promjena histološke građe jetre štakora izazvana prehranom
TRANSCRIPT
SVEUČILIŠTE U ZAGREBU
STOMATOLOŠKI FAKULTET
Iva Marolt Banek
PROMJENA HISTOLOŠKE GRAĐE JETRE
ŠTAKORA IZAZVANA PREHRANOM
DIPLOMSKI RAD
Zagreb, rujna 2011.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
Rad je ostvaren u:
1. Zavodu za fiziologiju Stomatološkog fakulteta, Sveučilište u Zagrebu
(eksperimentalni dio, prof. dr. sc. Jagoda Roša)
2. Zavodu za Histologiju i embriologiju Medicinskog fakulteta,
Sveučilište u Zagrebu
(histološki dio, prof. dr. sc. Ljerka Banek)
Voditelj rada:
Prof. dr.sc. Ljerka Banek
Zavod za histologiju i embriologiju
Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu
Lektor hrvatskog jezika: Anja Hohnjec, prof. hrvatskog jezika
Lektor engleskog jezika: Ivan Sertić, prof. engleskog jezika
Rad sadrži: 30 stranica
7 slika
1 CD
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
Zahvaljujem prof. dr. sc. Jagodi Roši, koja mi je omogućila rad na ovoj temi i pod
čijim je vodstvom načinjen cjelokupni eksperimentalni dio rada
Također, zahvaljujem prof. dr. sc. Ljerki Banek, na pomoći kod izrade histološkog
dijela istraživanja i vodstvu pri pisanju i oblikovanju diplomskog rada
Preliminarni rezultati ovog rada prikazani su na 2. hrvatskom mikroskopijskom
kongresu s međunarodnim sudjelovanjem, Topusko, 2006.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
SADRŽAJ
1. UVOD ................................................................................................... 1
1.1. Jetra - središnji metabolički organ .................................................................... 2
1.2. Sudjelovanje hepatocita u metabolizmu glukoze, masti i aminokiselina ......... 5
1.3. Masno tkivo sadrži najkoncentriraniji oblik pohranjene energije .................... 8
1.4. Debljina i pretilost – prijetnje zdravlju sadašnjih i budućih generacija ........... 8
1.5. Masna bolest jetre i prehrana ............................................................................ 9
2. CILJ I SVRHA RADA ....................................................................... 11
3. MATERIJALI I POSTUPCI ............................................................... 12
3.1 Pokus .............................................................................................................. 12
3.2. Svjetlosna i elektronska mikroskopija ............................................................ 12
4. REZULTATI ....................................................................................... 14
5. RASPRAVA ....................................................................................... 18
6. ZAKLJUČAK ..................................................................................... 25
7. SAŽETAK ........................................................................................... 26
8. SUMMARY ........................................................................................ 27
9. LITERATURA .................................................................................... 28
10. ŽIVOTOPIS ...................................................................................... 30
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
POPIS OZNAKA I KRATICA
DAG (engl. diacylglycerol) – diacilglicerol
GLUT-2 (engl. glucose transporter protein 2) – protein za prijenos glukoze 2
GLUT-4 (engl. glucose transporter protein 4) – protein za prijenos glukoze 4
HDL (engl. high-density lipoprotein) – lipoprotein velike gustoće
IRS-2 (engl. insulin receptor substrate 2) – substrat inzulinskih receptora 2
LDL (engl. low-density lipoprotein) – lipoprotein male gustoće
NAFLD (engl. nonalcoholic fatty liver disease) – nealkoholna masna bolest jetre
NASH (engl. nonalcoholic steatohepatitis) – nealkoholni steatohepatitis
PKCε – protein kinaza Cε
PUFA (engl. poliunsaturated fatty acid) – polinezasićena masna kiselina
TNF-α (engl. tumor necrosis factor alfa) – faktor tumorske nekroze alfa
VLDL- (engl. very-low-density lipoprotein) – lipoprotein vrlo male gustoće
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
1
1. UVOD
Jetra je glavni metabolički organ u tijelu. Hranjivi sastojci, koji se apsorbiraju u
crijevu ulaze putem krvi u jetru i tu se obrađuju i pohranjuju za uporabu u cijelom
organizmu. Zato jetrene stanice, hepatociti imaju ključnu ulogu u metabolizmu
glukoze, masti i aminokiselina. Također, sintetiziraju brojne bjelančevine kao i
lipoproteine važne za metabolizam i prijenos masti u krv.
Zbog razvoja tehnologije posljednjih desetljeća znatno se promijenio životni stil pa
su ljudi mnogo manje fizički aktivni. Također, zbog velikog napretka u proizvodnji i
preradi hrane glad je gotovo nestala u razvijenim zemljama svijeta. Danas je
relativno širokom sloju populacije dostupno obilje raznovrsne hrane. Međutim, zbog
obilne, a osobito masne prehrane uz relativno smanjenu fizičku aktivnost vrlo lako
dolazi do nekontrolirane i neželjene debljine pa i pretilosti u svim dobnim
skupinama.
Debljina, a osobito pretilost osobe može biti praćena brojnim, dodatnim
zdravstvenim problemima. Kako je jetra središnji metabolički organ za preradu i
pohranu hranjivih sastojaka to će kod prevelikog unosa hrane i pojave pretilosti često
doći i do prevelikog i patološkog nakupljanja masti i u samoj jetri. Ukoliko se
preveliki unos hrane i nepravilna prehrana nastavi i dalje, doći se do poremećaja
cjelokupnog metabolizma tijela. To često izaziva bolest različitih organa, a
nakupljanje masti u jetri, uz djelovanje nekih drugih nepovoljnih čimbenika, može
konačno dovesti do ciroze jetre i čak biti uzrok smrti osobe.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
2
1.1. Jetra - središnji metabolički organ
Jetra je najveća žlijezda pridružena probavnoj cijevi. Glavni je metabolički organ
tijela pa ima strateški položaj u krvotoku. Većina krvi (oko 80 %), ulazi u jetru
putem v. porte. Ova venska krv sadrži hranjive sastojke apsorbirane u crijevu.
Također, sadrži i krv iz gušterače i slezene [1].
(Ostatak od oko 20 % krvi, koja je bogata kisikom ulazi u jetru iz jetrene arterije).
U jetri, venska krv bogata hranjivim sastojcima najprije prolazi kroz interlobarne
vene, a zatim putem interlobularnih vena dolazi na periferiju jetrenih režnjića [1].
Režnjići (sl. 1), su osnovna građevna jedinica jetre. Čine ih tračci ili ploče jetrenih
stanica ili hepatocita, koje teku radijalno od periferije prema središtu režnjića, a
između njih nalaze se sinusoidne kapilare. Na periferiji režnjića, krv se iz
interlobularne vene (bogata hranjivim sastojcima iz portalne vene) ulijeva u
sinusoidne, vijugave kapilare, koje teku između tračaka (ploča) hepatocita i konačno
se ulijevaju u središnju venu (centrolobularnu venu ili v. centralis). Sva krv
sinusoidnih kapilara, (nakon što su hepatociti metabolizirali sastojke hrane zajedno s
tvarima koje su izlučili), konačno se ulijeva se u središnju venu svakog režnjića.
Napuštajući režnjić, središnja vena režnjića ulijeva se u veću prijelaznu
(sublobularnu) venu. Prijelazne vene se spajaju u više jetrenih vena. Na kraju, jetrene
vene ulijevaju se u donju šuplju venu.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
3
Slika 1. Jetreni režnjić. Krv iz interlobularne vene (V) i arterije (A) ulijeva se u sinusoidne
kapilare (S) obložene fenestriranim endotelnim stanicama. Ploče hepatocita (H). Disseov
prostor (*). Modificirano prema : Weiss L, Greep RO. Histology. 4th ed. New York:
McGraw-Hill;1977. [2]
Osnovni građevni sastojak jetre je hepatocit. Jezgra mu je okrugla s dvije ili više
jezgrica. Citoplazma ovih stanica sadrži brojne mitohondrije (oko 2000 po stanici)
kao i Golgijeve komplekse (do pedeset po stanici, [1]). U citoplazmi se nalazi i
obilna hrapava i glatka endoplazmatska mrežica te lizosomi i peroksisomi.
Peroksisomi kao i lizosomi sadrže enzime. Enzimi peroksisoma sudjeluju u
oksidaciji suvišnih masnih kiselina, razgradnji vodikova peroksida i purina.
Hepatociti su vjerojatno najsvestranije stanice u tijelu. U njima se zbivaju brojni
komplicirani kemijski procesi kao glukoneogeneza te neutralizacija (detoksikacija)
otrovnih odnosno štetnih spojeva (alkohola, lijekova i dr.). Imaju i endokrinu
V
A
S
H
*
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
4
funkciju (izlučivanje lipoproteina i bjelančevina krvne plazme direktno u krv).
Između susjednih hepatocita nalaze se i žučne kapilare, u koje ove stanice izlučuju
žuč (egzokrina sekrecija jetre). Također, hepatociti imaju važnu ulogu u
metabolizmu glukoze, koju prerađuju u pričuvni glikogen, koji se u obliku
elektronski gustih zrnaca nalazi uz glatku endoplazmatsku mrežicu (sl. 2)
Slika 2. Ploča hepatocita između dviju sinusoidnih kapilara. Fenestrirane endotelne stanice.
Disseov prostor. Itova stanca. Kupfferova stanica. hEM (hrapava endoplazmatska mrežica s
ribosomima).gEM (glatka endoplazmatska mrežica). Preuzeto iz: Ross MH, Pawlina W.
Histology: a text and atlas. 5th ed. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins; 2005. [3]
Sinusoidne kapilare jetre građene su od isprekidanog sloja fenestriranih endotelnih
stanica s brojnim sitnim otvorima. U lumenu sinusoidnih kapilara nalaze se
makrofazi koji se nazivaju Kupfferove stanice. Između endotelnih stanica krvnih
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
5
kapilara i hepatocita je subendotelni, perisinusoidalni ili Disseov prostor, u koji strše
mikrovili hepatocita. Krv teče polagano, kroz nepravilno proširene sinusoidne
kapilare, od periferije režnjića do središnje vene. Pri tome se krvna plazma iz
kapilara cijedi kroz otvore endotelnih stanica u Disseov prostor, oplakuje površinu
hepatocita i vraća se natrag u kapilare. Na taj način hranjive tvari iz krvi u obliku
glukoze, masti i aminokiselina dolaze direktno do hepatocita i tu se apsorbiraju i
prerađuju.
U Disseovom, perisinusoidalnom prostoru jetre, koji se nalazi oko sinusoidnih
kapilara, smještene su zvjezdolike Itove stanice. One u zdravih ljudi primaju i
pohranjuju A vitamin te izlučuju tek oskudnu mrežicu kolagenih vlakana (kolagen
tipa III), koja služi kao potpora hepatocitima. Pod utjecajem patoloških čimbenika
ove stanice se pretvaraju u miofibroblaste i imaju glavnu ulogu u nastanku ciroze
jetre (sl. 2).
1.2. Sudjelovanje hepatocita u metabolizmu glukoze, masti i
aminokiselina
Kod normalne jetre u citoplazmi hepatocita nalazi se i mali broj sitnih masnih
kapljica koje nisu omeđene membranom. Uz njih mogu biti prislonjeni mitohondriji.
Također, hepatociti sintetiziraju lipoproteine, važne za metabolizam i prijenos masti
te ih oslobađaju u krv. Od lipoproteina jetre najvažniji je lipoprotein vrlo male
gustoće (engl. very low density lipoprotein, VLDL). Ovaj lipoprotein sadrži jetrene
trigliceride nastale esterifikacijom apsorbiranih masnih kiselina iz portalne krvi, na
glatkoj endoplazmatskoj mrežici hepatocita (sl. 3). VLDL lipoproteini obloženi su s
različitim apolipoproteinima sintetiziranim na hrapavoj endoplazmatskoj mrežici
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
6
hepatocita. Funkcija lipoproteina male gustoće jest da prenose većinu jetrenih
triglicerida u druge organe, a prije svega u masne stanice ili adipocite.
Slika 3. Hepatocit. Sinteza lipoproteina. Esterifikacija masnih kiselina u glatkoj
endoplazmatskoj mrežici. Hrapava endoplazmatska mrežica. Modificirano prema: Bloom W,
Fawcett DW. A Textbook of histology, 10th ed. Philadelphia: Saunders; 1975. [4]
U adipocitima pohranjuje se također u obliku triglicerida i mast iz hrane, koju
prenose najveći lipoproteini krvne plazme, hilomikroni. Oni nastaju isključivo u
tankom crijevu u apsorpcijskim stanicama i to od apsorbiranih masnih kiselina duga
lanca. Hilomikroni ulaze najprije u limfu, a zatim u krv. Zanimljivo je da masne
kiseline kratkog i srednjeg lanca, odmah nakon apsorpcije, zaobilazeći
reesterifikaciju na glatkoj endoplazmatskoj mrežici apsorpcijskih stanica crijeva,
odlaze direktno u krv pa putuju do jetre gdje se dalje prerađuju.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
7
Postoje još i lipoproteini: LDL i HDL. Oni su također vezani uz jetru. LDL prenosi
estere kolesterola iz jetre u periferne organe. HDL nosi kolesterol iz perifernih tkiva
u jetru. (Povećan rizik nastanka kardiovaskularnih bolesti je u direktnoj vezi s
povišenim razinama LDL-a u krvnoj plazmi.)
Glukoza ulazi i u hepatocite i β stanice Langerhansovih otočića gušterače, pomoću
transportnog proteina za prijenos glukoze 2 (engl. glucose transporter protein 2,
GLUT-2) na membrani ovih stanica. Ovaj prijenosni protein (GLUT-2) neovisan je o
inzulinu. Zato će kad se povisi razina glukoze u krvi, ona ulaziti kako u hepatocite,
tako i u β stanice gušterače. Visoka razina glukoze u krvi stimulira β stanice
Langerhansovih otočića gušterače na izlučivanje hormona inzulina. Kod povišene
razine glukoze u krvi, inzulin omogućuje povećanje prijenosa glukoze iz krvi u
masne stanice (adipocite) te u skeletni i srčani mišić. Međutim, prijenosna
bjelančevina na površini membrane adipocita i mišićnih stanica ovisna je o inzulinu i
naziva se protein za prijenos glukoze 4 (eng. glucose transporter protein 4, GLUT-
4). Dakle, normalna funkcija hepatocita, adipocita i mišićnih stanica ovisna je o
glukozi i inzulinu. Inzulin omogućuje ulazak glukoze i aminokiselina u stanice te
stvaranje glikogena u hepatocitima i mišićnim stanicama. Ovaj hormon također u
hepatocitima inhibira enzime za glukoneogenezu . Na hepatocite djeluje i glukagon,
hormon α stanica Langerhansovih otočića gušterače. Ovaj hormon izaziva djelovanje
suprotno inzulinu, dakle povisuje razinu glukoze u krvi. Hiperglikemija koju izaziva
glukagon nastaje upravo zbog razgradnje glikogena pohranjenog u hepatocitima
(glikogenoliza).
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
8
1.3. Masno tkivo sadrži najkoncentriraniji oblik pohranjene energije
Pored glikogena u hepatocitima i mišićnom tkivu, tijelo također skladišti energiju u
obliku masnih kapljica, koje sadrže adipociti. Veći broj masnih stanica čini masno
tkivo. Kod odraslih ljudi masno tkivo čine stanice, koje sadrže u citoplazmi samo
jednu masnu kapljicu, a zbog boje u živom stanju nazivaju se bijelo masno tkivo.
Masna kapljica adipocita sadrži trigliceride, koji su najkoncentriraniji pohranjeni
oblik metaboličke energije u ljudskom tijelu. Trigliceridi su međutim, dinamički
oblik pohrane energije. Stvaraju se uvijek kad je energija dobivena konzumiranom
hranom veća od energije, koju je tijelo potrošilo [3]. Također, trigliceridi se troše
kada je unos energije hranom manji od potrošene energije [3]. Ulazak glukoze u
adipocite te njenu pretvorbu u trigliceride omogućuje inzulin. Također, ovaj hormon
(inhibicijom enzima lipaze) smanjuje lipolizu i istjecanje slobodnih masnih kiselina
iz ovih stanica, što dovodi do pohranjivanja triglicerida u njima. Djelovanje hormona
glukagona na adipocite jest suprotno te izaziva lipolizu i dovodi do mobilizacije
rezervi triglicerida [5]. Novija istraživanja su pokazala da i neki drugi hormoni
također povećavaju ili smanjuju lipolizu u adipocitima [5]. Isto tako ustanovljeno je
da i masno tkivo izlučuje različite hormone, čimbenike rasta i citokine pa se sada
smatra i endokrinim organom [3].
1.4. Debljina i pretilost – prijetnje zdravlju sadašnjih i budućih
generacija
Masno tkivo je normalno prisutno u tijelu kao potkožno tkivo (lat. panniculus
adiposus ili hypodermis) te u unutrašnjosti tijela u omentumu, mezenteriju kao i
retroperitonealno oko bubrega. Međutim, zbog načina života, koji uključuje premalo
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
9
fizičke aktivnosti , a bogatu prehranu dostupnu širokom sloju pučanstva, količina
masnog tkiva osobe može se znatno povećati. Smatra se da već povećanje tjelesne
težine za oko 20 % (od prosječne težine za određenu populaciju), predstavlja
zdravstveni rizik [3]. Usprkos tome danas statistički podaci o tjelesnoj težini odraslih
osoba širom svijeta, pokazuju epidemijski porast debljine i pretilosti. Neželjeni
porast učestalosti debljine i pretilosti nalazi se u svim slojevima pučanstva ( pa čak i
kod djece) [3], [6], [7], [8]. Uzroci ovog porasta nisu još potpuno razumljivi, ali
analize pokazuju čak i vjerojatno daljnje povećanje ovog fenomena u budućnosti [7].
Opasnost za zdravlje kod debelih i pretilih osoba predstavlja znatno povećani rizik
pojave dijabetesa tipa 2 te kardiovaskularnih bolesti. Pojava ovih bolesti skraćuje
očekivano trajanje života [7]. Često se javlja metabolički sindrom praćen
poremećajem metabolizma glukoze i lipida (dislipidemija) te povišenim krvnim
tlakom (hipertenzija). Isto tako debljinu i pretilost te metabolički sindrom može
pratiti i nealkoholna masna bolest jetre (engl. non-alcoholic fatty liver disease,
NAFLD). Smatra se da je vjerojatni uzrok ovih poremećaja metabolizma rezistencija
na hormon inzulin koji ne može adekvatno regulirati metabolizam.
1.5. Masna bolest jetre i prehrana
NAFLD je danas najčešća bolest jetre. Većinom se javlja kod debelih, pretilih
odnosno starijih osoba i često je dio metaboličkog sindroma. Ključna morfološka
promjena jetre je obilno nakupljanje triglicerida u hepatocitima, koji su ispunjeni
jednom ili više masnih kapljica. Opsežno nakupljanje masti u hepatocitima (lat.
steatosis hepatis) može biti reverzibilno, dakle prolazno i benigno, čak i bez
kliničkih simptoma. Ipak, ove promjene hepatocita, osobito kod genetski
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
10
predisponiranih osoba, čine ove stanice osjetljivim na daljnja oštećenja pa mogu
izazvati i njihovo propadanje. Tada može doći do infiltracije jetre makrofazima, a
citokini pokreću upalne promjene. Tako nastaje stanje nealkoholnog steatohepatitisa
(engl. non-alcoholic steatohepatitis, NASH), koje konačno, zbog moguće aktivacije
Kupfferovih i Itovih stanica može napredovati do ciroze jetre i biti uzrok smrti.
Brojne studije pokazuju da je povećanje učestalosti pojave masne bolesti jetre
povezano s epidemijom debljine i pretilosti. Također, smatra se da je vrlo obilna,
masna i bogata prehrana uz sjedilački način života ljudi uzrok nastanka masne
bolesti jetre kao i pojave pretilosti.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
11
2. CILJ I SVRHA RADA
Masna i obilna prehrana ljudi mogla bi biti uzrok nastanka masne bolesti jetre kao i
pojave pretilosti. Međutim, utjecaj pojedinih vrsta hrane pa tako i pojedinih vrsta
masti i ulja na patogenezu spomenutih poremećaja tek se istražuje. Zbog toga je
svrha ovog rada bila ispitati da li prehrana bogata suncokretovim uljem izaziva
promjenu u histološkoj građi jetre štakora i može li izazvati masnu promjenu jetre.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
12
3. MATERIJALI I POSTUPCI
3.1 Pokus
U svim eksperimentima, korišteni su odrasli, muški štakori soja Wistar tjelesne mase
između 250-325g.
Štakori su bili smješteni pojedinačno, u žičane kaveze u prostoriji s kontroliranom
temperaturom od 21 ± 1 °C i 12-satnim ciklusom svjetlo-tama te slobodnim
pristupom hrani i vodi.
Eksperimentalna skupina obuhvatila je 5 životinja na visoko masnoj dijeti. Ovi
štakori hranjeni su prehranom s visokim udjelom masti. Hrana s visokim udjelom
masnoća, bila je pripremljena dodavanjem 30 % suncokretovog ulja standardnoj
hrani. Nakon toga hrana s visokim udjelom masnoća, sadržavala je prema udjelu
energije 30 % ugljikohidrata, 16 % bjelančevina i 54 % masti.
Kontrolna skupina od 3 životinje hranjena je standardnom hranom, koja je prema
udjelu energije sadržavala 57 % ugljikohidrata, 32 % bjelančevina i 11 % masti.
Pokus je trajao tri tjedna.
Štakori su anestezirani fenobarbitolom (10 mg/100 g tjelesne težine) i izvađena im je
jetra. Primijenjeni su svi principi njege životinja (NIH br.85-23, revidirani 1996.g.).
3.2. Svjetlosna i elektronska mikroskopija
Dokazivanje lipida
Tkivo jetre izrezano je u blokove. Dio blokova stavljen je u kriotube i odmah
smrznut s tekućim dušikom. Tkivo je izrezano u kriostatu na rezove debele 10 μm.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
13
Smrznuti rezovi obojeni su s hemalaun eozinom te Sudan III i IV (Kay i Whitehead,
1941, cit. [9], str. 696) kao i Oil Red O bojom (po Lillieu, 1944, cit. [9], str.697) , za
dokazivanje neutralnih masti.
Polutanki rezovi
Drugi dio jetrenog tkiva izrezan je u male blokove, ( s duljinom stranice od oko 0,5
mm). Ovi blokovi fiksirani su u mješavini 2,5 % glutaraldehida i 0,8 %
paraformaldehida u 0,1 M fosfatnom puferu. Nakon toga uzorci su postfiksirani u
1 % osmijevom tetroksidu, dehidrirani i uklopljeni u Durcopan. Tkivo je izrezano na
polutanke rezove debljine 1 µm i obojeno toludinskim modrilom.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
14
4. REZULTATI
Jetra svih štakora hranjenih s prehranom, koja je sadržavala visoki udjel masnoća,
dobiven dodavanjem suncokretovog ulja njihovoj standardnoj hrani, sadržavala je
hepatocite krcate masnim kapljicama. Brojne masne kapljice u hepatocitima obojene
su sa Sudanom III i IV, kao i s Oil Red O (masne kapljice crveno-narančaste, jezgre
plave)(sl 4 i 5)
Slika 4. Jetra štakora na visoko masnoj dijeti. Steatoza u perivenskom području režnjića.
Sudan III i IV. Masne kapljice: crveno (600×)
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
15
Kod svih eksperimentalnih životinja, područja hepatocita s brojnim, nagomilanim
masnim kapljicama u citoplazmi, nalazila su se u perivenskom području jetrenih
režnjića oko v. centralis (fokalna steatoza). Međutim, svi hepatociti susjednih
režnjića, bili su također, potpuno ispunjeni masnim kapljicama (difuzna steatoza).
Slika 5. Jetra štakora na visoko masnoj dijeti. Oil Red O. Hepatociti sadrže brojne masne
kapljice. (600 ×)
Dakle, nakon tri tjedna konzumacije masne prehrane s povišenim udjelom masnoća,
zbog dodanog suncokretovog ulja, jetra eksperimentalne skupine štakora pokazivala
je miješanu fokalnu i difuznu steatozu. (sl. 4 i 5). Citoplazma hepatocita sadržavala
je veći broj masnih kapljica. Neke od njih dijelom su potiskivale jezgru.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
16
Za razliku od toga, hepatociti jetre kontrolne skupine štakora, koji su hranjeni
standardnom hranom, sadržavali su tek vrlo sitne, diskretne kapljice lipida (sl. 6).
Slika 6. Jetra štakora. Kontrolna skupina. Oil Red O. Hepatociti sadrže diskretne, sitne
lipidne kapljice. (600 ×).
Na polutankim rezovima, citoplazma hepatocita štakora na visoko masnoj dijeti, sa
suncokretovim uljem, sadržavala je na polutankim rezovima veliki broj masnih
kapljica. Ove stanice, premda napuhnute, zbog brojnih kapljica sačuvale su svoju
građu. Lumen sinusoidnih kapilara bio je sužen (sl. 7).
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
17
Kod kontrolne skupine štakora, tek je poneki hepatocit u citoplazmi sadržavao
rijetke masne kapljice.
Slika 7. Jetra štakora na prehrani s visokim udjelom masti (suncokretovo ulje). Steatoza.
Toluidin blue. (600 ×)
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
18
5. RASPRAVA
Rezultati ovog istraživanja jasno pokazuju pojavu masne jetre (lat. steatosis hepatis),
kod štakora već nakon tri tjedna, neprekidnog konzumiranja hrane s visokim udjelom
masnoća (suncokretovo ulje). Rezultati ovog istraživanja direktno potvrđuju da
velika količina udjela masti u prehrani, može biti glavni uzrok nastanka steatoze
jetre. Naime, masne kiseline (osobito dugih lanaca) iz prehrane dolaze do hepatocita
putem najvećih lipoproteina plazme hilomikrona [10]. Hilomikrone sintetiziraju
apsorpcijske stanice tankog crijeva [3][10]. Pored toga masne kiseline srednjih i
kratkih lanaca iz masne hrane, nakon apsorpcije u stanicama tankog crijeva,
oslobađaju se direktno u krv, gdje se vežu na albumine plazme, pa ih hepatociti,
kada stignu do jetre, također mogu direktno upijati [10]. Sve masne kiseline pristigle
putem krvi do jetre će se reesterificirati na glatkoj endoplazmatskoj mrežici
hepatocita i zatim, u obliku brojnih masnih kapljica koje sadrže trigliceride,
nakupljati u citoplazmi ovih stanica [11]. Steatozu jetre štakora kao direktnu
posljedicu konzumiranja prehrane s povećanim udjelom masti, u obliku biljnih ulja,
dobili su i drugi autori [12]. Iako suncokretovo ulje, ali i neka druga biljna ulja
spadaju u polinezasićene masne kiseline (PUFA), u navedenom istraživanju nije
pobliže označena vrsta ispitivanog biljnog ulja [12].
Također, spomenuti autori opisali su i steatozu jetre štakora, koja je nastala kao
direktna posljedica prehrane s visokim udjelom ugljikohidrata. Naime veliki dio
glukoze, koja se apsorbira iz tankog crijeva, hepatociti odmah upijaju i pretvaraju u
glikogen [11]. Međutim, čim se jetra zasiti glikogenom, a to je već kada on čini oko
5 % mase jetre, sva se dodatna glukoza usmjeruje u metabolički put, koji vodi do
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
19
sinteze masnih kiselina [11]. Masne kiseline će zatim u hepatocitu biti esterificirane
u trigliceride. Velika količina tako stvorenih triglicerida će se, dakle, kao direktna
posljedica preobilne i prebogate prehrane ugljikohidratima (uz adekvatnu količinu
bjelančevina, i masti), taložiti u obliku velikog broja masnih kapljica u ovim
stanicama [11].
U ljudskom tijelu, normalno samo adipociti imaju sposobnost nagomilavanja viška
masnih kiselina, u obliku triglicerida u svojoj citoplazmi. Kod hepatocita povećano
nagomilavanje lipida može izazvati poremećaj funkcije ovih stanica kao što je
rezistencija na inzulin. Također, nagomilavanje masti u hepatocitima može dovesti i
do smrti stanica. Taj fenomen naziva se lipotoksičnost i povezuje se sa štetnim
djelovanjem zasićenih masti na hepatocite [11]. Istraživanja su pokazala da je
prehrana s visokim udjelom zasićenih masnoća, a sadržavala je životinjsku mast,
također izazvala steatozu jetre [12]. Međutim, steatoza izazvana obiljem zasićenih
masti u dijeti dovela je do izrazitog oštećenja jetre s naglašenim stresom
endoplazmatske mrežice, povišenom razinom aktivnosti kaspaze i apoptozom
hepatocita [12]. Ova istraživanja, dakle, pokazuju da je sastav masnih kiselina koje
izazivaju steatozu jetre bitan čimbenik koji određuje da li će doći do ozljede jetre
[12]. Nadalje, štetno djelovanje zasićenih masnih kiselina iz hrane direktno je
izazvalo oštećenje hepatocita i povećanje učestalosti njihove apoptoze. Zanimljivo je
da su se ova štetna djelovanja odvijala neovisno od pojave debljine, razina leptina,
TNF-α i funkcije mitohondrija ) [12].
Rezultati različitih istraživanja pokazuju da je apoptoza hepatocita glavni mehanizam
koji dovodi do fibrogeneze i ciroze jetre [13]. Apoptotička tjelešca nastala nakon
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
20
apoptoze hepatocita, fagocitiraju susjedne zvjezdolike Itove stanice, koje su još tada
u mirnom stanju [13]. Međutim, upravo ova fagocitoza apoptotičnih hepatocita
dovodi do aktivacije mirnih Itovih stanica u miofibroblaste. Navedena aktivacija
mijenja fenotip i funkciju ovih stanica. Aktivirane Itove stanice izlučuju sada
kolagen tipa I. Kolagen tipa I je glavna vrsta kolagena koja se nagomilava kod ciroze
jetre [13].
U našem istraživanju steatoze jetre štakora, nastale nakon tri tjedna konzumacije
prehrane s visokim udjelom masnoća podrijetlom iz suncokretovog ulja, nismo našli
oštećenje hepatocita niti njihovu apoptozu. To govori da je u ovom eksperimentu
nagomilavanje masti u jetri životinja vjerojatno još reverzibilan proces i da nije
došlo do oštećenja hepatocita.
Pored ovog direktnog djelovanja bogate prehrane s povećanim udjelom masti, tako
da se, dakle, lipidi iz hrane nagomilavaju u hepatocitima kao trigliceridne kapljice,
postoji dokazano i indirektno djelovanje masne prehrane na jetru, ali isto tako i na
masne stanice, adipocite te mišiće i to preko razvoja stanja rezistencije na inzulin [8],
[11], [14], [15].
Naime, inzulin normalno inhibira lipolizu u masnom tkivu sprečavajući tako
oslobađanje masnih kiselina iz adipocita i tako „štedi tijelu mast“ [11]. Također,
inzulin smanjuje proizvodnju glukoze od strane jetre (smanjujući glukoneogenezu i
glikogenolizu u jetri). Nadalje, ovaj hormon povećava upijanje glukoze u skeletne
mišiće i masno tkivo [11]. Sva spomenuta djelovanja inzulin vrši putem svojih
receptora u navedenim ciljnim tkivima [5].
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
21
Kod prehrane s visokim udjelom masnoća dolazi do nagomilavanja viška metabolita
masti, kao što je diacilglicerol (engl. diacylglycerol, DAG) u hepatocitima i
mišićima [8], [11].
Preveliko nakupljanje diacilglicerola unutar ciljnih stanica za inzulin dovodi do
aktivacije nove, atipične protein kinaze Cε (protein kinaza C epsilon - PKCε). Tako
aktivirana protein kinaza Cε veže se za inzulinski receptor u njegovim ciljnim
stanicama i inhibira aktivnost tirozin kinaze receptora [11]. Također, misli se da
aktivirana protein kinaza Cε može interferirati sa sposobnošću inzulina da
fosforilira substrat inzulinskih receptora 2 (engl. insulin receptor substrate 2, IRS-2)
[11]. Na taj način, dakle, zbog inaktivacije inzulinskih receptora spriječeno je
djelovanje inzulina na njegove ciljne stanice, pa nastaje stanje koje se naziva
rezistencija na inzulin. Tada je onemogućeno širenje signala inzulina te izostaju i
njegova različita metabolička djelovanja. Dakle, usprkos normalnoj razini inzulina u
krvi, koji izlučuju β stanice Langerhansovih otočića, glukoza neće moći ulaziti u
svoje ciljne organe pa će se njezina razina u krvi povisiti i nastat će hiperglikemija i
dijabetes tipa 2.
Zanimljivo je da stanje rezistencije na inzulin, pored prehrane s visokim udjelom
masti, može isto tako izazvati i prehrana s visokim udjelom ugljikohidrata [11].
Naime, i tada će nakon stvorene zalihe glikogena jetra svu dodatnu glukozu iz hrane
usmjeravati u metabolički put za sintezu masnih kiselina. I tada može kao posljedica
preobilne prehrane i udjela ugljikohidrata, konačno doći do nakupljanja viška
metabolita masti i razvoja rezistencije na inzulin u njegovim ciljnim organima [11].
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
22
Pored direktnog djelovanja sastava prehrane na nagomilavanje masti u jetri, višak
kalorija i prehrana s visokim udjelom masti i ugljikohidrata može biti uzrok debljine
i pretilosti, stanja koje je također povezano s rezistencijom na inzulin [15]. Naime,
masne stanice pohranjuju lipide u obliku triglicerida. Kod debelih i pretilih ljudi, kod
kojih postoji rezistencija na inzulin, vrlo često dolazi do pojačanog otpuštanja
neesterificiranih masnih kiselina iz povećane mase perifernog masnog tkiva [11].
Ovo povećano otpuštanje neesterificiranih masnih kiselina iz adipocita posljedica je
njihove rezistencije na inzulin. Naime, inhibicija lipolize inzulinom u masnom tkivu,
zbog rezistencije adipocita na inzulin, izostaje [15]. Zato kod pretilih osoba često
dolazi do “prelijevanja masti“ iz njihovog masnog tkiva prema jetri. Ta „prelivena
mast“, podrijetlom iz adipocita, ugradit će se u jetru i izazvati opsežno
nagomilavanje triglicerida u hepatocitima [11].
I epidemiološka istraživanja su pokazala povezanost između debljine i pojave masne
jetre. Naime, učestalost nealkoholne masne bolesti jetre iznosila je u općoj populaciji
oko 20 %. Kod debelih ljudi ova se učestalost povećala se na 75 %, dok je kod
pretilih i bolesno debelih osoba iznosila gotovo 100 % [15]. Također, učestalost
nalaza masne jetre bila je povećana kod dijabetesa tipa 2 (50-75%) i metaboličkog
sindroma [15].
Kako se učestalost pojave debljine drastično povećala u SAD, Kini, Indiji i brojnim
drugim državama svijeta (pa i u našoj zemlji) [15], porastao je interes za
istraživanjem funkcija masnog tkiva i njegove uloge u spomenutim metaboličkim
poremećajima. Ustanovljeno je da masno tkivo predstavlja aktivni endokrini organ,
koji izlučuje brojne tvari. Sve ove tvari nazivaju se adipokini [16]. Među
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
23
najpoznatijima je čimbenik rasta TNF-α, koji interferira sa signaliziranjem
inzulinskih receptora i može izazvati rezistenciju na inzulin kod pretilosti [3].
Povišena razina TNF-α u plazmi, povezuje se sa stanjem kronične upale niskog
stupnja, koju nalazimo kod pretilih osoba i starijih dijabetičara [7]. Slična uloga
pripisuje se i interleukinu-6, čija je razina u krvi povišena kod pretilih osoba kao i u
stanju rezistencije na inzulin [16]. Nadalje tu spada i resistin za koji se smatra da
povezuje debljinu, dijabetes tipa 2 i proupalno stanje [3], [16]. Suprotno djelovanje
ima adiponektin, koji povećava osjetljivost ciljnih stanica na inzulin [3], [16].
Adipociti nadalje izlučuju: inhibitor aktivatora plazminogena, čija povišena razina u
krvi dovodi do stvaranja krvnih ugrušaka, kao i angiotenzinogen, koji nakon
pretvorbe u angiotenzin izaziva povišenje krvnog tlaka [3]. Sve ove nove spoznaje o
adipokinima dodatno objašnjavaju ulogu debljine i pretilosti u povećanju bolesti i
smrtnosti pojedinca i populacije.
U našem istraživanju, međutim, prehrana s visokim udjelom masti trajala je samo tri
tjedna, tako da kod naše eksperimentalne skupine štakora, nije došlo do značajnog
porasta debljine. To znači da je steatoza jetre u našem istraživanju, vjerojatno nastala
isključivo kao posljedica obilne masne prehrane, bez dodatnog djelovanja
prelijevanja lipida u jetru, iz adipocita. Međutim, nakon prehrane s visokim udjelom
masti podrijetlom iz suncokretovog ulja nađen je porast proizvodnje glukoze u
hepatocitima viši za 79 % u odnosu na kontrolu. Ovaj porast glukoze u kulturi,
posljedica je razvoja rezistencije na inzulin u hepatocitima, a izazvan je masnom
prehranom [14]. Zato možemo pretpostaviti da je steatoza jetre u našem istraživanju
također posljedica razvoja rezistencije na inzulin u hepatocitma i inaktivacije
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
24
inzulinskih receptora. Tada zbog nemogućnosti inzulina da inhibira glukoneogenezu
dolazi do porasta proizvodnje glukoze u hepatocitima.
Konačno, povišena razina glukoze u krvi (hiperglikemija) zajedno s povišenom
razinom inzulina (hiperinzulinemija) može dovesti do skretanja staničnog
metabolizma hepatocita, s lipidne oksidacije na esterifikaciju triglicerida [11]. Na taj
način nastaje de novo lipogeneza u hepatocitima. Ova de novo sinteza masnih
kiselina, zajedno s oštećenom β oksidacijom, može izazvati steatozu jetre [11].
Također, rezultati našeg istraživanja pokazali su dijelom fokalnu steatozu, kod koje
je obilno nakupljanje kapljica masti obuhvatilo prije svega hepatocite oko središnje
vene. Međutim, u susjednim jetrenim režnjićima štakora su svi hepatociti bili
zahvaćeni opsežnim nakupljanjem masti. To nam govori da kod jako izražene
steatoze jetre i tako poremećenog metabolizma hepatocit, nestaje bilo kakve razlike u
reagiranju hepatocita smještenih u različitim dijelovima jetrenih režnjića.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
25
6. ZAKLJUČAK
1. Jetra štakora koji je hranjen prehranom s visokim udjelom masnoća (podrijetlom
iz suncokretovog ulja) histološki je promijenjena.
2. Nakon 3 tjedna trajanja pokusa (tj. prehrane bogate suncokretovim uljem) na
histološkim preparatima nalazimo miješanu fokalnu i difuznu steatozu.
3. Citoplazma hepatocita sadržavala je veliki broj masnih kapljica (lat. steatosis
hepatis).
4. Navedene promjene hepatocita ukazuju na promjenu metabolizma u hepatocitima
uzrokovanu povećanim unosom suncokretovog ulja.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
26
7. SAŽETAK
Preobilna i masna prehrana izaziva epidemiju debljine, ali i masnu bolest jetre. Do
sada nije jasno ustanovljeno kako pojedine vrste masnoća djeluju na jetru. Cilj ovog
rada bio je istražiti utjecaj prehrane s visokim udjelom masti, koja sadrži
suncokretovo ulje, na jetru štakora.
U svim eksperimentima upotrijebljeni su odrasli muški štakori soja Wistar.
Eksperimentalna skupina životinja hranjena je prehranom s visokim udjelom
masnoća, pripremljenom dodavanjem 30 % suncokretovog ulja standardnoj hrani.
Prema omjeru energije prehrana s visokim udjelom masti sadržavala je 30 %
ugljikohidrata, 16 % bjelančevina i 54 % masti. Kontrolna skupina hranjena je
standardnom hranom. Pokus je trajao tri tjedna.
Jedan dio tkiva jetre bio smrznut, a rezovi su bili obojeni Sudanom III i IV kao i
bojom Oil Red O. Drugi dio tkiva stavljen je u mješavinu 2,5 % glutaraldehida i
0.8 % paraformaldehida u 0,1 M fosfatnom puferu. Nakon toga, uzorci su
postfiksirani u 1 % osmijevom tetroksidu, dehidrirani i uklopljeni u Durcopan te su
načinjeni polutanki rezovi.
Kod jetre svih štakora čija je prehrana sadržavala visoki udio masnoća, u obliku
suncokretovog ulja, nađena je steatoza. Područja difuzne steatoze izmjenjivala su se
s fokalnom steatozom.
Ovo ukazuje da prehrana s visokim udjelom masnoća u obliku suncokretovog ulja
izaziva promjene u metabolizmu hepatocita.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
27
8. SUMMARY
Diet-Induced Histological Change in Rat Liver
Excessive and fat diet causes epidemic obesity, but also the fat liver disease. It has
not been clearly established how fats of different kind act on liver. The aim of this
study was to investigate the effect of high-fat sunflower oil dietary intake on the liver
in rat.
In all experiments male adult Wistar rats were used. The experimental group was fed
with high-fat diet, which was prepared by adding 30 % of sunflower oil to the
standard food. In the terms of energy, the high-fat diet contained 30 %
carbohydrates, 16 % protein and 54 % fat. The control group was fed with the
standard food. The experiment lasted for three weeks.
One part of the liver tissue was immediately frozen and the sections were stained
with Sudan III and IV as well as Oil Red O. The other part of the tissue was placed in
a mixture of 2,5 % glutaraldehyde and 0,8 % paraformaldehyde in 0,1 M phosphate
buffer. After that, the specimens were postfixed in 1 % osmium tetroxide,
dehydrated, embedded in Durcopan and semi-thin sections were cut.
All rats treated with the sunflower oil high-fat diet presented a steatotic liver. Areas
of diffuse steatosis were mixed with focal steatosis.
This indicates that high-fat diet with sunflower oil induces a change in the
metabolism of hepatocytes.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
28
9. LITERATURA
[1] Mecher AL, editor. Junqueira's basic histology text and atlas. 12th ed. New
York: McGraw-Hill; 2009.
[2] Weiss L, Greep RO. Histology. 4th ed., New York: McGraw-Hill; 1977.
[3] Ross MH, Pawlina W. Histology: a text and atlas. 5th ed. Baltimore:
Lippincott Williams & Wilkins; 2005.
[4] Bloom W, Fawcett DW. A Textbook of histology, 10th ed. Philadelphia:
Saunders; 1975.
[5] Kierszenbaum AL. Histology and cell biology. An introduction to pathology.
2nd ed. Philadelphia: Mosby Elsevier; 2007.
[6] Wree A, Kahraman A, Gerken G, Canbay A. Obesity affects the liver - the
link between adipocytes and hepatocytes. Digestion. 2011;83(12):124-33.
[7] Zeida M, Stuling TM. Obesity, inflamation and insulin resistance-A mini-
review. Gerontology. 2009;55:379-386.
[8] Samuel VT, Petersen KF, Shulman GI. Lipid induced insulin resistance:
unravelling the mechanism. Lancet. 2010;375:2267-2277.
[9] Pierce AGE. Histochemistry, Theoretical and applied, 3rd ed., vol 1. London:
Churchill; 1968.
[10] Gartner LP, Hiatt JL. Color textbook of histology, 2nd ed. Philadelphia:
Saunders; 2001.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
29
[11] Postic C, Girard J. Contribution of de novo fatty acid synthesis to hepatic
steatosis and insulin resistance: lessons from genetically engineered mice. J
Clin Invest. 2008;118:829-838.
[12] Wang D, Yuren W, Pagliassotti MJ. Saturated fatty acids promote
endoplasmic reticulum strss and liver injury in rats with hepatic steatosis.
Endocrinology. 2006;147:943-951.
[13] Witek RP, Stone WC, Karaca FG, Syn WK, Pereira TA, Agboola KM,
Omenetti A, Jung Y, Teabery V, Choi SS, Guy CD, Pollard J, Charlton P,
Diehl AM. Pan-caspase inhibitor vx-166 reduces fibrosis in an animal model
of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2009;50:1421-1430.
[14] Roša J, Pancirov H, Skala H, Gadžić A, Roša J. Effects of troglitazone and
insulin on glucose production in cultured hepatocites isolated from rats on
high fat diet. Coll Antropol. 2004;28:631-637.
[15] Utzschneider KM, Kahn SE. Review: The role of insulin resistance in
nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Endocrinol Metab. 2006;91: 4753-
4761.
[16] Rabe K, Lehrke M, Parhofer KG, Broedl UC. Adipokines and insulin
resistance. Mol Med. 2008;14:741-751.
[17] Banek Lj, Roša J, Ježek D, Vrdoljak I, Marolt I, Žurić A. Diet induced
hepatic steatosis in rat. In: Gajović S, editor. Zbornik radova. 2. hrvatski
mikroskopijski kongres sa međunarodnim sudjelovanjem; 2006 May 18-25;
Topusko, Croatia. Zagreb: Croatian society for electron microscopy, 2006. p.
165-166.
Iva Marolt Banek, diplomski rad ,
30
10. ŽIVOTOPIS
Iva Marolt Banek je rođena 1982. u Zagrebu. Osnovnu školu pohađala je u Zagrebu.
Godine 2001. maturirala je na Zdravstvenom učilištu u Zagrebu. Akademske godine
2002./2003. upisuje Stomatološki fakultet Sveučilišta u Zagrebu. Apsolvent postaje
2007. Udana je i majka je dvoje djece.