imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora
DESCRIPTION
Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora. doktorant: Vana Košta mentor: prof. dr. sc. Ivica Grković Zavodu za anatomiju, histologiju i embriologiju Medicinskog fakulteta u Splitu. uvod. Inervacija srca. Nodozni ganglij. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/1.jpg)
Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na
srčane neurone u nodoznom gangliju štakora
doktorant: Vana Koštamentor: prof. dr. sc. Ivica GrkovićZavodu za anatomiju, histologiju i
embriologiju Medicinskog fakulteta u Splitu
![Page 2: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/2.jpg)
Inervacija srca
uvod
![Page 3: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/3.jpg)
Nodozni ganglij
Imunohistokemijska obilježja
neurotransmiteri: glutamat, katekolamini, serotonin,
acetilkolin
neuropeptidi: CGRP, ENK, galanin, NPY, SOM, SP, NKA,
VIP
IB4, N52, TRPV1
bjelančevine koje vežu kalcij: CALR, CALB, PARV
![Page 4: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/4.jpg)
Imunohistokemijska obilježja “srčanih” neurona u nodoznom gangliju
svega 2-5 % svih neurona nodoznog ganglija
Aδ vlakna C vlakna 70%
N52 61% IB4 20 % SP 17% CGRP 9%
![Page 5: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/5.jpg)
Utjecaj tjelovježbe na srce
povećanje udarnog srčanog volumena
povećanje volumena desne i lijeve klijetke
hipertrofija miokarda
promjene u nadzornom djelovanju autonomnog živčanog sustava
![Page 6: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/6.jpg)
Utjecaj tjelovježbe na vagus
pojačana vagalna aktivnost
smanjenje srčane frekvencije u mirovanju (Lin et al. 1972., Wisloff et al. 2001., Danson et al. 2003.)
kardioprotektivni utjecaj tjelovježbe posredovan vagusom (Buch et al. 2002. i Buchheit et al. 2004.)
![Page 7: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/7.jpg)
Utjecaj tjelovježbe na neurone
povećanje broja neurona u hipokampusu koji eksprimiraju bjelančevine koje vežu kalcij (Arida i sur. 2004 i Choi i sur. 2009.)
nastanak novih neurona u području hipokampusa (Jin i sur. 2008.)
produljeno preživljenje neurona (van Praag i sur. 1999. i Jin i sur. 2008.)
![Page 8: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/8.jpg)
Obilježiti „srčane“ neurone unutar nodoznog ganglija koji se projiciraju u različite dijelove srca i obilježene skupine neurona usporediti brojčano, morfološki i imunohistokemijski.
Utvrditi može li intenzivna aerobna tjelovježba i posljedična promjena srčane strukture izazvati promjene neurokemijskog fenotipa osjetnih srčanih neurona u nodoznom gangliju štakora.
Ciljevi istraživanja
![Page 9: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/9.jpg)
Hipoteze istraživanja
1. Imunohistokemijske karakteristike osjetnih neurona koji inerviraju srčane klijetke i pretklijetke su različite.
2. Tjelovježba i posljedične strukturalne promjene lijeve klijetke bit će dovoljan poticaj za kvantitativne i imunohistokemijske promjene osjetnih srčanih neurona u nodoznom gangliju.
![Page 10: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/10.jpg)
metode istraživanja
Pokusne životinjeSprague-Dawley rats
N=24
![Page 11: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/11.jpg)
Kirurški zahvat i obilježavanje neuronalnom bojom (Huikeshoven et al. 2000.)
![Page 12: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/12.jpg)
Priprema tkiva
Mjerna jedinica = 1mm na D, 400μm na E i 100μm na slici F
![Page 13: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/13.jpg)
Dvostruka imunohistokemija
protutijelo kat. br. vrsta razrijeđenje proizvođač
primarno
neurofilament 200 MAB 5266 miš 1:1000 Sigma, St. Louis, SAD
kalretinin Ab702 zec 1:400Abcam plc.332 ,
sekundarno
zečji IgG-R F2507 magarac 1:200 Biotechnology
mišji IgG (H+L), TR 71C3-1 koza 1:200 Molecular Probes,
Eugene, Oregon, SAD
Primarna i sekundarna protutijela
izolektin konjugiranim s fluorescein isotiocijanatom (FITC) (1:200, Sigma, St. Louis, SAD)
![Page 14: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/14.jpg)
Tjelovježba
8 tjedana
60 min/dan
5 dana/tjedan
nagib 10º
28 m/min
![Page 15: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/15.jpg)
Statistički postupci
Broj FB pozitivnih neurona, promjer stanica, tjelesna težina životinja i težina njihovih srdaca izražen je kao aritmetička sredina±SD.
Obrada se napravila uz pomoć GraphPad (La Jolla, CA, USA) računarskog programa; razina statističke značajnosti je p<0,05.
Hi-kvadrat test koristili smo za usporedbu imunopozitivnosti među skupinama, a za ostale podatke Kolmogorov-Smirnov test nakon kojeg je slijedio t-test ili ANOVA
![Page 16: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/16.jpg)
rezultati
Obilježja neurona nodoznog ganglija koji inerviraju srce štakora
prosječan broj FB obojanih
neurona u nodoznom gangliju 51
(51±30, 9-133)
značajno veći br neurona koji se
projicirao u klijetke nego u
pretklijetke 65,8±35 vs. 39,6±21,
p=0,03N=1344
![Page 17: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/17.jpg)
Neurokemijski fenotip i morfološka obilježja srčanih aferentnih neurona u nodoznom gangliju
Izolektin pozitivni srčani neuroni
Mjerna jedinica = 50µm.
23% IB4+ neurona projicira se u desnu stranu srca dok se u lijevu stranu srca projicira 16% IB4+ neurona (p=0,01, Hi-kvadrat test).
![Page 18: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/18.jpg)
Neurofilament 200 pozitivni srčani neuroni
Mjerna jedinica = 50µm.
60% neurona je koji se projiciraju u lijevu klijetku su N52+, dok je udio N52+ neurona koji se projiciraju u desnu klijetku 44% (p=0,03, Hi-kvadrat test).
![Page 19: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/19.jpg)
Kalretinin pozitivni srčani neuroni
Mjerna jedinica = 25µm.
36% neurona koji se projiciraju u klijetke su CALR+, dok je samo 11% neurona koji se projiciraju u pretklijetke CALR+ (p<0,0001, Hi-kvadrat test).
![Page 20: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/20.jpg)
Neurokemijski profil neurona u nodoznom gangliju koji se projiciraju u različite dijelove srca. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama.
FB obilježeni
neuroni (N=736)
lijeva
pretklijetka
(N=155)
desna
pretklijetka
(N=179)
lijeva klijetka
(N=245)
desna klijetka
(N=157)
IB4+ 19/155 (12) 37/179 (21) 45/245 (18) 41/157 (26)
N52+ 43/76 (56) 46/82 (56) 70/116 (60) 31/70 (44)
CALR+ 10/79 (13) 10/97 (10) 51/129 (40) 27/87 (31)
![Page 21: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/21.jpg)
Neurokemijski profil dvostrukog bojenja (kolokalizacije) FB-om obilježenih neurona u nodoznom gangliju koji se projiciraju u različite dijelove srca. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama.
FB obilježeni
neuroni (N=736)
lijeva
pretklijetka
(N=155)
desna
pretklijetka
(N=179)
lijeva klijetka
(N=245)
desna klijetka
(N=157)
IB4+N52+ 2/76 (3) 5/82 (6) 2/116 (2) 2/70 (3)
IB4-N52- 26/76 (34) 22/82 (27) 26/116 (22) 20/70 (29)
IB4+CALR+ 2/79 (3) 1/97 (1) 9/129 (7) 3/87 (3)
IB4-CALR- 66/79 (84) 70/97 (72) 65/129 (50) 43/87 (49)
![Page 22: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/22.jpg)
Utjecaj tjelovježbe na srce i neurone nodoznog ganglija štakora
Utjecaj tjelovježbe na srce i tjelesnu težinu vježbanih i kontrolnih životinja. Vrijednosti su izražene kao aritmetičke sredine±S.D.
kontrolne
životinje
vježbane
životinje
tjelesna težina, g 228±17,5 256±21,3
težina srca, g 0,956±0,06 1,093±0,16
težina srca/tjelesna težina,
x10004,20±0,38 4,25±0,34
![Page 23: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/23.jpg)
Neurokemijski profil neurona nodoznog ganglija koji se projiciraju u lijevu klijetku u životinja podvrgnutih tjelovježbi i u kontrolnih životinja. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama.
FB+ neuroni
kontrolnih životinja
(N=238)
FB+ neuroni životinja
podvrgnutih
tjelovježbi (N=176)
IB4+ 83/238 (34) 57/176 (32)
N52+ 73/118 (62) 55/77 (71)
CALR+ 18/120 (15) 18/99 (18)
![Page 24: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/24.jpg)
Mali broj neurona pokazao je dvostruka bojenja
Mjerna jedinica = 50µm.
![Page 25: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/25.jpg)
Utjecaj tjelovježbe na veličinu srčanih neurona
U skupini podvrgnutoj tjelovježbi promjer N52+ neurona (24,5±4,5μm, N=30) značajno je veći i od promjera CALR+ (21,2±3,2μm, N=30) i od IB4+ neurona (21,4±4,2μm) (p=0,0071, jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) za nezavisne uzorke popraćena Bonferronijevim testom).
Promjer N52+ neurona značajno je veći u životinja podvrgnutih tjelovježbi nego u životinja u kontrolnoj skupini (p=0,016, t-test za nezavisne uzorke).
![Page 26: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/26.jpg)
Utjecaj tjelovježbe na promjene neurokemijskog fenotipa srčanih neurona tijekom vremena
![Page 27: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/27.jpg)
Utjecaj tjelovježbe na imunohistokemijske karakteristike svih neurona unutar nodoznog ganglijaNeurokemijski profil svih neurona nodoznog ganglija u životinja podvrgnutih tjelovježbi i kontrolnih životinja. Svi podaci su prikazani kao proporcije s postotkom u zagradama.
neuroni nodoznog ganglija
kontrolnih životinja
(N=1767)
neuroni nodoznog ganglija
životinja podvrgnutih
tjelovježbi (N=1513)
IB4+* 1280/1767 (72) 1176/1513 (78)
N52+254/785 (32) 202/713 (28)
CALR+77/982 (8) 69/800 (9)
* p=0.007, Hi-kvadrat test
![Page 28: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/28.jpg)
zaključci
1.Neuroni koji se projiciraju u različite dijelove srca imaju različite imunohistokemijske karakteristike temeljene na njihovoj imunoreaktivnosti na IB4, N52 i CALR.
2.Neuroni nodoznog ganglija koji šalju svoje projekcije u srce imaju drugačije osobine i to ne samo kada ih se uspoređuje međusobno (ovisno u koji dio srca se projiciraju) nego i kada ih se uspoređuje s ostalim neuronima u nodoznom gangliju ili s neuronima u spinalnim ganglijima koji se projiciraju u srce.
![Page 29: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/29.jpg)
3. Rezultate pojedinih imunohistokemijskih bojenja neurona u štakora važno je promatrati u odnosu na dob životinja.
4. Intenzivna tjelovježba u štakora ne dovodi do promjena u imunoreaktivnosti na IB4, N52 i CALR unutar neurona nodoznog ganglija koji se projiciraju u lijevu klijetku.
5. Morfološka obilježja neurona koji se projiciraju u lijevu klijetku kao i imunohistokemijska obilježja ostalih neurona unutar nodoznog ganglija mijenjaju se kao odgovor na tjelovježbu.
![Page 30: Imunohistokemijska obilježja i utjecaj tjelovježbe na srčane neurone u nodoznom gangliju štakora](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062422/56812b3b550346895d8f4e06/html5/thumbnails/30.jpg)
6. Utvrđivanje postojanja različitih podskupina neurona koji su odgovorni za inervaciju točno određenog dijela srca važno je jer takve podskupine predstavljaju vrlo preciznu metu za daljnja istraživanja i potencijalni cilj na koji se može djelovati terapijski.
7. Tjelovježbom uvjetovane morfološke i imunohistokemijske promjene neurona unutar nodoznog ganglija upućuju na mogućnost da je upravo nodozni ganglij inicijator vagalnih promjena koje nastaju kao posljedica dugotrajne tjelovježbe.