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Proyecto Nº SC93-155Proyecto Nº SC93-155
INMUNOLOGIA PORCINA:DESARROLLO DE METODOS PARA LAINMUNOLOGIA PORCINA:DESARROLLO DE METODOS PARA LADETECCION Y/O CUANTIFICACION DE CITOQUINAS. CLONAJE YDETECCION Y/O CUANTIFICACION DE CITOQUINAS. CLONAJE Y
CARACTERIZACION DEL COMPLEJO CD3-TCR PORCINO.CARACTERIZACION DEL COMPLEJO CD3-TCR PORCINO.CARACTERIZACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTECARACTERIZACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTE
LEUCOCITOS PORCINOS.LEUCOCITOS PORCINOS.
Equipo Investigador:Equipo Investigador:Javier Domínguez Juncal (Dr. Med.)Angel Ezquerra Martínez (Dr C.Q.)Fernando Alonso Moreno (Dr. C.B.)Antonio Bernabé Salazar (Dr. Vet.)Joaquin Sánchez Campillo (Dr. Vet.)Mª del Carmen Babín Vich (Dra. C.B.)Rosario Bullido de las Heras (L.V.)Manuel Gómez del Moral (L.B.)
Equivalente de jornada completa: 2,30
Centro de Investigación:Centro de Investigación:Centro de Investigación en Sanidad Animal (C.I.S.A.). INIA.28130 VALDEOLMOS (MADRID)Tel: 91/620 23 00 - Fax: 91/620 22 47
Duración:Duración:Enero 1993 - Diciembre 1995
Coste:Coste:Miles de pesetas: 24.668Financiación INIA 100 %
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PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOSPLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS
El cerdo representa uno de los sectores ganaderos económicamente más importantes de
nuestro país. Varias de las líneas de trabajo del Centro de Investigación en Sanidad
Animal (CISA) tienen por objetivo la obtención o mejora de vacunas frente virus que
afectan al cerdo (Virus de la Peste porcina africana (VPPA), de la fiebre aftosa (VFA),
de la gastroenteritis transmisible (VGT), etc). La consecución de estos objetivos
requiere un mejor conocimiento del sistema inmune del cerdo y de los mecanismos
inmunológicos que confieren protección en las distintas infecciones. Para ello es
necesario el desarrollo de técnicas y reactivos que ya están siendo utilizados en modelos
experimentales de ratón y humano y que han permitido un gran avance en la
comprensión de la inmunología de las enfermedades infecciosas en estas especies.
En el presente proyecto se pretenden desarrollar reactivos y técnicas que permitan un
análisis más profundo del sistema inmune, particularmente de los mecanismos de
inmunidad celular, en el cerdo. Estos reactivos y técnicas serán utilizados en el estudio
de la respuesta inmune frente virus que son objeto de estudio de otros grupos del
Centro. Los objetivos concretos que se pretenden alcanzar son los siguientes:
1) Obtención de una colección de anticuerpos monoclonales (Acmo) frente a
antigenos de diferenciación de leucocitos porcinos, con especial interés en antígenos
específicos de monocitos-macrófagos porcinos y antígenos de activación de linfocitos T.
2) Puesta a punto de técnicas para la detección de citoquinas porcinas. Nos
proponemos obtener antisueros policlonales, anticuerpos monoclonales (Acmo) y/o
sondas de cDNA frente a diversas citoquinas porcinas (IFNα, IFNγ, TNFα, IL1,etc), de
las que se dispone de material purificado (IFNα, IFNγ) o se conoce su secuencia (TNFα,
IL1, IL10, IFNα, IFNγ). Con estos reactivos se desarrollarán inmunoensayos (ELISA) o
técnicas de RT-PCR para la cuantificación de estas citoquinas en sueros y/o secreciones
corporales y en órganos de animales sanos e infectados. Estos reactivos serán también
utilizados en técnicas inmunohistológicas y de hibridación "in situ" para la detección de
células productoras de citoquinas en cortes de tejidos de animales sanos y en lesiones e
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infiltrados inflamatorios en animales infectados. Estas técnicas nos servirán para
analizar (en próximos proyectos y en colaboración con otros grupos) el papel que juegan
las distintas citoquinas en las infecciones por VPPA, VFA, virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP), etc.
3) Clonaje y caracterización del complejo CD3-TCR (receptor de antígeno de los
linfocitos T). Este objetivo es un paso previo al análisis de la diversidad y del repertorio
de linfocitos T en respuesta a distintos virus de interés. La disponibilidad de sondas
derivadas de los genes del TCR permitirá analizar la distribución y diversidad de los
linfocitos Tαß y Tγδ en tejidos y lesiones o infiltrados inflamatorios, por hibridación in
situ.
RESULTADOSRESULTADOS
Antígenos de diferenciación de leucocitos porcinosAntígenos de diferenciación de leucocitos porcinos
Se ha obtenido una colección de 40 anticuerpos monoclonales frente linfocitos activados
(con ConA+PMA) y macrófagos alveolares porcinos. De ellos, cinco Acmo reconocen
antígenos de activación, no expresados o expresados a niveles muy bajos en células en
reposo; y tres reconocen antígenos específicos de monocito-macrófagos. Entre las
moléculas reconocidas por este panel de Acmo se han podido identificar las siguientes:
CD5, CD11b, CD25, CD45, CD45RA, CD46, SWC7, SLA I y SLA II (DR y DQ).
Es interesante resaltar la obtención por vez primera de Acmo frente CD11b, CD45RA,
SWC7, asi como frente a varios antígenos específicos de macrófagos.
TCRTCR
Se ha abordado el análisis de la expresión y diversidad del TCR porcino mediante RT-
PCR. Para ello se diseñaron una serie de oligonucleótidos que permiten la amplificación
de porciones de los segmentos constantes de los genes alfa, beta y delta del TCR. Se
comprobó la especificidad de la amplificación mediante el clonaje y secuenciación de los
productos obtenidos, que correspondían efectivamente a los genes del TCR.Mediante
esta tecnología se ha determinado la expresión de los genes α y β del TCR en un clon de
linfocitos T especifico frente al virus de la fiebre aftosa.
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CitoquinasCitoquinas
Se han producido antisueros policlonales y/o Acmo frente IFNγ e IFNα recombinantes
porcinos y frente TNFα recombinante bovino. Con estos anticuerpos se han
desarrollado ELISAs para la detección de IFNγ e IFNα. Por otra parte, se ha puesto a
punto una técnica de RT-PCR, tras diseño asistido por ordenador de los "primers"
correspondientes, para la detección y semi-cuantificación de la expresión de los genes de
IFNγ, IL-1β, IL-10, TNF-α en tejidos y suspensiones celulares.
INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR ELINFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL
PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES.PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES.
Antígenos de diferenciación de leucocitos porcinosAntígenos de diferenciación de leucocitos porcinos
Se han realizado una fusión inmunizando con leucocitos de sangre periférica (PBL), 5
fusiones frente a linfocitos activados con Con A y PMA, y dos fusiones inmunizando con
macrófagos alveolares porcinos. De los híbridos obtenidos se han seleccionado 40 AcMo
para su posterior caracterización.
Se ha analizado por citometría de flujo la distribución en las distintas poblaciones
celulares de los antígenos, estudiando la reactividad de los AcMo con linfocitos en
reposo o activados, monocitos, macrófagos alveolares, granulocitos, plaquetas,
eritrocitos y con diferentes líneas celulares porcinas (PK-15, 38A1D). La distribución
tisular de estos antígenos se ha analizado mediante tecnicas de inmunoperoxidasa
indirecta sobre cortes de congelación de timo, bazo, ganglios linfáticos, placas de Peyer,
amígdalas, hígado, riñón y piel. El peso molecular de los antígenos reconocidos por estos
AcMo se ha determinado por inmunoprecipitación y/o Western blotting. También
hemos estudiado la posible reactividad cruzada con PBL humanos, equinos,bovinos,
ovinos y caninos.
En la tabla 1tabla 1 se refleja la reactividad de los AcMo con linfocitos, en reposo o activados
con ConA+PMA, granulocitos, plaquetas, eritrocitos y macrófagos alveolares. Estos
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datos se han obtenido por citometría de flujo, y corresponden al porcentaje de células
positivas.
Cinco AcMo tienen alta reactividad con linfocitos activados, y no reaccionan o
reaccionan débilmente con linfocitos circulantes. Se han realizado estudios de la
expresión de los antígenos a distintos tiempos y con distintos mitógenos. De este grupo,
un Acmo (6E2/12) reconoce la cadena α del receptor de IL-2 (CD25) y dos Acmo (2F6/8
y 2A10/8) reconocen un antígeno expresado en células B de centros germinales (SWC7).
Siete Acmo, obtenidos frente macrófagos alveolares, reconocen antígenos específicos de
la serie mielomonocítica. Tres de estos Acmo (2A10/11, 3B11/11 y 3F7/11) parecen
reconocer antígenos presentes en macrófagos alveolares, cuya expresión es más débil en
monocitos y negativa en granulocitos, y que podrían servir como marcadores de
maduración. De los cuatro restantes, dos (1E12/11 y 4E9/11) muestran una reacción
muy débil con monocitos y granulocitos, y otros dos (2C12/10 y 2F4/11) reconocen por
igual monocitos, macrófagos alveolares y granulocitos. Uno de estos (2F4/11) reconoce la
cadena a del receptor de complemento tipo 3 porcino o CD11b. Este anticuerpo es capaz
de bloquear la fagocitosis de partículas de zymosan opsonizado por macrófagos
alveolares y granulocitos PMN, así como la adhesión al plástico de estos últimos cuando
se activan con PMA. En cuanto a la distribución tisular, todos marcan macrófagos en
los órganos linfoides, pero con distintos patrones de tinción. En hígado, las células de
Kupffer se tiñen fuertemente con los AcMo 1E12, 3B11, 4E9 y 2A10, mientras que el
AcMo 2C12 reacciona con las células endoteliales de los sinusoides hepáticos. Los AcMo
3B11 y 1E12 muestran un patrón de tinción similar, y en gánglios linfáticos parecen
reconocer células foliculares dendríticas en los centros germinales.
Entre las moléculas reconocidas por los restantes Acmo se han podido identificar CD5
(1H6/8), CD45 (2A5), CD45RA (6E3/7 y 3C3/9), CD46 (1C5, 6D8/8, 2C11), SLA I
(4B7/8) y SLA II-DR ( (2F4, 1F12 y 2E9) y SLA II-DQ (2H5/13, 4H2/13).
TCRTCR
Se ha abordado el análisis de la expresión y diversidad del TCR porcino mediante RT-
PCR. Para ello se diseñaron una serie de oligonucleótidos que permiten la amplificación
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de porciones de los segmentos constantes de los genes alfa, beta y delta del TCR. Se
comprobó la especificidad de la amplificación mediante el clonaje y secuenciación de los
productos obtenidos, que correspondían efectivamente a los genes del TCR. Mediante
esta tecnología se ha determinado la expresión de los genes α y β del TCR en un clon de
linfocitos T especifico frente al virus de la fiebre aftosa.
En el proceso de análisis de la expresión de los genes β del TCR se observó un fenómeno
que consiste en la acumulación de mensajeros inmaduros, es decir aquellos que aún
conservan secuencias intrónicas. Se clonaron y secuenciaron los productos amplificados
de estos mensajeros y se comprobó que esta acumulación no era debida a la existencia
de genes defectuosos, ya que las secuencias de "splicing" podían ser identificadas en los
extremos de los exones.
También se ha abordado el análisis de la variabilidad en la región hipervariable de los
genes α y β del TCR que se denomina CDR3, es decir la región hipervariable que
resulta de la unión del segmento variable y el segmento J en los genes α, y en el caso de
la cadena β de la unión de los segmentos V, D y J. Para este análisis se diseñaron
oligonucleótidos específicos de un segmento Vα, y de un segmento Vβ, y se clonaron los
productos amplificados. Se han secuenciado 46 clones pertenecientes a genes TCRα, 38
de los cuales mostraron secuencias diferentes, identificándose 27 segmentos J. De los
clones correspondientes a genes TCR β se han secuenciado 9, todos ellos con secuencias
diferentes, identificándose 3 segmentos J y un segmento D.
CitoquinasCitoquinas
Se han producido antisueros policlonales en conejo frente IFNγ e IFNα recombinantes
porcinos y frente TNFα recombinante bovino (la homología con TNFα porcino es
superior al 85%) y anticuerpos monoclonales frente IFNγ e IFNα recombinantes
porcinos. Los Acmo obtenidos frente IFNγ recombinante aunque reconocen el IFNγ
presente en trofoblasto, no reaccionan o lo hacen muy débilmente con el IFNγ producido
en sobrenadantes de linfocitos T estimulados con ConA, posiblemente debido a
diferencias postraduccionales entre el IFNγ recombinante y el linfocitario. Por ello
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hemos utilizado los antisueros policlonales para el desarrollo de ensayos ELISA para la
detección de IFNγ. Este ensayo permite detectar 50 ng/ml de IFNγ recombinante
porcino, y ha servido para cuantificar la producción de IFNγ en sobrenadantes de
cultivo de linfocitos circulantes obtenidos de cerdos infectados con aislados atenuados
del virus de la peste porcina africana y reestimulados in vitro. Para la detección de IFNα
se dispone de un ELISA que utiliza 2 Acmo cedidos por Dr. B. Charley (INRA, Jouy-en-
Josas) que permite detectar hasta 1ng/ml de IFNα. Para la detección de TNFα porcino
se ha puesto a punto un ensayo biológico utilizando la línea PK-15,que permite detectar
concentraciones de 10 ng/ml en sobrenadantes de cultivo.
Además se ha puesto a punto una técnica de RT-PCR, tras diseño asistido por
ordenador de los "primers" correspondientes, para la detección (y semi-cuantificación)
de la expresión de los genes de IFNγ, IL-1β, IL-10, TNF-α . Con estas técnicas se está
analizando la cinética de expresión de estas citoquinas en diversos tipos celulares y
organos tras infecciones experimentales con aislados virulentos de VPPA. (Mientras en
los cerdo control no se detecta expresión de IFNγ, en los cerdos infectados con VPPA
éste se puede detectar a los 3 días postinoculación en ganglios linfáticos y bazo,
alcanzando un máximo a los 5 días postinoculación y desapareciendo a los 7 días
postinoculación, cuando el animal ha entrado ya en fase terminal. La cinética de IFNα
parece más temprana, con niveles detectables en bazo e higado desde los primeros días).
LEYENDA DE LA FIGURALEYENDA DE LA FIGURA
Fig. 1 Análisis por citometría de flujo de la reactividad del Acmo 2F4/11 con células
mononucleares de sangre periférica (PBMC), granulocitos polimorfonucleares (PMN),
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macrófagos alveolares (MO), eritrocitos (E) y plaquetas. La línea gris corresponde al
control negativo, incubando las células con un Acmo irrelevante.
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FORMACION DE PERSONALFORMACION DE PERSONAL
Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Rosario Bullido de las Heras,titulada “Producción y caracterización de anticuerpos monoclonales frente a antígenosde diferenciación de leucocitos porcinos”, en la Facultad de Veterinaria de laUniversidad Complutense de Madrid..
Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Manuel Gómez del Moral,
titulada “Análisis de citoquinas en infecciones víricas porcinas: Peste porcina africana”,
en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense de Madrid.
PUBLICACIONESPUBLICACIONES
Artículos científicos
Saalmuller, A., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Goldman, T., Lunney, J.,
Maurer, S., Pescovitz, M., Pospisil, R., Salmon, H., Tlaskalova, H., Valpotic, I.,
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porcine T-lymphocyte antigens. Vet. Immunol. Immunopathol. 43. 219-228.
Saalmuller, A., Aasted, B., Canals, A, Dominguez, J., Goldman, T., Lunney, J.K.,
Maurer, S., Pescovitz, M., Pospisil, R., Salmon, H., Trebichavsky, I., Valpotic, I.,
Vizcaíno, J.S., Zuckerman, F., 1994. Analyses of mAb reactive with porcine CD8. Vet.
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Saalmuller, A., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Goldman, T., Lunney, J.,
Maurer, S., Pauly, T., Pescovitz, M., Pospisil, R., Salmon, H., Trebichavsky, I., Valpotic,
I., Vizcaíno, J.S., Weiland, E., Zuckermann, F., 1994. Analyses of mAb reactive with
porcine CD6. Vet. Immunol. Immunopathol. 43, 243-247.
Saalmuller, A., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Goldman, T., Lunney, J.K.,
Maurer, S., Pescovitz, M., Pospisil, R., Salmon, H., Summerfield, A., Tlaskalova, H.,
Valpotic, I., Vizcaíno, J.S., Weiland, E., Zuckermann, F., 1994. Analyses of mAb
reactive with porcine CD5. Vet. Immunol. Immunopathol, 43. 237-242.
10
Saalmuller, A., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Goldman, T., Lunney, J.K.,
Pauly, T., Pescovitz, M., Pospisil, R., Salmon, H., Sinkora, J., Summerfield, A.,
Valpotic, I., Vizcaíno, J.S., Zuckermann, F., 1994. Analysis of mAb reactive with the
porcine SWC1. Vet Immunol.Immunopathol, 43. 255-258.
Pescovitz, M., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Vizcaino, J.S., Pospisil, R.,
Trebichavsky, I., Salmon, H., Valpotic, I., Davis, W., Arn, S., Sachs, D., Lunney, J.,
Zuckerman, F., Weiland, E., Saalmuller, A., 1994. Analysis of monoclonal antibodies
reactive with the porcine CD4 antigen. Vet. Immunol. Immunopathol, 43. 233-236.
Pescovitz, M., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Vizcaino, J.S., Pospisil, R.,
Sinkora, J., Salmon, H., Valpotic, I., Davis, W., Arn, S., Sachs, D., Lunney, J.,
Zuckerman, F., Weiland, E., Saalmuller, A., 1994. Analysis of monoclonal antibodies
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11
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R. Bullido, M. Gomez del Moral, B. Alvarez, E. Ortuño, A. Ezquerra, F. Alonso, J.
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R. Bullido, M. Gomez del Moral, B. Alvarez, E. Ortuño, A. Ezquerra, F. Alonso, J.
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Congreso de la Sociedad Española de Inmunología. Oviedo (España). Mayo, 1996.
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Domínguez. Análisis por anticuerpos monoclonales de la susceptibilidad de las
poblaciones de monocitos/macrófagos porcinos a la infección por el virus de la Peste
porcina africana. XXII Congreso de la Sociedad Española de Inmunología. Oviedo
(España). Mayo, 1996.
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Patentes y obtenciones
Se está tramitando a través de la OTRI-INIA un convenio con BIOVET-UCO para la
distribución y comercialización de varios de los Acmo frente leucocitos porcinos.
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MEMORIA DEL PROYECTO SC93-155MEMORIA DEL PROYECTO SC93-155:
INMUNOLOGIA PORCINA:DESARROLLO DE METODOS PARA LAINMUNOLOGIA PORCINA:DESARROLLO DE METODOS PARA LA
DETECCION Y/O CUANTIFICACION DE CITOQUINAS. CLONAJE YDETECCION Y/O CUANTIFICACION DE CITOQUINAS. CLONAJE Y
CARACTERIZACION DEL COMPLEJO CD3-TCR PORCINO.CARACTERIZACION DEL COMPLEJO CD3-TCR PORCINO.
CARACTERIZACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTECARACTERIZACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTE
LEUCOCITOS PORCINOS.LEUCOCITOS PORCINOS.
CENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMALCENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMAL
VALDEOLMOS, MADRID 28130VALDEOLMOS, MADRID 28130
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1.- INTRODUCCION1.- INTRODUCCION
La obtención de Acmo frente antígenos de diferenciación de leucocitos han permitido
definir en el cerdo, al igual que en otras especies, distintas subpoblaciones de linfocitos T
(CD4, CD8), con características funcionales propias (Pescovitz et al, 1984, 1985, Jonjic y
Koszinowski, 1984) y analizar su distribución en los distintos órganos linfoides en
animales sanos (Jonjic et al, 1987) e infectados (Mínguez et al, 1988, Susa et al, 1992).
Estudios realizados con estos Acmo han puesto de relieve la existencia de ciertas
peculiaridades en el sistema inmune del cerdo, como son la presencia de linfocitos
CD4+CD8+ dobles positivos en sangre periférica, cuya función todavía se desconoce
(Saalmuller et al, 1989) (es la única especie estudiada en la que se ha observado esta
población en sangre periférica), o la existencia de un porcentaje elevado de linfocitos
Tγδ en sangre periférica (Hirt et al, 1990). Esto último también se ha descrito en vaca y
oveja.
Aunque en los últimos años se ha obtenido un importante número de Acmo frente
antígenos de membrana de leucocitos porcinos, especialmente frente linfocitos T
(revisado en Lunney y Pescovitz, 1987, 1988), existen muchas moléculas de membrana,
implicadas en distintos mecanismos inmunológicos, cuyas funciones han sido
caracterizadas en otras especies (ratón y hombre), para las que no se dispone de Acmo.
En este sentido, sería de gran interés disponer de Acmo frente antígenos de activación
(moléculas que se expresan selectivamente en los linfocitos después de su activación por
antígenos o mitógenos) ya que podrían utilizarse en distintas patologías como
marcadores para la detección de poblaciones activadas. También sería de gran utilidad
la obtención de Acmo frente a diferentes estadios de maduración/diferenciación de los
monocito-macrófagos, (en la fecha de comienzo de este proyecto se disponía de un
número reducido de Acmo frente estas células que además reconocían granulocitos), ya
que en estas células replican varios patógenos importantes de la especie porcina como
son el virus de la PPA (Malmquist y Hay, 1960) y el virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino (SRRP) (Pol et al, 1991), y que permitirían una mejor
caracterización fenotípica de las poblaciones susceptibles a estos virus y del efecto de la
infección sobre las mismas. Además muchos de estos Acmo, por su capacidad de
estimular o bloquear la función de determinadas subpoblaciones celulares permitirán
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conocer en mayor detalle los mecanismos inmunologicos implicados en la protección o
en la patogenia de estas enfermedades.
Otra de las limitaciones en el análisis de la respuesta inmune celular en el cerdo
es el desconocimiento genético y estructural de las moléculas responsables del
reconocimiento antigénico (TCR). El análisis del uso y diversidad de TCR en las
respuestas de linfocitos T a varios virus (LCMV, MCMV, Influenza, etc) en ratón ha
mostrado en ciertos casos la utilización preferente de determinados segmentos variables
(Yanagi, Y.,1991).Esto abre la posibilidad de actuar sobre la respuesta mediante la
activación, o el bloqueo, de células con cierto tipo de receptor que están implicadas en la
protección o patología asociada a ciertas infecciones virales. Dado el interés en analizar
la respuesta inmune celular a varios virus que infectan al cerdo (VPPA, VFA, VSRRP,
etc) que existe en nuestro Centro, nos hemos planteado el análisis genético y molecular
de los TCR porcinos.
Los complejos CD3-TCR están compuestos por al menos 7 cadenas
polipeptídicas, cinco de las cuales son invariantes en su estructura y se denominan
complejo CD3 (cadenas CD3γ,δ,ε,ζ y η). Las dos cadenas restantes, que son el TCR
propiamente dicho, son variables, pueden ser de dos tipos, αβ o γδ, y los genes que las
codifican contienen varios segmentos variables (V, J y en las cadenas β y δ D) que se
reordenan para dar lugar al gen funcional (Allison et al., 1987; Wilson et al.,1988;
Raulet et al.,1989; Clevers et al., 1988).
En la actualidad se conoce la estructura de genes del complejo CD3-TCR de
varias especies animales (que incluyen al hombre, ratón, rata, oveja, vaca, perro, conejo,
macaco, aunque sólo en los casos del hombre y el ratón se conoce la estructura de todos
y cada uno de los genes. Todas las secuencias de estos genes se encuentran en las bases
de datos del European Molecular Biology Laboratory (EMBL), o Gen Bank USA).La
comparación de las secuencias de genes homólogos de distintas especies ha mostrado
que todos tienen regiones muy conservadas en las distintas especies. Este hecho hace
factible el empleo de técnicas de amplificación in vitro de ácidos nucleicos (PCR) para el
aislamiento y análisis de estos genes.
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Las células del sistema inmune producen diversos factores hormonales,
denominados interleuquinas o más genéricamente citoquinas, que regulan la respuesta
inmune, controlando los procesos de activación, crecimiento y diferenciación celular.
El análisis de las citoquinas producidas por clones de linfocitos T en ratón y otras
especies animales ha puesto de manifiesto la existencia de al menos 2 subpoblaciones de
linfocitos CD4+, denominadas Th1 y Th2, que sintetizan distintos tipos de citoquinas
(Mosmann y Coffman, 1989). Estas 2 subpoblaciones se estimulan de forma diferente
por distintos tipos de patógenos o en diferentes estadios de la infección y parecen actuar
de forma antagónica en varios modelos de infecciones experimentales analizados
(revisado en Scott y Kaufman, 1991). En diversos modelos infecciosos, resistencia y
susceptibilidad se correlacionan con distintos perfiles de producción de citoquinas (Pond
et al, 1989; King et al, 1990; Yakamura et al, 1991). Estos estudios han revelado la
existencia de un complejo cuadro de interacciones entre distintas citoquinas y los
diversos tipos celulares del sistema inmune. (Ken-Ichi et al, 1990; Hamblin, 1988).
Los interferones están considerados como importantes defensas inespecíficas frente a las
infecciones víricas. El papel protector del IFNγ ha sido claramente demostrado en
infecciones por virus de la coriomeningitis linfocitaria (Leist et al. 1989; Klavinskis et al.
1989), por virus vaccinia (Karupiah et al. 1990) y virus influenza A (Taylor et al. 1989).
Este efecto antivírico puede ser mediado por su acción directa sobre la célula infectada o
de forma indirecta, a través de la inducción de mecanismos inmunológicos como la
actividad citotóxica (Willie et al. 1989). En la especie porcina, se ha demostrado una
inhibición de la replicación in vitro del virus de la estomatitis vesicular, VGT y VPPA en
varias líneas celulares y en cultivos de macrófagos por IFNγ recombinante porcino
(Charley et al, 1988; Esparza, 1988) y por IFNα recombinante bovino y humano
(Esparza, 1988; Páez et al, 1990). También se ha descrito la producción de IFNγ por
linfocitos T específicos del virus de la Peste porcina africana (Revilla et al, 1992). Sin
embargo, no existen estudios sobre el papel de estas citoquinas "in vivo" en animales
que sobreviven la infección experimental. El TNFα también posee actividad antivírica
(Wong y Godel,1986), y puede potenciar el efecto del IFN (Feduchi et al, 1989; Paez et
al, 1990). Estas citoquinas también pueden estar implicadas en la patogenia de muchas
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de las lesiones que ocurren durante las infecciones. Así, el TNF parece ser el principal
mediador del choque endotóxico causado por bacterias Gram negativas, en el que
también se ha implicado a la IL-6 (Starnes et al, 1990). La presencia de niveles altos de
TNF en líquido cefalorraquídeo se ha correlacionado con el desenlace fatal en las formas
cerebrales de la malaria (Kwiatkowski et al, 1990).
Muchos virus que infectan células del sistema inmune evaden la respuesta inmune
alterando el patrón de citoquinas producidas por estas células. Como ejemplo podemos
citar el incremento de la producción de TGF-β por linfocitos de enfermos de SIDA. Esta
citoquina posee actividad inmunosupresora y puede contribuir a la deficiente función
inmune observada en las primeras fases de la enfermedad (Kekow et al, 1990).
Recientemente se ha identificado una proteína en el virus del Epstein-Barr que presenta
una alta homología con la IL-10 humana. Esta proteína , al igual que la IL-10 inhibe la
producción de IFNγ por los linfocitos activados (Hsu et al, 1990). En la PPA se ha
descrito también la inhibición por el virus de ciertas funciones inmunológicas, como la
respuesta proliferativa a mitógenos o la actividad NK (Wardley, 1982; Ara-Chaves et al,
1988; González et al, 1990; Mendoza et al, 1991). Algunas de estas inhibiciones están
mediadas por factores solubles producidos durante la infección.
Estos estudios sobre la implicación de estas citoquinas en la resistencia o en el desarrollo
de lesiones han sido posibles gracias al clonaje y expresión de los genes que codifican
estas moléculas, lo que ha permitido su obtención en grandes cantidades y con gran
pureza, y ha facilitado el desarrollo de reactivos (Acmo, sondas cDNA) y técnicas (RIAs,
ELISAs, hibridación "in situ", inmuohistoquímica) para su detección y/o cuantificación
en sueros y secreciones corporales, y la identificación de las células que las producen en
suspensiones celulares y cortes de tejido (Mosmann y Fong, 1989; Moller, 1991). En el
cerdo se han clonado y secuenciado los genes del IFNα (Lefevre y La Bonnardiere,
1986), IFNß (Artursson et al, 1992), IFNγ (Dijkmans et al, 1990), TNFα (Pauli et al,
1989; Drews et al, 1990), TNFß (Kuhnert et al, 1991), IL-1α (Maliszewski et al, 1990),
IL-2 (Goodall et al, 1991) e IL-6 (Richards y Saklatva, 1991).
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2.- PLANTEAMIENTO Y DESARROLLO DE LAS ACTIVIDADES2.- PLANTEAMIENTO Y DESARROLLO DE LAS ACTIVIDADES
REALIZADASREALIZADAS
El cerdo representa uno de los sectores ganaderos económicamente más importantes de
nuestro país. Varias de las líneas de trabajo del Centro de Investigación en Sanidad
Animal (CISA)tienen por objetivo la obtención o mejora de vacunas frente virus que
afectan al cerdo (Virus de la Peste porcina africana (VPPA), de la fiebre aftosa (VFA),
de la gastroenteritis transmisible (VGT), etc). La consecución de estos objetivos
requiere un mejor conocimiento del sistema inmune del cerdo y de los mecanismos
inmunológicos que confieren protección en las distintas infecciones. Para ello es
necesario el desarrollo de técnicas y reactivos que ya están siendo utilizados en modelos
experimentales de ratón y humano y que han permitido un gran avance en la
comprensión de la inmunología de las enfermedades infecciosas en estas especies.
En el presente proyecto se pretenden desarrollar reactivos y técnicas que permitan un
análisis más profundo del sistema inmune, particularmente de los mecanismos de
inmunidad celular, en el cerdo. Estos reactivos y técnicas serán utilizados en el estudio
de la respuesta inmune frente virus que son objeto de estudio de otros grupos del
Centro. Los objetivos concretos que se pretenden alcanzar son los siguientes:
1) Obtención de una colección de anticuerpos monoclonales (Acmo) frente a
antigenos de diferenciación de leucocitos porcinos, con especial interés en antígenos
específicos de monocitos-macrófagos porcinos y antígenos de activación de linfocitos T.
2) Puesta a punto de técnicas para la detección de citoquinas porcinas. Nos
proponemos obtener antisueros policlonales, anticuerpos monoclonales (Acmo) y/o
sondas de cDNA frente a diversas citoquinas porcinas (IFNα, IFNγ, TNFα, IL1,etc), de
las que se dispone de material purificado (IFNα, IFNγ) o se conoce su secuencia (TNFα,
IL1, IL10, IFNα, IFNγ). Con estos reactivos se desarrollarán inmunoensayos (ELISA) o
técnicas de RT-PCR para la cuantificación de estas citoquinas en sueros y/o secreciones
corporales y en órganos de animales sanos e infectados. Estos reactivos serán también
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utilizados en técnicas inmunohistológicas y de hibridación "in situ" para la detección de
células productoras de citoquinas en cortes de tejidos de animales sanos y en lesiones e
infiltrados inflamatorios en animales infectados. Estas técnicas nos servirán para
analizar (en próximos proyectos y en colaboración con otros grupos) el papel que juegan
las distintas citoquinas en las infecciones por VPPA, VFA, virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP)etc.
3) Clonaje y caracterización del complejo CD3-TCR (receptor de antígeno de los
linfocitos T). Este objetivo es un paso previo al análisis de la diversidad y del repertorio
de linfocitos T en respuesta a distintos virus de interés. La disponibilidad de sondas
derivadas de los genes del TCR permitirá analizar la distribución y diversidad de los
linfocitos Tαß y Tγδ en tejidos y lesiones o infiltrados inflamatorios, por hibridación in
situ.
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3.- GRADO DE CONSECUCION DE LOS OBJETIVOS3.- GRADO DE CONSECUCION DE LOS OBJETIVOS
Los objetivos propuestos se han alcanzado en su mayor parte. Se ha obtenido
una amplia colección de Acmo frente antígenos de diferenciación de leucocitos porcinos.
Muchos de estos Acmo han sido caracterizados en cuanto a peso molecular, distribución
celular y tisular, y propiedades funcionales de los antigenos reconocidos se refiere. Sin
embargo, en algunos casos, no hemos identificar ningún CD humano o de ratón
homólogo, por lo que continuamos con su caracterización. Es interesante resaltar la
obtención de Acmo frente CD11b, SWC7, CD45RA y antígenos específicos de
macrófagos, de los que no se disponía en la especie porcina. En cuanto al receptor de
células T se ha puesto a punto una técnica por RT-PCR que permite detectar la
expresión de los genes de las cadenas α,β y δ de dicho receptor en el cerdo. Esta técnica
ha permitido caracterizar en mayor profundidad un clon T específico del virus de la
Fiebre aftosa (VFA), desarrollado por el grupo del Dr. Francisco Sobrino en nuestro
Centro. La aproximación propuesta en el proyecto para el análisis de la diversidad de
los genes del TCR porcino (RACE), aún no ha dado resultados por problemas técnicos
todavía no superados. Sin embargo, el análisis de la diversidad se ha abordado por
clonaje y secuenciación de los segmentos variables. Por último, en relación con ensayos
para citoquinas, disponemos de ELISAs para la detección y cuantifiación de IFN α e
IFN γ porcinos, de un ensayo biológico para la cuantificación de TNF α porcino, y de
una técnica RT-PCR para analizar la expresión de los genes de IFN γ, TNFα, IL-1β e
IL-10 porcinos. Asimismo disponemos de sondas para algunas de estas citoquinas (IFN
α, IFN γ, TNFα) para su uso en técnicas de hibridación "in situ", aunque todavía no se
han ensayado.
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4.- CONCLUSIONES Y RESULTADOS ALCANZADOS4.- CONCLUSIONES Y RESULTADOS ALCANZADOS
Se han realizado una fusión inmunizando con leucocitos de sangre periférica (PBL), 5
fusiones frente a linfocitos activados con Con A y PMA, y dos fusiones inmunizando con
macrófagos alveolares porcinos. De los híbridos obtenidos se han seleccionado 40 AcMo
para su posterior caracterización.
Se ha analizado por citometría de flujo la distribución en las distintas poblaciones
celulares de los antígenos, estudiando la reactividad de los AcMo con PBLs, linfocitos
activados, monocitos, macrófagos alveolares, granulocitos, plaquetas, eritrocitos y con
diferentes líneas celulares porcinas (PK-15, 38A1D). La distribución tisular de estos
antígenos se ha analizado mediante tecnicas de inmunoperoxidasa indirecta sobre cortes
de congelación de timo, bazo, ganglios linfáticos, placas de Peyer, amígdalas, hígado,
riñón y piel. El peso molecular de los antígenos reconocidos por estos AcMo se ha
determinado por inmunoprecipitación y/o Western blotting. También hemos estudiado
la posible reactividad cruzada con PBLs humanos, equinos,bovinos, ovinos y caninos.
En la tabla 1tabla 1 se refleja la reactividad de los AcMo con linfocitos, en reposo o activados
con ConA+PMA, granulocitos, plaquetas, eritrocitos y macrófagos alveolares. Estos
datos se han obtenido por citometría de flujo, y corresponden al porcentaje de células
positivas.
Cinco AcMo tienen alta reactividad con linfocitos activados, y no reaccionan o
reaccionan débilmente con linfocitos circulantes. Se han realizado estudios de la
expresión de los antígenos a distintos tiempos y con distintos mitógenos. De este grupo,
un Acmo (6E2/12) reconoce la cadena α del receptor de IL-2 (CD25) y dos Acmo (2F6/8
y 2A10/8) reconocen un antígeno expresado en células B de centros germinales (SWC7).
Siete Acmo,obtenidos frente macrófagos alveolares, reconocen antígenos específicos de
la serie mielomonocítica. Tres de estos Acmo (2A10/11, 3B11/11 y 3F7/11) parecen
reconocer antígenos presentes en macrófagos alveolares, cuya expresión es más débil en
monocitos y negativa en granulocitos, y que podrían servir como marcadores de
maduración. De los cuatro restantes, dos (1E12/11 y 4E9/11) muestran una reacción
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muy débil con monocitos y granulocitos, y otros dos (2C12/10 y 2F4/11) reconocen por
igual monocitos, macrófagos alveolares y granulocitos. Uno de estos (2F4/11) reconoce la
cadena a del receptor de complemento tipo 3 porcino o CD11b. Este anticuerpo es capaz
de bloquear la fagocitosis de partículas de zymosan opsonizado por macrófagos
alveolares y granulocitos PMN, así como la adhesión al plástico de estos últimos cuando
se activan con PMA. En cuanto a la distribución tisular, todos marcan macrófagos en
los órganos linfoides, pero con distintos patrones de tinción. En hígado, las células de
Kupffer se tiñen fuertemente con los AcMo 1E12, 3B11, 4E9 y 2A10, mientras que el
AcMo 2C12 reacciona con las células endoteliales de los sinusoides hepáticos. Los AcMo
3B11 y 1E12 muestran un patrón de tinción similar, y en gánglios linfáticos parecen
reconocer células foliculares dendríticas en los centros germinales.
Entre las moléculas reconocidas por los restantes Acmo se han podido identificar CD5
(1H6/8), CD45 (2A5), CD45RA (6E3/7 y 3C3/9), CD46 (1C5, 6D8/8, 2C11), SLA I
(4B7/8) y SLA II-DR ( (2F4, 1F12 y 2E9) y SLA II-DQ (2H5/13, 4H2/13).
TCRTCR
Se ha abordado el análisis de la expresión y diversidad del TCR porcino mediante RT-
PCR. Para ello se diseñaron una serie de oligonucleótidos que permiten la amplificación
de porciones de los segmentos constantes de los genes alfa, beta y delta del TCR. Se
comprobó la especificidad de la amplificación mediante el clonaje y secuenciación de los
productos obtenidos, que correspondían efectivamente a los genes del TCR. Mediante
esta tecnología se ha determinado la expresión de los genes α y β del TCR en un clon de
linfocitos T especifico frente al virus de la fiebre aftosa.
En el proceso de análisis de la expresión de los genes β del TCR se observo un fenómeno
que consiste en la acumulación de mensajeros inmaduros, es decir aquellos que aún
conservan secuencias intrónicas. Se clonaron y secuenciaron los productos amplificados
de estos mensajeros y se comprobó que esta acumulación no era debida a la existencia
de genes defectuosos, ya que las secuencias de "splicing" podían ser identificadas en los
extremos de los exones.
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También se ha abordado el análisis de la variabilidad en la región hipervariable de los
genes α y β del TCR que se denomina CDR3, es decir la región hipervariable que
resulta de la unión del segmento variable y el segmento J en los genes α, y en el caso de
la cadena β de la unión de los segmentos V, D y J. Para este análisis se diseñaron
oligonucleótidos específicos de un segmento Vα, y de un segmento Vβ, y se clonaron los
productos amplificados. Se han secuenciado 46 clones pertenecientes a genes TCRα, 38
de los cuales mostraron secuencias diferentes, identificándose 27 segmentos J. De los
clones correspondientes a genes TCR β se han secuenciado 9, todos ellos con secuencias
diferentes, identificándose 3 segmentos J y un segmento D.
CitoquinasCitoquinas
Se han producido antisueros policlonales en conejo frente IFNγ e IFNα recombinantes
porcinos y frente TNFα recombinante bovino (la homología con TNFα porcino es
superior al 85%)y anticuerpos monoclonales frente IFNγ e IFNα recombinantes
porcinos. Los Acmo obtenidos frente IFNγ recombinante aunque reconocen el IFNγ
presente en trofoblasto, no reaccionan o lo hacen muy débilmente con el IFNγ producido
en sobrenadantes de linfocitos T estimulados con ConA, posiblemente debido a
diferencias postraduccionales entre el IFNγ recombinante y el linfocitario. Por ello
hemos utilizado los antisueros policlonales para el desarrollo de ensayos ELISA para la
detección de IFNγ. Este ensayo permite detectar 50 ng/ml de IFNγ recombinante
porcino, y la presencia de IFNγ en sobrenadantes de cultivo de linfocitos circulantes
obtenidos de cerdos infectados con aislados atenuados del virus de la peste porcina
africana y reestimulados in vitro. Para la detección de IFNα se dispone de un ELISA
que utiliza 2 Acmo cedidos por Dr. B. Charley (INRA, Jouy-en-Josas) que permite
detectar hasta 1ng/ml de IFNα. Para la detección de TNFα porcino se ha puesto a punto
un ensayo biológico utilizando la línea PK-15,que permite detectar concentraciones de
1-10 ng/ml en sobrenadantes de cultivo.
Además se ha puesto a punto una técnica de RT-PCR, tras diseño asistido por
ordenador de los "primers" correspondientes, para la detección (y semi-cuantificación)
de la expresión de los genes de IFNγ, IL-1β, IL-10, TNF-α . Con estas técnicas se está
analizando la cinética de expresión de estas citoquinas en diversos tipos celulares y
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organos tras infecciones experimentales con aislados virulentos de VPPA. (Mientras en
los cerdo contol no se detecta expresión de IFNγ, en los cerdos infectados con VPPA éste
se puede detectar a los 3 días postinoculación en ganglios linfáticos y bazo, alcanzando
un máximo a los 5 días postinoculación y desapareciendo a los 7 días postinoculación,
cuando el animal ha entrado ya en fase terminal. La cinetica de IFNα parece más
temprana, con niveles detectables en bazo e higado desde los primeros días).
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5.- APLICACION AL SECTOR Y POSIBLE DIFUSION DE RESULTADOS5.- APLICACION AL SECTOR Y POSIBLE DIFUSION DE RESULTADOS
Los reactivos y ensayos desarrollados a lo largo de este proyecto son de gran interés
para estudios de inmmunología porcina, existiendo una importante demanda de los
mismos por laboratorios que trabajan en patología infecciosa del cerdo y en
xenotransplante (utilizando al cerdo como donante de órganos). Varios de los Acmo
frente leucocitos porcinos obtenidos en este proyecto han sido enviados al Second
International swine CD workshop (desarrollado entre 1994-1995, y en el que nuestro
grupo ha participado activamente) para su análisis y validación. Parte de los resultados
obtenidos han sido publicados en revistas cientificas internacionales. Por último, se está
tramitando a través de la OTRI-INIA un convenio con BIOVET-UCO para la
distribución y comercialización de varios de los Acmo frente leucocitos porcinos.
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6.- COLABORACIONES Y AYUDAS RECIBIDAS O PRESTADAS6.- COLABORACIONES Y AYUDAS RECIBIDAS O PRESTADAS
Ver apartado 7
7.- VINCULACION DEL PROYECTO A PROGRAMAS DE COOPERACION7.- VINCULACION DEL PROYECTO A PROGRAMAS DE COOPERACION
CIENTIFICA Y TECNICA INTERNACIONALCIENTIFICA Y TECNICA INTERNACIONAL
Varios de los Acmo frente leucocitos porcinos obtenidos en este proyecto han sido
enviados al Second International swine CD workshop (desarrollado entre 1994-1995, y
en el que nuestro grupo ha participado activamente) para su análisis y validación.La
organización del Second International swine CD workshop ha sido financiada por el
Comité de Inmunología Veterinaria de la Unión Internacional de Sociedades de
Immunología. Los análisis o estudios realizados han corrido a cargo de los laboratorios
participantes.
Se ha firmado un convenio de cooperación INIA-INRA (PA02,1995-1996) con el
laboratorio del Dr. Bernard Charley (Jouy-en Josas) para el análisis de citoquinas
porcinas en patologías infecciosas (VPPA, TGE) en el que se contempla el intercambio
de técnicas y reactivos. Uno de los becarios adcritos a este proyecto (Manuel Gómez del
Moral) ha realizado una estancia de 2 meses en el mencionado laboratorio y hemos
recibido del mismo muestras de Acmo frente IFNα e IFNγ porcinos para su uso en
ELISA.
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LEYENDA DE LAS FIGURASLEYENDA DE LAS FIGURAS
Fig. 1 Análisis por citometría de flujo de la reactividad del Acmo 2F4/11 con células
mononucleares de sangre periférica (PBMC), granulocitos polimorfonucleares (PMN),
macrófagos alveolares (MO), eritrocitos (E) y plaquetas. La línea gris corresponde al
control negativo, incubando las células con un Acmo irrelevante.
B) Distribución de las células mononucleares de sangre periférica de acuerdo a los
parámetros de tamaño (FSC) y complejidad (SSC). La región R1 corresponde a
linfocitos y la R2 a monocitos.
Fig. 2 Inmunomarcaje mediante una técnica de immunoperoxidasa indirecta de cortes
de timo (A), ganglio linfático mesentérico (B) e higado (C) con los Acmo 2A10 (A), 4E9
(B) y 1E12 (c). Se puede observar elmacaje de macrófagos en la corteza tímica,
macrófagos de cuerpo tingible en los folículos del ganglio y de las células de Kuppfer en
el higado.
Fig. 3. Análisis por inmunoprecipitación de los antígenos reconocidos por los Acmo
1F12, 2E9, 2F4 y 4B7.
Fig.4. Detección de la expresión de los genes del receptor de células T (TCR) en un clon
de linfocitos T porcino.
Fig.5. Curva patrón de la valoración de la expresión de TNFα por PCR, realizada con
un plásmido que contiene la secuencia de cDNA de dicha citoquina. Sobre la figura se
indican las cantidades de plásmido utilizadas en cada reacción.
Fig. 6. Detección de la expresión de IFNγ por RT-PCR en un ganglio mediastínico de un
cerdo infectado con virus de la Peste porcina africana.