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Biología molecular en el laboratorio clínico: cómo implementar ?
Dra. Gabriela Muñoz
Laboratorio Biología Molecular
Servicio Laboratorio Clínico
Hospital Clínico Universidad de Chile
Curso Microbiología Mayo 2015
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Temario
• Qué considerar ?
• Qué implementar?
• Cómo implementar?
• Cómo evaluar costos?
• Cómo controlar la calidad?
• Cómo eliminar desechos?
• Cómo interpretar?
• Cómo informar?
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Es necesario implementar BM?
Necesidad clínica Sensibilidad Especificidad oportunidad
Demanda UCI Pediatría Ginecología Urologia Med Interna Infectología Ambulatorio
semanal
Frecuencia
24/7 diaria
Infraestructura Personal Equipamiento/formato/menú
Costo Implementación / costo por muestra
oportunidad
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Equipos y formatos de PCR Convencional TIEMPO REAL
Investigación
IVD - RUO – S - E
SINGLE
FORMATO
COMPRA COMODATOS
ADQUISICIÓN
MULTIPLEX
PROGRAMAS UNICOS
PROGRAMAS COMPARTIDOS
OFE
RTA
D
EMA
ND
A
CO
STO
OPCIONALES PREDEFINIDOS
CUANTITATIVOS URGENCIAS
CUALITATIVOS SINDROMES
EQUIPO MENOR Y FUNGIBLES
DEFINICION NECESIDADES UTILIDAD CLINICA COSTO PRESTACIÓN DEMANDA
CUALITATIVOS SEMI Q
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• Microcentrifuga /spin
• Termobloque/baño TR
• Vortex
• Micropipetas
• Microtubos RNAse free /tips con filtro
• Gradillas
• Cooler /cool rack
• Refrigeradores- Freezer
Equipos menores y fungibles
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Cuál es el costo ?
• Costo por determinación
• Costo por muestra procesada
– Costo de cada reactivo desde extracción a detección (IVA): costo por determinación
– Costo de Fungibles por corrida
– Cuantas determinaciones necesito hacer por una corrida para 1 muestra ( controles, stds): costo total por muestra
– Estimación demanda mínima y máxima: costo total por protocolo
–
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ANALISIS COSTO HSV (VZV)
MUESTRAS EXTRAC AMPLI CAPIL EXTRAC AMPL CAPIL
TOTAL
REACT COSTO/MTA
1 3 5 5 16.353 73135 1660 91.148 91148
2 4 6 6 21.804 87762 1992 111.558 55779
3 5 7 7 27.255 102389 2324 131.968 43989
4 6 8 8 32.706 117016 2656 152.378 38095
5 7 9 9 38.157 131643 2988 172.788 34558
6 8 10 10 43.608 146270 3320 193.198 32200
7 9 11 11 49.059 160897 3652 213.608 30515
8 10 12 12 54.510 175524 3984 234.018 29252
9 11 13 13 59.961 190151 4316 254.428 28270
10 12 14 14 65.412 204778 4648 274.838 27484
11 13 15 15 70.863 219405 4980 295.248 26841
12 14 16 16 76.314 234032 5312 315.658 26305
13 15 17 17 81.765 248659 5644 336.068 25851
14 16 18 18 87.216 263286 5976 356.478 25463
15 17 19 19 92.667 277913 6308 376.888 25126
Cotización 0119 julio
KIT EXTRACCION x 32 $145.480 + iva = $ 174.431 costo x extraccion: $5.451 5451
KIT AMPLIFICACION x 48= 590.000 + IVA 112.100 = $ 702.100 costo x amplif : $ 14.627 14627
Capilares x 480 $ 149.900 + iva = $159.381 costo x capilar: $ 332 332
total determ: 20410
Rendimiento máximo: 48 AMPLIFICACIONES 4 controles x protocolo
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PCR tiempo real
Infraestructura y diseño
Extracción
transcripción One step
automatizada Manual
Extracción Mezclas carga
Separadas físicamente Equipos y fungibles exclusivos Pipetas exclusivas Zonas despejadas Guantes/delantales exclusivos
Gabinete bioseguridad II
campana aire muerto
Amplificación/detección
Flujos de aire: presiones
A R E A S
FLUJO - FRECUENCIA
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Flujos de aire en PCR
Área limpia Área contaminada
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Extracción manual y PCR - TR
In house Incubaciones /lavados Centrifugaciones
Columnas silica Incubaciones/lavados Centrifugaciones presion
AREA EXCLUSIVA aislada separada CAMPANA BS UNIDIRECCIONAL INSTRUCCIONES ESTRICTAS
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Extracción manual y PCR - TR
TIPS
Limpiar area de trabajo antes y despues del trabajo
Decontaminar con UV post término
Area despejada al término
Preparar todo el material necesario previamente
Tubos de muestra cerrados. Abrir solo tubo en uso.
Tubos de lisis cerrados. Abrir solo en uso
Separar tubo de lisis por medio en gradilla
Seguir instrucciones
Cambiar Tips y eliminar
Usar control de extracción
Guantes / delantal desechable exclusivo
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Extracción Mezcla PCR Carga eluído Amplificación/
detección
Extracción manual y PCR - TR
UNIDIRECCIONAL areas separadas /aisladas/ independiente
Exclusiva
Campana BS
(aislada)
Separada
Exclusiva
Separada
Independiente
Exclusiva
independiente
aislada (gabinete)
Separada
Exclusiva
Aislada (Gabinete)
Separada
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Extracción automatizada y PCR - TR
Zona carga muestra
AREA EXCLUSIVA ( gabinete BS)
Extracción Extracción + amplificación
Zona carga eluído
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Preparación de mezclas
Mantener área limpia y despejada
Bajo campana o en área exclusiva independiente
Seguir instrucciones
Mantener reactivos en frío
Marcar descongelación de reactivos
Alicuotar reactivos
Mezclar previa preparación
Mirar volumen al depositar en tubos/capilares
Guantes y delantal exclusivos
NO VOLVER A ESTA ÁREA (M)
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• Bajo campana aislada separada(BS II)
• Área limpia y despejada
• Aseo previo y post con UV
• Tubos cerrados. Abrir al cargar y cerrar.
• Capilares. Tapar al cargar.
• Mirar volumen de carga. No trabajar mecanicamente.
• Cambiar tips / eliminar
• Guantes y delantal exclusivo
• Cambiar guantes para el traslado
Carga de eluídos/extraídos
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Amplificación y detección
Equipos y PC Seguir instrucciones de carga y establecimiento de protocolo Mantener secuencia Area separada independiente - Climatizada -limpia Guantes nuevos al trasladar y depositar Sin guantes al programar Eliminar tubos / capilares/ placas
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PCR Cuantitativa
Monitoreo infección
Pronóstico
Rol patogénico
Cuantificación acumulación exponencial : Interpretación Log10
• Uso de estándares
Diferente linearidad
Diferente formatos de unidad Copias/ ml
UI/ ml
Copias /PCR
Copias/5 ml
No intercambiables entre sí No equivalentes entre sí Copias/ ml y log10 Repetir positivos bajos / diluir
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Capacitación personal
• Capacitación metodologías
• Certificado
• Capacitación en manualidades de PCR
• Mínimo 2 profesionales
• Rotación
• Mínimo frecuencia de 2-3 veces a la semana
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EPP - Eliminación desechos
Sin talco
Exclusivo en cada área No tocar NADA sin guantes
•Muestras
•cortopunzante Reactivos
Tips
guantes
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• AREA LIMPIA AREA SUCIA
• MATERIAL EXCLUSIVO
• CONTROLES DE CONTAMINACIÓN
• ALICUOTAR REACTIVOS
• DECONTAMINACIÓN (UDG/ UV/ hipoclorito 0,5%/ etanol 70%)
• MANIPULACIÓN
• PERSONAL ASEO
Contaminación
La contaminación no se ve ni se siente Detección tardía
FUENTE Templado Amplicones
VIA Contacto Aerosoles
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Estandarización de PCR Característica Fuente Forma /frecuencia
Precisión Reproducibilidad Repetibilidad
Conocidas positivas negativas
Cuali: 3 mts LOD/ < 20%/ > 20% x 40 veces c/u QT: 5 mts alta/baja/LOD x duplicado x20 dias
Linearidad Rango detección alto y bajo
Estandarizadas positivas
7-11 concent diferentes Sobre y bajo Limites alto /bajo 2-4 replicados por concentración
S analítica Rango detección baja estandarizadas diluidas
2-40 replicados en diluciones 20 mts bajo y sobre LOD
E analítica Reacción cruzada/ interferentes/inhibición
Conocidas negativas Relación genetica Sindrome / interferentes
Cada Tipo de muestra diferente Duplicado Contaminar
Exactitud trueness Estandarizada Metodo referencia
40 -50 mts x duplicado (+) alto bajo medio 50 (-) genotipos
Revalidación
Cambio modificacion ensayo/ tipo mts
Conocidas positivas negativas
Intervalo Referencia
Cualitativo NO QT
Estandarizadas clinicamente
Diluciones LOD / CUTOFF asintomatico vs activa
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Limitaciones
• Costo
• Disponibilidad de controles
• Método de referencia
• Positivos conocidos /negativos
•clinicos •otro método
• Estandares QT de proficiencia • Otros laboratorios
• Kit completo ( > 50 determinaciones) • Positivos y negativos (60/40) • Duplicado • Diluciones (LOD) QT
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Controles de PCR
CLIA ( each run)
• Cualitativa – Extracción
– Amplificación :positivo/negativo
– Control interno
• Cuantitatitativa – Extracción
– Amplificación: negativo/alto /bajo
– Control interno
– Control calibración (cutoff)*
– Control rango analitico*
ISP (contaminación)
• Control extracción – H20 RNAse free
• Control reactivos – Mezcla sin DNA
• Control manipulación – Tubos con H2O intercalados
cada 3-4 mts
• Control de réplica – Mts en duplicado (TR)
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Controles de PCR
Extracción
Amplificación
Inhibición
´Contaminación
Positiva* Negativa Mezcla E
Mezcla A Duplicadas
* Q positivo bajo y alto
CI
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Control de inhibición (CI)
Control Interno
Homólogo extrínseco Target modificado
Heterólogo extrínseco Target diferente Primers – probes diferentes
Heterólogo intrínseco Housekeeping genes Primers – probes diferentes
Inhibidores Endógeno Exogenos CI en bajas concentraciones
Co-amplificación (Competitivo) /paralelo Desde extracción ( proceso completo) Desde mezcla ( amplificación) Diferentes tipos según formato
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Protocolos
M 1
M 1
M 2
MC -
C E
M 2
MC +
C A
Muestras duplicadas •reproducibilidad •Contaminación •amplificación
Extracción amplificación
contaminación
(extraccion) Amplificación C +
contaminación
contaminación
CI
POS
NEG
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Interpretación e Informes
Muestra Control (+) Control (-) CI Resultado
negativa positivo negativo positivo NEGATIVO
positiva positivo Negativo Positivo negativo
POSITIVO
negativa positivo negativo negativo INHIBIDO REPETIR
Positiva Positivo Positivo Positivo negativo
CONTAMINACION REPETIR
Positiva negativo negativo Positivo negativo
Cambio mta? Cambiar control Repetir
Método utilizado Tipo muestra Limite de detección / linearidad
No detectado / Detectado N° copias/ml log 10 Detectado fuera de rango de cuantificación ( < a 10 cps/ ml : > 100 mil cps/ml) Observaciones
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Control de calidad
Cualitativos: Registro de valores de CT C(+) durante el mes (DS 2) Alternar ensayos
Cuantitativos: Registro de valores de log10 standard (+) durante el mes (CV < 20%) Alternar ensayos
Control Calidad Externo Cuali - cuantitativo
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• Funcionamiento multiplex
• Desechos
• fotos