., y cols. (2006). Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature 444, 574-579. Sanchez-Lopez, E., Rayego, S., Rodrigues-Diez, R., Rodriguez, J.S., Rodriguez-Vita, J., Carvajal, G., Aroeira, L.S., Selgas, R., Mezzano, S.A., Ortiz, A., y cols. (2009). CTGF promotes inflammatory cell infiltration of the renal interstitium by activating NF-kappaB. J Am Soc Nephrol 20, 1513-1526. Schober, J.M., Chen, N., Grzeszkiewicz, T.M., Jovanovic, I., Emeson, E.E., Ugarova, T.P., Ye, R.D., Lau, L.F., and Lam, S.C. (2002). Identification of integrin alpha(M)beta(2) as an adhesion receptor on peripheral blood monocytes for Cyr61 (CCN1) and connective tissue growth factor (CCN2): immediate-early gene products expressed in atherosclerotic lesions. Blood 99, 4457-4465. Seale, P., and Rudnicki, M.A. (2000). A new look at the origin, function, and "stem-cell" status of muscle satellite cells. Dev Biol 218, 115-124. Serrano, A.L., Mann, C.J., Vidal, B., Ardite, E., Perdiguero, E., and Munoz-Canoves, P. (2011). Cellular and molecular mechanisms regulating fibrosis in skeletal muscle repair and disease. Curr Top Dev Biol 96, 167-201. Shi, Y., and Massague, J. (2003). Mechanisms of TGFbeta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell 113, 685 - 700. Skuk D, Goulet M, Tremblay JP. Use of repeating dispensers to increase the efficiency of the intramuscular myogenic cell injection procedure. Cell Transplant. 2006;15(7):659–663.
Sommer, M., Eismann, U., Gerth, J., and Stein, G. (2002). Interleukin 4 co-stimulates the PDGF-BB- and bFGF-mediated proliferation of mesangial cells and myofibroblasts. Nephron 92, 868-880; discussion 880-862. Spencer, M.J., Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K., and Tidball, J.G. (2001). Helper (CD4(+)) and cytotoxic (CD8(+)) T cells promote the pathology of dystrophin-deficient muscle. Clinical immunology 98, 235-243. Stedman, H.H., Sweeney, H.L., Shrager, J.B., Maguire, H.C., Panettieri, R.A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J.M., Sladky, J.T., and Kelly, A.M. (1991). The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature 352, 536-539. Straub, V., Rafael, J.A., Chamberlain, J.S., and Campbell, K.P. (1997). Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol 139, 375-385. Taylor DA, y cols. Regenerating functionalmyocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat Med. 1998;4(8):929–933. Tidball, J. (2005). Inflammatory processes in muscle injury and repair. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288, R345 - 353. Tidball, J., and Villalta, S. (2010). Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 298, R1173 - 1187. Tidball, J.G., Spencer, M.J., and St Pierre, B.A. (1992). PDGF-receptor concentration is elevated in regenerative muscle fibers in dystrophin-deficient muscle. Exp Cell Res 203, 141-149. Torrente Y, y cols.Autologous transplantation of muscle-derived CD133+ stem cells in Duchenne muscle patients. Cell Transplant. 2007;16(6):563–577. Tremblay JP, y cols. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 1993;2(2):99–112. Turgeman, T., Hagai, Y., Huebner, K., Jassal, D.S., Anderson, J.E., Genin, O., Nagler, A., Halevy, O., and Pines, M. (2008). Prevention of muscle fibrosis and improvement in muscle performance in the mdx mouse by halofuginone. Neuromuscular disorders : NMD 18, 857-868. Tyler, K.L. (2003). Origins and early descriptions of "Duchenne muscular dystrophy". Muscle Nerve 28, 402-422.
Uhm, W.S., Na, K., Song, G.W., Jung, S.S., Lee, T., Park, M.H., and Yoo, D.H. (2003). Cytokine balance in kidney tissue from lupus nephritis patients. Rheumatology (Oxford) 42, 935-938. van Deutekom, J.C. (2005). Gene therapy: the 'pro-sense' approach to Duchenne muscular dystrophy. Eur J Hum Genet 13, 518-519. van Deutekom, J.C., and van Ommen, G.J. (2003). Advances in Duchenne muscular dystrophy gene therapy. Nat Rev Genet 4, 774-783. Vial, C., Zuniga, L., Cabello-Verrugio, C., Canon, P., Fadic, R., and Brandan, E. (2008). Skeletal muscle cells express the profibrotic cytokine connective tissue growth factor (CTGF/CCN2), which induces their dedifferentiation. J Cell Physiol 215, 410 - 421. Villalta, S.A., Nguyen, H.X., Deng, B., Gotoh, T., and Tidball, J.G. (2009). Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy. Human molecular genetics 18, 482-496. Wang, S., Wilkes, M.C., Leof, E.B., and Hirschberg, R. (2005). Imatinib mesylate blocks a non-Smad TGF-beta pathway and reduces renal fibrogenesis in vivo. FASEB J 19, 1-11. Wehling, M., Spencer, M.J., and Tidball, J.G. (2001). A nitric oxide synthase transgene ameliorates muscular dystrophy in mdx mice. J Cell Biol 155, 123-131. Wehling-Henricks, M., Sokolow, S., Lee, J.J., Myung, K.H., Villalta, S.A., and Tidball, J.G. (2008). Major basic protein-1 promotes fibrosis of dystrophic muscle and attenuates the cellular immune response in muscular dystrophy. Human molecular genetics 17, 2280-2292. Wu, S.H., Wu, X.H., Lu, C., Dong, L., Zhou, G.P., and Chen, Z.Q. (2006). Lipoxin A4 inhibits connective tissue growth factor-induced production of chemokines in rat mesangial cells. Kidney Int 69, 248-256. Wynn, T. (2008). Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. J Pathol 214, 199 - 210. Wynn, T.A. (2004). Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature reviews Immunology 4, 583-594. Xia, Y.F., Ye, B.Q., Li, Y.D., Wang, J.G., He, X.J., Lin, X., Yao, X., Ma, D., Slungaard, A., Hebbel, R.P., y cols. (2004). Andrographolide attenuates inflammation by inhibition of NF-kappa B activation through covalent modification of reduced cysteine 62 of p50. J Immunol 173, 4207-4217.
Yoshiji, H., Noguchi, R., Kuriyama, S., Ikenaka, Y., Yoshii, J., Yanase, K., Namisaki, T., Kitade, M., Masaki, T., and Fukui, H. (2005). Imatinib mesylate (STI-571) attenuates liver fibrosis development in rats. American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 288, G907-913. Zhao, Y., Haginoya, K., Sun, G., Dai, H., Onuma, A., and Iinuma, K. (2003). Platelet-derived growth factor and its receptors are related to the progression of human muscular dystrophy: an immunohistochemical study. J Pathol 201, 149-159. Zhou, L., Porter, J.D., Cheng, G., Gong, B., Hatala, D.A., Merriam, A.P., Zhou, X., Rafael, J.A., and Kaminski, H.J. (2006). Temporal and spatial mRNA expression patterns of TGF-beta1, 2, 3 and TbetaRI, II, III in skeletal muscles of mdx mice. Neuromuscular disorders : NMD 16, 32-38. Zhou, L., Rafael-Fortney, J.A., Huang, P., Zhao, X.S., Cheng, G., Zhou, X., Kaminski, H.J., Liu, L., and Ransohoff, R.M. (2008). Haploinsufficiency of utrophin gene worsens skeletal muscle inflammation and fibrosis in mdx mice. Journal of the neurological sciences 264, 106-111. Zhu, J., Li, Y., Shen, W., Qiao, C., Ambrosio, F., Lavasani, M., Nozaki, M., Branca, M., and Huard, J. (2007). Relationships between transforming growth factor-beta1, myostatin, and decorin: implications for skeletal muscle fibrosis. J Biol Chem 282, 25852 - 25863.
0 1 2 3
Ejercicio
(meses)
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*
* *
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C57BL/10 mdx
Meses de ejercicio
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Figura 3. El ejercicio acelera la progresión del fenotipo fibrótico en el musculo esquelético de animales distróficos mdx. A. Ratones mdx y controles fueron sometidos a protocolos de ejercitación, 3 veces por semana, por el periodo de tiempo señalado. Al finalizar el protocolo se procedió a aislar el musculo Tibialis Anterior para evaluar los niveles de fibronectina mediante western blot, como control se evaluaron los niveles de la proteína GAPDH. B. Cuantificación de 3 ensayos distintos. Las barras azules representan muestras provenientes de ratones control y las barras rojas muestras provenientes de animales mdx.
0
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1 2 3 4 5 6 7 8
* *
A
B
Figura 4. El ejercicio induce un aumento en la expresión de TGF-β en músculos distróficos. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de ejercitación 3 veces por semana a una velocidad de 12 metros por minuto, por un período de 1, 2 y 3 meses. Al finalizar el protocolo se procedió a extraer el RNA total del músculo tibialis anterior para evaluar la expresión de TGF-β en este músculo. A) Se evaluó la expresión de TGF-β mediante RT-PCR. B) Del mismo modo se evaluó en forma cuantitativa los niveles del mensajero para TGF-β mediante RT-PCR en tiempo real.
00,51
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PARACTIN
mdx
Figura 5. El ejercicio induce un aumento en el número núcleos positivos para la proteína smad-3 fosforilada en ratones mdx. Ratones mdx y controles de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de ejercitación, 3 veces por semana, durante 3 meses. A. Al finalizar el protocolo se procedió a aislar el músculo tibialis anterior para mediante inmunofluorescencia para el número de núcleos positivos para la proteína smad 3 fosforilada (rojo). B. Razón entre núcleos positivos para smad-3 fosforilada y núcleos totales..
C57 BL/10 Sedentario C57 BL/10 ejercitado
mdx Sedentario mdx ejercitado
50 µm
0
10
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%Nucleos positivos para smad
-‐3
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Ejercicio - +-+
C57BL/10 mdx
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Α
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F
Figura 6. El ejercicio induce un aumento en la expresión de CTGF en músculos distróficos. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron sometidos a protocolos de ejercitación 3 veces por semana durante 1, 2 y 3 meses. A) Se evaluó de forma cualitativa la expresión de CTGF mediante RT-PCR. B) Del mismo modo se evaluó en forma cuantitativa los niveles del mensajero para CTGF mediante RT-PCR en tiempo real.
0 1 2 3 0 1 2 3
mdx
Ejercicio (meses)
28s
CTGF
* *
TGF -‐ β
28s
-‐ + -‐ + -‐ -‐ + + Ejercicio
Andrografólido
mdx
Figura 7. El andrografólido no afecta la inducción de TGF-β en ratones mdx ejercitados. Ratones mdx tratados o no con andrografólido, fueron ejercitados durante 3 meses a partir de los 3 meses de edad 3 veces por semana, al finalizar el protocolo se procedió a extraer RNA total del musculo Gastronemio para determinar A) cualitativamente mediante RT-PCR la expresión del mRNA de TGF-β como también en forma cuantitativa a través de RT-PCR en tiempo real (B).
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28s
CTGF
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Andrografólido
mdx
Figura 8. El Andrografólido inhibe la inducción de CTGF en músculo de ratones mdx ejercitados. Ratones mdx tratados o no con Andrografólido fueron ejercitados durante 3 meses a partir de los 3 meses de edad 3 veces por semana, al finalizar el protocolo se procedió a extraer RNA total del musculo Gastronemio para determinar A) cualitativamente mediante RT-PCR la expresión de CTGF como también en forma cuantitativa a través de RT-PCR en tiempo real (B).
A
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Andrografólido +
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50 µ
m
Figura 10. El andrografólido inhibe el aumento células positivas para smad-3 fosforilado en respuesta al ejercicio en ratones mdx. Ratones mdx y C57BL/10 fueron ejercitados durante 3 meses. Al finalizar el protocolo se realizó una inmunofluorescencia para la proteína smad-3 fosforilada. A. cuantificación del promedio total de núcleos por sección. B. Proporción de núcleos positivos para smad-3 fosforilada y núcleos totales (DAPI).
A
B
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Nucleos positivos para smad
-‐3 fo
sforilada
Ejercicio - + - +
C57BL/10 mdx
0
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%Nucleos positivos para smad
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fosforilada/nucleos totales
Ejercicio - + - +
C57BL/10 mdx
A
B
mdx mdx + Andrografólido
200 µm
200 µm
mdx mdx + Andrografólido
Figura 11. El Andrografólido disminuye el numero de macrófagos en el músculo distrófico de ratones mdx. Ratones mdx de 2 semanas de edad fueron tratados durante las siguientes 2 semanas con Andrografólido, para luego evaluar mediante inmunohistoquímica en el musculo Gastronemio (A)y diafragma (B), la presencia de macrófagos (F4/80).
Macrofagos Eosinófilos CD4+ CD8+ mdx + Vehículo 12145 4635 841 339
mdx + PARACTIN® 6323 2298 417 170
0
2000
4000
6000
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10000
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16000
Células/mm2
Figura 12. El Andrografólido disminuye el numero de células inflamatorias en el músculo distrófico de ratones mdx. Ratones mdx de 2 semanas de edad fueron tratados durante las siguientes 2 semanas con Andrografólido, para luego evaluar mediante inmunohistquímica en el musculo quadriceps, la cantidad de células inflamatorias presentes por unidad de area. A) inmuhistoquímica para diferentes tipos de células inflamatorias encontradas en el músculo distrófico, eosinófilos (MBP), macrófagos (F4/80), Linfocitos citotóxicos (CD8+) y linfocitos ayudadores (CD4+). B) Cuantificación del numero total de células inflamatorias encontradas en el musculo de los animales distróficos tratados o no con el Andrografólido.
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el m
úscu
lo T
ibia
lis A
nter
ior m
edia
nte
tinci
ón d
e H
emat
oxili
na/E
osin
a.
-‐-‐
+ +
Ejercicio
C57B
L/10
mdx
Androg
rafólid
o-‐
-‐+
+
50 µ
m
-‐-‐
+ +
Ejercicio
C57B
L/10
mdx
Androg
rafólid
o-‐
-‐+
+
Figu
ra 1
4. E
l And
rogr
afól
ido
inhi
be la
indu
cció
n de
col
ágen
o tip
o II
I en
mús
culo
s dits
rófic
os. R
aton
es
mdx
de
3 m
eses
de
edad
, tra
tado
s o n
o co
n A
ndro
graf
ólid
o fu
eron
eje
rcita
dos 3
vec
es p
or se
man
a du
rant
e 3
mes
es. A
l fin
aliz
ar e
l pro
toco
lo, s
e es
tudi
aron
secc
ione
s tra
nsve
rsal
es d
el m
úscu
lo T
ibia
lis A
nter
ior m
edia
nte
inm
unof
luor
esce
ncia
indi
rect
a pa
ra d
etec
tar l
a pr
oteí
na d
e M
EC, c
olág
eno
tipo
III (
verd
e).
50 µ
m
Col III
GAPDH
-‐ + -‐ +
-‐ -‐ + +Ejercicio
PARACTIN -‐ + -‐ +
-‐ -‐ + +
C57BL/10 mdx
FN
Ejercicio Andrografólido
FN
Tub
Paractin -‐ + -‐ +mdx
Ejercicio -‐ -‐ + +Ejercicio
Andrografólido
Figura 15. El Andrografólido inhibe la inducción de MEC en músculo de ratones mdx. A. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con el inhibidor de Andrografólido y además fueron ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el protocolo, se aisló el músculo Tibialis Anterior y se procedió a realizar un extracto de proteínas para determinar los niveles de Fibronectina (FN) y colágeno tipo III (Col III) mediante ensayos de western blot. Como control de carga se evaluaron los niveles de la proteína GAPDH. B. Ratones mdx de 2 semanas de edad fueron tratados o no con el inhibidor de NFkB (Andrografólido) y a partir de los 3 meses de edad fueron también ejercitados 3 veces por semana durante 3 meses. Al finalizar el protocolo, se aisló el músculo Tibialis Anterior y se procedió a determinar los niveles de fibronectina (FN) mediante ensayos de western blot. Como control de carga se evaluó la proteína Tubulina (Tub).
A
B
Figura 16. El andrografólido inhibe la inducción de CTGF por TGF-β. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 6 horas con TGF-β en presencia y ausencia de Andrografólido, al finalizar la incubación se procedió a extraer el RNA total de los extractos para evaluar mediante ensayos de Northern Blot los niveles de expresión del mRNA de CTGF en respuesta a TGF-β. Como control de carga se muestran las subunidades ribosomales 28s y 18s.
-‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ + + + + TGF-‐β1 (10 ng/ml)
-‐-‐ -‐-‐ 50 25 12.5 -‐-‐ 50 25 12.5 Andrografólido (µM)
CTGF
CTGF
28S
18S
-‐-‐ -‐-‐ -‐-‐ + + + TGF-‐β1 (10 ng/ml)-‐-‐ 50 -‐-‐ -‐-‐ 50 -‐-‐ Andrografólido (µM)
A
B
25
Figura 17. El Andrografólido inhibe la inducción de proteínas de MEC por TGF-β en células musculares. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF-β en presencia y ausencia de Andrografólido. Finalizado el protocolo se evaluó mediante ensayos western blot los niveles de fibronectina, Colágeno tipo III y CTGF. Como control de carga se utilizó la proteína GAPDH.
Control
TGF-‐β
Andrografólido
TGF-‐β + Andrografólido TGF-‐β + PARACTIN
PARACTIN
-‐ + -‐ +
-‐ -‐ + +TGF-‐β
PARACTIN
mdx
FN
GAPDH
COL III
CTGF
TGF-‐β (10 ng/ml) Andrografólido (50µM)
Figura 18. El Andrografólido inhibe la insucción de colágeno tipo III por TGF-β. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF-β en presencia y ausencia del inhibidor de Andrografólido y el extracto enriquecido en el (PARACTIN). Finalizado el protocolo se evaluó mediante inmunofluorescencia indirecta en celulas no permeabilizadas, la acumulación de Colágeno tipo III (verde). En azul (Hoechst) se muestran los núcleos celulares.
Control
TGF-‐β
Andrografólido
TGF-‐β + Andrografólido
Hoechst
TGF-‐β + Paractin
Paractin
Figura 19. El andrografólido inhibe la inducción de colágeno tipo III por TGF-β. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 24 horas con TGF-β en presencia y ausencia del inhibidor de andrografólido y el extracto enriquecido en el (PARACTIN®). Finalizado el protocolo, las células fueron soltadas utilizando el quelante de calcio EDTA para luego evaluar mediante inmunofluorescencia indirecta, la deposición de Colágeno tipo III (rojo). En azul (Hoechst) se muestran los núcleos celulares. Se utilizó la tinción Hoechst para demostrar que la señal es proveniente de la MEC y no de células adheridas.
Figura 20. El Andrografólido inhibe la inducción de proteína de MEC por TGF-β en miotubos y fibroblastos. A. Células musculares C2C12 fueron diferenciadas para formar miotubos, al día 5 de diferenciación fueron incubadas durante 24 horas con TGF-β en presencia y ausencia de Andrografólido. Finalizado el protocolo se evaluó mediante ensayos de western blot los niveles de fibronectina y colágeno tipo III, como control de carga se utilizó la proteína GAPDH. B. Fibroblastos 3T3 fueron incubados durante 24 horas con TGF-b en presencia y ausencia de Andrografólido. Finalizado el protocolo se evaluó mediante ensayos de western blot los niveles de fibronectina y colágeno tipo III, como control de carga se utilizó la proteína GAPDH.
+ + -‐ -‐ -‐ -‐ + +
Andrografólido TGF-‐β
FN
Col III
Tub
+ + -‐ -‐ -‐ -‐ + +
Andrografólido TGF-‐β
FN
Col III
Tub
A
B
A
C
B
D
Figura 21. El andrografólido inhibe la inflamación inducida por TGF-β en el músculo esquelético. Músculos tibialis anterior de ratones C57 BL/10 tratados o no con andrografólido, fueron inyectados con TGF-b1, para evaluar mediante RT-PCR en tiempo real, los niveles de expresión de moléculas relacionadas con fibrosis como colágeno tipo I (A) e inflamación como IFN-γ (B), además se evaluaron los niveles de expresión de marcadores celulares específicos de macrófagos del tipo M1 como es CD68 (C) y de macrófagos M2 como CD 206 (D).
0
2
4
6
8
10
12
Adv GFP + Vehiculo
Adv GFP + Andrografólido
Adv CTGF + Vehiculo
Adv CTGF + Andrografólido
Veces d
e indu
cción Co
lágeno
tipo
I
BSA + Vehículo
TGF-β + Andrografólido
BSA + Andrografólido
TGF-β + Vehículo
0
2
4
6
8
10
12
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
Veces d
e indu
cción CD
206
BSA + Vehículo
TGF-β + Andrografólido
BSA + Andrografólido
TGF-β + Vehículo
BSA + Vehículo
TGF-β + Andrografólido
BSA + Andrografólido
TGF-β + Vehículo
0
2
4
6
8
10
12
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
Veces d
e indu
cción CD
68
0
2
4
6
8
10
12
BSA + Vehiculo BSA + Andrografólido
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
Veces d
e indu
cción IFN-‐gam
ma
BSA + Vehículo
TGF-β + Andrografólido
BSA + Andrografólido
TGF-β + Vehículo
BSA + Vehículo
TGF-β + Andrografólido
BSA + Andrografólido
TGF-β + Vehículo
0
2
4
6
8
10
12
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
TGFb + Vehiculo TGFb + Andrografólido
Veces d
e indu
cción CD
68
TGF-‐ β (1ng/ml) -‐ -‐ + Andrografólido(50µM)
-‐ + -‐ + p -‐ smad3
smad3
+
Control
TGF-‐β
Andrografólido
TGF-‐β + Andrografólido TGF-‐β + PARACTIN
PARACTIN
Figura 22. El Andrografólido no afecta la fosforilación de smad-3 inducida por TGF-β en células musculares. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 30 min. con TGF-β en presencia y ausencia de Andrografólido para evaluar mediante ensayos de western blot la fosforilación de la proteína smad-3. Como control se determinaron los niveles de la proteína smad-3 total.
Figura 23. El Andrografólido no afecta la translocación nuclear de smad-3 inducida por TGF-β en células musculares. Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 1 hora con TGF-β, en presencia y ausencia de Andrografólido y PARACTIN, para evaluar mediante inmunofluorescencia la translocación nuclear de la proteína smad-3 fosforilada (verde).
Figura 24. El andrografólido no afecta la inducción del reportero especifico para TGF-β, p3Tp-Luc en mioblastos C2C12. Mioblastos C2C12 fueron transfectadas transitoriamente con el reportero especifico para TGF-β, p3Tp-Luc, para luego ser estimuladas durante 48 horas con 10ng/ml de TGF-β1 en presencia y ausencia de 50 µM de andrografólido. Finalizado el protocolo se determinó la actividad de la enzima luciferasa.
0
5
10
15
20
25
control TGF-‐b andrografólido andrografólido + TGF-‐b
Veces d
e indu
cción repo
rtero p3
Tp-‐Luc
Figura 25. TGF-β es capaz de activar la ruta de activación canónica de NFκB en células musculares C2C12. A) Células musculares C2C12 fueron incubadas durante 30 min. con TGF-b en presencia y ausencia de Andrografólido para evaluar mediante western blot la fosforilación de la proteína IκB, como control positivo se utilizó TNF-α. B) Células musculares C2C12 fueron incubadas con TGF-β durante 60 y 360 min. en presencia y ausencia de Andrografólido para evaluar mediante western blot los niveles de la proteína IκB, como control positivo se utilizó TNF-α.
PARACTIN -‐-‐+ +TGF-‐β-‐+ -‐+
P-‐IκB
IκBtotal
-‐ + -‐ +
-‐ -‐ + +TGF-‐β
AndrografólidoPARACTIN -‐ -‐ + +
TGF-‐β -‐ + -‐ +
P-‐IκB
IκB total
P-‐IκB
IκB
TGF-‐ β (1ng/ml) -‐ -‐ + Andrografólido (50µM) -‐ + -‐ +
+
TGF-‐β (1 ng/ml) -‐ 60 360
IκB
TGF-‐ β (1ng/ml) -‐ 60 360
A
B
Veces d
e indu
cción gen
repo
rtero NFκB
Andrografólido (50 µM)
H2O2
TGF-‐β (10 ng/ml)
PARACTIN
012345678910111213141516
-‐ + -‐ -‐ + -‐ -‐ +-‐ -‐ + -‐ -‐ + -‐ -‐-‐ -‐ -‐ + + + -‐ -‐-‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ + +
-‐+-‐+
Figura 26. TGF-β induce la actividad de un reportero para NFκB en células musculares C2C12. Células musculares C2C12 fueron transfectadas con un reportero específico para NFκB y posteriormente fueron incubadas durante 24 horas con TGF-β en presencia y ausencia de Andrografólido y/o PARACTIN. Como control positivo de la inducción del reportero se utilizó H2O2 (200 µM).
Figura 27. El andrografólido inhibe la formación de fibras de estrés inducida por CTGF en células musculares. Células musculares C2C12 fueron pre-incubadas durante 2 horas con andrografólido para luego ser co-incubadas con CTGF durante 1 hora. Al finalizar la incubación las muestras fueron estudiadas mediante inmunofluorescencia utilizando la toxina faloidina acoplada a FITC (verde).
Control
CTGF + Andrografólido
Andrografólido
CTGF
Figura 28. El andrografólido inhibe el aumento de colágeno tipo III inducido por CTGF en el músculo esquelético. Ratones C57BL/10 fueron inyectados en el músculo Tibialis Anterior con un adenovirus que contiene la secuencia codificante para CTGF. Previamente los ratones fueron tratados con andrografólido durante 2 días previos a la inyección y durante los 5 días posteriores a la inyección. Se evaluó mediante inmunohistoquímica la proteína de MEC colágeno tipo III.
Adv CTGF + Andrografólido CTGF + PBS Adv
100 µm
0
2
4
6
8
10
12
Adv GFP + Vehiculo Adv GFP + PARACTIN
Adv CTGF + Vehiculo
Adv CTGF + PARACTIN
Veces d
e indu
cción CD
206
Adv CTGF + Andrografólido
Adv GFP + Vehículo
Adv GFP + Andrografólido
Adv CTGF + Vehículo
Adv CTGF + Andrografólido
Adv GFP + Vehículo
Adv GFP + Andrografólido
Adv CTGF + Vehículo
0
2
4
6
8
10
12
BSA + Vehiculo BSA + PARACTIN TGFb + Vehiculo TGFb + PARACTIN
Veces d
e indu
cción IFN-‐gam
ma
0
2
4
6
8
10
12
Adv GFP + Vehiculo Adv GFP + PARACTIN
Adv CTGF + Vehiculo
Adv CTGF + PARACTIN
Veces d
e indu
cción Co
lágeno
tipo
I
Adv CTGF + Andrografólido
Adv GFP + Vehículo
Adv GFP + Andrografólido
Adv CTGF + Vehículo
0
2
4
6
8
10
12
Adv GFP + Vehiculo Adv GFP + PARACTIN
Adv CTGF + Vehiculo
Adv CTGF + PARACTIN
Veces d
e indu
cción CD
68
Adv CTGF + Andrografólido
Adv GFP + Vehículo
Adv GFP + Andrografólido
Adv CTGF + Vehículo
A
C
B
D
Figura 29. CTGF induce fibrosis e inflamación en el musculo esquelético y el andrografólido es capaz de inhibir estos efectos. Músculos tibialis anterior de ratones C57BL/10 tratados o no con andrografólido, fueron inyectados con un adenovirus que contiene la secuencia codificante para CTGF, para evaluar mediante real time RT-PCR, los niveles de expresión de moléculas relacionadas con fibrosis como colágeno tipo I (A) e inflamación como IFN-γ (B), además se evaluaron los niveles de expresión de marcadores celulares específicos de macrófagos del tipo M1 como es CD68 (C) y de macrófagos M2 CD206 (D).
AdvCTGF + AndrografólidoAdvCTGF + PBS
A
B
Figura 30. CTGF induce un aumento en la infiltración de macrofágos en el musculo esqueletico y el andrografólido inhibe este efecto. Ratones C57BL/10 fueron inyectados en el musculo tibialis anterior con un adenovirus que contiene la secuencia codificante para CTGF. Previamente los ratones fueron tratados con andrografólido durante 2 días previos a la inyección y durante los 5 días posteriores a la inyección. A) Se evaluó mediante inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos anti F4/80 (verde) y CD206 (rojo) para determinar los tipos de poblaciones presentes en el tejido. Los macrofagos del tipo M1 (F4/80 positivos y CD206 negativos) se observan en verde, mientras los macrófagos del tipo M2 (F4/80 positivos y CD206 positivos). Se observan en color amarillo. (B) Para determinar de forma más específica la presencia de macrófagos M1, determinamos mediante inmunohistoquímica la presencia de estos utilizando el anticuerpo anti CD68.
50 µm
50 µm
A
Figura 31. El andrografólido disminuye principalmente el número de Macrófagos M1 inducidos por CTGF en el músculo esquelético. Ratones C57BL/10 fueron inyectados en el musculo tibialis anterior con un adenovirus que contiene la secuencia codificante para CTGF. Previamente, los ratones fueron tratados con andrografólido durante 2 días previos a la inyección y durante los 5 días posteriores a la inyección. A) Cuantificación del número de macrófagos M1 por unidad de área, evaluados mediante inmunofluorescencia (F4/80 positivos y CD206 negativos). B) Cuantificación del número de macrófagos M2, evaluados mediante inmunofluorescencia (F4/80 positivos y CD206 positivos) por unidad de área. C) Porcentaje del número de macrófagos M1 y M2 versus el número total de Macrófagos.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
Adv CTGF + Vehículo Adv CTGF + Andrografólido
Macrófagos M2
N°de MacrófagosM
2/mm
2
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
Adv CTGF + Vehículo Adv CTGF + Andrografólido
Macrófagos M1
N°de MacrófagosM
1/mm
2
C
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Adv CTGF + Vehículo Adv CTGF + Andrografólido
Macrófagos M1
Macrófagos M2
% de MacrófagosM1 o M2/
Macrófagos totales
Figure 32. La fibrosis inhibe la migración celular y el andrografólido revierte este efecto. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados o no con andrografólido y además ejercitados durante 3 meses. Finalizado este protocolo se procedió a inyectar 5 millones de células migratorias (fibroblastos de tendón) teñidas con DiI (rojo) en el musculo Tibialis Anterior. A. Luego de transcurrido un mes post-inyección se cuantificó el número de células encontradas en lugares lejanos al sitio de la inyección en relación al numero total de células encontradas por sección. En verde se muestra la proteína colágeno tipo III teñida mediante inmunofluorescencia. B. Cuantificación del porcentaje de células encontradas en zonas alejadas al sitio de la inyección (mayor a 1 mm de distancia).
A
B
Ejercicio Andrografólido
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4-‐ -‐
+ -‐
-‐ +
+ +
mdx sedentario + vehículo
mdx sedentario + vehículo
mdx ejercitado + Andrografólido
mdx ejercitado+ Andrografólido
Figura 33. Las células migratorias se encuentran preferentemente en aéreas con bajo contenido de Colágeno tipo III. Músculos tibialis anterior de animales mdx tratados o no con andrografólido, fueron inyectado con 5 millones de células migratorias (fibroblastos de tendón) teñidas con DiI (rojo). Luego de un mes se procedió a realizar cortes histológicos y del músculo para determinar el número de células migratorias en diferentes zonas con diferentes niveles de colágeno tipo III (verde). El contenido se colágeno se cuantifico de forma indirecta, mediante el software image J (NIH/USA), determinando el area de la imagen ocupada por colágeno.
0-‐10 10-‐20 20-‐30 30-‐40 40-‐50 50-‐60 60-‐70 70-‐80 80-‐90 90-‐100 0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
% de colágeno 6po III
% de celulas m
igratoria
s
Vehículo Andrografólido
0
40
80
120
160
200
mdx + Vehículo mdx + PARACTIN
# Fibras distrofi
na (+
) / Tibialis
Anterio
r
Figura 34. El tratamiento previo con andrografólido aumenta la eficiencia de la terapia celular. Ratones mdx de 3 meses de edad fueron tratados durante 2 meses con andrografólido. Finalizado este tratamiento se esperaron 2 semanas para luego trasplantar mioblastos de musculo control en el musculo Tibialis Anterior de estos ratones. A) Al cabo de 1 mes se procedió a analizar los músculos mediante inmunofluorecencia indirecta para determinar el numero de fibras capaces de expresar distrofina (rojo). Para demostrar que los músculos provenientes de ratones mdx tratados con andrografólido presentan menos fibrosis, realizamos inmunofluorescencia para la proteína de MEC (colágeno tipo III) mostrada en color verde, en azul se muestran los núcleos celulares teñidos con Hoechst. B) cuantificación del numero de fibras musculares positivas para distrofina.
A
B
Figura 35. El andrografólido induce un aumento en la fuerza en músculos distróficos. Ratones mdx y control fueron tratados o no con andrografólido a partir de las 2 semanas de edad durante 4 meses. Al finalizar el protocolo se procedió a evaluar mediante electrofisiología la fuerza inmediata (sacudida) a diferentes frecuencias.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80 100
mN/m
m2
Frecuencia (pps)
C57 + Vehículo
C57 + PARACTIN®
mdx + PARACTIN®
mdx + Vehículo
C57 BL/10 + Vehículo
C57 BL/10 + Andrografólido
mdx BL/10 + Andrografólido
mdx BL/10 + Vehículo
** * *
*
Figura 36. El andrografólido induce un aumento en la fuerza en músculos distrófico. Ratones mdx y control fueron tratados o no con andrografólido a partir de las 2 semanas de edad durante 4 meses. Al finalizar el protocolo se procedió a evaluar mediante electrofisiología la fuerza tetánica producida a la mínima frecuencia que produjo la mayor fuerza inmediata (sacudida).
0
5
10
15
20
25
30
C57Bl/10 + Vehículo
C57Bl/10 + Andrografólido
mdx+ Vehículo mdx + Andrografólido
mN/m
m2
*
Figura 37. El andrografólido mejora el performance de los animales distróficos frente al ejercicio. A. Ratones mdx y control fueron tratados o no con andrografólido a partir de las 2 semanas de edad durante 4 meses. A partir del 6 semanas de edad comenzaron a ser entrenados en una cinta trotadora durante los siguientes 3 meses. Luego fueron desafiados un protocolo de ejercicio extenuante durante 5 minutos y se evaluó el número de veces en que estos paraban y retrocedían en la cinta trotadora, cruzando la zona demarcada con la línea roja. B. Cuantificación de un promedio de 5 mediciones de 8 animales distintos para cada tratamiento.
A
B
0
5
10
15
20
25
30
C57Bl/10 + Vehículo
C57Bl/10 + Andrografólido
mdx+ Vehículo mdx + Andrografólido
mN/m
m2
05
101520253035
C57 + Vehículo C57 + PARACTIN®
mdx + Vehículo mdx + PARACTIN®
#Retrocesos
*