Introduktion till laborationBiokemi 1

Annica Blissing

IFM – Biochemistry

2

Laborationen sträcker sig över flera tillfällen

Isolering, gelfiltrering, absorbansmätning och påvisande av sulfat

Provberedning, SDS-PAGE, pipettkalibrering, gelinfärgning

Dataanalys och diskussion kring resultat

Rapport

Upplägg

3

Tillfälle 1

Väl införstådd med teorin

Plan för utförandet

Tillfälle 2

Väl införstådd med teorin

Plan för utförandet

Beräknat provvolym till SDS-PAGE

Tillfälle 3 – analys och diskussion

All insamlad data

Repeterat teorin inför diskussion

Förberedelser

Alltså VAD och VARFÖR

Vi hjälper er med HUR!

4

Teori inför laborationen

5

Inom biokemi vill man i princip alltidseparera komponenter i en lösning.

Olika separationskriterier

Isolera och rena hemoglobin

centrifugering och utsaltning

gelfiltrering

Kontrollera renhet och bestämmamolekylvikt med SDS-PAGE

Separationstekniker

6

4 subenheter

kvartärstruktur

Hemoglobin

7

Hemoglobin

8

Samma osmotiska trycki och utanför cellen

Semipermeabelt membranErytrocyt

Porer och kanaler

joner H2O

DiffusionNa+

Na+

K+

Na+

Na+

K+

K+K+

Na+

K+

Cl-

Cl-

Cl-

Cl-

Erytrocyter

9

Osmos

Diffusion från högre koncentration till lägre koncentration, tills koncentrationsgradienten är utjämnad.

10

Isoton lösning0.9% NaCl

Hyperton lösning> 0.9% NaCl

Hypoton lösning< 0.9% NaCl

[NaCl] ↓

[NaCl] ↑

H2O

H2O

H2OH2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

Lysering

11

Proteiner har laddningar på ytan

löslighet

neutralisera laddningarna

Olika sammansättningav laddningar på ytan

faller ut vid olikasaltkoncentrationer

Separation med av-seende på löslighet

(NH4)2SO4

löslighet

tillsätt “motladdningar” tills proteinets laddningar

neutraliserats

Utsaltning

12

Större molekyler får inte plats – vandrar runt gelkornen

Separation med avseende på storlek och form.

Size exclusionchromatography

Tvärbundenglukospolymerer

Små molekyler går in i gelkornen

lång vandrings-sträcka kortare vandrings-

sträcka

Gelfiltrering

13

14

Absorbans280 nm

Volym (ml)

fraktioner

Kromatogram

baslinjeseparation

Voidvolym

15

Separation med avseende på storlek och form.

Avlånga och utsträckta molekyler uppför sig som att

de hade högre molekylvikt

Gelfiltrering

CalmodulinPDB molecule of the month Aug 2003http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?momID=44

16

Gelfiltrering

Hydrodynamisk radie

svårare att ta sigin i gelkornen än globulära partiklar

globulär

separation trotssamma molekylvikt!

Avlånga och utsträckta molekyler uppför sig

som att de vore större

17

störst går först

Omvänd sil

Separation med avseende på storlek och form.

Gelfiltrering

separationskriterier

18

Laddad partikel rör sigmot pol i elektriskt fält

polyakrylamidgel

tredimensionelltnätverk

jmf elektrolys

Gelelektrofores

Proteiner har laddningar på ytan

19

Tredimensionelltnätverk

Bestämd porstorlek

Separation med avseende på storlek

Stora molekyler retarderas Små molekyler passerar lättare

Minst går först

bisakrylamid

Polyakrylamidgelelektrofores

20

Polyakrylamidgelelektrofores

21

Proteinbanden färgasmed coomassie

visualisera

Polyakrylamidgelelektrofores

22

MEN formen påverkar migrationen!

Kan ha samma form menolika laddningar på ytan

Nativ struktur påverkar migrationen

Lösning: denaturera!

form

laddning

Polyakrylamidgelelektrofores

23

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis

disulfidbryggor och primärstruktur intakta

bryter icke-kovalenta bindningar

Sekundär Tertiär Kvartär

denaturering

negativnettoladdning

Alla peptidkedjor fårsamma form och laddning

SDS bindertill proteiner

β-mercaptoetanol

24

Alla peptidkedjor sammaladdning och form

––

–– – – – –

–––––––

–

Molekylviktsbestämning

Renhetsbedömning

Samma elektroforetiska mobilitet

Separation endast m a p storlek

SDS-PAGE

25

Molekylviktsbestämning

Log molekylvikt

Vandringslängd (mm)

Mät vandringslängder

Log-diagram

SDS-PAGE

Exempelrapport på kurshemsidan!

Referensproteiner medkända molekylvikter

26

0 10 20 30 40 50 60

3.9

4.1

4.3

4.5

4.7

4.9

5.1

5.3

5.5f(x) = -0.02x + 5.37

Log-diagram

SDS-PAGE

vandringslängd (mm)

Loga

ritm

erad

mol

ekyl

vikt

Använd för att räknaut molekylvikten

27

0 10 20 30 40 50 60

3.9

4.1

4.3

4.5

4.7

4.9

5.1

5.3

5.5f(x) = -0.02x + 5.37

Log-diagram

SDS-PAGE

vandringslängd (mm)

Loga

ritm

erad

mol

ekyl

vikt

28

Viktigt!

Molekylvikten säger INGENTING om provets renhet!

Hur avgör man renheten?

29

Ett band = en molekylvikt

Ofta en sorts protein

Ett band = rent protein

Renhetsbedömning

SDS-PAGE

30

MEN vissa proteiner kanuppvisa fler än ett band

Kom ihåg:

Hb har 4 subenheter

Hb:s subenheter väger lika~ 16 000 g/mol

Så är inte alltid fallet!

⇒ endast ett band på gelen!

Renhetsbedömning

31

Nativt protein

–– – – – – – –

–––––––

–

SDS-PAGE

Denaturerat protein

Jämförelse

Nativt protein

PAGE

storlek storlek storlek

form form

laddning

CalmodulinPDB molecule of the month Aug 2003http://www.rcsb.org/pdb/101/motm.do?

momID=44

Gelfiltrering

32

Absorbans280 nm

Volym (ml)

Använda gelfiltrering förmolekylviktsbestämning?

Kända referensproteiner påsamma sätt som SDS-PAGE

Jämförelse

Referensproteinermed samma form!

33

Isolering och rening av hemoglobin

34

Kom i tid

Kom förberedd

Labbar börjar med genomgång och kort förhör

Närvaro förutsättning för att få labba!

Obligatorisk närvaro

Hela labpasset

Meddela förhinder till handledare i god tid

Rapportera närvaro efter avslutat labtillfälle

Gör vid varje labtillfälle!

Laborationer på Biokemi 1

Förväntas hakoll på läget

Meddela oss direktom något händer!

35

1.5 ml helblod

500 g, 15 min

Tvätt 0.9% NaCl

500 g, 10 min

Hemolys H2O

Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4

1000 g, 15 min

Lös pellet, 3 delar H2O

1000 g, 10 min

Supernatantenkastas

Supernatantenkastas

Pelletenkastas

Supernatantenkastas

36

H2O

1.5 ml helblod

500 g, 15 min

Tvätt 0.9% NaCl

500 g, 10 min

Hemolys H2O

1000 g, 15 min

Lös pellet, 3 delar H2O

1000 g, 10 min

Supernatantenkastas

Supernatantenkastas

Pelletenkastas

Supernatantenkastas

Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4

pellet

37

H2O

1.5 ml helblod

500 g, 15 min

Tvätt 0.9% NaCl

500 g, 10 min

Hemolys H2O

1000 g, 15 min

Lös pellet, 3 delar H2O

1000 g, 10 min

Supernatantenkastas

Supernatantenkastas

Pelletenkastas

Supernatantenkastas

Utsaltning 385mg/ml (NH4)2SO4

38

0.5 ml

Viktigt att gelytan är rak!Gelen får aldrig torrläggas!

Gelen ekvilibrerad

jämviktad

anpassadebuffertförhållanden

Ekvilibreringslösninggenom kolonnen

Gelfiltrering för attseparera (NH4)2SO4 från Hb

från utfällningen

39

A = ε · c · l

Lambert-Beers lag

Absorbansmätning

ε = molära absorptiviteten

ε = 14480 M-1 cm-1 l = 1 cm

c = koncentrationen i molar

Om A > 1 måste provet spädas

I0 I

l

40

41

Påvisa sulfatjoner

En droppe Ba(NO3)2

OBS! Inte till toppfraktionen!

Högst koncentration Hb

Giftigt! anvisadplats

skyddsutrustning

till SDS-PAGE

42

Kromatogram konstruerat avForskarskolans elever 2011

43

Separation!

sulfatjonerhemoglobin

44

Utbyte

0.5 ml supernatant

absorbansvärden

koncentration

massa ellersubstansmängd

hemoglobin

45

Rapporten

46

47

Inledning

Syfte och utförlig teori

Utförande

Beskriv tillvägagångssätt

Passiv form!

Håll isär utförande och teori!

Riskanalys

Akrylamid

Resultat

Redovisas tydligt

Rådata, beräkningar, figurer/bilder, tabeller...

Diskussion

Diskutera resultaten

Felkällor och hur de har påverkat resultatet

Jämförelse GF + SDS-PAGE

Utförlig och komplett rapport!

Rapporten

48

Examination

En rapport för alla tillfällen

Tänk på helheten!

Enligt riktlinjer

+ punkterna i handledningen

Copy – paste oacceptabelt

Se baksidan på försättsbladet

5 arbetsdagar

Gäller även returer

Elektronisk inlämning

3 rättningar

Track changes aktiverat

Fullständig!

Saknas något ⇒ retur

“right-first-time”

Rapporten

49

Tips inför rapporten

Skriv inledning och utförande så snart som möjligt

Se det som förberedelse

Skriv resultat och diskussion så snart som möjligt

Se även “Redovisning” i kompendiet!

Checka av att allt är med

Passa på att fråga oss på schemalagd tid

Vi svarar gärna!

Utanför schemalagd tid jobbar vi med annat

Säkrast: e-mail

Använd allt tillgängligt material!

Föreläsningsanteckningar

Kursboken

Labhandledningen

50

Tillfälle 1 – gelfiltrering

Väl införstådd med teorin

Plan för utförandet

Tillfälle 2 – SDS-PAGE

Väl införstådd med teorin

Plan för utförandet

Beräknat volym Hb

Tillfälle 3 – analys och diskussion

All insamlad data

Funderat på förväntad molekylvikt

Förberedelser

Alltså VAD och VARFÖR

Vi hjälper er med HUR!

51

Vi ses på lab!

Annica Blissing Amelie Wallenhammar Mikaela Eliasson

annij@ifm.liu.se amewa@ifm.liu.se mikel@ifm.liu.se