iqb201 – bioquímica básica i sequenciamento de proteínas joab trajano silva instituto de...
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IQB201 – Bioquímica Básica I
Sequenciamento de Proteínas
Joab Trajano SilvaInstituto de Química/UFRJ
Sequenciamento de Proteínas
A sequencia de aminoácidos de uma proteína pode ser determinada pelo sequenciamento de Edman, a partir da determinação da ordem dos aminoácidos na cadeia peptídica, ou inferida a partir da sequencia de DNA do gene.
• Determinar o número e tipos de subunidades presentes na proteína
• Clivar as pontes de enxofre (se houver)
• Purificar cada uma das subunidades
• Determinar a composição de aminoácidos de cada subunidade
• Determinar o resíduo N-terminal
Preparo da Proteína para o Sequenciamento
I. Redução das Pontes Dissulfeto
II. Composição de Aminoácidos da Proteína
I ndividual Amino Acids24 h
110o
Seal
Protein6N HCl
N2
Ala + Asp + Ser*110°, 24h6N HCle.g. AlaAspSer
II. Composição de Aminoácidos da Proteína
H H
: :
H 3 N CH
R 1
C NH
O
CH
R 2COO
H 3 N CH
R 1
C NH
O
CH
R 2COO
H3N CH
R 1
COO–
H3N CH
R 2
COO–
H H
C NH
O
HH
+
+
+ _
_+
O H+O
H+
• Completa destruição de Trp
• Perda parcial de Ser, Thr e Tyr
• Não destingue Glu de Gln e Asp de Asn
R 1
H 3 N
C
C
N
C
C
N
C
C
O CH 2 H O
R 2OH
C
O NH 2
+
Asn
(also hydrolysis of peptide bonds)
H+
NH C
H
NH C
CH 3
NH C
CH 3
OO O
H B
D-amino acidL-amino acid
_
base + :BH
CC
CH3
C
B:
A hidrólise alcalina é realizada em NaOH a 100°C por 4-8h
•Decomposição de Cys, Ser e Thr
•Desaminação e racemização de outros aminoácidos
•Permite a quantificação de Trp
Hidrólise Alcalina
Determinação do Resíduo N-terminal
Análise do N-terminal (Edman)
C-terminal Análise por Carboxipeptidase
A F V MG
C C
OH
CH2OH
H
NH3N C C
H O
CH3 CH2CH2SCH3
H O
CC ON
H
C C
OH
H
N
H
C C
OH
CH(CH3)2
N
HH
N
CH2
H O
CC
C CO
OH
H
N
CH2CH2SCH3
H O
COCNH3
H3
+
S
G
M
Carboxypeptidase
C C
OH
CH2OH
H
NH3N C C
H O
CH3
C CO
OH
H
N
H
C C
OH
CH(CH3)2
N
HH
N
CH2
H O
CC
Carboxypeptidase
C C
OH
CH2OH
H
NH3N C C
H O
CH3
C CO
OH
CH(CH3)2
N
HH
N
CH2
H O
CC +
Separação dos aminoácidos por HPLC
10 min
20 min
30 min
40 min
S G A V M F
S A V M FG
Leucina aminopeptidase: Análise do N-terminal
A F V MG
C C
OH
CH2OH
H
NH3N C C
H O
CH3 CH2CH2SCH3
H O
CC ON
H
C C
OH
H
N
H
C C
OH
CH(CH3)2
N
HH
N
CH2
H O
CC
S
A (first aa released) F V GS
Leucineaminopeptidase, 10 min
Leucineaminopeptidase, 10 more min
F VS (2nd aa released) G
+
M
C C
OH
CH2OH
N
CH2CH2SCH3
H O
CC ON
H
C C
OH
H
N
H
C C
OH
CH(CH3)2
N
HH
N
CH2
H O
CCH3N C CO
H O
CH3
H3
C CO
OH
CH2OH
N
M
CH2CH2SCH3
H O
CC ON
H
C C
OH
H
N
H
C C
OH
CH(CH3)2
N
H
N
CH2
H O
CCH3 H3+
Separação dos Aminoácidos Liberados
S G A V M F
S G A V M F
10 min
20 min
30 min
40 min
Sequenciamento da Cadeia Polipeptídica
• Fragmentar a cadeia polipeptídica em locais específicos de modo a gerar peptídeos pequenos o suficiente para serem sequenciados diretamente
• Purificar cada fragmento
• Determinar a sequencia de aminoácidos de cada fragmento purificado
• Repetir as etapas anteriores usando peptídeos obtidos a partir do uso de outro método de clivagem