isolasi dan identifikasi senyawa golongan fenol...

Seminar Nasional Sains dan Teknologi (Senastek),Denpasar Bali 2014

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN FENOL

DARI KULIT BUAH TAMARILLO (Solanum betaceum Cav.) YANG

AKTIF SEBAGAI ANTIOKSIDAN

Ida Ayu Raka Astiti Asih11) Ni Made Puspawati21) Wiwik Susanah Rita31) Ni Luh Putu

Devi Sintia Dewi1) 1Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Udayana

Jl. Kampus Unud Bukit Jimbaran, Badung – Bali

Telp: 0361701954 ext.255

[email protected]

Abstrak

Buah tamarillo (Solanum betaceum Cav.) merupakan buah yang kaya akan nutrisi dan dipercaya

memiliki aktivitas antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan kandungan total fenol dan

mengidentifikasi senyawa golongan fenol yang aktif sebagai antioksidan. Kandungan total fenol

dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu dan uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH

(difenilpikril hidrazil). Identifikasi senyawa aktif menggunakan teknik spektrofotometer UV-Vis dan

FTIR. Maserasi 1210g kulit buah tamarillo dengan etanol 70% menghasilkan 126,17g ekstrak pekat

etanol. Partisi 50g ekstrak kasar menghasilkan 0,2791g ekstrak n-heksan, 0,2841g ekstrak kloroform, dan

5,2277g ekstrak n-butanol. Ekstrak n-butanol dengan total fenol yang tinggi sebesar 3,37 mg/g eq asam

galat (GAE)/g menunjukkan aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 68,14 mg/L. Pemisahan dan

pemurnian ekstrak n-butanol dengan kromatografi kolom menggunakan fase gerak n-butanol: etil asetat:

asam asetat 10% (2:7:1) menghasilkan enam fraksi (A, B, C, D, E, F). Identifikasi fraksi E yang positif

fenol dan flavonoid dengan spektrofotometri FTIR menunjukkan isolat memiliki gugus karakteristik OH

terikat, C-H aromatik, C=C aromatik, C=O, C-O, dan C-H alifatik. Analisis spektrofotometri UV-Vis

menunjukkan isolat memiliki dua pita serapan maksimum pada panjang gelombang 327,20 (pita I) dan

panjang gelombang 245,40 (pita II) yang diduga mengindikasikan rentangan serapan senyawa flavonoid

golongan isoflavon dengan letak substituen OH pada posisi C-6, C-7 atau C-7, C-8 dan posisi C-3’, C-4’

setelah ditambah pereaksi geser.

Kata kunci : Tamarillo (Solanum betaceum Cav.), total fenol, aktivitas antioksidan,

isoflavon

Abstract

Tamarillo fruits (Solanum betaceum Cav.) are rich in nutrients that are believed to have an

antioxidant activity. This research aims to determine phenolic content and to identify invitro antioxidant

active compounds in Tamarillo fruits extracts. The total phenolic content was measured using Folin-

Ciocalteu method and invitro antioxidant activity was determined using DPPH (diphenilpikril hidrazil)

method. Identification of active compounds was conducted by using UV-Vis and FTIR

spectrophotometer. Maceration of 1.210g Tamarillo fruit peels with 70% ethanol produced 126.17g crude

ethanol extract. Partition of 50g crude ethanol gave 0.2791g n-hexane, 0.2841g chloroform, and 5.2277g

n-buthanol extracts respectively. The highest total phenolic content was found in n-buthanol extract with

value 3.37 mg gallic acid equivalent (GAE)/g and it also showed the lowest IC50 of 68.14 mg/L indicating

the most potent antioxidant activity. Separation and purification of of n-buthanol active extract was done

using silica gel column chromatography with n-buthanol: ethyl acetate: 10% acetic acid (2:7:1) as mobile

phase and six fractions (A, B, C, D, E, F) were obtained. The active fraction E which was positive

phenolic compounds of flavonoid on phytochemical testing was further identified using UV-Vis and

FTIR spectrophotometer. FTIR spectra indicated that the active isolate E has the functional characteristic

group of O-H bonded, CH aromatic, C=C aromatic, C=O, C-O and CH aliphatic while UV-Vis spectra

gave two peaks at wavelengths 327.20 nm for band I and 245.40 for band II suggested that the active

antioxidant compounds was isoflavone with hydroxyl groups attached at C-6, C-7 or C-7, C-8 and C-3’,

C-4’ positions.

Keyword : Tamarillo (Solanum betaceum Cav.), total phenolic, invitro antioxidant activity, isoflavone

mailto:[email protected]

1. PENDAHULUAN

Radikal bebas dewasa ini merupakan penyebab utama terhadap munculnya berbagai macam

penyakit kronis dan akut. Banyaknya polusi, radiasi ultraviolet, stress, rokok, diet tidak sehat,

makanan berlemak tinggi, bahan makanan tambahan, dan faktor-faktor lainnya, tanpa disadari

menyebabkan peningkatan produksi radikal bebas (Bast et al,1991). Radikal bebas merupakan

molekul yang bersifat tidak stabil dikarenakan memiliki satu atau lebih elektron tidak berpasangan

pada orbital luarnya, sehingga sangat reaktif dan berbahaya bagi manusia. Masyarakat sebagian

besar tidak menyadari akan keberadaan dan pengaruh radikal bebas terhadap kesehatan tubuh

mereka sehingga untuk melindunginya dari ancaman radikal bebas diperlukan suatu antioksidan

alami yang teruji aman.

Antioksidan merupakan senyawa yang berfungsi sebagai penyumbang elektron (donor) untuk

melengkapi kekurangan elektron dari radikal bebas sehingga dapat menghambat reaksi oksidasi

pembentukan senyawa radikal yang dapat menyebabkan stres oksidatif (Prakash A, 2001). Salah

satu produk alam yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber antioksidan alami adalah buah tamarillo

(Solanum betaceum Cav.). Tamarillo (Solanum betaceum Cav.) atau sering disebut dengan terong

belanda merupakan buah yang kaya akan khasiat dan manfaat. Menurut Sinaga (2009), daging dan

biji buah tamarillo mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, glikosida, serta

steroid/triterpenoid yang dapat berfungsi sebagai antioksidan.

Berdasarkan uji pendahuluan, ekstrak etanol kulit buah tamarillo positif mengandung senyawa

fenolik yang menghasilkan perubahan warna menjadi hitam pekat. Menurut Mertz et al (2009),

kandungan fenolik yang terdapat pada buah tamarillo berkisar antara 308-570 mg per 100 g sampel.

Hal ini juga didukung oleh hasil penelitian Siti Hawa dan Mohd Fadzelly (2012) yang

menunjukkan bahwa kulit buah tamarillo mengandung total fenol yang tinggi dengan nilai sebesar

4,89 ± 0,04 mg/g eq asam galat (GAE)/g.

Senyawa golongan fenol diketahui sangat berperan penting pada aktivitas antioksidan.

Semakin besar kandungan senyawa golongan fenolnya maka semakin besar aktivitas

antioksidannya (Shahwar et al, 2010). Berdasarkan latar belakang di atas, maka dilakukan

penelitian untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa golongan fenol dari kulit buah

tamarillo (Solanum betaceum Cav.) yang aktif sebagai antioksidan.

2. BAHAN DAN METODE

2.1 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah tamarillo (Solanum betaceum Cav.) yang

masih segar dan sudah matang, etanol (CH3CH2OH) 98% dan 70%, etil asetat (EtOAc) p.a., n-

heksan (C6H14), kloroform (CHCl3), n-butanol (C4H9OH) p.a., kristal difenilpikril hidrazil (DPPH),

kalium bromida (KBr), akuades, silika gel GF254 dan silika gel 60, asam galat, reagen Folin-

Ciocalteu, natrium karbonat (Na2CO3) 5%. Alat-alat yang digunakan tediri dari toples kaca, chamber kromatografi, tabung reaksi, corong pisah, beker gelas, gelas ukur, neraca analitik, botol vial, ball filler,

aluminium foil, pipet volume, batang pengaduk, pipet kapiler, kertas saring, penguap vakum putar (rotatory

vacuum evaporator), spektrofotometri UV-Vis Double Beam Shimadzu/UV-1800, dan spektrofotometri

inframerah Shimadzu/IR Prestige-21.

2.2 Metode

Penyiapan sampel

Buah tamarillo (Solanum betaceum Cav.) segar dicuci bersih, kemudian dikupas dan diambil

bagian kulit buah. Kulit buah yang diperoleh ditimbang dan ditentukan kadar airnya dengan cara

dioven pada suhu 1500C selama 1 jam dan ditimbang kembali sampai berat sampel konstan. Kulit

buah sebanyak 1.210 g dihaluskan.

3

Ekstraksi dan partisi kulit tamarillo

Sampel halus kulit buah tamarillo dimaserasi dengan etanol dalam toples kaca dan dibiarkan

selama ± 24 jam. Proses maserasi dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. Filtrat yang sudah

terkumpul langsung diuapkan menggunakan rotary evaporator dan diperoleh 126,17 g ekstrak pekat

etanol kemudian dilarutkan ke dalam campuran etanol :air (7:3), dan diuapkan hingga tersisa

ekstrak air. Ektrak air lalu dipartisi bertahap dengan n-heksan, kloroform, dan n-butanol sebanyak

400 mL kemudian dipekatkan. Masing-masing ekstrak hasil partisi dan ekstrak kasar kemudian

diuji total fenol dan aktivitas antioksidan.

Penentuan kandungan total fenol

Kandungan total fenol pada kulit buah tamarillo ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu.

Sampel sebanyak 10 mg ditimbang dan dilarutkan dengan etanol 98% dalam labu ukur 10 mL

kemudian di kocok dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipipet 1,0 mL ditambahkan dengan reagen

folin sebanyak 0,8 mL dalam labu ukur 10 mL dan ditambahkan dengan Na2CO3 5% sampai tanda

batas. Campuran dikocok dan didiamkan selama 60 menit. Serapannya diukur pada 755,4 nm pada

spektrofotometer UV-Vis dengan pengulangan 2 kali. Hasilnya diplotkan terhadap kurva standar

asam galat 100 ppm (1, 2, dan 4 ppm) yang dipersiapkan dengan cara yang sama. Kandungan total

fenol dinyatakan sebagai mg/g eq asam galat

Uji aktivitas antioksidan menggunakan DPPH

Aktivitas antioksidan ditentukan menggunakan metode DPPH (dipenilpikril hidrazil). Sebanyak 10

mg sampel ditimbang dan dilarutkan dengan etanol 98% pada labu ukur 10 mL, dikocok dan

disaring sehingga diperoleh larutan induk 1000 ppm. Larutan induk diencerkan kembali untuk

membuat konsentrasi 10, 25, 50, 75, dan 100 ppm pada labu ukur 10 mL. Sebagai larutan

pembanding digunakan asam galat 100 ppm yang diencerkan dengan konsentrasi 2,5; 5; 7,5; dan 10

ppm dalam labu ukur 10 mL. Masing-masing larutan sampel dan pembanding dipipet 1,0 mL,

dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan 2 mL DPPH 0,0040%. Campuran dikocok

kemudian didiamkan selama 30 menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 518,4 nm

menggunakan spektrofotometer UV-vis. Kemampuan antioksidan diukur sebagai penurunan

serapan larutan DPPH akibat adanya penambahan sampel. Aktivitas antioksidan untuk

menghambat radikal bebas dinyatakan dalam % inhibisi, yang dihitung menggunakan rumus yaitu :

Nilai IC50 dihitung berdasarkan persentase inhibisi terhadap radikal DPPH dari masing-masing

konsentrasi larutan sampel.

Pemisahan dan pemurnian

Ekstrak aktif yang diperoleh selanjutnya dipisahkan dengan teknik kromatografi yaitu kromatografi

lapis tipis (KLT) dalam berbagai campuran eluen dan kromatografi kolom. Uji kemurnian

dilakukan dengan menggunakan KLT pada beberapa campuran fase gerak. Jika isolat menunjukkan

noda tunggal pada plat KLT dengan fase gerak yang berbeda, maka isolat tersebut sudah relatif

murni secara KLT.

Identifikasi isolat aktif

Identifikasi isolat yang dilakukan pada penelitian ini terdiri dari uji fitokimia dengan pereaksi

warna dan teknik spektrofotometri UV-Vis dan spektrofotometri FTIR.

%100% xblangkoabsorbansi

sampelabsorbansiblangkoabsorbansiinhibisi

4

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Ekstraksi dan Partisi Kulit Buah Tamarillo

Maserasi 1.210 g kulit buah tamarillo yang sudah halus dengan etanol 70% menghasilkan ekstrak

pekat etanol yang berwarna coklat kehitaman sebanyak 126,17 g.

Kandungan total fenol pada ekstrak etanol kulit tamarillo tinggi dengan konsentrasi sebesar 3,564

mg/g eq asam galat. Analisis ini sesuai dengan hasil uji kualitatif senyawa fenol menggunakan

pereaksi FeCl3 1% yang telah dilakukan pada ekstrak etanol kulit tamarillo yang memberikan

perubahan warna hitam yang tajam. Hasil analisis nilai IC50 menunjukkan bahwa ekstrak etanol

kulit tamarillo memiliki aktivitas antioksidan. Pada konsentrasi 200,84 mg/L ekstrak etanol dari

kulit sudah mampu mereduksi radikal bebas sebesar 50%. Jika dibandingkan dengan asam galat,

aktivitas antioksidan ekstrak etanol kulit tamarillo relatif lemah. Asam galat sudah mampu

mereduksi radikal bebas sebesar 50% pada konsentrasi 7,438 mg/L.

Ekstrak pekat etanol kulit tamarillo sebanyak 50 g dilarutkan dalam campuran etanol : air (7:3)

sebanyak 200 mL dan dipartisi sehingga diperoleh ekstrak n-heksan sebesar 0,2791 g (coklat

pekat); ekstrak kloroform sebesar 0,2841 g (coklat); dan ekstrak n-butanol sebesar 5,2277 g (coklat

kemerahan). Berat ekstrak n-butanol lebih besar dibandingkan dengan berat ekstrak n-heksan dan

kloroform. Hal ini menandakan bahwa senyawa yang terkandung pada ekstrak n-butanol kulit

tamarillo sebagian besar bersifat polar.

3.2 Penentuan Total Fenol Ekstrak Hasil Partisi

Kandungan total fenol pada masing-masing ekstrak hasil partisi menunjukkan bahwa ekstrak n-

butanol memiliki kandungan total fenol yang paling tinggi sebesar 3,37 mg/g eq asam galat. Hal ini

mungkin disebabkan senyawa yang diisolasi semakin murni akibat pemisahan berdasarkan

perbedaan sifat kepolaran. Kadar total fenol pada ekstrak hasil partisi ditampilkan pada Tabel 1.

Menurut Widyastuti (2010), antara total fenol dan aktivitas antioksidan memiliki hubungan korelasi

yang positif dan kuat. Semakin besar kandungan total fenol dalam suatu sampel, maka semakin

besar pula aktivitas antioksidannya. Maka dari itu, ekstrak n-butanol dilanjutkan untuk diuji

aktivitas antioksidan secara spektrofotometri menggunakan senyawa DPPH.

Tabel 1. Kadar Total Fenol Pada Ekstrak Hasil Partisi

Ekstrak partisi Berat (g) Konsentrasi Rata-rata Kadar Total Fenol

(mg/g eq asam galat)

n-Heksan 0,0117 (7,3332 ± 0,0344) 0,14

kloroform 0,0116 (3.3092 ± 0,1138) 0,0064

n-Butanol 0,0120 (9,7726 ± 0,3964) 3,37

3.3 Aktivitas Antioksidan pada Ekstrak n-butanol

Hasil analisis nilai IC50 menunjukkan pada konsentrasi 68,14 mg/L, ekstrak n-butanol sudah

mampu mereduksi radikal bebas sebesar 50% dibandingkan dengan ekstrak kasar. Hal ini mungkin

disebabkan senyawa campuran yang terkandung memiliki hubungan sinergis dan antagonis

sehingga mempengaruhi aktivitas yang dihasilkan. Aktivitas antioksidan ekstrak n-butanol

tergolong aktif dan kuat karena memiliki nilai IC50 berkisar antara 50-100 g / mL (Sinaga, 2009)

dan jika dibandingkan dengan asam galat, aktivitas antioksidan yang dimiliki ekstrak n-butanol

lebih rendah. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak n-butanol dipaparkan pada Tabel 2.

Tabel 2. Aktivitas Antioksidan Ekstrak n-Butanol

Konsentrasi (mg/L) % Inhibisi Regresi linier

0 0 y = 0,7217x + 0,8197

r = 0,9944

Nilai IC50 = 68,14 10 5,97

25 18,58

5

50 42,52

75 55,28

100 70,21

3.4 Pemisahan dan Pemurnian

Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan terlebih dahulu dengan tujuan untuk mendapatkan fase

gerak terbaik untuk pemurnian menggunakan kromatografi kolom. Fase diam yang digunakan pada

KLT adalah silika Gel GF254 (1x10 cm) dan sebagai penampak noda digunakan radiasi ultraviolet

pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Hasil analisis KLT menunjukkan bahwa ekstrak n-

butanol dapat dipisahkan dengan baik menggunakan fase gerak n-butanol: etil asetat: asam asetat

10% (2:7:1). Fase gerak ini memberikan pemisahan noda terbanyak yaitu enam noda dan terpisah

dengan jarak yang baik.

Pemisahan komponen dari ekstrak n-butanol kulit tamarillo dengan kromatografi kolom

menghasilkan 61 eluat. Seluruh eluat diamati pola pemisahan nodanya dengan KLT. Eluat yang

memiliki pola pemisahan noda yang sama pada KLT digabungkan dan diperoleh enam fraksi

penggabungan (A, B C, D, E, F) yang memiliki pola pemisahan noda yang berbeda. Masing-

masing fraksi hasil KLT penggabungan diuji fitokimia senyawa fenol menggunakan reagen FeCl3

1%. Hasil uji fitokimia menunjukkan ada empat fraksi yang positif mengandung senyawa fenol

yaitu fraksi FB, FD, FE, dan FF. Isolat FE dan FF yang memiliki noda tunggal secara KLT

dilanjutkan untuk dilakukan uji kemurnian. Hasil uji kemurnian menunjukkan bahwa isolat FE

hanya menampakkan satu (1) noda pada plat KLT. Hal ini menandakan bahwa isolat FE relatif

murni secara KLT, sehingga dilanjutkan untuk dianalisis menggunakan spektrofotometer FTIR dan

UV-Vis.

3.5 Identifikasi Isolat Aktif

a. Spektrofotometer FTIR

Analisis spektrofotometri FTIR dilakukan untuk mengetahui dan memberi informasi mengenai

gugus-gugus fungsi khas yang terkandung dalam isolat FE. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa

isolat FE memiliki beberapa gugus fungsi spesifik seperti serapan uluran O-H terikat pada daerah

bilangan 3321,42 cm-1 yang melebar serta didukung adanya serapan pada daerah sidik jari dengan

bilangan gelombang 1269,16-1041,56 cm-1 yang menunjukkan adanya gugus C-O alkohol. Pada

daerah bilangan gelombang 3126,61 cm-1 menunjukkan adanya serapan uluran C-H aromatik.

Karakteristik lain yang mengidikasikan adanya cincin aromatik ditunjukkan adanya serapan pada

daerah bilangan gelombang 1648,30 cm-1 yang merupakan serapan dari regangan cincin C=C

aromatik. Hasil ini diperkuat dengan munculnya serapan cincin C=C keluar bidang pada panjang

gelombang 621,08-453,27 cm-1 (Silverstein et al., 1986). Spektra FTIR dari isolat FE ditujukan

pada Gambar 1.

Gambar 1. Spektra FTIR Isolat FE

6

Pita serapan pada daerah bilangan gelombang 2958,80 cm-1, 2933,73 cm-1 dan 2873,94 cm-1

menunjukkan adanya serapan untuk C-H alifatik (CH3 dan CH2 stretching) yang didukung dengan

munculnya serapan CH2 bending dan CH3 bending pada daerah bilangan gelombang 1465,90 cm-1

dan 1379,10 cm-1. Pita serapan yang tajam pada daerah bilangan gelombang 1710,86 cm-1

menunjukkan adanya serapan gugus C=O (gugus karbonil) (Silverstein et al., 1986). Berdasarkan

hasil analisis spektra FTIR diduga isolat FE mengandung gugus –gugus fungsi -OH, C-H aromatik,

C=C aromatik, C-O, C=O dan C-H alifatik.

b. Spektrofotometer UV-Vis

Spektra spektrofotometer UV-Vis dari isolat FE dalam metanol ditampilkan pada Gambar 2.

Panjang Gelombang (nm)

Ab

sorb

ansi

Pita I

maks 327,20 nm

Pita II

maks 245,40 nm

Gambar 2. Spektra UV-Vis Isolat FE

Hasil analisis menunjukkan bahwa isolat FE memberikan dua pita serapan maksimum pada panjang

gelombang 327,20 untuk pita I dan panjang gelombang 245,40 untuk pita II. Serapan pada panjang

gelombang 245,40 diduga karena adanya transisi *n dan *n yang menunjukkan adanya

gugus kromofor C=O dan gugus auksokrom -OH sedangkan serapan yang terjadi pada panjang

gelombang 327,20 disebabkan adanya transisi * yang menunjukkan adanya kromofor C=C

terkonjugasi (Fessenden and Fessenden,1995). Serapan spektra UV-Vis pada panjang gelombang

tersebut diduga menunjukkan rentangan serapan senyawa flavonoid golongan isoflavon dengan

rentang panjang gelombang 310-330 (pita I) dan 245-275 untuk pita II (Markham, 1988). Hasil

analisis ini sesuai dengan uji fitokimia flavonoid yang dilakukan menggunakan test Willstater (Mg-

HCl), penambahan pereaksi H2SO4 pekat dan test dengan NaOH 10% yang memberikan perubahan

warna (uji positif) menjadi kuning.

Untuk melihat dan menentukan kemungkinan letak substituen (pola oksigenasi) gugus hidroksi

(OH) pada kerangka dasar isoflavon, maka digunakan pereaksi geser sebagai pendeteksi. Pereaksi

geser yang digunakan terdiri dari NaOH, NaOAc, NaOAc - H3BO3, AlCl3, dan AlCl3-HCl. Fungsi

pereaksi geser adalah menentukan kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid

dengan melihat pergeseran puncak serapan yang terjadi. Pergeseran panjang gelombang spektra

UV-Vis isolat FE setelah penambahan pereaksi geser ditampilkan pada Tabel 3.

Tabel 3. Pergeseran Panjang Gelombang Spektra UV-Vis Isolat FE.

Isolat FE Panjang Gelombang maks

(nm)

Geseran Panjang

Gelombang maks (nm)

Pita I Pita II Pita I Pita II

metanol 327,20 245,40

metanol + NaOH 387,20 255,40 + 60 + 10

metanol + NaOH (5 menit) 387,20 255,40 + 60 + 10

metanol + NaOAc 387,20 253,20 +60 +7,8

metanol + NaOAc + H3BO3 334,40 276,20 +7,2 + 30,8

7

metanol + AlCl3 325,80 243,00 -1,4 -2,4

metanol + AlCl3 + HCl 326,60 245,20 -0,6 -0,2

Berdasarkan data pada Tabel 3, menunjukkan setelah penambahan pereaksi geser NaOH terjadi

pergeseran batokromik pada pita I maupun pita II yang menunjukkan adanya gugus OH pada cincin

A dan B. Dugaan ini diperkuat dengan adanya pergeseran batokromik pada pita II setelah ditambah

natrium asetat yang menunjukkan adanya gugus 7-OH pada cincin A. Hal ini terjadi karena natrium

asetat hanya dapat mengionisasi isoflavon khususnya pada gugus 7-OH. Pergeseran batokromik

yang terjadi pada pita I dan pita II setelah ditambah NaOH juga menunjukkan adanya 3’,4’-

dihidroksi isoflavon (Mabry, 1992).

Penambahan pereaksi geser natrium asetat-asam borat menunjukkan adanya pergeseran batokromik

pada pita I dan pita II yang mengindikasikan terdapat gugus orto-diOH pada cincin A tepatnya pada

posisi C-6 ,C-7 atau C-7, C-8 (Astiti Asih,2009). Gugus orto dihidroksi pada cincin B tidak dapat

dideteksi dengan natrium asetat/asam borat karena kurang efektifnya konjugasi dengan kromofor

utama (Mabry, 1992). Penambahan pereaksi geser AlCl3 dan AlCl3 yang ditambah HCl

memperlihatkan adanya pergeseran hipsokromik yang menunjukkan tidak terdapat gugus OH pada

atom C-5 pada cincin A. Penambahan AlCl3 dan AlCl3/HCl juga tidak dapat mendeteksi adanya

gugus 3’,4’-dihidroksi isoflavon karena cincin B mempunyai sedikit atau tidak ada konjugasi

dengan kromofor utama (Mabry, 1992).

Berdasarkan hasil analisis pergeseran spektra UV-Vis setelah ditambah pereaksi geser

menunjukkan bahwa isolat FE diduga merupakan senyawa flavonoid golongan isoflavon yang

memiliki substituen OH pada kerangka dasarnya yaitu pada cincin A dengan posisi atom C-6,C-7

atau C-7, C-8 dan cincin B pada posisi C-3’, C-4’.

4. SIMPULAN DAN SARAN

4.1 Simpulan

1. Kandungan total fenol ekstrak kasar sebesar 3,564 mg/g eq asam galat, memiliki kemampuan aktivitas antioksidan terhadap DPPH pada konsentrasi (nilai IC50) sebesar 200,84 mg/L.

Kandungan total fenol pada ekstrak n-butanol sebesar 3,37 mg/g eq asam galat dan memiliki

kemampuan aktivitas antioksidan terhadap DPPH pada konsentrasi (nilai IC50) sebesar 68,14

mg/L.

2. Identifikasi isolat aktif golongan fenol pada fraksi E dari fraksi n-butanol kulit tamarillo mengandung senyawa flavonoid golongan isoflavon yang mempunyai gugus karakteristik OH

terikat, C=C aromatik, C-H alifatik, gugus C=O, C=C aromatik, C-O dan C-H aromatik dengan

substituen gugus hidroksi (OH) pada cincin A dengan posisi atom C-6,C-7 atau C-7, C-8, dan

cincin B pada posisi C-3’, C-4’.

4.2 Saran

Perlu dilakukan analisis yang lebih lengkap misalnya dengan metode 1H-NMR, 13C-NMR,

dan GC-MS untuk menetapkan struktur senyawa aktif. Selain itu, perlu dilakukan uji secara in vivo

untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dari ekstrak n-butanol.

Ucapan Terimakasih

Penulis mengucapkan terima kasih kepada DITJEN DIKTI yang mendanai proyek ini

melalui LPPM Unud.

8

DAFTAR PUSTAKA

Astiti Asih, I.A.R., 2009, Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Isoflavon Dari Kacang Kedelai

(Glycine max), Jurusan Kimia FMIPA, Universitas Udayana, Bukit Jimbaran, Jurnal Kimia 3

(1), Januari 2009 : 33-40

Bast, A., G.R.M.M. Haenen., and C.J.A. Doelman., 1991. Oxidants and Antioxidants: State of Art,

The American journal of Medicine, Proceedings of a Symposium Oxidants and Antioxidats :

Pathophysiologic Determinants and Therapeutic Agents.

Fessenden, R.J., and Fessenden, J.S., 1995, Kimia Organik, Terjemahan Aloysius, H.A., Jilid I,

Edisi III, Airlangga, Jakarta.

Mabry T.J., Markham.K.R., dan Thomas M.B., 1970, The Systematic Identification of Flavonoids,

Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin

Mabry T.J., Markham.K.R., dan Thomas M.B., 1992, The Systematic Identification of Flavonoids,

Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.

Markham K. R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid, Terjemahan Kosasih, P., Edisi I, ITB,

Bandung.

Mertz, C., A. Gancel., Z. Gunata., P. Alter., C. Dhuique-Mayer, et al., 2009, Phenolic Compounds,

Carotenoids and Antioxidant Activity of Three Tropical Fruits, Journal of Food Composition

and Analysis, Vol. 22, No. 5, PP, 381-387.

Oktarini Anthonia Candra Dewi, Ni Wayan., 2013, Aktivitas Antioksidan Senyawa Flavonoid

Ekstrak Etanol Biji Terong Belanda (Solanum betaceum, syn) dalam Menghambat Reaksi

Peroksidasi Lemak Pada Plasma darah Tikus Wistar, Tesis, Program Magister, Program Studi

Kimia Terapan, Universitas Udayana, Denpasar.

Prakash, A., 2001. Antioxidant Activity, Medallion Laboratories: Analithycal Progres, Vol. 19, No.

2: 1-4.

Shahwar D., Shafiq-ur-Rehman., Ahmad N., Ullah S., and Raza M.A., 2010, Antioxidant Activities

of the Selected Plants from the Family Euphorbiaceae, lauraceae, Malvaceae and

Balsaminaceae, African Journal of Biotechnology, 9(7): 1086-1096.

Silverstein., Bassler., and Morrill., 1986, Penyidikan Spektrometrik Senyawa Organik, Edisi IV,

a.b. Drs. A.J. Hartomo., Dra. Anny Victor Purba, M.Sc.,Erlangga, Jakarta.

Sinaga, Irma L. H., 2009, Skrining Fitokimia dan Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Buah

Terong Belanda (Solanum betaceum Cav), Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera

Utara, Medan.

Siti Hawa, Ali Hassan., and Fadzelly Abu Bakar., 2012, Antioxidative and Anti-Cholinesterase

Activity of Cyphomandra Betaceae Fruit, Institute for Tropical Biology and Conservation,

Universiti Malaysia sabah, Jalan UMS, 88400, Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia.

Widyastuti, Niken., 2010, Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode Cuprac, DPPH, dan

Frap serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid Pada Enam Tanaman, Skripsi, FMIPA

Institut Pertanian Bogor.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN FENOL

DARI KULIT BUAH TAMARILLO (Solanum betaceum Cav.)

YANG AKTIF SEBAGAI ANTIOKSIDAN

Ida Ayu Raka Astiti AsihNi Made Puspawati, Wiwik Susanah Rita

Ni Luh Putu Devi Sintia Dewi

reaktif Merusak komponen

sel dalam tubuh

protein

DNA

Membran

lemakPeroksidasi

Lemak

Terputusnya

rantai asamMalondialdehid

(MDA)

Menimbulkan

berbagai penyakit

seperti kanker,

jantung, dan

penyakit

degeneratif

lainnya

Vit.A, C, E, β-karoten,

asam fenolat, flavonoid

Berada dalam

tumbuh-

tumbuhan

antioksidan

Tamarillo(solanum

betaceum, syn)

Radikal bebas

TAMARILLO

Secara Tradisional:

Penyakit rematikMemperlancar air seni

Menurunkan kadar kolesterol darah Uji Pendahuluan

Ekstrak etanol kulit buah tamarillo positif

mengandung senyawa fenolik

Hasil Penelitian▪ Kandungan fenolik pada

buah berkisar antara 308-570 mg per 100 g sampel.

▪ Kandungan total fenol pada kulit sebesar 4,89 ±0,04 mg/g eq asam galat (GAE)/g

Target Penelitian

Mendapatkan senyawa fenol yang

terkandung pada kulit buah tamarillo

(Solanum betaceum Cav.) yang bersifat

paling aktif sebagai antioksidan.

IdentifikasiUV-Vis dan FTIR



Senyawa golongan Flavanon(substitusi gugus OH pada

C6,C7 atau C7,C8)

Isolat FE Isolat FBIsolat FBIsolat FB

Senyawa golongan Isoflavon(substitusi gugus OH pada C6, C7

atau C7,C8 dan C3’,C4’)

Senyawa golongan Flavanon(substitusi gugus OH pada C2’, C5’, C6’ dan gugus O-glikosida pada C7)

Partisi Partisi Partisi

Ekstrakn-heksan0,2791 g

Ekstrakkloroform0,2841 g

Ekstrakn-butanol5,6277 g

Ekstrakn-heksan

0,45 g

Ekstrakkloroform

0,37 g

Ekstrakn-butanol

3,39 g

Ekstrakn-heksan

0,62 g

Ekstrakkloroform

3,42 g

Ekstrakn-butanol

3,00 g

Kulit 1.210 g Daging 3.950 g Biji 2.480 g

Maserasi dengan etanol 70%uji aktifitas antioksidan

Ekstrak etanol 178,44 gIC50 1365,55 ppm



Buah terong belanda



Uji fitokimia flavonoiduji aktifitas antioksidan



Ekstrak n-butanolIC50 68,14 ppm

Ekstrak n-butanolIC50 621,45 ppm

Ekstrak n-butanolIC50 2.250,769 ppm

Kromatografi kolomn-butanol:etil asetat:asam asetat

10% (2:7:1)

Kromatografi kolomn-heksan:etil asetat:air (6:4:01)

Fraksi FA-FF Fraksi FA-FG Fraksi FA-FB

Uji fitokimia flavonoidUji kemurnian



Kromatografi kolomn-butanol:etil asetat:asam asetat

10% (2:7:1)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Cawan Berat

konstan

cawan (g)

Berat konstan cawan +

sampel (g)

Berat basah

konstan (g)

Berat

kering

konstan (g)

% Kadar

air

Basah Kering

1 18,28 25,51 20,65 7,23 2,37 67,22%

2 18,32 25,62 20,71 7,30 2,39 67,26%

3 18,20 25,54 20,61 7,34 2,41 67,17%

% Kadar air rata-rata 67,22%

Kandungan Total Fenol Ekstrak Kasar

Standar asam galat

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Abs

orba

nsi

Konsentrasi (ppm)

Kurva Kalibrasi Asam galat

y = 0,1195x + 0,00125

r = 0,9961

Ekstrak kasarUji Fitokimia

Berat

(g)

Ulangan Konsentrasi Konsentrasi Rata-

rata

Kadar Total Fenol

(mg/g eq asam

galat)

0,0173 1

2

3

5,7134

6,0314

5,9920

(5,9123 ± 0,1326) 3,564

Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kasar

%100% xblangkoabsorbansi

sampelabsorbansiblangkoabsorbansiinhibisi

Konsentrasi

(ppm)

% Inhibisi Regresi Linier

0

10

25

50

75

100

0

3,88

9,26

14,52

19,11

25,19

y = 0,2413x + 1,537

r = 0,9926

Nilai IC50 = 200,84

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40 60 80 100 120

% In

hib

isi

Konsentrasi Sampel (ppm)

Kurva Kalibrasi Ekstrak Kasary = 0,2413x + 1,537

r = 0,9926

Partisi

Pelarut Berat Sampel

(g)

Berat Fraksi (g) Warna Fraksi

n-heksan 400 mL

kloroform 400 mL

n-butanol 400 mL

50

50

50

0,2791

0,2841

5,6277

Coklat pekat

Coklat

Coklat kemerahan

Penentuan kandungan total fenol

n-heksan kloroform n-butanol

Ekstrak

partisi

Berat (g) Konsentrasi Konsentrasi Rata-rata Kadar Total Fenol (mg/g

eq asam galat)

n-Heksan 0,0117 7,2816

7,3544

7,3636

(7,3332 ± 0,0344) 0,14

Kloroform 0,0116 3,4799

3,2958

3,1518

(3,3092 ± 0,1138) 0,0064

n-Butanol 0,0120 10,3674

9,3632

9,5874

(9,7726 ± 0,3964) 3,37

Aktivitas Antioksidan

Konsentrasi

(ppm)

% Inhibisi Regresi linier

0

10

25

50

75

100

0

5,97

18,58

42,52

55,28

70,21

y = 0,7217x + 0,8197

r = 0,9944

Nilai IC50 = 68,14

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

% In

hib

isi

Konsentrasi Sampel (ppm)

Kurva Kalibrasi n-Butanol

y = 0,7217x + 0,8197

r = 0,9944

Pencarian Eluen Pada KLT

Fase Gerak Jumlah

Noda

Harga Rf

A n-butanol: air: kloroform

(3:0,5:1)

4 0,05; 0,13; 0,33;0,59

B n-butanol: air: kloroform

(7:1:2)

4 0,05; 0,13; 0,32;0,55

C n-butanol: air: etil asetat

(1:0,5:3)

4 0,04; 0,21; 0,4;0,78

D n-butanol: kloroform: asam

asetat 10% (7:2:1)

5 0,04;0,17;0,26;0,51;0,78

E n-butanol: kloroform: asam

asetat 10% (8:1:1)

4 0,06; 0,2; 0,29; 0,51

F etil asetat: kloroform: asam

asetat 10% (7:2:1)

4 0,06; 0,2; 056; 0,81

G n-butanol: etil asetat: asam

asetat 10% (2:7:1)

6 0,04;0,21;0,4;0,57;0,82;

0,91

Profil KLT

KLT Penggabungan Hasil Kolom

Botol

Fraks

i

Fraksi Warna Jumlah

noda

Harga Rf

9-12 A Coklat 1 0,83

13-16 B Coklat 2 0,83; 0,69

17-20 C Coklat 1 0,69

21-22 D Coklat 2 0,69; 0,49

23-37 E Hijau 1 0,49

38-53 F Hijau

kekuningan

1 0,38

Uji Fitokimia

Fraksi Uji fitokimia fenol Perubahan warna

A - Orange

B + Coklat kehijauan

C - Orange

D + Hitam

E + Hijau kehitaman

F + Hijau kehitaman

Uji Kemurnian

Fraksi E

No Fase gerak Jumlah noda Harga Rf

1 n-butanol: kloroform:

asam asetat 10% (7:2:1)

1 0,58

2 etil asetat: kloroform:

asam asetat 10% (7:2:1)

1 0,04

3 n-butanol: air: kloroform

(3:0,5:1)

1 0,53

4 n-butanol: air: etil asetat

(1:0,5:3)

1 0,55

5 n-butanol: etil asetat (3:7) 1 0,63

6 n-heksan: n-butanol (4:6) 1 0,2

Fraksi F

Keterangan:

A = Kloroform : etil asetat (3:7)

B = n-butanol : etil asetat (3 :7)

C = n-butanol : air: kloroform (3:0,5:1)

D = n-butanol: air: etil asetat (1:0,5:3)

Identifikasi dengan FTIR

Bilangan Gelombang

% T

ran

smit

an

Bilangan Gelombang (cm-1) Bentuk Pita Kemungkinan

Gugus FungsiSpektra isolat Pustaka*

3321,42 3550-3200 Melebar -OH terikat

3126,61 3150-3050 Tajam -CH aromatik

2958,80

2933,73

2873,94

3000-2840 Tajam -CH alifatik

1710,86 1850-1730 Tajam -C=O

1648,30 1650-1585 Rendah C=C aromatik

1465,90

1379,10

1475-1300 Rendah -CH alifatik

1269,16-1041,56 1300-1000 Melebar -C-O

950,91-738,74 900-675 Tajam -CH aromatik

621,08

453,27

600-400 Rendah C=C aromatik

Analisis spektra FTIR isolat fraksi E

Berdasarkan hasil analisis spektra FTIR diduga isolat fraksi Emengandung gugus –gugus fungsi -OH, C-H aromatik, C=Caromatik, C-O, C=O dan C-H alifatik.

Identifikasi dengan UV-Vis

Pita IPita II

Hasil analisis menunjukkan bahwa isolat fraksi Ememberikan dua (2) pita serapan maksimumpada panjang gelombang 327,20 untuk pita I danpanjang gelombang 245,40 untuk pita II.

Panjang gelombang

Ab

sorb

ansi

Struktur Dasar Isoflavon

Data pergeseran panjang gelombang spektra UV-Vis isolat

Panjang Gelombang

Ab

sorb

an

si

+ NaOH

+ NaoAc

Panjang Gelombang

Ab

sorb

an

si

Panjang Gelombang

Ab

sorb

an

si

+ NaoAc/H3BO3

Isolat fraksi E Panjang Gelombang

(nm)

Geseran Panjang

Gelombang

(nm)

Pita I Pita II Pita I Pita II

metanol 327,20 245,40

metanol + NaOH 387,20 255,40 + 60 + 10

metanol + NaOH (5

menit)

387,20 255,40 + 60 + 10

metanol + NaOAc 387,20 253,20 +60 +7,8

metanol + NaOAc +

H3BO3

334,40 276,20 +7,2 + 30,8

metanol + AlCl3 325,80 243,00 -1,4 -2,4

metanol + AlCl3 + HCl 326,60 245,20 -0,6 -0,2

Dugaan Struktur Senyawa Isoflavon

Atau

KESIMPULAN DAN SARAN

1. Kesimpulan

➢ Kandungan total fenol ekstrak kasar dan fraksi n-butanolsebesar 3,564 mg/g eq asam galat dan 3,37 mg/g eqasam galat serta memiliki kemampuan aktivitasantioksidan terhadap DPPH pada konsentrasi (nilai IC50)sebesar 200,84 ppm dan 68,14 ppm.

➢ Identifikasi isolat aktif golongan fenol pada fraksi Ediduga mengandung senyawa flavonoid golonganisoflavon yang mempunyai gugus karakteristik OHterikat, C=C aromatik, C-H alifatik, gugus C=O, C=Caromatik, C-O dan C-H aromatik dengan substituengugus hidroksi (OH) pada cincin A dengan posisiatom C-6,C-7 atau C-7, C-8, dan cincin B pada posisiC-3’, C-4’.

2. Saran

➢ Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk memastikan

struktur senyawa dengan teknik analisis yang lebih lengkap,

misalnya dengan metode 1H-NMR, 13C-NMR, dan GC-MS.

➢ Perlu dilakukan uji in vivo untuk mengevaluasi aktivitas

antioksidan dari ekstrak n- butanol kulit Tamarillo.

THANKS

senastek 2015.pdf (p.1-8)PPT senastek 2015.pdf (p.9-31)

isolasi dan identifikasi senyawa golongan fenol...

Documents