investigación hidatidosis
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Investigación de técnicas inmunológicas para la detección de hidatidosis en humanosTRANSCRIPT
TÉCNICA DE INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA DETECCIÓN DE HIDATIDOSIS EN HUMANOS.
Cinthia Dalmao
Tattiana Faccio
Adriana La Greca
RESUMEN
La hidatidosis quística o equinococcosis humana es una zoonosis parasitaria cosmopolita,
que afecta principalmente a las zonas agrícolas y ganaderas de América Latina, causada
por el estado larval de la Echinococcus granulosus. Cumple un ciclo en varios
hospedadores produciendo graves consecuencias sociales, económicas y sanitarias. Por
tal motivo es muy importante la prevención y el diagnóstico precoz de esta zoonosis, que
se basa principalmente en estudios clínicos y posterior comprobación serológica,
mediante diferentes técnicas. El test de ELISA (“Enzime linked immuno sorbent assay”) es
uno de los más confiables, pudiendo brindar pruebas inmunodiagnósticas, resultados
inmediatos y se puede realizar en cortos periodos de tiempo.
Palabras claves: Hidatidosis; Echinococcus granulosus; Inmunodiagnóstico.
SUMMARY
Human cystic hydatid disease or echinococcosis is a parasitic zoonosis cosmopolitan,
affecting mainly agricultural and pastoral areas of Latin America, caused by the larval
stage of Echinococcus granulosus. Is cycled in various hosts and produces serious social,
economic and health consequences. Therefore it is very important to the prevention and
early diagnosis of this zoonosis is mainly based on clinical studies with subsequent
serological testing, using different techniques. The ELISA test (Enzime linked immuno
sorbent assay) is one of the most reliable and can provide immunodiagnostic tests,
immediate results and can be performed in short periods of time.
Keywords: Hydatidosis; Echinococcus granulosus; Inmunodiagnosis.
1
INTRODUCCIÓN
La hidatidosis se ha denominado como
una zoonosis cosmopolita causada por la
Echinococus granulosus.
“Las zoonosis han sido definidas como
aquellas enfermedades e infecciones
cuyos agentes se transmiten
naturalmente de los animales al hombre
o viceversa”. (OMS 1959)
Las grandes repercusiones en la salud y
en la economía impulsaron la
implementación de programas de
prevención; que fueron posibles por el
conocimiento del ciclo de vida del
parásito y del desarrollo de la
enfermedad. El control de esta zoonosis
se lleva a cabo mediante un enfoque
interdisciplinario, el cual incluye: dinámica
de la transmisión, comportamiento de la
población en riesgo y uso de
inmunodiagnóstico en la vigilancia
epidemiológica.
Hidatidosis
La hidatidosis o echinococcosis humana
es una afección provocada por el estado
larval de cestodos pertenecientes al
género Echinococcus de la familia
Taeniidae. Existen cuatro especies: E.
granulosus, E. multilocularis, E. oligarthus
y E. vogeli, de las cuales las dos
primeras son las que se presentan con
mayor frecuencia en humanos,
provocando echinococcosis quística y
echinococcosis alveolar respectivamente.
Se transmite mediante la ingesta de los
huevos embrionados del parásito por
contacto con animales domésticos, como
el perro, o ingesta de alimentos y agua
contaminados.
Estructura de la Echinococus granulosus
En el cestodo adulto Echinococus
granulosus, con localización en el
intestino delgado del perro, se distinguen
una cabeza o escólex, cuello y estróbilo.
La cabeza presenta cuatro ventosas y
una doble hilera de ganchos de dos tipos:
unos más grandes- de unos 50
micrómetros- y otros más pequeños,
llegando a un total de 30 a 50 ganchos.
El cuello se caracteriza por ser corto, no
segmentado y ha de unirse al estróbilo.
Éste se integra por tres o cuatro proglotis,
siendo estos hermafroditas. El último
proglotis es el único capaz de madurar y
por lo tanto el que se desprende cuando
llega al estado de gravidez. Puede llegar
a contener entre 500 y 800 huevos en el
útero, y en el interior de cada huevo se
encuentra un embrión exacanto.
Los perros parasitados pueden albergar
2
en el intestino de 20.000 y 30.000 tenias.
Luego de unos meses en el intestino del
perro, E. granulosus desprende el último
proglotis o anillo grávido, donde cada
tenia elimina entre 500 y 800 anillos
grávidos y 1 millón de huevos
embrionados (embriósforos y oncósferas)
son eliminados con la materia fecal cada
15 días. Los embriósforos son resistentes
al calor, las heladas y la lluvia, por lo que
contaminan durante meses pastos,
aguadas y verduras, volviéndose una
fuente de infección para el ganado y
humanos.
Echinococcus granulosus adulto. Imagen:
Dr. Jorge Tay Z., Facultad de Medicina, UNAM.
Ciclo evolutivo de Echinococcus granulosus.
El ciclo evolutivo de la Echinococcus
granulosus es indirecto, para realizarlo
necesita de dos hospedadores, uno
definitivo, que son los perros domésticos
y algunos otros cánidos silvestres, y los
huéspedes intermediarios, que son
ovinos, bovinos, cerdos, equinos y el
hombre en forma accidental. En los
hospedadores definitivos vive el cestodo
adulto prendido a las vellosidades de la
mucosa del intestino delgado, mide de 3
a 6 mm de longitud, está compuesto por
tres proglótides, donde solo el último de
ellos es grávido, conteniendo varios
cientos de huevos que se desprende del
estróbilo y salen con la materia fecal del
cánido, desintegrándose en el medio
ambiente permitiendo que los huevos
embrionados, de pequeño tamaño y
peso, puedan ser diseminados con
facilidad a través del viento y el agua,
favoreciendo la contaminación de
pasturas, verduras y fuentes de agua.
Para continuar con el ciclo el hospedador
intermediario, deben ingerir estos huevos
que contienen un embrión hexacanto
(oncósfera), en el intestino delgado la
oncósfera se libera y ayudada por la
corona de ganchos atraviesa la pared
intestinal, es trasladada por la corriente
sanguínea a diferentes órganos,
pudiéndose detener en el hígado,
pulmones, pero puede llegar inclusive
hasta los huesos. Sin importar donde se
detenga, la oncósfera pierde sus ganchos
y se cavita (ahueca) dando origen al
estado larval, lo que comúnmente se
conoce como quiste hidático, hidátide.
3
Quiste hidático (Equinococosis)
El quiste hidático es generalmente
esférico y sin vellosidades, se compone
de una capa adventicia o periquística
formada por reacción del órgano
huésped, de tejido fibroso, al que le sigue
la capa externa del quiste o ectocisto,
quitinosa, cuticular, estratificada, elástica
e inerte de 200 µm a 1 cm. Por último la
capa externa o endocisto, granulosa,
germinativa o prolífera, es muy delgada
(20 µm), con núcleos activos y con
funciones de crecimiento, de formación
de escólex, de líquido y de cutícula.
Por gemación en la capa germinativa, se
forman pequeñas cápsulas o vesículas
prolígeras de 200 a 500 µm, que
contienen los protoescólex en un número
variable, estas vesículas forman la
llamada “arenilla hidática”. Los escólex,
originados en el interior de las vesículas,
tienen doble corona de ganchos y 4
ventosas. Una vez totalmente
desarrollado el protoescólex
permanecerá latente en el quiste hidático
hasta que la integridad del medio
ambiente estéril del quiste sea alterado.
En el interior del quiste se encuentra el
líquido hidático, límpido y ligeramente
alcalino (pH 6,7 a 7,9), generalmente
estéril, con varias sustancias orgánicas e
inorgánicas.
Los quistes que no contienen
protoescólex reciben el nombre de
acéfaloquistes o estériles, mientras que
los quistes fértiles y viables tienen
protoescólex vivos en o sobre la
membrana prolígera y también en el
líquido hidático (arenilla hidática).
Es importante la cantidad de proteínas
séricas del huésped presente en el
líquido, entre las que se destacan la
albúmina y las inmunoglobulinas,
representando un 24,6% de las proteínas
totales del líquido del quiste. Es
conveniente analizar las estructuras y
tejidos del quiste hidático, en función de
su capacidad de producir una respuesta
inmunológica en el portador.
Entre el quiste intacto, normal o no
alterado, denominado hialino, y el quiste
hidático que se rompe liberando su
contenido y produciendo una fuerte
estimulación, habría toda una amplia
variedad de situaciones en las cuales la
4
salida de inmunógenos alcanzarían
niveles intermedios entre estos dos
extremos. Esta diferencia en estimulación
permitiría explicar la ausencia o las
grandes diferencias en concentración de
antígenos en portadores de quiste
hidático.
El quiste hidático se desarrolla en el
hígado y los pulmones principalmente,
aunque también es posible que la larva
llegue a otras partes del organismo y en
lugares no tan frecuentes. Estos quistes
crecen lentamente, por tal motivo los
síntomas solo aparecen cuando éstos
comienzan a presionar tejidos u órganos
adyacentes, provocando algún tipo de
daño o molestia.
El único tratamiento para esta
enfermedad es la extracción quirúrgica
del quiste hidático cuando alcanza un
tamaño considerable.
Quiste hidatídico. E. granulosus. Capas adventicia, acelular y germinativa, de afuera hacia adentro. En la capa germinal se forman cápsulas o vesículas hijas, dentro de las cuales se desarrollan protoescólices (escólices).
Imágenes: Dra. I. de Haro Arteaga, Facultad de Medicina, UNAM
Esquema de quiste hidático.
Imagen: Prof. Velasco García, Dr. Orquín, cátedra de Patología Quirúrgica. Universidad de Cádiz
Interacción parásito- hospedador
La relación inmunológica entre el
hospedador y el parásito es una compleja
serie de interacciones entre la reacción
inmune del hospedador contra el
parásito; y la evasión de las defensas del
hospedador por el parásito.
La infección del hospedador intermediario
con E. granulosus se caracteriza por una
5
coexistencia prolongada entre parásito y
hospedador, sin un rechazo efectivo por
este último.
El tratamiento de la hidatidosis se basa
mayoritariamente en la cirugía, a veces
combinado con la quimioterapia, pero la
cirugía es el único procedimiento eficaz;
aunque presenta un riesgo importante de
resiembra accidental de protoescólex en
el acto quirúrgico (pudiendo generar
infecciones secundarias).
Inmunodiagnóstico
El inmunodiagnóstico de la infección por E.
granulosus en huéspedes intermediarios o
definitivos, puede definirse como el empleo de
técnicas inmunológicas para medir de manera
indirecta la infección o exposición, por detección
específica de anticuerpos, complejos
inmunitarios, poblaciones de células o antígenos
de parásitos en líquidos corporales del huésped
(sangre, suero, saliva, orina, heces o material de
otro tipo), o en muestras de los propios parásitos.
(Craig, P.S. 1993)
Los métodos serológicos (detección de
anticuerpos) en los que se utilizan
preparados con antígenos de líquido
hidático se usan para: diagnóstico pre
quirúrgico así como tamizado de
poblaciones asintomática; seguimiento de
los pacientes posterior a la cirugía (para
la detección de infecciones secundarias);
detección, control y seguimiento de
pacientes con hidatidosis.
Los individuos con hidatidosis producen
niveles detectables de anticuerpos
específicos contra E. granulosus
permitiendo el inmunodiagnóstico de la
infección.
Existen diferentes técnicas para evaluar
la concentración de anticuerpos en
sueros sanguíneos, la selección de un
test en particular involucra considerar su
especificidad como su sensibilidad. El
diagnóstico de esta enfermedad puede
realizarse por una o por la combinación
de varias de estas técnicas:
- ELISA (“Enzime linked inmuno
sorbent assay”).
- IFI (Inmunofluorescencia).
- Inmunoelectroforesis/
inmunopresipitación.
- Aglutinación con latex.
En los últimos años el estudio por
ELISA de la respuesta de anticuerpos
específicos se ha centrado en el
análisis de los diferentes isotipos, en
la búsqueda del que presente la
mayor relevancia diagnóstica. Se
observa que los anticuerpos de los
isotipos IgG son los más relevantes,
aunque otros isotipos también se
expresan durante la infección.
El anticuerpo específico más
abundante en pacientes hidáticos es
6
el isotipo IgG, con niveles variables de
IgM e IgE (niveles de IgA son
generalmente muy bajos).
MATERIALES Y MÉTODOS
Técnica de ELISA
Para realizar esta técnica de
inmunodiagnóstico se requiere la
utilización de placas de ELISA, las cuales
cuentan con 96 pocillos (12 columnas y 8
filas).
Placa ELISA.
Para la preparación del antígeno se
extrajo quistes hidáticos de bovinos,
recolectados en las playas de faena. Se
utilizaron principalmente quistes fértiles
porque presentan protoescólex. Se
hicieron pooles de líquido hidático
proveniente de los quistes fértiles, la
solución obtenida se liofilizó y el
liofilizado se conservó a 4 ºC (antígeno
de líquido hidático bovino, Ag LHB).
La técnica consta de varias etapas:
1. Sensibilización: el antígeno de
naturaleza proteica (suspendido
en un buffer), se siembra en cada
uno de los pocillos de la placa de
ELISA. Se utiliza para este
procedimiento pipeta automática,
sembrando con 100 µl/ pocillos de
una solución de 20 µg Ag LHB/ ml
en PBS (buffer fosfato salino) la
solución que se forma al diluir es
incolora. La siembra con el
antígeno que se realiza,
corresponde a la patogenia
sospechada.
Luego de terminar de sembrar con
el antígeno se deja incubando
durante toda la noche en una
cámara húmeda a temperatura
ambiente, para que el antígeno se
adhiera a las paredes de la placa
de ELISA.
2. Bloqueo con una proteína inerte
para el sistema: luego de
descartar los sobrenadantes se
adicionan 200 µl de BSA (sero
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albúmina bovina) al 1 % en PBS
(PBS-BSA), para bloquear los
posibles sitios libres que hayan
quedado en la superficie plástica
de la placa de ELISA. El bloqueo
se realiza dispensando la proteína
con pipeta automática, y se deja
reposar en cámara húmeda hasta
el día siguiente. Luego se
descartan los sobrenadantes y se
procede al lavado de la placa por
tres veces, con 200 µl/ pocillos de
PBS con 0,05 % de Tween 20
(PBS-T) durante 3 minutos, y una
vez con PBS por 5 minutos.
3. Incubación: se seleccionaron cinco
sueros que estaban congelados
(recolectados de muestras de
sangre de pacientes confirmados
quirúrgicamente con hidatidosis).
Se rotularon de la siguiente
manera:
1- E 2056192
2- E 309190
3- E 575191
4- E 10191
5- E 26189
Se colocan en la centrifugadora
automática junto con un suero
normal.
Luego se realiza una dilución de
los cinco sueros elegidos en PBS
0,05 % de Tween 20 y 1 % de
BSA (PBS-T-BSA). Se
dispensaron 100 µl/ pocillos de la
solución diluida, habiendo una
relación directa de la cantidad de
anticuerpos con la absorbancia
(relación lineal). Se realiza la
misma dilución con un suero de un
paciente que no está infectado, y
se procede a sembrar la placa
ELISA con todos los sueros.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
14
A B Suero S1 S S3 S S5 S(+)
8
2 4
B L Normal
C A
D N
E C S1 S2
S3 S4
S5 S(+)
F O
J
H
Esquema de la placa ELISA con la ubicación de los
sueros.
La primera columna se deja en blanco
como testigo, se divide la placa al medio
y se colocan los sueros con las diferentes
diluciones por duplicado.
En la segunda columna se coloca el
suero de un paciente no infectado (de
control).
En la tercera columna, el suero nº 1.
En la cuarta columna el suero nº 2.
En la quinta columna el suero nº 3.
En la sexta columna el suero nº 4.
En la séptima columna el suero nº 5.
En la octava columna se coloca un suero
positivo (más nuevo y comercial), las
diluciones en esta columna se hicieron a
la mitad de la concentración, todas
iguales.
Se deja incubar en cámara húmeda
durante toda la noche.
Se realiza un lavado de la misma manera
que se describió anteriormente.
4. Conjugado: se adicionan 100 µl/ pocillos
de una dilución apropiada del conjugado
enzimático en toda la placa de ELISA.
Los anti- anticuerpos fueron preparados
en otro animal (por ejemplo conejo), y
específico para inmunoglobulinas
humanas.
Se deja a temperatura ambiente por una
hora en la cámara húmeda y luego se
refrigeran hasta el día siguiente.
Se procede al lavado.
5. Sustrato: se agrega 200 µl del sustrato
MBTH – DMAB (3 – metil2 –
bezotiazolianona hidrazona clorhidrato
ácido dimetilamino benzoico) y peróxido
de hidrógeno sobre el cual actúa la
enzima (peroxidasa). Se deja agitando
por 20 minutos en un agitador para que la
enzima actúe sobre el sustrato, dando
una coloración en los tonos de lila.
Luego se introduce la placa en un lector
de placa de ELISA, para que lea la
coloración. Se lee a 620 nm
seleccionando un filtro en modo
absorbancia.
9
RESULTADOS
A
medida que se diluyen los anticuerpos se
visualizan una menor coloración de
absorbancia. Se observa una coloración
lila intensa en los pocillos que tienen una
mayor concentración de anticuerpos.
Lectura de la absorbancia
CONCLUSIONES
10
Es una metodología ampliamente
utilizada para el diagnóstico, también se
la emplea para el control de efectividad
de las vacunas.
Es una técnica que permite realizar el
inmunodiagnóstico de una gran cantidad
de muestras al mismo tiempo y con
mayor rapidez.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a Gabriela Ferragut, Mag.
en Química, docente del Laboratorio de
Inmunología “Dr. Alberto Nieto” de
Regional Norte, por permitirnos realizar la
pasantía bajo su tutela y brindarnos
información sobre el tema que
desarrollamos en este informe.
Al docente de Biología y profesor de la
pasantía, Darío Dalmas por guiarnos y
aconsejarnos para la realización del
mismo.
BIBLIOGRAFÍA
Barnes, R.; “Zoología de
invertebrados”.
Trabajo de tesis de Magister en
Química, Gabriela Ferragut Astol.
http://bvs1.panaftosa.org.br/local/
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