IN SITU MELEZLEME(HİBRİDİZASYON)

ln situ melezleme (hibridizasyon) (lSH),

• Nükleik asit dizilerinin (DNA ve RNA) morfolojik olarak

korunmuş kromozomlar, hücreler veya doku kesitlerinde

saptanarak gösterilmesini sağlayan ve temel olarak çift iplikli

nükleik asit oluşumu esasını kullanan bir tekniktir.

• lSH’da nükleik asitler kendi hücresel ortamlarında gösterilir.

DNA Zinciri Açılabilir

Merkezi Dogma

• Bir proteinin üretilebilmesi için ilgili genden mRNA üretilmelidir.

• Eğer bir dokuda ilgilendiğiniz mRNA üretiliyorsa bu, o dokuda ilgili genin aktif olduğunu yani genin okunduğunu gösterir.

• mRNA’yı belirleyebilirseniz hangi genin okunduğunu kolayca anlayabilirsiniz.

Antisense RNA

• RNA zincirinin komplomenteri zincir

Antisens mRNA’lar protein sentezini durdurmak amacıyla kullanılabilir

Tek zincirli DNA ve RNA nasıl belirlenir?

Kromozom üzerinde hibridizasyon

Etiketler• Digoxigenin (DIG, Roche)

– Sıklıkla kullanılır– Antikorlar tarafından belirlenir

• Biotin– Avidin ile belirlenir

• 2,4-dinitrophenyl (DNP, PerkinElmer)• Floresans etiketler

Enzimler• Alkalin fosfataz

– En hassas görüntüleme sistemidir – Bazı memeli dokularında mevcuttur– En yaygın substratı: NBT/BCIP (nitroblue tetrazolium / 5-

bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), koyu mavi renk– Floresans substrat: ELF-97 (Molecular Probes)

• Peroksidaz– Değişik memeli dokularında bulunur– Yaygın substratı: DAB (diaminobenzidine), kahverengi

Nükleik asitlerin hücredeki yerlerinde saptanması ne işe yarar?

• Kromozomların fiziksel haritalarının yapılmasında,

• Kromozom yapı ve hatalarının analizinde,

• Kromozomların ve genomun yapı ve işlevinin araştırılmasında,

• Gen anlatımının belirlenmesinde,

• Eşey tayininde,

• Dokudaki virüs ve bakterilerin tanısında,

• Transformasyon dizilerinin ve onkogenlerin yerlerinin

belirlenmesinde önemlidir.

ISH’ın başlıca aşamaları1

• Biyolojik materyalin hazırlanması• Probun işaretlenmesi

2• Probun ve materyalin denetürasyonu

3• Melezleme

4• Yıkama

5• Saptama

6• Görünür hale getirme

Materyale Uygulanan On İşlemler

Hibridizasyondan önce, • Probun hedef olmayan nükleik asitlerle melezlenmesini

engellemek• Proteinlerle veya diğer elemanlarla spesifik olmayan etkileşimleri

azaltmak için materyale aşağıdaki işlemler uygulanır: RNaz Uygulaması Asetilleme Dokuyu Gecirgen Hale Getirme (Permeabilizasyon) Endojen enzimlerin etkisiz hale getirilmesi Melezleme oncesi fiksasyon

RNaz Uygulaması

DNA dizilerini saptamak amacıyla yapılan çalışmalarda

sitoplazma ve nükleusdaki RNA’ların probla melezlenmesini

önler ve endojen RNA’nın temizlenerek istenmeyen zemin

boyanmasını azaltmayı sağlar.

Asetilleme

Bu işlem genellikle RNA/RNA ISH için uygundur.

Trietanolamin+asetik anhidrid uygulamasıyla asetilleme (+)

yüklü molekülleri nötralleştirir ve poli-L-lizin kaplı lamlar

kullanıldığına probun lama özgün olmayan bağlanmalarını önler.

Endojen biyotini de yok eder (Aksi halde zemin boyanmasına

neden olabilir )

Dokuyu Gecirgen Hale Getirme (permeabilizasyon)

• Proteaz Uygulaması

Proteazlar (pronaz E, proteinaz K, pepsin/HCl) prob ve saptama

belirtecinin dokuya girebilmesine yardım eder.

Hedef nükleik asitleri maskeleyen proteinleri sindirerek etki ederler.

Proteolitik enzim uygulaması dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir.

Konsantrasyon yetersiz olursa normalin aItında melezleme

gerçekleşir; bu durumda konsantrasyon artırılabilir. Morfolojinin

bozulması halinde ise konsantrasyonun düşürülmesi gerekir.

• HCl Uygulaması

Bazı yöntemlerde kullanılır. Kesin etkisi bilinmemekle beraber

proteinlerin ekstraksiyonunu ve hedef dizilerin kısmen

hidrolizini sağlayarak sinyalin artmasına katkıda bulunduğu

düşünülmektedir.

• Deterjan Uygulaması

Diğer işlemlerin lipid ekstraksiyonunda yetersiz kaldığı

düşünüldüğünde kullanılır.

Triton X-100, sodyum dodesil sülfat

Endojen Enzimlerin Etkisiz Hale Getirilmesi

Prob işaretleyici olarak herhangi bir enzim kullanılmış ise

dokudaki endojen enzim etkisiz hale getirilmelidir. Örneğin,

peroksidaz için, kesitlere % 1 H2O2, alkalin fosfataz için substrat

solüsyonuna levamisol eklenir.

Melezleme Oncesi Fiksasyon (prehibridizasyon)

Proteaz uygulamasından sonra materyali paraformaldehit ile

tekrar fikse etmek yararlı olur. Melezleme öncesi fiksasyon

hücredeki DNA ve RNA'nın daha sonraki işlemler sırasında

kaybını önlemek için yapılır.

ln situ Melezleme Problarının Secimi

lSH'da kullanılacak probların seçilmesinde iki temel nokta vardır:

Prob olarak kullanılacak nükleik asidin tipi

Uygun işaretleme cinsi

Prob Tipleri• Prob olarak hazırlanan nükIeik asitler; çift iplikli DNA (dsDNA), tek iplikli

DNA ssDNA), tek iplikli RNA ve oligonükleotidler olarak sınıflandırılabilirler .

• Kromozomlar üzerinde gerçekleştirilen lSH'da ve viral DNA tayinlerinde

genellikle DNA probları,

• mRNA tayinlerinde ise tek iplikli RNA probları veya oIigonükleotidler

tercih edilmektedir.

Problar izolasyon/ klonlama, in vitro transkripsiyon veya kimyasal sentez

yolu ile elde edilebilirler.

Prob Tipleri

DNA probları:

• Yüksek spesifik aktivite gösterir.

• Prob olarak kullanılmadan önce denatüre edilmelidir.

RNA probları:

• RNA-RNA hibridleri en stabil hibridlerdir.

• RNA probları düşük stabilite gösterir ve RNaz’larla kolaylıkla yok edilebilirler.

Oligonükleotid probları :

• Dizi hedef diziye tamamlayıcı olarak dizayn edilir.

• Problar çok stabildir.

• Küçük boyutundan dolayı hedefe kolayca girebilir.

Prob Uzunluğu

Maksimum melezleme oranı uzun problar ile elde edilir. Ancak lSH'da kısa problar gereklidir. Çünkü, probun hücre veya kromozomlar çevresindeki yoğun matriksten geçerek hedefe ulaşması gerekmektedir.

Probların 500 ve üzerinde baz uzunluğuna sahip olanları birçok doku için en iyi sinyali verir. Çok kısa problar ise çok zayıf sinyal verirler, bazen de istenmeyen işaretlere neden olabilirler.

Dokunun özelliği, fiksasyon tipi, melezleme öncesi işlemlerinin uygulanıp uygulanmamasına göre de prob uzunIuğunun seçimi değişir.

OligonükleotidIer tek iplikli oluşları ve çok iyi penetrasyon özelliklerine sahip olmalarından dolayı lSH için oldukça avantajlı problardır.

Probun İşaretlenmesi

• İzotopik işaretleme

• İzotopik olmayan işaretleme

İzotopik İşaretleme

• İşaretleme radyoaktif madde ile yapılır ve işaretin belirlenmesi için

otoradyografi kullanılır. Reaksiyon sonucunun hızına, prob stabilitesine ve

çalışılan konuya göre farklı tipte izotoplar kullanılır.

H3 işaretli problar; subsellüler uygulamalar kullanılır, yüksek çözünürlüğe

sahiptir. İşaretli problar birkaç yıl saklanabilir.

S35 lSH'da en yaygın olarak kullanılan radyoaktif işaretlemedir. S35 işaretli

problar, özellikle hücresel uygulamalar için uygundur. Otoradyografi işlemi 1

hafta sürebilir. İşaretli prob birkaç ay içinde tüketilmelidir.

P32, geniş çaplı alanlar için uygulanır. İşaretli problar bir hafta kullanılmalıdır.

İzotopik Olmayan İşaretleme,

• İşaretleme radyoaktif olmayan maddelerle yapılır ve işaretin tayini için immünohistokimyasal yöntemler kullanılır.

İzotopik olanlara göre avantajları,

İşaretli probların 6 ay veya daha uzun süreli olarak -20°C'da sakIanabilmesi,

çözünürlüğün yüksek olması,

hızlı sonuç alınması,

daha fazla sayıda işaretleme yöntemi bulunması ve

daha güvenilir olmasıdır.

Dezavantajları ise; duyarlılığının izotopik işaretlemelerden daha az olması ve istenmeyen bağlantılara daha fazla yol açabilmesidir.

İşaret molekülü Tayin Yorum

BİOTİN

DİGOKSİGENİN

ENZİM(Peroksidaz, alkalin fosfataz)

FLUORESEİN(FITC/ TRITC)

Prob işaretlemeleri kimyasal veya enzimatik reaksiyonlarla yapılır.En yaygın kullanılan işaret maddeleri;

lSH'da Kullanılan Probların Enzimatik İşaretlenmeleri

Hapten işaretli problar mRNA lSH için güvenilirlik, yüksek stabilite, hızlı sonuç

verme ve tek hücre çözünürlüğü gibi avantajlara sahiptirler.

En duyarlı yöntem, özgün bir antikora uygun olan bir haptenin, bir nükleotid

türevine bağlanması ile gerçekleştirilir (örneğin, digoksigenin ddUTP veya dUTp'ye

bağlanır)

Melezleme ve yıkamaları takiben doku bir enzime bağlı olan ve hapteni bağlayan

bir protein ile inkübe edilir. Daha sonra sinyal bu enzim için uygun substratın

kullanılması sonucunda, ürünün renklendirilmesi şeklinde elde edilir.

Bu işlem fluoresein işaret maddesinin kullanımı için de benzer şekildedir.

İşaret fluoresan mikroskobunda gözlenir.

Denatürasyon, Melezleme ve Yıkamalar

Melezleme Oncesi İşlemler (Prehibridizasyon)

Zemin boyanmasını önlemek için genellikle prehibridizasyon

gereklidir. Prehibridizasyon solüsyonu, prob ve dekstran sülfat

dışında melezleme karışımındaki tüm elemanları içerir.

Denatürasyon

DNA/DNA ISH için prob ve hedef dizilerin denatürasyonu

gereklidir.

Denatürasyon asit, ısı veya alkali uygulamasıyla yapılır. Alkali

maddeler biotinli problarla kullanılmaz. lsı ile denatürasyon,

uygulamanın basitliği ve daha etkili oluşu nedeniyle en çok

kullanılan yöntemdir.

Denatürasyon işlemleri genellikle morfoloji kaybına neden

olur. Bu nedenle, hedef DNA'nın denatürasyonu prob

denatürasyonuna göre daha kritik bir işlemdir.

Melezleme (Hibridizasyon)

Prob ve hedef nükleik asitler tek iplikIi hale getirildikten sonra,

DNA/ DNA melezleri için 37°C’ da ve RNA/RNA melezleri için

50-55°C'da bir gece inkübasyona bırakılırlar. Bu sıcaklıklar

genellikte Tm değerinin 20-25°C altındadır.

Radyoaktif lSH'da nükleik asit probunun her kilobazı için 0.1-0.3

ngµl-1 prob konsantrasyonu önerilmektedir. Prob ne kadar

uzunsa konsantrasyonu da o kadar yüksek olacaktır.

Genellikle radyoaktif olmayan yöntemlerle işaretlenmiş problar

daha yüksek konsantrasyonlarda (klonlanmış problar için 0.5-

2.0 ngµl-1, genomik problar için 1.5-5.0 ngµl-1 ) kullanılır.

İşaretlenmiş nükleik asit probları, formamid, dekstran sülfat,

bloke edici DNA veya tRNA, sodyum dodesil sülfat, sığır serum

albumini ve çeşitli tuzlar içeren bir melezIeme karışımı içine

konur.

• Formamid, denatürasyon ve melezleme solüsyonlarında

kullanılır. Reaksiyonun doku morfolojisini bozmayacak bir

sıcaklıkta gerçekleşmesini sağlar ve aynı zamanda reaksiyonun

özgünlüğünü de etkiler.

• Dekstran sülfat, melezlenme oranını artırır. Kuvvetli su çekici

özelliği ile melezleme solüsyonunda bir matriks oluşturur. Prob

bu matriksin dışında kalır ve konsantrasyonu artar

• İşaretlenmemiş bloke edici DNA ve tRNA probun özgün olmadığı bölgelerde melezlenmesini önlemek için kullanılır. Bunlar genellikle som balığı sperm DNA'sından elde edilmektedir. Bu diziler, dokudaki pozitif yüklü elemanlarla elektrostatik bağlar oluşturur ve prob ile bu tip bağlantıların oluşma olasılığını azaltır.

• Sodyum dodesil sülfat (SDS), probun dokunun içine girmesine yardım eder.

• Sığır serum albumini (BSA), probun dokuyla özgün olmayan etkileşimlerini azaltır.

• Tuzlar, melezleme ve denatürasyon solüsyonlarının iyonik gücünü ayarlar ve nükleik asit melezlerini sağlamlaştırır.

Melezleme oranı prob uzunluğuna, konsantrasyonuna ve dizinin kompleksliğine bağlıdır. Genellikle uzun problar materyal içine difüzyonun güçlüğü nedeniyle daha yavaş melezlenmeye sebep olur. Melezleme oranı dekstran sülfat kullanılarak artırılır.

Melezlenme yaklaşık 3-5 saatte tamamlanmakla beraber, bir gece inkübasyon daha uygundur.

Reaksiyonun kesinliği ve kuvveti

Bir lSH deneyinin kesinliği ("stringency") prob ve hedef nükleik asitteki

hatasız eşleşen nükleotid oranını belirler.

Reaksiyonun kesinliği sıcaklık, iyonik şartlar ve formamid gibi, çift sarmalı

ayıran moleküllerin melezleme karışımı ve melezleme sonrası yıkama

solüsyonlarındaki konsantrasyonu ile kontrol edilir.

Reaksiyon sıcaklığı yüksek ve katyon konsantrasyonu düşük ise bu koşullar

yüksek kesinlik koşullarıdır ve reaksiyonun özgünlüğü artar.

Aksine reaksiyon sıcaklığı azaltılır, yüksek katyon konsantrasyonları

uygulanırsa (düşük kesinlik koşulları) başka homolog diziler ile eşleşme

gerçekleşebilir, yani reaksiyonun özgünlüğü azalır.

Melezlenme Sonrası Yıkamalar (Posthibridizasyon)

Melezleme sonrası yıkamalar zayıf bağlanan probu temizlemek ve sadece

doğru eşleşmiş olanları bırakmak amacıyla uygulanır. Genellikle önce

düşük sonra yüksek "stringency" yıkamaları yapılır. Böylece önce zayıf

melezlenmiş veya melezlenmemiş prob ve melezleme solüsyonunun diğer

elemanları temizlenir; daha sonra tuz konsantrasyonu düşük ve sıcaklığı

yüksek yıkamalar ile probun melezleme özgünlüğü son bir kez

düzenlenmiş olur.

RNA/RNA melezlemesi için ek bir işlem daha uygulanır. RNA probları

yapışmaya eğilimlidir ve bu nedenle yoğun zemin sinyali oluştururlar. Bu

amaçla melezleme sonrası RNaz uygulaması yapılır.

ln situ Melezleme Bolgelerinin Saptanması

Yıkama işleminden sonra melezleme bölgeleri saptanır. Saptama

ve görünür hale getirme yöntemleri probu işaretlemede

kullanılan işaretleyicinin tipine bağlıdır. Radyoaktif işaretli

probların saptanması için otoradyografik yöntemler, radyoaktif

olmayanlar için ise immünohistokimyasal yöntemler kullanılır.

radioactive in situ Hybridization

mRNA35S labelled probe

Radyoaktif Olmayan Probların Saptanması

Doğrudan ve dolaylı olmak üzere iki ceşittir.

Doğrudan yontemde işaret, doğrudan doğruya nükleik asit

probuna bağlanır ve hedef nükleik asitle melezlemeden hemen

sonra mikroskop altında görülebilir. Doğrudan yöntemlerde

prob ile işaretleyici molekül arasındaki bağın melezleme ve

yıkamalar sırasında uygulanan oldukça tahrip edici koşullara

dayanması temeldir. Ayrıca işaretleyici molekülün melezleme

reaksiyonunu engellememesi gereklidir.

Dolaylı yontemde proba bağlanan işaretleyici molekül

doğrudan doğruya görülemez. Melezlemeden sonra ikinci bir

molekül (haberci molekül) probdaki işaretleyiciye bağlanır ve

böyIece probun melezIenme bölgeleri görünür hale getirilir.

Bu yöntemde de probu işaretleyici molekül, melezleme

reaksiyonunu engellememelidir. Ayrıca haberci molekülün

kolay saptanabilmesi gereklidir.

Radyoaktif olmayan prob işaretlerinin çoğu immünojeniktir ve

immünohistokimyasal yöntemler ile saptanabilir.

En çok kullanılan radyoaktif olmayan işaretler biotin ve

digoksigenindir. Bunlar kendilerine karşı oluşturulan

antikorIar (örneğin, antidigoksigenin) ile saptanabilirler.

Biotin için ise iki saptama sistemi vardır; bunlar anti-biotin

antikorIarı ve biotin-(strept)avidin sistemleridir.

İmmünohistokimyasal Yontem

Probla melezlenme bölgeIerinin görülebilmesini sağlayan, sinyal

oluşturan sistemler (haberci moleküller), işarete karşı oluşturuIan

birincil (primer) bir antikora bağlanabilirler.

Bu yönteme tek aşamalı saptama yontemi denir.

İki aşamalı yontem ise primer antikorun elde edildiği türe karşı oluşturulan ikincil (sekonder) bir antikor, haberci molekülü taşımaktadır.

Bu yöntem tek aşamalı olana göre genellikle daha duyarlıdır. Çünkü her primer antikora sinyali taşıyan birkaç sekonder antikor birden bağlanabilir

Biotin - (strept)avidin sistemi

Avidin yumurta akından elde edilen ve biotine karşı aşırı ilgisi olan bir glikoproteindir.

Haberci molekülü veya sinyali içeren avidin biotin işaretli proba bağlanır

Biotinli antiavidin antikoru eklenir

Sinyal oluşturucu sistemi içeren başka bir avidin tabakası eklenerek sinyal artırılır.

(1)

(2)

(3)

Bu şekilde sinyal ileri derecede artırılmış olur.

Avidinin yerine kullanılabilen streptavidin ise Streptococcus

avidini'den elde edilir. Avidinden farklı oIarak yüksüz bir

moleküldür ve özgün olmayan elektrostatik bağlanmalar daha

az oluşur. Bununla beraber biotine ilgisi avidininkine göre

daha azdır ve daha dayanıksızdır.

Sinyal oluşturan sistemler (haberci moleküller)

Prob melezIeme bölgeIerinin görünür hale gelmesi, antikora veya (strept) avidine bağlanan sinyal oluşturan sistemlerle (haberci moleküllerle) sağlanır.

Bu sistemler fluorokromlar, enzimler ve metaller olmak üzere üç temel gruba ayrılır

17-aminometil-kumarin-3-asetik asit; 2fluoresein izotiyosiyanat

• Fluorokromlar

Uygun dalga boyundaki ışıkta fluoresan yayan fluorokromların

streptavidine veya antikorlara bağlanabilen çeşitli tipIeri vardır. En çok kullanılanlar;– fluoresein izotiyosiyanat (FITC) yeşil, Teksas kırmızısı ve rodamin

kırmızı, – amino-metil- kumarin asetik asit (AMCA) ise mavi renkte fluoresan

yayarlar.

• yüksek duyarlılık,• çözünürlüğün daha iyi oluşu,• kantitatif çalışmaya uygunluğu • birden fazla probun aynı anda saptanmasıbu yöntemin üstünlükleridir

morfolojik görüntünün zayıflığı, sinyalin çabuk solması nedeniyle sonuçların hemen fotoğrafla saptama zorunluluğu gibi bazı sakıncaları vardır.

• Enzimler

Enzimlerle sinyal oluşturan sistemler, melezleme bölgesinde,

görülebilen bir ürünün çökelmesini sağlayarak işlemektedir.

En çok kullanılan enzimler peroksidaz ve alkalin fosfatazdır.

Enzimlerle saptama yöntemlerinin temel üstünlüğü;• reaksiyon ürününün dayanıklılığı nedeniyle uzun süre saklanabilenpreparatlara olanak vermesi • morfoloji daha iyi görüldüğü için melezlerin kesin yerleşimi belirlenebilmesi• sinyalin normal ışık mikroskobuyla gözlenebilmesi

KulIanılacak enzimin seçimi materyale bağlıdır. Bazı dokularda endojen

enzimler istenmeyen zemin boyanmasına neden olabilir. Endojen

peroksidazın sorun olduğu dokularda (örneğin, eritrositler, nötrofiIler,

makrofajlar) bu enzimin aktivitesi periyodat ve borohidrit, sodyum

nitroferrisiyanit veya fenil hidrazin ile

önlenebilir.

Endojen alkalin fosfataz ise plasenta ve barsak dokularında bulunur.

Plasenta dokusundaki alkalin fosfatazın aktivitesi, kesitlere levamisol

uygulaması ile, bağırsak dokusundakinin ise % 20 asetik asit veya 0.2 N

HCl ile önlenir.

Yabanturpu (Horseradish) peroksidaz (HRP) genellikle sekonder antikora bağlanır (iki aşamalı yöntem) ve en çok kullanılan substrat diaminobenzidindir (DAB). Reaksiyon sonunda iyi görülebiIen kahverengi bir çökelti oluşur.

Saptama duyarlılığı peroksidaz/anti-peroksidaz (PAP) yöntemi kullanılarak artırılabilir. PAP; HRP iIe antikorun oluşturduğu bir komplekstir.

Alkalin fosfataz için, BClP/NBT (5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat/nitroblue tetrazolium) reaksiyonu oldukça duyarlıdır. Bu reaksiyon sonucu prob melezleme bölgeIerinde mavi

bir çökelti oluşur. PAP kompleksine benzer şekilde kullanılan alkaIin fosfataz/anti-alkalin fosfataz (APAAP) kompleksi, prob saptama duyarlılığında artış sağIar.

DIG

anti-DIG AP

BCIP + NBTpurpleprecipitate

DIG: Digoxigenin (Hapten)AP: Alkaline Phosphatase

non-radioactive in situ Hybridization

mRNA labelled probe

Geffers, L.

DIG

anti-DIG POD

Tyramid Biotin

Tyramid Biotin

Tyramid Biotin

Tyramid BiotinTyramid Biotin

Neutravidin AP

BCIP + NBTpurpleprecipitate

DIG: Digoxigenin (Hapten)POD: Horseradish PeroxidaseAP: Alkaline Phosphatase

mRNAlabelled probe

situ Hybridization with TSA

Geffers, L.

• Metaller

lSH için en çok kullanılan metal kolloidal altındır. Bu metal

streptavidin ve antikorlara bağlanmış olarak kullanılır ve hem ışık

hem de elektron mikroskop düzeyinde görülebilir.

lşık mikroskobu düzeyinde, altın probları ile saptamanın duyarlılığı

gümüşle çoğaltma yöntemi ile artırılabilir. Elektron mikroskop

düzeyinde kolloidal altının enzimlerle oluşturulan çökeltilere göre

birçok üstünlüğü vardır.

Farklı büyüklükte altın tanecikleri birlikte kullanılarak aynı anda

birden fazla dizi saptanabilir. Bu metal tek tek yuvarlak tanecikIer

halinde gözlenebildiğinden bunların sayılması ile kantitatif

değerlendirme imkanı vardır. Ayrıca sinyal en yüksek çözünürlükte

saptanır.

Fakat bu yöntemin duyarlılığı diğer saptama yöntemlerine göre daha

azdır.

Ferritin ve hemosiyanin gibi diğer metallerle saptama yöntemleri de

vardır. Ancak bunların boyutları kolloidal altın kadar iyi kontrol

edilemediğinden daha az kullanılırlar.

ln situ Melezlemede Kontrol

ISH deney sonuçlarının doğru olarak yorumlanabilmesi ve güvenilirliği açısından çok dikkatli davranılmalı ve işlem sonuçlarından emin olmak için çeşitli kontroller yapılmalıdır.

Spesifik olmayan prob bağlanma kontrolü

Tayin ayıraçlarıyla kontrol

Üretkenliğin kontrolü

Hedef dağılımın kontrolü

Melezleme reaksiyonlarında, problar ile hedef olmayan nükleik asit dizileri arasında, olası homolojilerden dolayı istenmeyen sonuçlar ortaya çıkabilir. Ayrıca probun G-C bakımından zengin bölgeleri ile hedef olmayan nükleik asitler arasındaki melezleme de yanlış pozitif sonuç verebilir. Böyle hatalı melezleme reaksiyonlarının önlenmesi için prob dizisinin çok dikkatli seçilmesi ve kontrol probların kullanılması gereklidir.

Melezleme öncesi uygulamalarda yer alan RNaz veya DNaz ile

sindirme DNA veya RNA gibi hedef nükleik asitlerin varlığının

saptanmasında önemli bir kontroldür. Enzim uygulamaları çok

dikkatli yapılmalıdır. Nükleaz uygulamasından sonra hedef

nükleik asitin ortadan kaldırılmasını takiben, eğer enzim

dokudan tam olarak giderilememiş ise daha sonraki aşamada

probu da sindireceğinden melezleme sinyali gözlenemez.

İstenmeyen meIezleme sinyallerinin bir kısmı da probların spesifik olmayan hücresel bölgelere bağlanması ile ortaya çıkabilir. Bu duruma, proteinler ile prob arasındaki elektriksel çekimler yol açabilir. Bir diğer prob-protein ilişkisine DNA'ya bağlanan proteinler neden olabilir. Bu gibi özgün olmayan ilişkiler, hücresel nükleik asitlerle melezlenmeyen negatif kontrol problar kullanılarak ortadan kaldırılabilir.

Bunlara ek olarak, histokimyasal veya immünohistokimyasal tekniklerdeki bir hata yanlış pozitif sonuçlar doğurabilir. Bu da prob içermeyen melezleme tamponu ile inkübe edilen kesitlere işaret tayin sistemlerinin uyguIanması ile kontrol edilebilir. Ayrıca immünolojik tayin sistemlerinde kullanılan enzimlerin, dokuda endojen olarak varlıkları dikkate alınmalı; gerekirse bir başka enzim seçilmeli ya da prehibridizasyon aşamasında

endojen enzim maskelenmelidir.

Kontrol probları olarak sense veya antisense oligonükleotidler, ayrıca rastgele dizili oligonükleotidler ve oligo d(T) veya d(A) kullanılabilir. Oligo d(T) probları, dokudaki mRNA'nın korunmuşluğu ve hücresel aktivitesi hakkında önemli bilgi veren poliadenil RNA'ları tayin etmek için kullanılır.

Bu aynı zamanda lSH protokolünün optimizasyonunda kullanılan bir adımdır.

In Situ Melezlemede Ortaya Çıkan Sorunlar ve Çozümleri

Sorun Olası nedenler Çozüm

1) Kesitlerin düşmesi

2) ISH reaksiyon işaretlerinin yokluğu veya azlığı

Sorun Olası nedenler Çozüm

2) ISH reaksiyon işaretlerinin yokluğu veya azlığı

3) Kesitte özgün olmayan, çok fazla işaret olması (istenmeyen zemin boyanmaları)

ISH Protokolü(Eichele Lab.’ın protokolünden)

1. Örneklerin hazırlanması ve dokunun fiksasyonu,

2. Ön hibridizasyon işlemi, probların ilavesi ve hibridizasyon

işlemi,

3. Son hibridizasyon işlemi ve spesifik olmayan bağlanmaların

giderilmesi, slaytların bir seri çözeltiden geçirilerek fikse

edilmesi ve üzerlerinin lamelle kapatılması, örneklerin

mikroskopta incelenip uygun olanlar taranarak genel kullanım

için internet ortamına aktarılması.

Slâytların sandviç şeklinde hazırlanmasında kullanılan özel camlar bir gece

180°C sıcaklıktaki fırında bekletilir.

Kullanılan bütün çözeltilerin büyük bir kısmı otoklavlanır veya özel

şekillerde hazırlanır.

RNA’ları korumak için DEPC’li su kullanılır ve böylece RNase’a karşı korunur.

Fare embriyosu fareden alındıktan sonra OCT (optimal freezing medium)

içine gömülür. Bu amaçla özel alaşımlı kablar kullanılır. Bu özel kablar içine

konulduktan sonra ani dondurmayla dondurulan embriyo -70°C saklanır.

Mikroton cihazı kullanılarak lamlar üzerine fare embriyoları Cryosections

cihazıyla 20 µm kesitler halinde yayılır.

Slâytların hazırlanma şekli (sandviç); slâyt resminde slâyt ile kullanılan cam arasındaki boşluk 80 μm

Slaytlar robota yerleştirilir ve Prehibridizasyon işlemi yapılır.Hibridizasyon işlemi yapılır. NBT/BCIP kullanarak renk reaksiyonu uygulanır.İşlemler robotto otomatik şekilde yapılır. Cihaz bilgisayar programı ile kontrol edilir.

cycles T (min) volume Reagent l. class container temperature5 5 min. 300 H2O2 in MeOH ethanol 325 24º C7 5 min. 300 PBS (1) water 1000 24º C2 5 min. 300 0.2M HCl water 200 24º C4 5 min. 300 PBS (2) water 1000 24º C1 5 min. 400 PK buffer water 200 24º C2 10 min. 300 Proteinase K in PK buffer water 200 24º C7 5 min. 300 PBS (3) water 1000 24º C2 10 min. 300 4% PFA (1) water 200 24º C7 5 min. 300 PBS (4) water 1000 24º C2 15min 300 hyb-mix (1) hyb-mix 200 24º C1 15 min. heat up to 64º C hyb-mix - 64º C1 330 min 300 probe hybridization probe 300 64º C

Prehybridization/Hybridization

Robot

fresh frozen tissue sections are fixed in 4% PFA , acetylated and dehydrated before they are used on the robot

İn situ hibridizasyon işlemlerinin basamaklar halinde gösterilmesi

Geffers, L.

cycles T (min) volume Reagent l. class container temperature5 5 min. 300 5 x SSC water o/n 450 62º C5 10 min. 350 formamide I water o/n 450 62º C5 12 min. 350 formamide II water o/n 450 62º C3 8 min. 300 0.1 x SSC (1) water o/n 450 62º C1 8 min. 300 0.1 x SSC (2) water o/n 450 24º C

Posthybridization

Robot Geffers, L.

cycles T (min) volume Reagent l. class container temperature4 5 min. 300 NTE (1) water o/n 1000 24º C6 5 min. 300 20 mM iodoacetamide (1) water o/n 325 24º C4 5 min. 300 NTE (2) water o/n 1000 24º C2 5 min. 300 TNT (1) water o/n 1000 24º C6 5 min 300 4% sheep serum (1) water o/n 325 24º C4 5 min. 200 TNT (2) water o/n 1000 24º C2 10 min. 300 TNB blocking buffer water o/n 325 24º C2 5 min. 200 TNT (3) water o/n 1000 24º C2 5 min. 300 maleate wash buffer (1) water o/n 1000 24º C2 10 min. 350 blocking reagent water o/n 200 24º C2 5 min. 300 maleate wash buffer (2) water o/n 1000 24º C2 5 min. 250 TNT (4) water o/n 1000 24º C3 5 min. 350 TMN water o/n 325 24º C4 5 min. 200 TNT (2) water o/n 1000 24º C4 10 min. 300 TNB blocking buffer water o/n 325 24º C2 30 min 350 antiDIG-POD water o/n 200 24º C6 5 min. 200 TNT (3) water o/n 1000 24º C1 25 min 250 tyramide-biotin - 24º C6 5 min. 250 maleate wash buffer (1) water 1000 24º C2 20 min 350 Neutravidin water 200 24º C6 5 min. 250 maleate wash buffer (2) water 1000 24º C4 5 min. 250 TNT (4) water 1000 24º C

Immuno and TSA

RobotGeffers, L.

cycles T (min) volume Reagent l. class container temperature2 5 min. 400 TMN water 325 24º C3 10 min 350 BCIP/NBT water 200 24º C3 x 400 System liquid (1) System liquid 24º C1 x 300 NTE (3) water 1000 24º C1 10 min. 200 4% PFA (2) water 200 24º C3 x 400 System liquid (2) System liquid 24º C

Color Reaction

Robot

Geffers, L.

Slâytlar bir gece bekledikten sonra slâyt kaplama makinesinde yüzeyleri

kaplanarak kurutulur. Daha sonra slâytlar mikroskopta incelenir ve sonra

taranarak bilgisayar ortamına alınır.

A): Slâyt kaplama makinesi, (B): Slâytları incelemede kullanılan mikroskop, (C): Slâytların taramasının yapıldığı scanner cihazı

C

Geffers, L.

Pax6

Slc25a37Runx1Trp63 MyoD

E14.5

P7

Gene Expression

Geffers, L.

Atlas Building

Geffers, L.

In situhybridization of BDNF, c-Fos and Arg3.1/arc in adult rat cochlea and AC. - HRP-DAB System

Tan, J. et al. Neuroscience

in situ hybridization with a 35S-radioactive

Yamamoto, N. et al. Neuroscience

Bütün Halinde Hazırlanan Preparatlar(whole mount ISH)

Bir organizmanın tümünü (örneğin Drosophila embriyoları, bezelye embriyoları vb.) araştırmak i in, 1 -2 mm çbüyüklüğündeki parçalar fikse edilir.

Bu şekilde hazırlanan preparatlarda prob ve saptama belirtecinin materyale girmesinde karşılaşılan sorunların aşılması için örneğin; bitki hücreleri selülaz ve pektinaz gibi hücre duvarını sindiren enzimler ile ön işleme tutulabilir .

whole mount ISH protokolü zebrafish embryos

Thisse, C. and Thisse, B. (2008) High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3: 59 – 69

Thisse, C. and Thisse, B. (2008) High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3: 59 – 69