isolamento degli acidi nucleici avvertenze: utilizzare tessuti freschi o correttamente conservati la...
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ISOLAMENTO degli ACIDI NUCLEICI
AVVERTENZE:
Utilizzare tessuti freschi o correttamente conservati
La QUALITA’ del materiale di partenza influenza la qualità e la resa del DNA isolato
Evitare di agitare fortemente o di pipettare
Molecole grandi di DNA sono facilmente danneggiate dalle forze frizionali
Lavorare in sterilità per prevenire contaminazioni da nucleasi
Autoclavare soluzioni e strumenti
Aggiungere alle soluzioni EDTA per chelare gli ioni Mg2+ necessari per l’attività delle DNasi
Trattare materiali e soluzioni con DEPC per inibire le RNasi
...ISOLAMENTO degli ACIDI NUCLEICI
Rottura dei tessuti (mortaio e pestello, omogeneizzatori…)
Digestione enzimatica della parete cellulare e lisi della membrana plasmatica
Trattamenti con RNasi e DNasi
Deproteinizzazione mediante soluzioni acquose di fenolo/cloroformio
Le proteine denaturate rimangono all’interfaccia fra la fase organica e quella acquosa
Precipitazione con etanolo o isopropanolo
Conservazione a -20°C/-80°C in un tampone contenente EDTA
Il DNA è soggetto a idrolisi acida se conservato in acqua
PROCEDURA:
CARATTERIZZAZIONE SPETTROFOTOMETRICA
CONCENTRAZIONE:
A260 = 1 OD
A260 = 1 OD
[DNA]= 50 g/ml
[RNA]= 40 g/ml
Misurazione dell’assorbimento a 260 nm
PUREZZA:
Rapporto A260/A280
A260/A280 = 1.7/1.9 (DNA)
A260/A280 = 1.9/2.1 (RNA)
Le misure spettrofotometriche non differenziano fra DNA ed RNA
Il fenolo ha un massimo di assorbimento a 270-275 nm
CONTROLLO INTEGRITA’ e TAGLIA
Elettroforesi su gel di agarosio
1 2 3 4 5
28 S26 S
18 S
25 S23 S18 S16 S
M 1 2 3 4 5 6 7 8 M Kb
97.0
48.5
M: Markers1: Sangue2: Cellule HeLa3: Cellule CHO4: E. coli5: B. subtilis6: Coda di topo7: Fegato8: SS. cerevisiae
1: Topo2: Uomo3: Lievito4: Batterio5: Pianta
Solo gli mRNA possiedono code di poli(A) lunghe 30-150 residui.Le sequenze di oligo(dT) sono immobilizzate su supporti solidi, generalmente di cellulosa.
L’RNA viene denaturato e quindi applicato alla colonna in una soluzione salina concentrata (NaCl 0.5 M).
Si effettuano molti lavaggi con una soluzione salina meno concentrata (NaCl 100 mM) per rendere più selettivo il legame tra RNA e oligo(dT).
Aggiungendo una soluzione di TRIDS/EDTA si recupera l’mRNA legato alla colonna.
AAA
AAA
AAAA
RNA cellulare totale
TTT
TTTTT
Oligo dT-cellulosa
.. ...
AAA
AAAA
...
TTT
TTTTT
....
.. ...
AAA
AAA
AAAA
AAAAAAAA
AAAAAA
NaCl 100 mM
L’mRNA con poli(A) si ibrida con l’oligo(dT)
TRIS 10 mMEDTA 1 mM
Viene eluito l’mRNA
L’rRNA ed il tRNA vengono eluiti
ISOLAMENTO mRNA
STRUTTURA degli ACIDI NUCLEICI
ANALISI FISICA
Effetto ipercromico:Aumento dell’A260nm durante il processo di denaturazione del DNA.
Temperatura di melting (Tm):Temperatura in corrispondenza della quale il DNA è denaturato al 50%.
Maggiore è G+C, maggiore è Tm.
Gra
do d
i d
en
atu
razi
on
e
(%)
40 60 80 100
50
0
1.3
1.2
1.1
1.0
Temperatura (°C)
Assorb
an
za a
26
0 n
m
Tm
Curva di fusione
CINETICA di RINATURAZIONE
Effetto ipocromico:
Diminuzione dell’A260nm durante il processo di rinaturazione del DNA.
Parametri che influenzano la rinaturazione:
1) C0 Concentrazione espressa in nucleotidi/unità di volume
2) Tempo
La misura della velocità di rinaturazione può fornire utili informazioni circa la complessità del DNA
Log CotR
inatu
razi
on
e (
%)
DNA arinaturazionerapida
0
50
100
-2 -1 0 1 2 3 4 5
Curva C0t
DNA arinaturazionelenta
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
Ha reso possibile il CLONAGGIO dei GENI permettendo di
ISOLARE
AMPLIFICARE frammenti di DNA
SEQUENZIARE
Perché manipolare i geni?
1) Per facilitare lo studio dell’espressione genica e della regolazione fisiologica;
2) per identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la sovraespressione;
3) per studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine;
4) per identificare componenti cellulari che interagiscono con particolari sequenze di acidi nucleici o con particolari domini proteici
PROCEDURA di CLONAGGIO
ISOLAMENTO del gene
INSERZIONE del gene in un VETTORE PLASMIDICO
INTRODUZIONE del vettore plasmidico IN CELLULE VIVENTI per propagarlo
Le fasi più delicate sono quelle del taglio e dell’unione di sequenze di DNA in modo preciso….…..tutto ciò si ottiene con l’ausilio di ENZIMI
ENDONUCLEASI di RESTRIZIONE
Si distinguono in due classi:
Enzimi di CLASSE ITagliano il DNA in siti adiacenti alla sequenza riconosciuta
Enzimi di CLASSE IITagliano il DNA all’interno della sequenza riconosciuta
Sono enzimi che tagliano entrambi i filamenti della doppia elica del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze.
Riconoscono SEQUENZE PALINDROMICHE di 4 o 6 nucleotidi5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’Entrambe le catene hanno la stessa sequenza se lette in direzione 5’3’
...ENDONUCLEASI di RESTRIZIONEPossono lasciare estremità:
TRONCHE (o blunt) se il taglio cade al centro della sequenza riconosciuta
SPORGENTI (o 5’/3’ protruding) dette anche ADESIVE (o sticky) se il taglio avviene a posizioni sfalsate sui due filamenti
5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’HpaI
5’-GTT AAC-3’3’-CAA TTG-5’
5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHI
5’-G GATCC-3’3’-CCTAG G-5’
MAPPATURA di RESTRIZIONE
E’ il processo di determinazione delle posizioni dei siti di taglio
delle endonucleasi di restrizione all’interno di un pezzo di DNA.
IMPIEGHI COMUNI:
Distinzione di molecole di DNA della stessa lunghezza, ma con sequenze diverse senza doverle sequenziare.
Individuazione di mutazioni geniche responsabili di malattie genetiche.
Identificazione di un frammento di interesse da un digerito in base al suo peso molecolare.
...MAPPATURA di RESTRIZIONE
62 1
A B
TRATTAMENTO DIMENSIONE deiFRAMMENTI (Kb)
INTERPRETAZIONE
Nessuna digestione
Enzima A
Enzima B
Enzima A+ B
9
A
2 7
A
3 6
B
A
36
B
4 3
A B
2
9
2 + 7
3 + 6
2 + 3 + 4
1 + 2 + 6
M Markers 7 SstI/NcoI1 pBlueStar 8 HinDIII2 XbaI/SstI9 NcoI/HinDIII3 XbaI 10 NcoI 4 BamHI/XbaI 11 NdeI/NcoI5 NcoI/XbaI 12 BamHI/NcoI6 NcoI
IDENTIFICAZIONE del FRAMMENTO di INTERESSE mediante Southern blotting
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
OH
OH P
P
OH
OHP
P
DNA LIGASI
Forma legami covalenti fra il gruppo fosfato 5’ di una estremità ed il gruppo ossidrilico 3’ della catena adiacente.
L’enzima comunemente utilizzato è la T4 DNA Ligasi perché stabile e poco costosa.
CARATTERISTICHE DELLA REAZIONE:
Presenza di ATP
10° C o.n. oppure temperatura ambiente, poche ore
OH
POH
P
BamHI
5’-G GATCC-3’3’-CCTAG G-5’
OH
P OH
P
EcoRI
5’-G AATTC-3’3’-CTTAA G-5’
La bassa temperatura è consigliata in quanto, diminuendo l’energia cinetica delle molecole, riduce la possibilità che le estremità appaiate si separino prima di venir stabilizzate dalla ligazione.
DNA LIGASI
OH
OH P
P
OH
OH
P
P
OH
OH P
P
OH
OHP
P
FOSFATASI ALCALINA
OH
POH
P
BamHI
5’-G GATCC-3’3’-CCTAG G-5’
HpaI
5’-GTT AAC-3’3’-CAA TTG-5’
OH
P OH
P
OH
OH
Blunt ends ligationoppure trattamento conTransferasi terminale
OH
OH
Sticky ends ligation
OH
OH P
P
+ dATP
OH
OH+ dTTP
AAA P
P AAA
TTT
TTT
Sticky ends ligation
DNA LIGASI
OH
OH P
POH
OHP
P
OH
OHP
P OH
P
P
OH
NUCLEASI S1
blunt ends ligationoppure
legame con un linker
BamHI
5’-G GATCC-3’3’-CCTAG G-5’
-GGAATTCC CCTTAAGG-
P
P
EcoRI
5’-G AATTC-3’3’-CTTAA G-5’
OH
OHP
P +OH
POH
P
EcoRI
digestione
OH
OH P
P
sticky ends ligation
PLASMIDI
Per essere un buon vettore di clonaggio, un plasmide deve avere:
Dimensioni contenute
Un sito di origine della replicazione di tipo batterico controllato in maniera “rilassata” o “stringente”
Due geni che conferiscono resistenza a due antibiotici
Siti unici di restrizione
Piccole molecole di DNA batterico extracromosomico, circolare.
In natura conferiscono vantaggi selettivi ai ceppi che li contengono.
Ingegnerizzati per l’uso di laboratorio.
TRASFORMAZIONE delle CELLULE BATTTERICHE
Solo le cellule che hanno incorporato il plasmide formeranno delle colonie.
METODO CHIMICO METODO ELETTRICO
SHOCK TERMICO
Le cellule sono rese COMPETENTI mediante:
trattamento a freddo con glicerolotrattamento a freddo con ioni Ca2+
Il DNA viene incorporato mediante:
IMPULSO di CORRENTE ELETTRICA
PIASTRAMENTO SU TERRENO SELETTIVO
INATTIVAZIONE INSERZIONALE
Quelle che hanno incorporato il plasmide con l’inserto possono essere individuate grazie alla perdita di una
funzione metabolica
ANALISI dei PLASMIDI RICOMBINANTI
PIASTRAMENTO PER REPLICA
Crescono solo le cellule contenenti il
plasmide privo dell’inserto
Colonie sviluppatesi su terreno contenente
ampicillina
Piastra con terreno contenente tetraciclina
Recupero delle colonie contenenti il plasmide
ricombinante dalle piastre con ampicillina
Tampone di velluto Pistramento per replica
Incubazione
…ANALISI dei PLASMIDI RICOMBINANTI
SCREENING BLU/BIANCO
pcslacZgene che codifica per la -galattosidasiinterrotto dal sito di clonaggio multiplo (pcs)
L’enzima -galattosidasi è in grado di metabolizzare il substrato incolore X-Gal formando un composto di colore blu.
Un ceppo batterico lac-, trasformato con il plasmide ricombinante pUC19, è in grado di metabolizzare il substrato X-Gal solo se il plasmide è privo dell’inserto e forma colonie di colore blu.
Piastra con terreno contenente X-Gal
Colonie di batteri lac- che contengono plasmidi ricombinanti
Colonie di batteri lac+ che contengono plasmidi senza inserto
Curva di crescita di E. coli
INTERVALLO (Lag phase)
I batteri vengono diluiti nella coltura iniziale; la divisione procede lentamente in quanto le cellule si stanno adattando al terreno fresco.
FASE LOGARITMICA
4 - 5 ore
I batteri crescono esponenzialmente.
10 - 11 ore
FASE STAZIONARIA
La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente.
Tempo (h)D
ensi
tà c
ellu
lare
(O
D6
00)
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0 5 10 15 20
PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO
LISI ALCALINA
1. RISOSPENSIONE
E. coli
2. LISI
NaOH / SDS
RNasi
DNA cromosomico
DNA plasmidico
Centrifugazione
3. NEUTRALIZZAZIONE
KAc
Precipitato contenente DNA genomico, proteine, detriti cellulari
Supernatante contenente il DNA plasmidico
DNA cromosomico DNA plasmidico
Bromuro d’etidio Bromuro d’etidio
Svolgimento della doppia elica e diminuzione della densità
idrodinamica
Svolgimento della doppia elica compensato dall’introduzione di
supereliche
...PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO
ULTRACENTRIFUGAZIONE in gradiente di densita’ di CsCl in presenza di EtBr
Il superavvolgimento indotto nel DNA plasmidico dall’intercalazione del bromuro d’etidio fra le basi ne impedisce progressivamente il legame
rendendo la densità idrodinamica del DNA plasmidico maggiore di quella del DNA cromosomico.
VETTORI di ESPRESSIONE
OTTENERE NUMEROSE COPIE IDENTICHE di un certo frammento di
DNA
CLONARE
MA,
CLONARE IN UN VETTORE DI ESPRESSIONE
OTTENERE DISCRETE QUANTITÀ del PRODOTTO PROTEICO codificato dal gene di interesse
INSULINAORMONE DELLA CRESCITA UMANO
INTERFERONI sono solo pochi esempi di proteine
commercializzate prodotte da batteri
...VETTORI di ESPRESSIONE
PROPRIETA’:
SEQUENZA PROMOTRICE
SEQUENZA SHINE-DALGARNO a monte di uno o più siti di inserzione del DNA estraneo
Oltre alle normali caratteristiche di un vettore di clonaggio, un vettore per l’espressione di geni in cellule batteriche
DEVE POSSEDERE:
AVVERTENZE:
UTILIZZARE il cDNA
CLONARE il cDNA nella CORRETTA CORNICE di LETTURA
CONSIDERAZIONI:
I batteri non sono in grado di eseguire modificazioni post-traduzionali
T7 RNApolimerasi
promotore T7
lac o
gene target
pET
T7 RNA polimerasi
gene lac I
repressore lac
lac o promotore lac
T7 gene 1
E. coli RNApolimerasi
DE3
genoma di E. coli
gene lac I
repressore lac
IPTG IPTG
CELLULA OSPITE
ESPRESSIONE di GENI ETEROLOGHI in sistemi batterici
Per esempio,
viene spesso
usato un sistema
che accoppia al
sistema lac di E.
coli una RNA
polimerasi di
batteriofago.
Alcuni ceppi ospite sono stati opportunamente ingegnerizzati per l’espressione regolata dei geni.
PLASMIDI per la TRASFORMAZIONE GENETICA delle PIANTE
Derivano da modificazioni del plasmide naturale Ti (Tumor inducing) del batterio del suolo A. tumefaciens che trasforma geneticamente le piante con un processo che rientra normalmente nel suo ciclo vitale.
Confine destro
Confine sinistro
Geni vir
Auxina
Citichinina
OpinaT-DNA
Plasmide Ti
ori
Catabolismo dell’opina
STRATEGIA:
Sostituire i geni che causano il tumore con il gene di interesse, lasciando intatti i confini dx e sx necessari all’integrazione del DNA nel genoma della pianta.
Introdurre nel plasmidio:
un gene marcatore selezionabile, sia vegetale che batterico;
un’origine di replicazione che consenta al plasmidio di duplicarsi in E. coli ;
un sito di clonaggio multiplo compreso fra i confini dx e sx.
...PLASMIDI per la TRASFORMAZIONE GENETICA delle PIANTE
SISTEMA VETTORE BINARIO SISTEMA VETTORE COINTEGRATO
Un plasmide Ti modificato
contenuto in A. tumefaciens reca i
geni vir, indispensabili all’integrazione
del DNA compreso fra i confini dx e sx
nel genoma della pianta.
Confine destro
Gene bersaglio
Gene marcatore selezionabile
vegetale
E. coli ori
Gene marcatore per E. coli e A. tumefaciens
Confine sinistro
A. tumefaciens ori
Geni vir
Vettore cointegrat
o
Plasmide Ti
disarmato
Sequenza DNA omologaRICOMBINAZIONE
Confine destro
Confine sinistro
A. tumefaciens
ori
Gene bersaglioGene marcatore selezionabile vegetale
E. coli ori
Gene marcatore per E. coli e A. tumefaciens
Vettore binario
TRASFORMAZIONE GENETICA delle PIANTE
Il nuovo plasmide entra nelle cellule dal bordo del
ritaglio
Dischetti di foglie poste su una sospensione di cellule di Agrobacterium
Dischetti di foglie cresciute su un terreno nutriente selettivo; solo le cellule trasformate si moltiplicano
Vengono riprodotte intere piante contenenti il gene introdotto
Trasformazione mediata da A. tumefaciens
➺➺
➺➺
➺➺
➺
Bombardamento con microproiettili
Microproiettili di oro o tungsteno rivestiti di DNA plasmidico
Elettroporazione
Alto voltaggio
protoplasti
OLTRE AI PLASMIDI...
I plasmidi sono i vettori di elezione per clonare piccoli frammenti di DNA (5-10 Kb).
INFATTI,
Plasmidi di grandi dimensioni sono instabili e possono andare incontro a delezioni spontanee.
La trasformazione non avviene efficentemente.
Per clonare frammenti più grandi si impiegano come vettori del DNA dei batteriofagi (virus batterici)che consentono di iniettare grosse molecole di DNA nelle cellule batteriche per infezione.
QUINDI,
VETTORI FAGICI
VETTORI COSMIDICI
DNA VIRALE come VETTORE DI CLONAGGIO
Regione non essenziale (circa
20 Kb)
Eliminazione del DNA non essenziale
DNA da clonare
DNA ricombinante
Teste e code del
virus
Assemblaggio in vitro delle
particelle virali
Il DNA virale entra nelle cellule, viene replicato e dirige la sintesi delle proteine virali. La lisi delle cellule rilascia le nuove particelle virali assemblate Recupero delle particelle virali e
isolamento del DNA clonato
Infezione dei batteri
DNA virale
Un vettore comunemente utilizzato è il batteriofago , lungo 49 Kb.
COSMIDI
Sono PLASMIDI, ma contengono, oltre alle caratteristiche essenziali di un plasmide, anche un
SITO COS
La presenza di questo elemento è determinante per consentire
l’inserimento della molecola di DNA ricombinante nella testa del
virus che, a sua volta, la inietta in una cellula batterica per
infezione.
IMPACCHETTAMENTO del DNA VIRALE
Il DNA virale a doppia elica entra nelle cellule batteriche durante l’infezione come molecola lineare
Estremità coesive Estremità
coesive All’interno della cellula,
le estremità si appaiano originando una molecola di DNA
circolare
Sito cos
Concatameri di copie di DNA virale
Cicli ripetuti di replicazione con il
meccanismo del cerchio rotante
Il DNA codifica per le proteine della testa e della coda del virus
Il DNA viene inserito nelle teste del virus e tagliato a livello del sito cos
Sono aggiunte le
code Particella virale infettiva.I virus sono rilasciati per lisi delle cellule e possono infettare altre cellule batteriche.
5’•
VETTORI COSMIDICI
DNA da clonare
Sito cos
Gene per la resistenza
all’antibiotico Sito di restrizione
Taglio del plasmide e del DNA da clonare con lo stesso enzima di
restrizione
Ligasi (i frammenti sono inseriti a caso fra due
cosmidi)
Impacchettamento in vitro solo se la distanza fra i due siti cos è compresa
fra 37 e 52 Kb
Infezione di E. coli con i fagi e selezione delle colonie resistenti all’antibiotico
Batterio
Il DNA ricircolarizza attraverso i siti cos e viene replicato all’interno del batterio come un plasmide
ori
COSTRUZIONE BIBLIOTECHE GENOMICHE
PROCEDURA:
Isolamento del DNA genomico
Frammenti di 10-40 Kb
Restrizione parziale con un enzima che riconosca sequenze tetranucleotidiche
Clonaggio in un vettore
Bisogna produrre un numero discreto di cloni per far sì che ogni singolo gene sia presente almeno in un clone.
Per il clonaggio di frammenti di centinaia di migliaia di basi si utilizzano come vettori i cromosomi artificiali di lievito.
CROMOSOMI ARTIFICIALI di LIEVITO
Caratteristiche dei plasmidi:
Centromero
Sequenze telomeriche
Origine di replicazione autonoma
Geni marcatori di selezione
Siti di clonaggio
COSTRUZIONE BIBLIOTECHE di cDNA
PROCEDURA:
Isolamento RNA messaggero
Clonaggio in un vettore
AAA
AAA
AAAA
AAA
AAAA
AAA
AAA
AAAA
Sintesi DNA complementare Trascrittasi inversa
Questo tipo di biblioteche sono particolarmente utili per l’espressione dei geni tessuto-specifici.
AAAAA-3’
7-mG
TTTT-5’
AAAAA-3’mRNA 7-mG
Oligo (dT)TTTTT
AAAAA-3’7-mGTTTT-5’
OHTrascrittasi inversa
dATP, dCTP, dTTP, dGTP
AAAAA-3’7-mGTTTT-5’
OH-3’
AAAAA-3’7-mGTTTT-5’
OH-3’
AAAAA-3’7-mGTTTT-5’
AAAAA-3’7-mGTTTT-5’
Frammento di KlenowdATP, dCTP, dTTP, dGTP
TTTT-5’TTTT-5’
Rnasi HNucleasi S1
cDNA completo cDNA incompleto
SINTESI cDNA
SCREENING mediante IBRIDIZZAZIONE SU PLACCA
Placche di lisi
Punti di riferimento per l’orientazione della replica al termine dell’esperimento
•• •
•
• •Replica su filtri di nitrocellulosa(conservare le piastre originali)
Denaturazione, neutralizzazione elegame
del DNA al filtro
•
• •
Ibridizzazione con sonda marcata e lavaggio della sonda non legata
32P
32P
•
• •
32P32P 32P
32P
Sonda non legata
Sonda ibridizzata
•
• •Autoradiografia
Autoradiogramma che mostra la posizione delle
sonde ibridizzate
Recupero delle placche positive dalla piastra
originale
SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE
Una sonda è un filamento di DNA complementare a quello che si vuole isolare dalla biblioteca.
STRATEGIE DI SINTESI:
E’ nota la sequenza amminoacidica della proteina codificata dal gene
Si sintetizzano chimicamente le sequenze nucleotidiche (degenerate) più appropriate
osi amplifica un frammento del gene di interesse mediante
PCR
E’ nota la sequenza nucleotidica del gene di
interesse
CASO 1: CASO 2:
Si predice la sequenza nucleotidica che dovrebbe codificare per quella proteina
Nello screening di una libreria genica il cDNA può essere utilizzato come sonda per l’isolamento del corrispondente gene.
MARCATURA delle SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE
RANDOM PRIMING Metodo dell’innesco casuale
NICK TRANSLATIONSpostamento dell’incisione
3’- -5’
-3’3’- -5’5’-
DNA
denaturazione
aggiunta di inneschi esanucleotidici3’-GCATGC-5’
5’-TGCAGT-3’
5’-GCATAC-3’
3’-TAGCAG-5’
ibridizzazazione
-3’5’-3’-TAGCAG-5’3’-TAGCAG-5’
-5’3’-
5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’
Frammento di Klenow,dNTP
dATP32P-dCTP
dTTPdGTP Sintesi DNA
-3’5’-3’-TAGCAG-5’
-5’3’-
5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’
3’-TAGCAG-5’
DNA sonda
marcato
denaturazione
riempimento del buco prodotto con un nucleotide radioattivo e rimozione del
nucleotide successivo
-3’3’- -5’5’-
DNAG C G C A A G
C G C G T T C
-3’3’- -5’5’- G G C A A G
C G C G T T C
-3’
3’- -5’5’- G C C A A G
C G C G T T C
-3’3’- -5’5’- G C G A A G
C G C G T T C
-3’3’- -5’5’- G C G C A G
C G C G T T C
32P-dCTP
32P-dCTP
dGTP il taglio si muove in direzione 5’-3’
taglio di un’elica e rimozione di un nucleotide
mediante la DNA polimerasi I
Pol I